JPH0122904B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、体液中の基底膜物質
（Basalmembranmaterial）を免疫学的に測定す
る方法に関する。 多くの疫病（糖尿病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊
維症、血管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加
することは公知である。この血管変化は、従つて
屡々致死要因となつている。これらの疫病におけ
る免疫学的螢光検査によれば、これら基底膜変動
は、特にラミニンと称せられる新規の基底膜成分
及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づくことが
判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検査
を行なつているが、バイオプシー物質でのみ実施
でき、定量的には評価できない。 従つて、本発明は、この問題を血中及び他の体
液（尿、腹水）中の基底膜抗原を測定するための
定量的かつ特異的方法を得ることにより解決する
ことを目的としている。 この課題は、体液中の基底膜物質の免疫学的測
定法で解決され、これは、測定すべき試料の存在
下に抗原としての標識ラミニン、標識ラミニンフ
ラグメントP1又は標識基底膜フラグメントCol1
（）をその特異抗体と共にインキユベートし、
生じた抗原−抗体−結合体を分離し、結合体中又
は分離した体液中に含有される標識抗原の量を測
定することよりなる。 本発明方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質
即ちラミニン、ラミニンフラグメントP1及びコ
ラーゲンペプチドCol1（）の特性付けに基づ
く。これらの３種の新規物質殊に２種のフラグメ
ントラミニンP1及びCol1（）は、蛋白質分解及
び変性作用に対して高い安定性を示し、従つて体
液殊に血液中に良好に立証しうる量でも現われる
から、その定量によつて基底膜の増加が測定でき
る。 ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これ
は、炭水化物12〜15重量％を含有し、分子量800
〜1000kを有する糖蛋白質であり、２種の分子量
約220k及び440kのジスルフイド結合したポリペ
プチド鎖より成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で
基底膜含有組織を濃塩酸溶液で抽出し、引続きこ
の組織を0.4〜0.6MNaClで抽出し、後者抽出液を
3.3〜3.5MNaClで沈殿させ、再溶解させた沈殿を
クロマトグラフイにかけることにより得られる。 プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化
学的方法で例えば臭化シアンを用いるラミニンの
分解により、これからラミニンP1と称される多
大のフラグメントを得ることができる。このフラ
グメントは、直接、組織から得ることもできる。 ラミニンP1は、分子量200〜300kを有し、シス
テイン12〜14モル％を含有し、レクチンに対する
高い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を有
し、 (1)プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニン
を分解するか又は(2)プロテアーゼ阻害剤の存在下
で基底膜含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き
0.4〜0.6MNaClで抽出し、残留分をプロテアーゼ
と共にインキユベートし、得られる溶液を透析
し、得られた溶液を2M及び4MNaClの間で分別
沈殿させ、弱塩基性カチオン交換体を通すクロマ
トグラフイにかけ、レクチンを通すクロマトグラ
フイにかけることによつて得られる。 ラミニンP1に対して高い親和性を有するレク
チンの典型的な例はコンカナバリン
（Concanavalin）Ａ及び麦芽レクチンである。 本発明の範囲で使用できる第３の新規抗原は、
基底膜コラーゲンのジスルフイドの多い変形体よ
りなるフラグメントであり、慣用のプロテアーゼ
例えばペプシン及びトリプシンに対しても、細菌
用コラゲナーゼ（Cl−ヒストリテイクム）に対し
ても抵抗する。これは、Col1（）と称され、分
子量200〜300kを有し、システイン２〜５モル％
を含有し、軸比１：０、融点範囲60〜70℃の安定
なトリペルらせんを有し、コラゲナーゼに対して
抵抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有
組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き0.4〜0.6MNaCl
で抽出し、抽出残分をプロテアーゼと共にインキ
ユベートし、得られた溶液を透析し、2MNaClで
沈殿させ、再溶解した沈殿をプロテアーゼと共に
インキユベートし、透析しかつクロマトグラフイ
で精製することにより得られる。 比較すると、コラーゲンにおける軸比は１：
200である。 次表に新規の３種の抗原のアミノ酸組成を挙げ
る。

【表】 これらの新規基底膜成分（以後これらを本発明
の抗原と称する）は、前記のように、体液中殊に
血液中に基底膜物質を公知の免疫学的検査法を用
いる本発明による測定を可能にし、これは、共同
の抗体に関する周知量の標識抗原と被検試料中の
未知量の抗原との競争に基づく。この場合、公知
ラジオイムノアツセイー（RIA）−変法も、酵素
イムノアツセイー変法及び他の方式の標識付け例
えば螢光標識付け、染料標識付け等を用いる類似
測定法も使用できる。この種の方法は、当業者に
とつては公知である。すべてのこれらの方法は、
できるだけ高純度の抗原を用いて適当な実験動物
中に抗血清を作り、これをそのもの自体として又
はこれから単離した特異抗体を得、場合により抗
体もしくは抗血清を固体担体に結合した後、慣用
の抗原−抗体−結合体形成反応を反応成分相互の
インキユベートにより進行させることに基づく。
体液の被検試料中に存在する標識されていない抗
原の量に応じて、この結合体中では標識抗原の１
部分のみが結合しており、結合体の単離によるか
又は上澄み中で測定されうる。結合体中で結合し
た標識抗原の量は、結合しなかつた抗原の量に関
係するから、こうして、体液中の抗原作用をする
基底膜物質の含分を測定することができる。 抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹
腔内注射することにより行なうことができる。こ
の場合完全なフロインドのアジユバンド
（Freundschen Adjuvans）の存在で操作するの
が有利である。この種の場合に慣用の抗原量は更
に加工できる。家兎使用の際の特に好適な投与量
としては、0.5〜１mg／動物が効を奏する。次い
で生じた抗血清は当業者に公知の方法で回収さ
れ、そのもの自体として使用される。血清中に存
在する特異抗体を、予め、例えば親和クロマトグ
ラフイの方法でなお精製することもできる。 抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の
方法で実施できる。放射線核での放射性標識付け
の場合は、放射線核としてヨード125を使用する。
この放射線核を用いる標識付けは、公知のクロラ
ミンＴ−法で行なうことができる（Int.Arch.
Allergy29巻185頁参照）。 本発明方法の有利な実施形は、特異抗血清で形
成された抗原−抗体−結合体を第２の抗体の使用
により、結合しなかつた抗原から分離することよ
りなる。この場合、第２の抗体として、抗血清を
得るために使用した動物の免疫グロブリンＧに対
する抗体を使用するのが有利である。これにより
不溶の形に変えられた抗原−抗体−結合体を溶液
から分離することは、このために慣用の方法例え
ば遠心分離、濾過及び類似方法で行なうことがで
きる。抗血清もしくは抗体を固体担体例えば試験
管の内壁に結合させるのも有利である。 抗原−抗体−結合体の分離の後に、前記のよう
に、標識、例えば抗原−抗体−結合体に結合して
いる又は選択的に上澄み中に残留している放射能
又は酵素活性を測定する。公知の抗原含量の試料
を用いて製造した較正曲線を用いて、被検体中に
含有される抗原量を測定することができる。この
場合、原則的に、標識抗原の量（これは、生じた
抗原−抗体−結合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。 本発明による免疫学的測定法によれば、1n
ｇ／mlの範囲までの濃度の測定が可能である。従
つて、この方法を動物及びヒトの体液殊に血液も
しくは血清中の基底膜物質の測定法に使用するこ
とができる。正常の個体の場合に、血清中のこの
抗原の濃度は、20〜50nｇ／mlの範囲内にあり、
基底膜変化の際には例えば実験的糖尿病の際には
著るしく高まる。前記方法を用いると、この種の
変化は比較的迅速にかつ確実に測定できる。 本発明方法で使用される新規抗原は、原則的に
基底膜を含有するすべての組織から得られる。得
るべき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎
盤が有利である。同様に、多量の基底膜を形成す
る特定の腫瘍組織例えばマウスのEHS−肉腫も
有利である。 本発明により使用される新規抗原を得る場合
に、この組織からの基底膜の純粋製造は省略され
る。組織を差当り、プロテアーゼ阻害剤の存在で
高い塩濃度で抽出すると、この際付随蛋白質が除
かれる。この場合3.4〜4MNaClが有利である。
この抽出のために、組織を差当り常法で粉砕もし
くはホモゲナイズする。場合により高い塩濃度で
数回抽出の後に、低い塩濃度での、有利に0.4〜
0.6MNaClでの第２の抽出工程を数回実施するこ
とができる。この場合実際に基底膜コラーゲン
は、溶解しないが、ラミニンの１部分は溶解す
る。こうして得た溶液は、ラミニン及びラミニン
フラグメントラミニンP1を得るために使用でき、
二重塩抽出時に残留する不溶の組織残分は、フラ
グメントCol1（）を得るための出発物質として
使用されるが、ラミニンP1を得るためにも好適
である。 プロテアーゼ阻害剤として例えばフエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、ｐ−クロルメルクリ安
息香酸又はエチレンジアミンテトラ酢酸が使用さ
れる。しかしながら他のプロテアーゼ阻害剤も好
適である。阻害剤は、個々に又は混合して使用で
きる。好適な濃度は、通例約１〜50mg／であ
る。 ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付
随蛋白質の塩沈殿により分離できる。沈殿は3.3
〜3.5MNaClで行なうのが有利である。 こうして得た沈殿を再び緩衝液中に入れ、例え
ばアガロースA1.5ｍのクロマトグラフイにかけ
る。こうして、前記のように、本発明方法に使用
できる前記ラミニンが得られる。 こうして得たラミランからフラグメントP1は、
蛋白質分解酵素を用いる分解によるか又は化学的
方法で例えば臭化シアンを用いて得ることができ
る。約PH1.5〜2.5の強酸性溶液中でのペプシンを
用いる分解を行なうのが有利である。こうして得
た溶液から、分別塩沈殿によりフラグメントP1
を得ることができる。沈殿は有利に、差当たり
2MNaClを用い、かつ引続き4MNaClを用いて行
なうのが有利であり、この際最後の工程でラミニ
ンP1が沈殿する。 フラグメントP1は、直接、単離する必要のな
い基底膜物質から得ることもできる。この有利な
取得法では、２工程塩抽出の不溶組織成分から出
発される。残分を懸濁させ、蛋白分解酵素と共
に、この酵素に好適な温度及びPH値条件下に、イ
ンキユベートする。有利にペプシンを使用し、約
1.5〜2.5のPH−値で常温又は僅かに低い温度で操
作するのが有利である。約10〜20℃が好適であ
る。その後不溶分を分離し、低分子量物質を透析
により除去し、得られた溶液から塩分別により前
記のように、ラミニンP1が得られる。沈殿は有
利に差当たり2MNaClで、引続き4MNaClを用い
て行なう。 沈殿したフラクシヨン２〜4MNaClから、ラミ
ニンP1は、クロマトグラフイにより更に精製で
きる。有利に、差当り弱塩基性のカチオン交換体
例えばDEAE−セルロース又はDEAE−セフアデ
ツクスでのクロマトグラフイを実施する。精製
は、例えば担体結合又は網状化により不溶性形で
存在するレクチンへの結合により、かつ引続き適
当な炭水化物での溶離により行なうことができ
る。例えば網状化されたデキストラン例えばアガ
ロースA1.5ｍでのゲル濾過も精製のために使用
できる。 フラグメントCol1（）を得るために、同様
に、２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液か
ら出発する。プロテアーゼ処理の後に得られる
2MNaClまでの沈殿物を新たに溶解の後に、この
酵素に好適な温度及びPH値条件でコラゲナーゼと
共にインキユベートすると、Col1（）を除きす
べての余分のコラーゲンが分解され、透析により
除去することができる。精製は、例えば網状化さ
れたデキストラン及び／又はカルボキシメチルセ
ルロースでのモレキユラーシーブクロマトグラフ
イにより行なうことができる。 前記の蛋白質分解法にとつてペプシンが有利で
あるが、他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこ
のために好適である。化学的分解法も使用でき
る。これは臭化シアンを用いて行なうのが有利で
ある。 次に実施例につき本発明を説明する。 例 １ 標識抗原の製造 ラミニンP1又はペプチドCol1（）25μｇをク
ロラミン−Ｔ−法によりヨード1250.5ミリキユリ
ーで標識し、結合体しなかつたヨードを透析又は
ビオーゲルＰ−２でのゲル濾過により除く。引続
く工程を有利に非イオン性界面活性剤例えばツイ
ーン（Tween）20 0.04％の存在で実施する。抗
体との結合曲線を、標識ペプチド1nｇを用いて
測定する。 免疫学的測定（RIA）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニン
P1又はCol1（）の濃度を、次の阻害試験で測定
する。特異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と
共に４℃で16時間予備インキユベートし、標識抗
原1nｇの添加の後に更に４℃で８時間インキユ
ベートする。その後家兎免疫グロブリンＧに対す
る抗体を過剰に加え、更に４℃で16時間後に免疫
結合体中に結合した抗原を遠心分離する。未知の
試料の阻害活性を非標識抗原の標準濃度の活性と
比較する。 例 ２ （参考例） ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマウ
ス腫瘍〔EHS−肉腫；オーキン（orkin）等によ
るJ.Exp.Med.145巻（1977年）204〜220頁参照〕
を使用する。組織を、まずプロテアーゼ阻害剤フ
エニルメチルスルホニルフルオリド（３mg／）、
ｐ−クロルメルクリ安息香酸（３mg／）及び
EDTA（0.01M）の存在で20倍過剰の3.4MNaCl、
0.05MトリスHCl（PH7.4）中で２〜３回ホモゲナ
イスし、抽出可能な蛋白質を遠心により除去す
る。次いで残分をプロテアーゼ阻害剤の存在下に
４℃で0.5MNaCl、0.05トリスHcl（PH7.4）で２回
１液にわたり抽出する。抽出物は天然ラミニンを
含有し、これを3.4MNaClを用いて沈殿させ、か
つ再溶解した沈殿をアガロースA1.5ｍ
（1MCaCl₂）でのクロマトグラフイにかける
（0.05Mトリス・HClPH7.4）ことにより付随蛋白
質を分離させる。 例 ３ （参考例） ペプチドラミランP1の製造 例２に記載の塩抽出物中に残留している不溶の
組織残分を0.5M酢酸中でホモゲナイズさせ（50
mg／乾燥重量ｇ）、HClの添加によりPHを２に調
節し、懸濁液をペプシン（50mg／乾燥重量ｇ）の
添加の後に15℃で24時間インキユベートする。酵
素で溶解させた物質を遠心により単離し、４℃で
0.5MNaCl、0.05Mトリス（PH7.4）で透析する。
この溶液から2MNaClを用いてコラーゲン性蛋白
質の混合物を沈殿させ、引続き上澄みを4MNaCl
で沈殿させることにより、フラグメントラミニン
P1の濃度を高める。2MNaClまでの沈殿はCol1
（）を得るために使用できる。 ラミニンP1を、0.05Mトリス・HCl（PH8.6）、
2M尿素中で均衡化し、線状勾配濃度のNaCl（０
〜0.4M）で溶離させ、更に精製する。最終精製
は、コンカナバリンＡ−カラムに結合させ、
0.1Mα−メチルマンノシドを用いて溶離させるこ
とにより行なう。必要な場合には、アガロース
M1.5ｍでのゲル濾過によりなお、更に精製する
ことができる。組織残分の代りに例２で得られる
ラミニンも使用できる。 例 ４ （参考例） Col1（）の製造 ペプチドCol1（）の単離のために、例３で得
たコラーゲン蛋白質の混合物（沈殿、0.5〜
2NaCl）を0.05Mトリス・HCl（PH7.4）、
0.2MNaCl、0.002MNaCl₂（10mg／ml）中に溶か
し、細菌コラゲナーゼ（0.1mg／ml）の添加の後
に20℃又は37℃で16時間インキユベートする。こ
の場合、ペプチドCol1（）を除いて全ての他の
コラーゲンは分解されて低分子量ペプチドになる
から、これらを透析により除去する。更にアガロ
ースA5M（1MCaCl₂、0.05トリス・Hcl、PH7.4）
で、かつ引続き、ペプチドを、0.01M酢酸ナトリ
ウム（PH4.0）、4M尿素中で均衡化したCM−セル
ロースのカラムに結合させることにより精製す
る。線状勾配濃度のNaCl（０〜0.2MNaCl）によ
り純粋なCol1（）をカラムから溶離させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 体液中の基底膜物質を免疫学的に測定する場
   合に、抗原としての標識ラミニン、標識ラミニン
   フラグメントP1又は標識基底膜フラグメント
   Col1（）をそれらの特異抗体と共に、測定すべ
   き試料の存在下にインキユベートさせ、生じる抗
   原−抗体−結合体を分離し、この結合体中又は分
   離された液体中に含有されている標識抗原の量を
   測定することを特徴とする、体液中の基底膜物質
   の免疫学的測定法。 ２ 放射線、免疫学的又は螢光物質で標識された
   抗原を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 抗原−抗体−結合体の分離のために、抗原が
   抗血清を得るために使用される動物の免疫グロブ
   リンＧである第２の抗体を使用する、特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４ 抗血清もしくは抗体を固体担体に結合させ
   る、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
   法。 ５ 家兎抗血清もしくは家兎抗体を使用する、特
   許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の
   方法。