JPH0123741B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、免疫学をベースとしたクレアチニン
の測定法及びそれに好適である試薬に関する。臨
床化学においてはクレアチニンの測定は腎機能を
診断するための最も重要な方法の１つである。尿
素測定に比してその測定は、血清中のクレアチニ
ン濃度が栄養摂取法、特に蛋白質に富んだ食餌の
供給に実際に影響されないという決定的な利点を
有する。 勿論、尿素に比較して血清中のクレアチニン濃
度は決定範囲において（正常値の上限は男子で
1.10mg／dl、女子で0.90mg／dl）著しく低い。そ
れ故、クレアチニン試薬の感度及び特異性に対し
て高い要求がなされている。 クレアチニン試薬は臨床実験室における標準試
験法として重要であるので、この試験は同時にで
きる限り低い作業経費で実施可能でありかつ特に
自動分析装置での利用に好適であることが必要で
ある。 従来最も一般的に使われているクレアチニンの
測定法はM.ヤツフエにより見出された、アルカ
リ性媒体中でのクレアチニンとピクリン酸との呈
色反応に基いている。この場合、試料の酸性脱蛋
白（例えばトリクロル酢酸又はピクリン酸で）の
後上澄み中にピクリン酸の添加及びアルカリ性化
後に赤色の呈色が発現し、それを光度測定する。
しかしこの簡単な方法は一連の基本的な欠点を有
する。 ヤツフエ反応が50種以上の同様に色原性の物
質、特に当然血清中に産生するグルコール、ピル
ベート、アセトアセテート及びアセトン、従つて
クレアチニンに対して特異的ではないような成分
により影響を受けることが明らかになつた〔文
献：“Clin.Chem.”、26巻、1119〜1126頁（1980
年）〕。なかんずく、低いクレアチニン濃度（１
mg／dl）ではこれらの“非クレアチニン色原体”
は妨害作用をし、このことはクレアチニンの検出
下限の制限をもたらす（“クレアチニンブライン
ド範囲”：Creatininblinder Bereich）。 また、反応媒体中のPH値の僅かな移動も色の深
みの変化をもたらす。最後に、部分的に腐食性で
毒性の試薬の使用もまた取扱いの際の危険の原因
となる。ヤツフエ反応の一連の変更は精度及び実
施可能性を改良するが、これらの基本的な欠陥は
完全には除去されていない。 他の公知の方法はクレアチニンをｏ−ニトロベ
ンズアルデヒドの添加下にメチルグアニジンに変
換し、これを坂口反応後に測定する。クレアチニ
ンとカリウム水銀チオシアネートとの呈色反応も
公知である。しかし両方の反応は臨床実験室には
不適当であることが明らかになつた。 更に、ヤツフエ反応を酵素の部分工程と組合わ
せることにより非特異性色原体による妨害を回避
することが知られている。この場合、ヤツフエ反
応においてクレアチニンアミドヒドロラーゼ／ク
レアチニンキナーゼ／ATPで処理する前とその
後で血清試料により得られた色相を測定しかつク
レアチニン含量の吸光度の差から計算する
〔“Arch.Pharm.”、３巻、893〜896頁（1980年）〕。
この方法は特異的ではあるが、その実施は煩雑で
ありかつ自動化が困難である。 更に、クレアチニンからクレアチニン−イミノ
ヒドロラーゼの作用により遊離したアンモニアを
アンモニア選択性電極を用いて〔“Anal.Chem.”、
46巻、246〜249頁（1976年）〕又は後続のグルタ
メートデヒドロゲナーゼ反応におけるNADH消
費量を螢光測定により〔“Clin.Chim.Acta”、100
巻、21〜23頁（1980年）〕測定するクレアチニン
測定法が公知である。しかし、試料中には比較的
多量の遊離アンモニアが存在する可能性があるの
で、この種の測定が十分に妨害されずに実施で
き、それ故定期診断に普及し得るかどうか疑わし
い。 最近、完全酵素的なクレアチニン試験が記載さ
れた。この試験ではクレアチニンをクレアチンに
変換し、これをATPと反応させてクレアチンホ
スフエートに変換し、その際に生成するADPを
ピルベートキナーゼ及びラクテートデヒドロゲナ
ーゼ（LDH）との結合反応において反応溶液中
のNADH含量の低下について光度測定する
〔“Scand.J.clin.Lab.Invest.、”補遺29巻、126頁
（1972年）〕。 この方法は血清試料の脱蛋白を必要とせずかつ
クレアチニンに特異的である。しかし大容量の試
料を使用した場合でも測定シグナルが比較的低い
ため試験の感度は低いクレアチニン濃度範囲にお
いて限定され、更に試料盲検値を測定する必要が
あるのでこの方法を自動分析装置に適用するのは
非常に困難である。 それ故、簡便で自動化可能であり、同時に非常
に特異的でかつ前記の理由から特にクレアチニン
の濃度範囲１mg／dl（“クレアチニンブライン
ド範囲”）で非常に敏感なクレアチニン試験が求
められている。 本発明はこの課題をクレアチニンの免疫学的測
定方法により解決し、本方法は試料からのクレア
チニンを初めにメチルヒダントインに、有利には
酵素的にクレアチニン−イミノヒドロラーゼ
（EC.3.5.4.21）を用いて変換しかつ生成した１−
メチルヒダントインにより、一般式： 〔式中R¹、R²、R³及びR⁴はそれぞれ独立にＨ原
子、Ｃ原子１〜３個を有するアルキル基又はフエ
ニル基を表わす〕のヒダントインとハプテン担体
との接合体と、更に一般式の他のヒダントイン
と同じハプテン担体、しかし有利には他のハプテ
ン担体との接合体に対して作用する、例えば抗血
清もしくはそれから得られる免疫グロブリンフラ
クシヨンの形の抗体との間の結合反応を濃度に相
応して阻害することに基いている。 優れた実施形では結合阻害試験に関してもまた
抗体形成に関してもハプテン担体と１−メチルヒ
ダントイン（R¹＝CH₃、R²〜R⁴＝Ｈ）との接合
体を使用する。 抗体とヒダントイン接合体との間の結合の阻害
は、クレアチニン、それ故１−メチルヒダントイ
ンがヒダントイン接合体との混合前に抗体に多量
に添加されている程強い。この阻害効果は測定す
べき試料溶液中のクレアチニンの濃度範囲が１
mg／dlより低くても、つまり公知のクレアチニン
測定法の利用可能性が著しく限定されてしまう範
囲において非常に顕著である。 長い間、簡便で特異的な、特に低い濃度範囲に
おいて良好であるクレアチニン測定法が求められ
かつ免疫学的試験法が40年来知られていたにもか
かわらず、従来はクレアチニンの免疫学的測定法
を開示し得なかつた。 就中このことは、クレアチニンが抗体を形成す
るすべての生物の生体中に広く分布している抗体
形成を開始し得ない物質であり、分子の大きさが
低くかつ血清濃度が比較的高いためにクレアチニ
ンとハプテン担体との接合体が、クレアチニンと
構造的に緊密に類縁の化合物、例えばクレアチニ
ンとすらも交叉反応しない抗体を形成することが
できかつそれ故クレアチニンの特異的な測定法を
構成し得ることを予測し得なかつたことに帰因す
る。 本発明ではこの課題は、クレアチニンから初め
に“異種化反応（Verfremdungsreaktion）”で
低分子でもあるが生体異種化合物でもあるヒダン
トインを形成し、の化合物に対して好適なヒダン
トイン接合体、特に１−メチルヒダントイン−ハ
プテン担体接合体により抗体を生成することがで
き、この抗体は意想外にも非常に特異的であり、
それは例えばクレアチニン、クレアチン及び尿素
のような基本的な構造的特徴がヒダントインのそ
れと共通している生体固有の化合物と有意には交
叉反応せず、それ故前記の異種化反応の適用によ
り特異的で敏感なクレアチニン試験を構成するの
に好適である。 抗体形成に好適なハプテン担体としては免疫学
でそのものとして知られている物質が好適であ
る。その例は原則的には、抗体形成に使われる宿
主動物では産生しないすべての種類の異なる蛋白
質、例えば種々の由来の血清アルブミン、キーホ
ールリンフオシアニン、（リポ）−ポリサツカリ
ド、アガロース、活性炭、ウイルスである。公知
の他のハプテン担体の例は“ハンドブツク・オ
ブ・エクスペリメンタル・イムノロジー
（Handbook of Experimental Immunology）”、
第３版、１〜11頁、ブラツクウエル・サイアンテ
イフイツク・パブリケーシヨンズ（Ｂ−lackwell
Scientific Publications）、1978年に記載されて
いる。該文献には担体とハプテンとの好適な結合
法も挙げられている。本発明範囲の優れているハ
プテン担体は例えば牛−又はヒト血清アルブミン
等のような種々の由来の血清アルブミン並びにエ
デスチンである。 抗体形成に使用した接合体が結合阻害試験に使
用した接合体と同じハプテン担体を含有する場
合、ハプテン担体に対する交叉反応は試験におい
て、本来重要なハプテンとの結合反応の測定前に
ハプテン担体に対して作用する抗体の沈澱に必要
な濃度のハプテン担体を抗体フラクシヨンに添加
することにより選択的に遮弊することができ、こ
の場合混濁形成の測定（TINIA、NINIA）によ
る試験を実施する際に初めにヒダントイン−接合
性抗体とハプテン担体との交叉反応により生じる
沈澱を例えば遠心分離又は過により除去する。 免疫化にもしくは結合阻害試験に使用するヒダ
ントイン−接合体は、ヒダントインを脂肪族又は
芳香脂肪族のカルボン酸に結合させ、カルボン酸
に由来する部分のカルボキシル基をハプテン担体
と結合させることにより製造すると優れている。
このためには炭素原子少なくとも２個、殊に炭素
原子４〜16個を有する脂肪酸並びにアルキル側鎖
基を有する芳香族カルボン酸が好適であることが
明らかになつた。芳香族環に炭素原子１〜４個の
アルキル基を有する安息香酸誘導体が特に好適で
ある。代表的な例はメチル安息香酸、エチル安息
香酸及びプロピル安息香酸である。これらの芳香
脂肪族カルボン酸のオリゴマー、例えばメチルベ
ンゾエート−メチル安息香酸も同様に好適であ
る。 本発明の場合免疫学的にハプテンであるヒダン
トインとカルボン酸との間の結合は公知方法で活
性カルボン酸誘導体の使用下に生ぜしめることが
できる。ハロゲン化カルボン酸、特に水性アルコ
ール性媒体中のω−ブロムカルボン酸を使用し又
は相応するハロゲン化カルボン酸エステルの場合
には無水媒体中で使用し、次いでけん化すると優
れている。最高の結果はω−ブロムカルボン酸エ
ステルを使い、次いでけん化することにより達成
され、この場合には50％までの収率が得られた。
水性アルコール性媒体中のヒダントインとの反応
は高められた温度、有利には沸点で行なう。カル
ボン酸エステルを使用する場合、溶剤として有利
に極性の有機化合物、例えばジメチルホルムアミ
ド、ホルムアミド、テトラヒドロフラン等を使用
する。反応をメタノラートとの反応により得られ
るヒダントインのナトリウム塩から行なうと有利
である。生成物のけん化は水性アルカリ性媒体中
で穏やかに加温しながら行なうことができる。結
合はヒダントインの３位の窒素（未置換）以外に
５位の炭素（R³及びR⁴＝Ｈ）を介してｐ−安息
香酸ジアゾニウム塩によるジアゾ化により行なう
ことができる。免疫化並びに結合阻害試験には３
位の窒素を介して架橋されたヒダントイン接合体
が優れている。 有利に、ハプテン担体との結合は水性有機媒体
中でアミン及びクロル蟻酸エステルの存在におい
て又はカルボン酸のヒドロキシスクシンイミドエ
ステルの製造により、次いでこのエステルを蛋白
質又は他の担体とPH７〜９で反応させることによ
り行なう。反応媒体としては水／ジオキサンが特
に好適であることが明らかになつた。 このようにして得られたヒダントイン接合体は
抗血清を形成するための免疫原としてあるいは直
接結合阻害試験に使用する。 抗血清の形成に当り当業者に公知の方法により
選択した動物種の接合体を投与する。免疫原をフ
ロイントアジユバンドと一緒に使用して免疫応答
を強化する。 一般に、抗体の形成には抗体形成するすべての
生物を使用することができる。羊を使うと優れて
いる。細胞培養から得られるモノクローン抗体も
また該当する。 本発明の範囲において抗体という用語は精製抗
体を抗血清も包含し、後者から得られる免疫グロ
ブリンフラクシヨン並びに抗体フラグメント、例
えばＦ（ab₂）Fab及びFv−フラグメントである。 ヒダントイン接合体とヒダントイン接合体抗体
との間の結合反応に対する１−メチルヒダントイ
ンの阻害作用は公知の免疫学的方法により直接測
定することができる。標識化した抗体もしくは抗
原を使用する方法、例えばRIA又はEIA（この場
合は実施形ELISA又はEMIT）、接合体と抗体と
の間の免疫沈澱の阻害の濁り測定（TINIA原理）
もしくは相応する比濁分析法（NINIA原理）等
が例として挙げられる。 更に、凝集阻止試験（PACIA＝Particle
Counting Immuno−Assay）及び補体結合反応
は適用することができる。これらすべての方法は
当業者に公知であり、本明細書では詳説しない。
EIAの実施形に関しては“クリニカル・キミカ・
アクタ（Clin.Chim.Acta）”、81巻、１〜36頁
（1977年）及び“J.Clin.Chem.Clin.Biochem.”、
18巻、197〜208頁（1980年）に記載されている。 酵素標識化の場合、有効に使用される酵素、例
えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスフアターゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、グルコース−６−ホスフエート−デヒドロ
ゲナーゼ及びルシフエラーゼが挙げられる。補酵
素による標識化には例えばNAD、NADPもしく
はそれらの還元型が該当する。抗体もハプテンも
標識化することができる。 前記の方法のうち優れている方法は、免疫沈澱
を所定の時間間隔で濁り測定することにより結合
反応の阻害を測定することである。 他の優れている方法は、非結合のハプテン担体
−ヒダントイン接合体を標識化抗体、特に有利に
酵素標識化した抗体で逆滴定することにより、標
識化物質の結合分又は非結合分を測定することに
より結合反応の阻害を測定するものである。この
際には、例えば放射性物質（RIA）、酵素もしく
は補酵素（EIA）、螢光（FIA）、スピン標識化
〔“Nature New Biology”、236巻、93〜94頁
（1972年）〕による標識化が好適である。標識化抗
体としては標識化した拮抗体も使用することがで
きる（二重抗体法）。 本発明の他の目的は、クレアチニンを免疫学的
に測定するための試薬であり、これはクレアチニ
ン−イミノヒドロラーゼ、ヒダントイン、殊に１
−メチルヒダントインと第１ハプテン担体との接
合体に対する抗体、ヒダントイン、殊に１−メチ
ルヒダントインと、第１ハプテン担体とは基本的
に交叉反応しない第２ハプテン担体との接合体及
び緩衝物質を含有することを特徴とする。 本発明による試薬は免疫沈澱を促進する物質を
含有していてもよい。それにはポリエチレングリ
コール単独で又は表面活性物質と一緒のそれが特
に好適である。ポリエチレングルコールとしては
分子量200〜20000のものが好適であり、分子量
6000±2000が優れている。試薬中のポリエチレン
グルコールの好適な濃度は０〜８％、殊に１〜４
％である。 抗体成分及び適用した標識化に関しては前記の
記載が本発明による試薬にも該当する。 濁り測定法に関しては本発明ではクレアチニン
−イミノヒドロラーゼ0.05〜100U／ml、１−メ
チル−ヒダントイン：血清アルブミン＝２：１〜
30：１のモル比の、ｐ−メチル安息香酸のような
芳香脂肪族カルボン酸を介して架橋された１−メ
チルヒダントインとヒト−又は牛血清アルブミン
とからの接合体0.5〜500μｇ／ml、ハプテン接合
体結合部位に対してモル比0.1〜10の、酪酸のよ
うな脂肪族カルボン酸を介して架橋した１−メチ
ルヒダントインとエデスチンとの接合体に対する
抗体、ポリエチレングルコール０〜８％並びに緩
衝物質（PH４〜10）0.05〜１モル／を含有する
試薬が優れている。 EMIT 法の場合、本発明による試薬は活性レ
セプター部位に関して１−メチルヒダントイン−
ハプテン担体接合体に対する抗体10^-4〜10^-14モ
ル／、１−メチルヒダントイン−マレートデヒ
ドロゲナーゼ接合体10^-4〜10^-14モル／、クレ
アチニン−イミノヒドロラーゼ0.05〜100U／ml
オキサル酢酸0.05〜50ミリモル／、ホスフエー
ト緩衝剤（PH６〜8.5）５〜200ミリモル／及び
NADH0.05〜0.4ミリモル／を含有すると有利
である。 本発明範囲では緩衝物質としてはPH範囲４〜
10、殊に６〜９で有効な公知のものを使用するこ
とができる。溶解した試薬中の緩衝剤濃度は
0.005〜1.0モル／、殊に0.01〜0.2モル／であ
る。範囲0.03〜0.07モル／が特に優れている。 試験における抗体濃度は約10^-4〜10^-14モル／
、殊に10^-6〜10^-12モル／であると有利であ
り、その際モル／とは活性レセプター部位であ
る。 本発明方法を実施するに当り分析すべき溶液を
直接試薬に添加することができる。クレアチニン
が高い濃度で存在する場合、予め試料を水で稀釈
すると有利である。 一般に、測定を温度10〜50℃、殊に15〜40℃で
実施することができる。 ヒダントイン接合体の製造は公知方法で、例え
ば“ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）”、228巻、713〜727頁
（1957年）に記載された混合無水物の操作法で行
なうことができる。酵素による標識化も同様であ
る。 次い本発明を実施例により詳説する。その際に
使つた略語は次の通りである： RSA牛血清アルブミン HSAヒト血清アルブミン RIAラジオイムノアツセイ EMITエンチーム・マルチプライド・イ
ムノアツセイ・テクニツク
（Enzyme multiplied
immunoassay technique） FLISAエンチーム・リンクド・イムノソ
ルベント・アツセイ（Enzyme
linked immunosrbent assay） TINIAタービジテイ・インヒビシヨン・
イムノアツセイ（Turbidity
inhibition immunoassay） NINIAネフエロメトリツク・インヒビシ
ヨン・イムノアツセイ
（Nephelometric inhibition
immunoassay） BP塗布用緩衝剤 IP恒温保持用緩衝剤 Tween20ポリオキシエチレン−ソルビタン
モノラウレート DMFジメチルホルムアミド WP洗浄用緩衝剤 SP基質用緩衝剤 PNPP−Naｐ−ニトロフエニルホスフエート
−Na RT室温 APアルカリ性ホスフアターゼ AP−TCアルカリ性ホスフアターゼ−試験
組成物 チナクアント（Tinaquant）−FN−緩衝剤：
Na、Ｋ−ホスフエート 66ミリモル／ PH8.0 EDTA 10ミリモル／ Brij −35 0.4％ NaN₃ 0.1％ ポリエチレングルコール6000
3.0％ EIA酵素イムノアツセイ (A) ヒダントイン接合体の製造 １−メチルヒダントイン11.4ｇ（100ミリモ
ル）を熱い無水メタノール中に溶解しかつ当量
のナトリウムメチラートを加える。その後メタ
ノールを留去させ、残る残渣を真空中で乾燥さ
せ、次いでDMF200ml中に採る。80〜100℃に
加熱する。この溶液に撹拌下に徐々にγ−ブロ
ム酪酸エチルエステル又はｐ−ブロムメチル安
息香酸120ミリモル／を添加する。その後、
更に５時間100℃で撹拌し、冷却しかつ生成し
た臭化ナトリウムを別する。液を濃縮しか
つイソプロパノール100ml中に採る。その後、
新たに沈澱した臭化ナトリウムを別する。
液を1/4に濃縮しかつ４℃に冷却すると、白色
物質が晶出する。結晶を水／メタノール（１：
１）から再結晶させる。生成したエステルを
1N−NaOHでけん化する。遊離酸をイソプロ
パノールから再結晶させる。 １ １−メチル−３−カルボキシブチリル−ヒ
ダントイン、融点102〜104℃、収率61％ ２ １−メチル−３−（ｐ−カルボキシフエニ
ル）−メチル−ヒダントイン、融点167〜170
℃、収率67％ 牛血清アルブミンとの結合には、牛血清アル
ブミン3.6ｇを水／ジオキサン（１：１）250ml
中に溶解し、1N−NaOH5.6mlを加え、それに
より溶解を開始し、次いで４℃に冷却する。こ
の溶液にジオキサン60ml及びDMF3ml中の１−
メチル−３−（ｐ−カルボキシフエニル）−メチ
ル−ヒダントイン1.7ｇ、トリブチルアミン1.7
ml及びクロル蟻酸イソブチルエステル0.95mlの
溶液を滴加する。このバツチを４℃で24時間撹
拌し、その後流動する脱塩水に対して36時間透
析する。その後で溶液を凍結乾燥させる。 エデスチンと結合させるに当り、前記の方法
と同様に、だが牛血清アルブミンの代りにエデ
スチンを及び１−メチル−３−（ｐ−カルボキ
シフエニル）−メチル−ヒダントインの代りに
１−メチル−３−カルボキシブチル−ヒダント
インを使用する。 (B) 抗血清の製造 抗血清を取得するために使用した動物の免疫
化は次のように実施する： 動物種：羊 免疫原：１−メチル−３−カルボキシブチリル
−ヒダントイン−エデスチン接合体 免疫化：

【表】 (C) 抗血清の後処理 羊抗血清に室温でアエロジル（無定形珪酸）
１％を加え、約２時間撹拌し、遠心分離しかつ
沈澱を廃棄する。 上澄みに徐々に固体の硫酸アンモニウムを
1.8モル／まで添加し、かつ４℃で数時間撹
拌する。混合物を遠心分離しかつ上澄みを廃棄
する。沈澱を出発容量の75％に調節し（Ｋ−レ
ホスフエート（PH7.0）50ミリモル／、
NaCl100ミリモル／、NaN₃0.05％）、その後
約24時間0.15モル／NaClに対して透析し、
次いで場合により遠心分離する。 上澄みを約８〜10時間３ミリモル／−HCl
に対して透析し、その際透析溶液を交換する
（容量比１：100）。生成した沈澱を遠心分離し
かつ廃棄する。 次いで、10ミリモル／−Ｋ−ホスフエート
（PH7.0）、150ミリモル／−NaClに対して約
12時間にわたつて逆透析する。（容量比１：
100）。生成した沈澱を遠心分離しかつ廃棄す
る。 例 １ TINIA原理 (a) 試薬： クレアチニン溶液：チナクアント−FN−緩衝
剤１dl当り0.2〜1000mgの濃度 クレアチニン−イミノヒドロラーゼ １−メチル−３−カルボキシブチリル−ヒダ
ントイン−エデスチン接合体に対する抗血清、
チナクアント−FN−緩衝剤で１：５に稀釈、
濁りを遠心分離により除去 １−メチル−３−（ｐ−カルボキシフエニル）−
メチル−ヒダントイン−RSA接合体（２mg／
−チナクアント−FN−緩衝剤） (b) 試験バツチ： キユベツト（ｄ＝１cm）中に、１本当りクレ
アチニン−イミヒドロラーゼ10U、種々の濃度
のクレアチニン溶液10μあるいは盲検用のチ
ナクアント−FN−緩衝剤10μを含有する稀
釈抗血清１mlをピペツト添加しかつ25℃で10分
間恒温保持する。 次いで、それぞれメチルヒダントイン−
RSA接合体溶液10μをピペツト添加しかつ混
濁の増加をメチルヒダントイン−RAS接合体
の添加後に366nｍで測光法により測定すする
（E₁開始前、E₂開始して５分後）。第１図はそ
のようにして測定した検量線であり、クレアチ
ニン濃度に対する吸光度差をプロツトした。 例 ２ ELISA原理〔“J.of.Immunology”、123巻、
1548〜1550頁（1979年）からの方法により〕 (a) 試薬： 塗布用緩衝剤（BP） Na₂CO₃（PH9.3〜9.5）、0.2モル／恒温保持
用緩衝剤（IP） Ｋ−ホスフエート（PH7.2）、0.05モル／
NaCl、0.1モル／ グリシン１％ Tween20 0.05％ NaN₃ 0.02％ 洗浄用緩衝剤（WP） NaCl、0.15モル／ Tween20 0.05％ NaN₃ 0.02％ 基質用緩衝剤（SP） AP試験 錠剤１個／緩衝剤76ml又はPNPP−Na17
mg／緩衝剤10ml123854からAPとウサギ−抗羊
IgGからの接合体クレアチニン−イミノヒドロ
ラーゼ (b) 試験バツチ： 微量滴定板をメチルヒダントイン−RSA接
合体（0.50μｇ／BPmlもしくは盲検用の
RSA0.50μｇ／BPml）で塗布し、RTで約16時
間恒温保持し、十分に吸引する。その後、
IP300μを加え、恒温保持し（１時間）再度
十分に吸引し、その後洗浄緩衝剤30μを加
え、十分に吸引する。次いで、メチルヒダント
イン抗血清を負荷する。そのため、クレアチニ
ン−イミノヒドロラーゼ10U／mlを含有する抗
血清1000μ（IP中１：200〜１：2000に稀釈）
をクレアチニン試料10μあるいはIP10μ
（盲検用）とRTで30分間恒温保持し、このよ
うにして得られた抗血清稀釈液200μを前記
の塗布した微量滴定板上に加え、60分間密封し
て（プラスチツク製袋）放置し、十分に吸引
し、WP300μを加えかつ再度十分に吸引す
る。 接合体塗布のため、AP150ｍＵ／IPmlを含
有するウサギ−抗羊IgG−AP接合体200μを
処理した微量滴定板に加え、37℃に２時間保持
し、その後十分に吸引しかつWP1回当り300μ
で２回洗浄する。 発色させるために基質用緩衝剤200μを加
えかつ混合物を30〜60分間恒温保持する。微量
滴定板からの試験溶液150μをNaOH（0.1モ
ル／）500mlと共に盲検値に対して405nｍで
測定して評価を行なう。第２図は異なる濃度の
クレアチニンで得られる検量線である。 例 ３ EMIT原理 10U／mlクレアチニン−イミノヒドロラーゼを
含有する50ミリモル／−Ｋ−ホスフエート緩衝
液（PH7.5）2.00mlに次のものを混合する： 試料（又は盲検用にH₂O） 0.02ml 緩衝溶液（50ミリモル／−ホスフエート（PH
7.5）0.01ml）中の0.7ミリモル／−オキサル酢
酸 1.00ml メチルヒダントイン−エデスチン抗血清（結合部
位濃度） 410^-7モル／ 1.4・10^-2モル／−NADH 0.04ml 30℃で20〜30分間恒温保持した後で１・10^-8モ
ル／−１メチルヒダントイン−マレートデヒド
ロゲナーゼ接合体0.05mlを加えかつ酵素活性を
340nｍ及び30℃で分光測光法により△Ｅ／分と
して測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図はTINIA原理に基いて測定したクレア
チニン濃度と吸光度差との相関関係を示す検量
線、第２図はELISA原理に基いて測定したクレ
アチニン濃度と吸光度差との相関関係を示す検量
線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クレアチニンを１−メチルヒダントインに変
   換し、形成された１−メチルヒダントインを、一
   般式： ［式中R¹、R²、R³及びR⁴は相互に関係なくそれ
   ぞれＨ原子、Ｃ原子１〜３個を有するアルキル基
   またはフエニル基を表わす］の第１ヒダントイン
   と抗体形成に好適な第１ハプテン担体との接合体
   に対して作用する抗体と水性媒体中で恒温保持
   し、一般式の第２ヒダントインと第２ハプテン
   担体との接合体と反応させ、かつ抗体と第２ハプ
   テン担体を含有するヒダントイン接合体との間の
   結合反応の阻害を測定し、この際前記の抗体と接
   合体とのうちの一方の成分は固相又は溶解形であ
   り、他方の成分は溶解形であることを特徴とする
   クレアチニンの免疫学的測定法。 ２ クレアチニンの１−メチルヒダントインへの
   変換は水溶液中で抗体との恒温保持の前又はその
   間に行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ クレアチニンを酵素的に１−メチルヒダント
   インに変換する特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の方法。 ４ クレアチニンをクレアチニン−イミノヒドロ
   ラーゼ（EC.3.5.4.21）で１−メチルヒダントイン
   に変換する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 第１ヒダントインが第２ヒダントインと同一
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 第１及び第２ヒダントインとして１−メチル
   ヒダントイン（R¹＝CH₃、R²〜R⁴＝Ｈ）を使用
   する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ ハプテン担体として蛋白質、ポリサツカリ
   ド、リポポリサツカリド、ラテツクス粒子、活性
   炭、ポリリシン又はウイルスを使用する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ８ 蛋白質としてヒト血清アルブミン、牛血清ア
   ルブミン、β−ガラクトシダーゼ又はエデスチン
   を使用する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 第１ハプテン担体と第２ハプテン担体が異な
   つている特許請求の範囲第７項又は第８項記載の
   方法。 １０ 第１ハプテン担体としてエデスチンを使用
   する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 第２ハプテン担体としてヒト血清アルブミ
   ン、牛血清アルブミン、β−ガラクトシダーゼ又
   はラテツクスを使用する特許請求の範囲第１０項
   記載の方法。 １２ ハプテン担体への架橋員としての脂肪族又
   は芳香脂肪族カルボン酸を介して結合しているヒ
   ダントインを使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １３ カルボン酸架橋員が炭素原子少なくとも２
   個を含有する接合体を使用する特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １４ 架橋員としてアルキルフエニルカルボン酸
   又はそのオリゴマーを含有する接合体を使用する
   特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ 抗体形成に使用したヒダントイン接合体の
   架橋員が結合阻害試験に使用したヒダントイン接
   合体のそれと異なる特許請求の範囲第１項ないし
   第１２項から第１４項までのいずれか１項記載の
   方法。 １６ 抗体形成に使用したヒダントイン接合体の
   架橋員として脂肪族カルボン酸を使用する特許請
   求の範囲第１項ないし第１２項から第１５項まで
   のいずれか１項記載の方法。 １７ 結合阻害試験に使用したヒダントイン接合
   体の架橋員としてアルキルフエニルカルボン酸を
   使用する特許請求の範囲第１項ないし第１２項か
   ら第１５項までのいずれか１項記載の方法。 １８ ハプテン担体１分子当りヒダントイン１〜
   50分子を含有する接合体を使用する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 １９ 抗体を抗血清、それから得られる免疫グロ
   ブリンフラクシヨンの形で、モノクローン抗体と
   して又は抗体フラグメントとして使用する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ２０ 結合反応の阻害を所定の時間間隔で免疫沈
   澱を比濁分析測定又は濁り測定により測定する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ２１ 結合反応の阻害の測定を非結合のハプテン
   担体−ヒダントイン結合体を標識化抗体で逆滴定
   して、標識化物質の結合割合と非結合割合を測定
   することにより行なう特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ２２ 酵素−又は補酵素標識化した抗体を使用す
   る特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３ 放射性又は螢光標識の抗体を使用する特許
   請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４ 羊抗体を使用する特許請求の範囲第１項か
   ら第２３項までのいずれか１項記載の方法。 ２５ 接合体をフロイントアジユバントと一緒に
   投与して取得した抗体を使用する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ２６ 抗体生成に当り、抗体生成に使用したハプ
   テン担体と交叉反応するハプテン担体を含有する
   ヒダントイン接合体を使用し、遊離ハプテン担体
   を抗体溶液と混合し、その際に形成する沈澱を分
   離しかつ得られた上澄みを抗体溶液として試験に
   使用する特許請求の範囲第１項から第２５項まで
   のいずれか１項記載の方法。 ２７ クレアチニン−イミノヒドロラーゼ、一般
   式： ［式中R¹、R²、R³及びR⁴は相互に関係なくそれ
   ぞれＨ原子、Ｃ原子１〜３個を有するアルキル基
   又はフエニル基を表わす］のヒダントインと第１
   ハプテン担体との接合体に対して作用する抗体、
   一般式のヒダントインと、、基本的に第１ハプ
   テン担体と交叉反応しない第２ハプテン担体との
   接合体及び緩衝物質を含有することを特徴とする
   クレアチニンの免疫学的測定用試薬。 ２８ １−メチルヒダントインに対する抗体及び
   １−メチルヒダントインとハプテン担体との接合
   体を含有する特許請求の範囲第２７項記載の試
   薬。 ２９ ポリエチレングリコールを含有する特許請
   求の範囲第２７項又は第２８項記載の試薬。 ３０ 抗体が抗血清、免疫グロブリンフラクシヨ
   ン、抗体フラグメント又はモノクローン抗体とし
   て存在する特許請求の範囲第２７項から第３０項
   までのいずれか１項記載の試薬。 ３１ 抗体が標識化されている特許請求の範囲第
   ３０項記載の試薬。 ３２ クレアチニン−イミノヒドロラーゼ0.05〜
   100U／ml、１−メチルヒダントイン：血清アル
   ブミン２：１〜30：１のモル比の接合体0.5〜
   500μｇ／ml、ハプテン結合部位濃度に対してモ
   ル比0.1〜10の１−メチルヒダントイン接合体に
   対する抗体、ポリエチレングリコール0.1〜８重
   量％及びイオン濃度0.03〜0.4の緩衝物質（PH４
   〜10）を含有する特許請求の範囲第２８項から第
   ３１項までのいずれか１項記載の試薬。 ３３ クレアチニン−イミノヒドラーゼ0.05〜
   100U／ml、活性ハプテンレセプター部位に対し
   て１−メチルヒダントイン−ハプテン担体接合体
   に対する抗体10^-4〜10^-14モル／、１−メチル
   ヒダントイン−マレートデヒドロゲナーゼ接合体
   10^-4〜10^-14モル／、オキサル酢酸0.05〜50ミリ
   モル／、ホスフエート緩衝剤（PH６〜8.5）５
   〜200ミリモル／及びNADH0.05〜0.4ミリモ
   ル／を含有する特許請求の範囲第２８項から第
   ３１項までのいずれか１項記載の試薬。