CN118047830A - 一种富集泛素化蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从生物样品中富集泛素化修饰蛋白质的方法,包括下述步骤:a)提供待富集样品;b)将待富集样品用变性提取液提取蛋白质,再利用还原烷基化试剂封闭酶活位点;c)去除步骤b)获得的蛋白样本中的变性剂,利用复性液使得泛素以及泛素链再折叠,恢复正确的空间结构;d)利用人工泛素结合结构域材料亲和介质进行泛素化修饰蛋白质的富集纯化。该方法适用于不同样本的泛素化蛋白富集,适应于不同泛素链类型的UBDs富集材料进行泛素化蛋白的富集。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种高效富集泛素化蛋白的方法。
背景技术
蛋白质是生命活动的主要承担者,而蛋白质翻译后修饰使得蛋白质种类与复杂度显著增加,对于蛋白质的功能发挥重要的调节作用,因此系统解析蛋白质及其翻译后修饰对于疾病的研究尤为重要。随着蛋白质组学技术不断地成熟和发展,可以通过在大规模水平对蛋白质组的特征进行分析,包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰,蛋白与蛋白的相互作用等。其中,泛素化修饰作为真核细胞内常见的、功能多样的蛋白质翻译后修饰之一,通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)行使泛素信号的合成、编辑、传递、识别和降解等过程,并介导了细胞内的蛋白质特异性降解,维持着体内蛋白质的动态平衡。泛素化修饰广泛参与了细胞周期、免疫应答、应激反应等几乎所有的生命活动过程。
泛素-蛋白酶体系统的精确调控构成了稳定而复杂的泛素化信号网络,泛素化及其信号途径的任何突变或紊乱都可能诱发如癌症、免疫性疾病、神经退行性疾病等多种严重疾病,系统深入地研究泛素化及其修饰系统具有重要的科学意义和临床价值。因此利用泛素化组学技术全面分析蛋白质的泛素化,可进一步了解泛素化在不同生命活动过程中发挥的作用,而鉴定泛素化修饰底物群是泛素化组学研究的关键环节。
人体中泛素-蛋白酶体系统约由700多种成分组成,包括2种泛素激活酶(E1),40多种泛素转移酶(E2),600~700种泛素连接酶(E3)以及100多种去泛素化酶(DUBs)。泛素是泛素系统的核心分子,是一种由76个氨基酸组成的分子量约8.5kDa的小分子蛋白质。泛素广泛存在于所有真核细胞中,且序列高度保守。泛素蛋白本身可以作为一种信号分子,其C末端的甘氨酸的羧基与底物蛋白的赖氨酸的ε残基共价链接形成泛素化修饰。由于泛素本身携带的7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和1个N端的甲硫氨酸残基(M1)均可以继续被泛素分子修饰,形成8种不同拓扑结构的泛素链,参与不同的生物学过程。生命活动或者疾病产生的分子机制的阐明,依赖于对泛素化底物蛋白质的鉴定及其在生理和病理条件下变化的定量比较研究。然而,泛素化底物蛋白质的鉴定、被修饰底物蛋白泛素链类型的鉴别及其定量至今在技术上仍存在诸多的挑战。翻译后修饰蛋白在整体蛋白质组的含量比例是较低的,泛素化修饰只占总蛋白质组的1%甚至更低,另外由于泛素链的复杂性,修饰位点的宏观不均一与微观不均一性,造成了泛素化修饰组的丰度低、组成复杂。除此之外,泛素化修饰介导蛋白质的降解导致蛋白不稳定,同时存在去泛素化酶的作用导致泛素链易被去除。质谱对样品中高丰度的蛋白质检测的偏爱也使得低丰度的泛素化蛋白的检测受到限制,难以直接进行大规模的鉴定。
对泛素化修饰底物群进行鉴定和筛选,首先需要对泛素化蛋白进行富集,主要可以分为在蛋白层面或肽段(位点)层面的富集。对细胞或组织进行裂解获得全蛋白,在蛋白层面可以使用不同的富集材料(比如商业化的TUBEs,以及发明人之前发明的ThUBD)对泛素化蛋白进行富集,富集后酶切消化进行质谱检测,从而获得泛素化组的数据。在位点层面进行富集主要是经过胰蛋白酶等酶切后产生特异性的K-ε-GG肽,再利用免疫亲和抗体进行特异性富集纯化,最后通过质谱获得泛素化组数据。而目前在蛋白质层面常用的纯化方法包括泛素偶联标签法(如Flag、HA、Myc、His和Biotin等)、泛素抗体法和泛素亲和介质法(UBD法)。这些方法各有优势,互为补充,满足了不同场景下的纯化需求,有效的提高了泛素化蛋白质组的纯化效率。随着Peng等人利用表达His标签的酵母,在变性条件下成功的富集了酵母细胞中的泛素化蛋白并获得了较大的泛素化蛋白鉴定数据,使得标签法在泛素化研究领域得到了广泛的应用。然而,在无法插入标签的组织、器官等泛素化蛋白质组的研究中受到了较大的限制,且无法应用于临床样本的检测研究;同时,泛素过表达可能会导致非生理性的泛素化修饰,干扰蛋白质的稳态。泛素抗体亲和富集是基于抗原-抗体特异性相互作用的方法,但其对于低丰度的泛素化修饰的蛋白的亲和特异性不高,经过酶切消化之后产生的非修饰的肽段占比高,质谱鉴定时对泛素化蛋白的检测产生严重的干扰,同时大量昂贵的抗体的使用成本也是一个明显的限制因素。
针对标签法和抗体法存在的问题,不同人工泛素结合结构域的开发成为分离纯化内源性的泛素化蛋白的一个较好的选择。近年来,人工泛素结合结构域(UBDs)亲和介质作为泛素化底物的富集工具越来越受到广泛使用,UBD的纯化技术也不断地得到改良和优化。2009年,Hjerpe等人通过串联4个UBA片段,开发出并商业化了可特异性识别多聚泛素链的串联重复泛素结合实体(TUBEs),实现了自然条件下从细胞裂解物中高效纯化泛素化蛋白。2011年,Shi等利用4个串联UBA结构域作为工具富集人体内的泛素化蛋白,通过质谱鉴定实现泛素化位点的鉴定。随后,Rubel等利用改良的4个串联的UBA结构域进行泛素化蛋白的富集,得到E3泛素连接酶的底物,使得UBD富集法进一步扩展到研究泛素连接酶及去泛素化酶(DUBs)底物的鉴定中。与此同时,特异性富集K48和K63链的UBDs也被不断地广泛使用在细胞或组织中进行特定修饰的泛素化底物的富集,进一步研究特定泛素链的生物学功能及其在疾病发生发展的机制。2016年,发明人团队徐平、高媛和李衍常等系统评价了不同UBD对7种泛素链的识别能力,筛选出了高亲和力的UBD,通过构建串联杂合UBD(ThUBD)实现了泛素化蛋白的高效、无偏性富集(Gao Y,Li Y,et al.,Enhanced Purification ofUbiquitinated Proteins by Engineered Tandem Hybrid Ubiquitin-binding Domains(ThUBD).Mol Cell Proteomics.2016Apr;15(4):1381-96.),并获得了专利(专利号:ZL201410323921.1);同时,该亲和富集材料亦可以用于泛素化信号的检测,通过对其进行辣根过氧化物酶HRP的标记结合,能实现对泛素化信号的快速检测(Xiao W,Huang S,GaoY,et al.,Chemically labeled ThUBD permits rapid and super-sensitive imagingof polyubiquitination signals.Analyst.2022;147(15):3434-3443.),并获得专利(专利号:ZL201910491358.1),为泛素化蛋白的富集和检测提供了有效的工具和方法。
然而,以UBD为基础的富集和检测技术存在技术难点。UBD亲和材料识别泛素化蛋白,依赖于UBD以及泛素和泛素链正确的空间结构。泛素分子的疏水表面(比如Ile44和Ile36两个疏水表面)是泛素化信号被识别的结构基础。不同赖氨酸连接形成的泛素链空间结构各异,进而暴露不同的疏水表面,并可为特异性的泛素结合结构域(UBD)所识别。多样的泛素间连接形式形成了多样的泛素链结构。因此,现有的以UBD为富集材料进行泛素化蛋白纯化的方法,必须在非变性条件下裂解提取蛋白,尽可能的保持蛋白质的空间结构,这样UBD与泛素化蛋白才能够识别泛素以及泛素链。然而现有的纯化方法存在许多问题与挑战:(1)非变性条件提取细胞、组织等样本的蛋白不够充分,蛋白提取效率低;(2)非变性条件下,蛋白酶的活性仍然活跃,包括去泛素化酶的高活跃状态以及蛋白酶体的存在均使得泛素化的信号极易被移除,导致鉴定与定量的波动性大;(3)非变性条件下,蛋白-蛋白相互作用存在,导致大量假阳性蛋白存在。面对在富集和检测中的诸多挑战,在UBD被广泛应用的背景之下,如何克服目前传统方法的局限性与技术缺陷,如何高效富集纯化泛素化蛋白,如何保护泛素化信号不被降解,成为业界亟待解决的技术难题。能否在变性条件下提升泛素化蛋白的纯化效率,能否结合蛋白质组学的基本流程,构建新的泛素化蛋白富集与检测技术体系?
泛素作为一种热稳定性良好的小分子蛋白,具有高度结构化的天然状态,具有很强的自我折叠能力(Jackson SE.Ubiquitin:a small protein folding paradigm.OrgBiomol Chem.2006May 21;4(10):1845-53.)。大量的研究表明,泛素可以在变性条件下解折叠,经过复性再折叠之后再次折叠恢复其空间结构,且其折叠的速率很快,不依赖于二硫键(Briggs MS,Roder H.Early hydrogen-bonding events in the folding reaction ofubiquitin.Proc Natl Acad Sci U S A.1992Mar 15;89(6):2017-21.)。那么是否可以将泛素稳定性好,更容易复性的这一特性更好的利用?另外,目前尚不清楚8种不同类型的泛素链经过变性后,是否可以准确的恢复空间结构,并有效的被泛素结合结构域所识别、富集。
发明内容
为了克服传统方法的技术不足,本发明的目的是提供一种泛素化蛋白富集新方法,其较传统方法具有更高纯化效率。所述方法可以克服现有方法的不足与问题,更高效的提取蛋白质,保护泛素化信号不被降解,提升富集效率。
基于对泛素化修饰组学的积累和认知,本发明提出了新的富集方法。利用变性-复性的策略,证明了被修饰底物上的泛素和泛素链经过复性再折叠后,可以被人工UBD亲和富集材料识别并富集,该方法实现了对泛素化蛋白的高效富集。本发明方法与传统方法的步骤示意如图9。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是利用变性-复性再折叠样本处理,结合串联杂合泛素结合结构域(ThUBD)进行泛素化蛋白的富集纯化,包括以下几个步骤:
步骤1、样本经过变性条件进行蛋白质的提取,并进行还原烷基化;
步骤2、测定蛋白质浓度;
步骤3、低温超滤置换进行梯度复性再折叠;
步骤4、利用不同类型的UBD富集材料进行泛素化蛋白的富集;
步骤5、富集后的蛋白进行免疫印迹检测或者酶切消化后进行质谱检测。
本方法主要以ThUBD(Tandem Hybrid Ubiquitin-binding Domains)串联杂合泛素结合结构域为例。
在一个较佳实施方式中,本发明提供一种从生物样品中富集泛素化修饰蛋白质的方法,所述方法包括下述步骤:
a)提供待富集样品;
b)将待富集样品用变性提取液提取蛋白质,再利用还原烷基化试剂封闭酶活位点;
c)去除步骤b)获得的蛋白样本中的变性剂,利用复性液使得泛素以及泛素链再折叠,恢复正确的空间结构;
d)利用人工泛素结合结构域材料亲和介质进行泛素化修饰蛋白质的富集纯化。
本发明方法中,步骤b)所述变性提取液包含可使所述样品中的蛋白质解折叠的变性剂以及缓冲液,所述变性剂选自2~9M尿素,2~6M盐酸胍,0.5%~2%重量脱氧胆酸钠和0.5%~4%重量十二烷基硫酸钠中的一种;所述缓冲液选自pH 7.0-8.0的50~150mM Tris缓冲液或100~150mM NaCl。
本发明所述的方法中,其中步骤b)所述的还原烷基化试剂包含还原剂和烷基化试剂,所述还原剂用于打开蛋白质内的二硫键,选自2~10mM三(2-羧乙基)膦(TCEP),2~10mM二硫苏糖醇和2~10mMβ-巯基乙醇;所述烷基化试剂用于封闭蛋白质的半胱氨酸残基,选自5~15mM碘乙酰胺(IAM)和5~40mM氯乙酰胺(CAM)。
本发明所述的方法中,其中步骤c)所述的复性试剂为使得蛋白保持空间结构的非变性溶液,使用浓度为梯度降低步骤b)所述的变性剂的浓度。
在一个较佳实施方案中,其中步骤c)所述的复性试剂的浓度为将步骤b)的尿素从8M降低到4M,然后到2M,最后置换成1×PBS、50-150mM Tris缓冲液,pH 7.0-8.0,或者100-150mM NaCl;复性后通过超滤法、透析法或稀释法使得蛋白质再折叠。
本发明所述的方法中,其中步骤d)所述的亲和介质试剂选自TUBE、ThUBD以及泛素链特异性的UBD。
具体地,所述泛素链特异性的UBD包括M1线性泛素链、K48泛素链、K63泛素链的亲和富集UBD。
在建立上述方法的基础上,本发明也提供一种富集试剂盒,包括至少一种包含泛素结合结构域多肽的富集试剂,一种蛋白质变性提取液,一种蛋白质复性再折叠液。
经过对蛋白质的还原使得蛋白打开二硫键,进一步解折叠蛋白,烷基化后封闭二硫键的结合位点,避免蛋白质后续恢复空间构象后再次折叠,同时封闭酶活位点,抑制酶的高活跃状态,该过程抑制包括去泛素化酶、蛋白酶体等蛋白酶的活性;同时通过变性条件破坏蛋白与蛋白之间的相互作用;同时该过程与蛋白质组学样本制备一致。
进一步,在步骤b)之后中进行蛋白质的定量,获得蛋白浓度。确保不同样本之间的起始量相同,为后续不同样本的泛素化蛋白质定量比较提供前提基础。
在步骤c)中利用低温超滤置换进行梯度复性再折叠,缓慢去除溶液中的尿素等变性成分,使被修饰蛋白上的泛素和多聚泛素链在去除变性剂之后能够自我折叠到正确的空间结构,从而能够被ThUBD识别,其余依赖于二硫键折叠的蛋白质因在步骤a)中进行位点封闭后无法折叠。
进一步,步骤d)采用以串联杂合的泛素结合结构域(ThUBD)为代表的富集材料,进行泛素化蛋白的富集纯化,获得目的的泛素化修饰的底物群;该过程不限于ThUBD,包括商业化的TUBE,或者泛素链特异性的UBD富集材料。
更进一步,在步骤d)之后利用胰蛋白酶进行酶切消化,获得肽段后经质谱检测,获得所需的泛素化组的数据集。
与现有的技术相比,本发明由于采取以上技术方案,其具有以下优点:
1.本发明中采用的变性提取条件,相较于非变性条件能提取更多的泛素化蛋白;
2.本发明通过变性使蛋白解折叠,破坏蛋白酶体结构,同时还原烷基化,封闭酶活位点,从而抑制DUB活性,使泛素化蛋白更加稳定,不易被移除或降解;
3.本发明所采用梯度复性再折叠法,蛋白复性再折叠后,强变性条件下的泛素化信号稳定且没有明显的丢失;
4.本发明提供的富集方法较传统的富集条件,变性-复性后的泛素化信号更加稳定,不容易被降解;
5.本发明证明变性后复性再折叠,泛素分子与八种类型的泛素链亦可以恢复正确的空间结构,并被UBD所识别和结合、富集,泛素化信号总量不变;
6.本发明所提供的方法,可以富集到更多的泛素化信号,八种链的鉴定量平均提高8-9倍,且位点鉴定量提高1.74倍;
7.本发明提供的方法,相较于传统方法,具有更高的稳定性和重现性,定量变异系数平均值小于5%;
8.本发明提供的方法,同样适用于组织等样本,包括传统方法无法适用的FFPE样本;
9.本发明所提供的方法,适用于其它类型的UBDs材料(包括商业化的TUBEs),以及泛素链特异性的UBDs,比如K48-UIM,K63以及M1链的TUBE。
附图说明
图1为实施例1中定量比较不同条件下蛋白质的提取以及复性再折叠后的泛素化信号变化。其中,(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测在不同条件下蛋白质提取质量,样本为正常小鼠鼠肝;(B)采用二喹啉甲酸法(BCA法)对三种裂解条件下提取的蛋白进行浓度测定(*代表p<0.05,具有统计学差异);(C)利用ThUBD-HRP探针检测不同条件下对泛素化信号的提取效果的蛋白免疫印迹结果图;(D)为(C)的定量值;(E)SDS-PAGE检测复性再折叠前后蛋白的损失情况;(F)免疫印迹检测复性再折叠前后的泛素化信号的丢失情况;(G)为(F)的灰度值定量。
图2为实施例1中定量比较不同条件下蛋白质的提取和复性再折叠后的泛素化信号的强弱、变化及稳定性的情况。其中,(A)在37℃条件下,泛素化信号在不同时间点的稳定性的免疫印迹结果图;(B)为(A)的灰度定量的两者的比值(Ratio)曲线图。
图3为实施例2中定量比较不同样本在变性和非变性条件下提取的泛素化信号强弱。其中,(A)酵母细胞(Yeast)、(B)哺乳动物细胞(人胚胎肾细胞HEK293T)、(C)福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE组织)。
图4为实施例3中利用简单体系证明泛素链在变性-复性再折叠后仍然能够恢复合适的空间结构被串联杂合泛素结合结构域(ThUBD)所识别,并进行有效富集。其中,(A)免疫印迹实验证明ThUBD能无偏性的识别八种泛素链;(B)在简单体系中进行验证的富集的流程图;(C)银染检测富集纯化过程中的所产生的全蛋白(Input)、流穿(FT)和洗脱(Elution)样本;(D)质谱选择反应检测扫描(Selective reaction monitoring,SRM)靶向检测两种条件下富集纯化后泛素整体鉴定量;(E)八种泛素链的鉴定比值。
图5为实施例4中在全蛋白复杂体系中利用ThUBD富集泛素化蛋白的能力检测。其中,(A)在复杂体系中进行变性和非变性条件的富集的流程图;(B)免疫印迹检测ThUBD在复杂体系中富集的效果;(C)质谱SRM靶向检测两种条件下在复杂体系中富集纯化后八种泛素链的质谱信号强度及比值。
图6为实施例4中在全蛋白复杂体系中利用ThUBD富集泛素化蛋白的能力检测的质谱整体鉴定分析。其中,(A)泛素化组的蛋白整体鉴定量;(B)泛素化组中整体泛素化蛋白的占比情况;(C)两种条件下diGly(K-ε-GG)的位点鉴定情况;(D)diGly位点信号的整体分布情况。
图7为实施例5中定量比较不同批次之间变性与非变性条件下富集泛素化蛋白的稳定性。其中,(A)利用免疫印迹检测两个批次纯化后泛素化信号的强弱;(B)为(A)的灰度定量值;(C)质谱检测后12个样本的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA);(D)质谱整体鉴定量的波动性(即平均变异系数CV值分布)。
图8为实施例6中评价变性-复性再折叠的方法对于其它不同类型特异性的泛素结合结构域(UBD)的富集效果。其中,(A)-(C)分别为利用商业化的M1-TUBE、K48特异的UIM、K63-TUBE进行比较的免疫印迹结果图;(D)-(F)分别为其富集后的质谱检测定量比较结果。
图9为传统方法与本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等,除了ThUBD之外,如无特殊说明,均可从商业途径得到。ThUBD的制备引入申请号为201410323921.1的中国专利申请作为参考。
实施例1、定量比较不同条件下蛋白质的提取以及复性再折叠后的泛素化信号变化
一、变性裂解液的选择与设计
首先,为了探究不同浓度的变性剂对蛋白提取浓度的影响,使用了不同浓度的尿素(2M–9M)与不同浓度的十二烷基硫酸钠(0.5%-4%)对相同质量的鼠肝进行提取,采用BCA法对蛋白的浓度进行测定,并计算蛋白质的提取效率。每一种成分条件均以0.02g鼠肝作为起始材料,加入相同体积(200μL)的裂解液进行蛋白质的平行提取,结果如表1所示,组织的提取效率均在10%左右,与文献中报道的组织蛋白的提取效率相当(Lu T,Qian L,etal,.Tissue-Characteristic Expression of Mouse Proteome.Mol CellProteomics.2022Oct;21(10):100408.)。对变性裂解液的成分进一步的评价。
表1:变性裂解液的成分、浓度和蛋白提取效率一览表
设计两种不同变性程度的裂解液,分别为强变性(Strong,S)裂解液和中变性(Middle,M)裂解液。同时与非变性(Weak,W)裂解液,三者进行后续的实验比较。组合了尿素、SDS以及缓冲盐成分,裂解液的成分如下表(表2)所示:
表2:三种裂解液的成分一览表
在变性裂解液成分中,使用常用的蛋白质变性试剂包括尿素(使用浓度2-9M),盐酸胍(使用浓度2-6M),脱氧胆酸钠(使用浓度0.5%-2%),十二烷基硫酸钠(使用浓度0.5%-4%)等,确保蛋白质解折叠;本发明以尿素(Urea)为例,浓度为8M,结合1%的十二烷基硫酸钠(SDS)等去垢剂,加入基础的缓冲成分。尿素可以使蛋白充分变性解折叠,基础缓冲成分如盐(Tris和NaCl)可以提供合适的裂解环境,去污剂(SDS)的使用可以充分的破坏膜的结构,使难溶于水的蛋白更加易溶。在所有裂解体系中,抑制酶活性的抑制剂:苯甲基磺酰氟(PMSF)主要用于抑制丝氨酸蛋白酶的活性;使用常用的蛋白质还原烷基化试剂,包括还原试剂三(2-羧乙基)膦(TCEP,使用浓度2-10mM),二硫苏糖醇(使用浓度2-10mM),β-巯基乙醇(2-10mM),用于打开蛋白质内的二硫键;常用的烷基化试剂包括碘乙酰胺(IAM,使用浓度5-15mM),氯乙酰胺(CAM,使用浓度5-40mM),封闭蛋白质的半胱氨酸残疾。本发明以TCEP和氯乙酰胺(CAM)为例,用于抑制半胱氨酸蛋白酶的活性,在变性裂解液中额外加入TCEP和更高浓度的CAM用于在蛋白质释放时立刻进行还原烷基化。
二、小鼠肝脏组织全蛋白提取
取6-8周龄的C57BL/6的小鼠的肝脏,对其进行灌注以去除血液污染。灌注后取小鼠的肝脏组织进行杂质清洗后液氮速冻,可移至-80℃直至后续的实验。称取相同质量的肝脏组织,装至2毫升的加厚研磨管中,内提前放置一颗5毫米和两颗3毫米的研磨钢珠,按照每0.2毫克组织对应1毫升裂解液的比例加入相应比例的裂解液。利用低温冷冻研磨仪在-10℃冷冻研磨10次,研磨结束后尽可能全部转移至新2毫升离心管中以去除研磨钢珠,用非接触超声仪在低温超声10分钟(工作4秒,停止4秒,总时间10分钟,功率为80%),超声后最高转速(14,800转/分,rpm)离心10分钟后取出上清。上述所有操作步骤均在低温状态下进行,以避免蛋白质的降解。
三、小鼠肝脏全蛋白进行SDS-PAGE质检及BCA蛋白质浓度定量
取等量小鼠肝脏全蛋白样本(步骤二),加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(缓冲液的溶剂为水,溶质及其浓度如下:10% SDS(w/v,质量/体积),50%甘油(v/v,体积/体积),0.5%溴酚蓝(w/v,质量/体积),0.25M Tris-HCl,pH 6.8),使其浓度为1×,经过在10mM三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)和40mM氯乙酰胺(CAM)常温反应15分钟充分还原烷基化。经10% SDS-PAGE电泳分离后,考马斯亮蓝染色,检测所提取的蛋白质的纯度和浓度。结果如图1A所示,条带较为清晰,三种条件下提取的条带基本一致,但变性条件下似乎提取到高分子量的蛋白较多。
取等量小鼠肝脏全蛋白样本(步骤二),按25倍和50倍的稀释比例进行稀释,每种条件下均设置三个技术重复。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定,在562纳米(nm)处进行测量,经由Excel处理后获得蛋白浓度。结果如图1B所示,三种条件下所提取的蛋白浓度相差不大,但变性条件提取的较多。三组重复所产生的6个数据,使用单因素方差分析one-wayANOVA进行两两比较统计学差异,如结果所示,S和M、M和W之间不存在差异,但S和W两组间P<0.05,存在统计学差异。
四、利用免疫印迹技术检测三种条件下所提取的泛素化信号强弱
取等量还原烷基化后的蛋白(步骤三),经由8% SDS-PAGE电泳分离后,转移至0.45微米(μm)的硝酸纤维素(NC)膜上,半干转恒压15伏特(V)转移50分钟,丽春红染色后用TBST配制的10%脱脂牛奶进行封闭1小时。使用辣根过氧化物酶HRP标记的ThUBD蛋白,按照1:1000稀释至10%的脱脂牛奶中(TBST配制),室温孵育2小时,TBST洗膜3次(10分钟/次)后进行ECL化学发光显影。依照显影程序进行不同梯度时长的曝光。结果如图1C所示,在短时间10秒及长时间120秒曝光,相同蛋白量的起始下,变性条件下的泛素化信号明显高于非变性条件,且强变性条件下更强。将所获得的结果导入Image J软件中进行灰度定量比较,扣除统一背景后,得到各个泳道所产生的灰度强度的值,以W的值为1,将S与W之间进行比率换算。将所得到的值进行柱状图绘制后得到如图1D所示的结果,实验设置三组技术重复以获得误差值,利用单因素方差分析进行两两之间的比较获得统计学差异结果,结果表明三种条件下两两之间存在显著的差异。
五、设计梯度复性的溶液,分别为含有8M、4M、2M、0M尿素的四种溶液。复性液的成分如下表(表3)所示:
表3:梯度复性液的成分一览表
配制表3中所涉及的四种梯度复性液,此步骤采用10kDa超滤管在低温条件下进行超滤置换法缓慢梯度复性进行泛素化蛋白复性再折叠。此实施例中所涉及三种条件下提取的蛋白均进行超滤复性,虽然传统在非变性条件下进行富集不需要经过此步骤,但在此实施例中为了平行比较三者经过超滤后的损失,同样将非变性条件下提取的蛋白利用溶液4在同等条件下进行超滤。超滤复性法的具体实施步骤为:取步骤二中所获得的全蛋白,对在变性条件下提取的蛋白质进行还原烷基化处理。将三种蛋白液分别加入至10kDa的超滤管中,分别向变性蛋白中加入5倍体积的溶液1,非变性的蛋白加入同等体积的溶液4(后续非变性蛋白管每次均加入与变性蛋白管等体积的复性液),在4℃进行离心至体积浓缩至原体积或更少(注意不要体积太小,避免蛋白不溶析出),重复一次后加入5倍体积的溶液2,以此类推,直至溶液4。每次置换均记录清楚剩余体积与加入的复性液体积,以便于后续计算蛋白液中剩余的尿素及SDS的含量,直至尿素浓度达到万分之一及以下时可以记为忽略不计以继续后续实验。超滤结束取出复性后的蛋白,高速离心后分离沉淀和上清液。记录复性再折叠前后的体积比,以便于后续实验计算。将上清液取适量进行上样前处理,沉淀用20μL 1×SDS上样缓冲液在100℃煮10分钟,离心取上清全部用于SDS-PAGE验证。
六、利用SDS-PAGE和免疫印迹技术进行复性再折叠前后蛋白及泛素化信号验证
取同等体积比例复性再折叠前后蛋白液经过10% SDS-PAGE电泳分离,考马斯亮蓝染色进行复性前后蛋白量及沉淀的比较。染色结果如图1E所示,强变性条件和非变性条件下的蛋白几乎没有损失,中变性条件下的蛋白复性后沉淀较多。
同样地,取等体积比的蛋白进行免疫印迹,验证再折叠前后泛素化信号的强弱。如步骤四所述步骤进行,结果如图1F所示。对其信号的灰度进行Image J定量,扣除背景后将结果绘制成如图1G所示的柱状图,证实了强变性条件下再折叠前后的泛素化信号无明显变化,但中变性和非变性条件下的泛素化信号丢失较多,因此可以说在复性再折叠的过程中强变性条件对泛素化信号没有明显的影响。
注:只有实施例1中的非变性条件下的蛋白经过超滤处理,其余实施例中非变性条件下提取的蛋白质均不经过超滤处理,直接进行后续实验。
七、定量比较经过复性再折叠后的泛素化信号与非变性条件下的稳定性
为了验证变性-复性后的泛素化信号是否更加稳定,各取5份等量的再折叠后蛋白和非变性条件下提取的蛋白,用表3中提及的溶液4稀释至相同的浓度。置于37℃恒温培养箱中孵育,在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时,取出对应的样本加入2×SDS上样缓冲液,混匀置于-30℃直至后续的免疫印迹验证。实验结果如图2A所示,将每个泳道进行ImageJ灰度定量后,各组以0小时的值为1,进行比值分析。将两种条件下信号的变化曲线进行绘制,结果如图2B所示(红色为强变性实验组的信号变化曲线,蓝色为非变性条件下的信号变化曲线。实验结果显示了经过变性-复性后的泛素化信号在37℃的条件下,4小时内也不易降解,但非变性条件下的泛素化信号4小时后几近丢失。证明了经过复性再折叠后的泛素化信号相较于在非变性条件下更加稳定,说明封闭酶活位点效果显著。
实施例2、定量比较不同样本在变性和非变性条件下提取的泛素化信号强弱
一、提取酵母细胞全蛋白:
在酵母对数生长期(OD600=0.2-0.6)的收集酵母沉淀,用0.1%叠氮化钠重悬细胞以充分抑制菌生长。以1OD菌(约3-5×107个细胞)能获得50微克(μg)蛋白为比例加入相应的裂解液,同时加入1-1.5倍的2μm研磨玻璃珠,置于低温冷冻研磨仪中进行震荡研磨(研磨参数:工作30秒,停止30秒,研磨30次)。研磨结束后低温高速离心取上清。
二、提取哺乳动物细胞全蛋白:
人胚胎肾上皮细胞HEK293T培养在含有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素混合液的DMEM培养基中。在37℃,5% CO2的培养箱中培养至细胞密度达到95%左右时,去掉培养基,用PBS清洗2-3遍,吹打收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入相应的预冷的裂液,重悬细胞后,利用非接触超声破碎仪低温裂解细胞(工作4秒,停止4秒,总工作时间为10分钟,功率为80%)。将裂解后的细胞裂解物在4℃,14,800转/分(rpm)离心15分钟,以清除细胞残渣,上清液用于后续的泛素化信号强弱检测。
三、福尔马林石蜡包埋(FFPE)组织蛋白获取:
将载玻片上的样本悉数刮下,置于离心管中。瞬时离心后加入1毫升二甲苯,室温26℃,300转/分(rpm)震荡10分钟,12,000×g离心3分钟去除上清,重复三次二甲苯以充分脱蜡,再利用无水乙醇梯度复水(100%、96%、70%、0%),均旋转混匀5分钟后12,000×g离心3分钟,吸干上清后利用真空旋转干燥仪干燥样本10分钟。干燥后加入裂解液,无接触超声20分钟后在99℃以300转/分(rpm)的速度震荡1小时,最后在4℃低温17000×g离心6分钟,取上清获得全蛋白裂解物。
取步骤一、二、三中获得的适量样本加入5×SDS-PAGE上样缓冲液,使其终浓度为1×,经过在10mM TCEP和40mM CAM常温反应15分钟充分还原烷基化。经过8%的SDS-PAGE分离后,利用免疫印迹技术(如步骤四所述)检测泛素化信号的强弱。
检测结果如图3A(酵母)、图3B(哺乳动物细胞293T细胞)、图3C(福尔马林固定石蜡包埋组织)所示。通过实施例2,证明了无论是酵母细胞、哺乳动物细胞在变性条件下均能提取到更多的泛素化信号,同样对于FFPE等难溶性较难提取的样本也能提取到更多的泛素化信号。
实施例3、利用简单体系证明泛素链在变性-复性后亦能够恢复合适的空间结构被ThUBD所识别,且能被有效富集
一、利用免疫印迹技术比较ThUBD与八种泛素链的亲和特性
取两份等量20ng商业化的8种二聚泛素链(Lifesensors),分子量均为16kDa,M1链由于迁移率较慢,位于其余泛素链上方。经13.5% SDS-PAGE电泳分离后,一份转移到0.2μm的硝酸纤维素膜上,湿转恒流200mA转膜60分钟,使用辣根过氧化物酶HRP标记的ThUBD蛋白,按照1:500稀释至10%的脱脂牛奶中(TBST配制),室温孵育2小时,TBST洗膜3次(10分钟/次)后进行ECL化学发光显影;一份用于银染(硝酸银法)进行显影定量作为质控标准(Loading control),最终结果如图4A所示。结果显示在接近等量的情况下,ThUBD能无偏性的识别八种泛素链。
二、ThUBD与NHS琼脂糖珠颗粒的偶联准备:
取一定量的NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒(GE公司产品,其产品目录号为17-0906-01)分别用1mM稀盐酸(HCl)洗2次,1×PBS洗3次,每次1毫升。将处理后的NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒与ThUBD蛋白按照1微升琼脂凝胶颗粒与5微克蛋白结合的比例(1μL:5μg)混合,4℃旋转反应过夜。过夜后用0.1M Tris-HCl封闭反应4h,醋酸钠(0.1M,pH 8.0)和PBS各洗涤3-4次。将ThUBD蛋白充分偶联到NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上,得到的琼脂糖凝胶颗粒重悬于1×PBS和50%(体积分数)甘油混合液中,-20℃保存待用。
三、利用简单体系证明泛素链变性-复性后能恢复合适的空间结构并被UBD所识别。
取步骤二中的偶联在NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上的ThUBD蛋白作为亲和介质。取等量的商业化的八种二聚泛素链与牛血清白蛋白BSA进行混合,均分为两份。一份经过8M尿素变性处理后经过超滤复性,一份不做处理,两份均与相同的ThUBD亲和介质进行偶联孵育2小时。孵育结束后低速离心取上清作为流穿(FT),剩下的琼脂糖凝胶颗粒用1×SDS上样缓冲液进行洗脱,作为洗脱(Elution)。均在孵育前留存部分作为全蛋白(Input)至后续的银染及质谱检测,实验流程如图4B所示。经过13.5%SDS-PAGE电泳分离后,经银染检测纯化效果。结果如图4C所示,全蛋白Input和洗脱Elution在相应位置有相同的条带,而流穿FT中没有,背景蛋白牛血清白蛋白BSA在洗脱中没有,证明在两种条件下都进行了有效的富集,且ThUBD具有明显的特异性。洗脱的剩余部分经过13.5% SDS-PAGE电泳分离后,考马斯亮蓝染色后将其对应的条带进行切胶,经过脱色、固化后添加胰蛋白酶进行胶内过夜酶解,得到酶解后的肽段。利用质谱进行SRM靶向离子检测。质谱检测结果如图4D和4E所示,整体泛素的信号在全蛋白Input和洗脱Elution中较为一致,八种泛素链在两种条件下均能检测到。
通过实施例3,证明了泛素链在变性-复性后能恢复合适的空间结构被ThUBD识别,且能被有效富集。
实施例4、在全蛋白复杂体系中利用ThUBD富集泛素化蛋白的能力检测
一、小鼠肝脏组织全蛋白裂解液制备及定量
同实施例1步骤一、二所述
二、变性条件下提取的全蛋白梯度复性
同实施例1步骤五中变性提取后复性再折叠所述
三、小鼠肝脏组织泛素化蛋白质的富集纯化
复性再折叠后蛋白和非变性条件下提取的蛋白分别与相同的ThUBD亲和介质进行偶联孵育2小时,混合液体装到纯化柱上,利用重力作用沉淀琼脂糖凝胶颗然后用洗涤缓冲液(配方:50mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.1% NP-40)清洗三次以尽量去除其中的非结合的背景蛋白,转移出凝胶颗粒后用1×SDS-PAGE电泳样品缓冲液重悬琼脂糖凝胶颗粒,100℃,煮5分钟,将结合在琼脂糖凝胶颗粒上的泛素化蛋白解离下来,上清液取少量进行8% SDS-PAGE电泳分离,银染检测富集的泛素化蛋白的纯度。同时富集的泛素化蛋白同样经8% SDS-PAGE电泳分离后,转移到NC膜上用ThUBD-HRP作为探针进行免疫印迹验证富集的泛素化蛋白。
结果显示,利用ThUBD成功的从小鼠肝脏全蛋白裂解物中富集到了泛素化蛋白(如图5B所示):与总细胞蛋白质(图5B Input)相比,富集的泛素化蛋白质(图5BElution)在带型上出现了明显的变化,具有规律性的分子量跃迁,而且在胶图上大分子量部分形成特征性弥散条带。利用ThUBD进行免疫印迹检测发现,富集后的样品中有明显的泛素化信号,进一步证明了均能进行有效富集,但从信号强弱上来看,变性条件下富集的泛素化信号明显强于非变性条件。
四、小鼠肝脏细胞泛素化蛋白质样品的酶解
通过上述操作富集的泛素化蛋白质经10% SDS-PAGE电泳分离后进行切胶。胶条切为1mm3的颗粒,50mM碳酸氢铵和30%(体积分数)乙腈混合液对胶粒进行脱色,100%乙腈脱水干燥后以10ng/μL的胰蛋白酶(trypsin)消化12-16小时。消后加入5%(体积分数)甲酸和50%(体积分数)乙腈的混合液终止消化,13,300转/分(rpm)离心后收集上清,加入适量乙腈,涡旋数分钟,13,300转每分离心1分钟后收集上清,再次加入乙腈,重复涡旋离心操作,直至凝胶颗粒中液体抽干,胶粒完全变硬。将得到的肽段溶液在真空干燥仪器中完全蒸干。
五、色谱-质谱联用分析鉴定小鼠肝脏细胞泛素化蛋白质及鉴定结果
将步骤四中所获得的蒸干后的肽段样品用5%(体积分数)乙腈和1%(体积分数)甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解,取适当体积进行色谱-质谱联用分析,具体参考文献为Xu,P.;Duong,D.;Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phasechromatography for shotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50中记载的方法。其中对八种泛素链的检测采用SRM靶向检测以测量其中的泛素链的占比。
六、肝脏组织的泛素化蛋白质组学鉴定结果
利用本发明方法富集泛素化蛋白质并进行质谱检测,结果显示八种泛素链均被检测,且变性条件下优于非变性条件,平均高出10倍左右(如图5C所示)。常规数据依赖式采集DDA模式下总共分别鉴定到1606个和1325个可能的泛素化蛋白质(如图6A所示),对其进行K-ε-GG富集,富集到1416和515个泛素化位点(如图6C所示)。在整体鉴定量相差不大的情况下,变性条件下泛素化蛋白的整体占比高于非变性条件下的信号2.4倍左右(如图6B所示)。对位点的整体信号分布进行分析,发现变性条件下的整体信号的中值高于非变性条件下,且两组具有显著差异(P<0.001)(如图6D所示)。
实施例5、定量比较不同批次之间变性与非变性条件下富集泛素化蛋白的稳定性
一、小鼠肝脏组织全蛋白裂解液制备及定量、复性再折叠
将整个小鼠肝脏(约1克)在液氮研钵中分为不同的颗粒小块,随机混合后,平均分为12份,每一份组织等重。蛋白提取及定量、变性条件下复性再折叠同实施例1步骤一、二、五所述。实验分为两个批次进行,每批次进行两个条件下的富集纯化。
二、小鼠肝脏组织泛素化蛋白质的富集纯化
同实施例4步骤三所述。经过银染及免疫印迹检测后,实验结果如图7A所示可以观察到两个批次下的变性条件下的泛素化信号均明显较高,用Image J进行灰度定量统计后绘制柱状图,结果如图7B所示。
对富集后的泛素化蛋白进行10% SDS-PAGE的电泳分离后,切胶进行胶内酶解消化,利用液相色谱与质谱串联对样本进行检测,实验步骤如实施例4步骤四和五所述。主成分分析PCA显示两种条件下的纯化能明显区分,但非变性条件下分离成了两个批次的两群,变性条件的批次之间没有分离,实验结果如图7C所示。所有共同鉴定的蛋白的在变性条件的平均变异系数CV值低于非变性条件,说明变性条件下纯化的组间波动性更小,且变性条件下的变异系数整体更多的小于5%(结果如图7D所示),且两组之间存在统计学差异。
实施例6、评价变性-复性再折叠的方法对于其它不同类型特异性的UBD的富集效果
一、小鼠肝脏蛋白裂解物的准备
同实施例1中步骤二中所述方法,获得全细胞裂解物后,将其分为三份用于后续的富集实验。
二、利用M1-TUBE、K63-TUBE(Lifesensors)、K48-UIM(来自Peters实验室)分别使用发明新方法(变性-复性再折叠)和传统方法(非变性条件)进行富集纯化小鼠肝脏泛素化蛋白。将三种UBDs与全蛋白在4℃旋转孵育2小时后,经过重力柱流穿洗涤后用1×上样缓冲液洗脱后进行银染及免疫印迹检测,结果如图8A、B、C所示,均能看到在两种条件下都进行了有效富集,但在变性条件下富集的泛素化信号更多。将剩余的样本进行质谱SRM靶向检测后能发现均能进行有效的特异性富集,特异性的链占据主要的信号,结果如图8所示。
Claims (9)
1.一种从生物样品中富集泛素化修饰蛋白质的方法,其特征在于所述方法包括下述步骤:
a)提供待富集样品;
b)将待富集样品用变性提取液提取蛋白质,再利用还原烷基化试剂封闭酶活位点;
c)去除步骤b)获得的蛋白样本中的变性剂,利用复性液使得泛素以及泛素链再折叠,恢复正确的空间结构;
d)利用人工泛素结合结构域材料亲和介质进行泛素化修饰蛋白质的富集纯化。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b)所述变性提取液包含可使所述样品中的蛋白质解折叠的变性剂以及缓冲液,所述变性剂选自2~9M尿素,2~6M盐酸胍,0.5%~2%重量脱氧胆酸钠和0.5%~4%重量十二烷基硫酸钠中的一种;所述缓冲液选自pH 7.0~8.0的50~150mM Tris缓冲液或100~150mM NaCl。
3.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b)所述的还原烷基化试剂包含还原剂和烷基化试剂,所述还原剂用于打开蛋白质内的二硫键,选自2~10mM三(2-羧乙基)膦,2~10mM二硫苏糖醇和2~10mMβ-巯基乙醇;所述烷基化试剂用于封闭蛋白质的半胱氨酸残基,选自5~15mM碘乙酰胺和5~40mM氯乙酰胺。
4.根据权利要求1所述的方法,其中步骤c)所述的复性试剂为使得蛋白保持空间结构的非变性溶液,使用浓度为梯度降低步骤b)所述的变性剂的浓度。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述复性试剂的浓度为将步骤b)的尿素从8M降低到4M,然后到2M,最后置换成1×PBS、50~150mM Tris缓冲液,pH 7.0~8.0,或者100~150mM NaCl;
复性后通过超滤法、透析法或稀释法使得蛋白质再折叠。
6.根据权利要求1所述的方法,其中步骤d)所述的亲和介质试剂选自TUBE、ThUBD以及泛素链特异性的UBD。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述泛素链特异性的UBD包括M1线性泛素链、K48泛素链、K63泛素链的亲和富集UBD。
8.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤a)之后进一步包括测定蛋白质浓度的步骤;和在步骤d)之后进一步包括将富集后的蛋白进行免疫印迹检测或者酶切消化后进行质谱检测的步骤。
9.一种富集试剂盒,包括至少一种包含泛素结合结构域多肽的富集试剂,一种蛋白质变性提取液,一种蛋白质复性再折叠液。
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