DE69915059T2

DE69915059T2 - Monoklonaler antikörper und assay zur bestimmung von n-terminalem prokollagen-propeptid typ iii (piiinp)

Info

Publication number: DE69915059T2
Application number: DE69915059T
Authority: DE
Inventors: Reinhold Elmar BURCHARDT; Werner Kroll; Mathias Gehrmann; Werner Schröder
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2019-05-18
Also published as: ES2216518T3; US7541149B1; ATE260298T1; WO1999061477A2; WO1999061477A3; EP1086135B1; DE69915059D1; AU4362399A; EP1086135A2; PT1086135E; DK1086135T3

Description

Stand der Technik
Das N-terminale Prokollagen(III)-Propeptid-PIIINP)-Molekül ist ein proteolytisches Fragment, das aus der spezifischen Spaltung von Prokollagen(III) durch N-Proteinase nach Exozytose hervorgeht. Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die sich an dieses N-terminale Ende binden bzw. daran gebunden werden, sowie einen Assay unter Anwendung dieser Antikörper.
Die agene I und III werden als Präpropeptide synthetisiert und sind posttranslational umfänglich modifiziert. Unter den spezifischen intrazellulären Modifikationen befinden sich Glycosylierungen, enzymatische Hydroxylierungsreaktionen unter Einbindung von Lysin und Proln in ihren 3- und 4-Positionen sowie die spezifische proteolytische Entfernung des Führer-Peptids. Die modifizierten Propeptide vereinigen sich spontan zu [α₁(III)]3-Homotrimeren im Fall von Kollagen (III) und meistens zu [α₁(I)]₂α₂(I)-Heterotrimeren sowie zu einem geringeren Ausmaß – zu [α₁((I)]₂-Homodimeren im Fall von Kollagen(I) in den mikrosomalen Kompartimenten. Nach Exozytose wird das Propeptid zuerst am C-Terminus des naszenten Kollagens und dann am N-Terminus durch einen Satz spezifischer Endoproteasen gespalten. In beachtenswerter Weise werden die Prokollagen I und II durch eine Proteinase-Aktivität gespalten, die sich von der für Prokollagen(III) spezifischen N-Proteinase-Aktivität unterscheidet (Peltonen et al, 1985). Ein Kandidaten-Gen für eine für menschliches Kollagen(III) spezifische N-Proteinase ist kürzlich vorgeschlagen worden (Scott et al, 1996). Eine vermutete cDNA-Sequenz für Rinder-Prokollagen (I)-N-Proteinase ist verfügbar (Colige et al, 1996).
PIIINP tritt als ein Trimer auf, das aus 3 identischen monomeren PIIINP-Untereinheiten besteht, die durch intermolekulare Disulfid-Brücken verbunden sind. PIIINP ist seinerseits strukturell in drei Domänen unterteilt. Die meiste N-terminal angeordnete Domäne (Col1) besteht aus einer globularen Struktur, die durch mehrere intramolekulare Cystin-Brücken verbunden ist. Col3 ist die Zwischendomäne und besitzt eine Kollagen-artige Struktur, die durch periodische Gly- und Pro-Reste gekennzeichnet ist. Diese Domäne ist zu einer charakteristischen dreifach helikalen Kollagen-Struktur zusammengebaut, die die Col3-Domäne kennzeichnet. Die Col2-Domäne umfasst die Teile der Prokollagen-Telopeptidregion in der Nähe der N-Proteinase-Spaltungsstelle. Die drei monomeren PIIINP-Untereinheiten sind als parallele Peptidstränge in dieser Domäne zusammengebaut. In kennzeichnender Weise enthält die Col2-Domäne zwei Cystein-Reste, die beide an intermolekularer Disulfid-Brückenbildung beteiligt und alleiniglich für die trimere Struktur von PIIINP verantworlich sind (Kühn et al, 1982).
Die gesamte cDNA-Sequenz, die PIIINP kodiert, wurde aus einer menschlichen Aorta-cDNA-Bibliothek (QUICK-Klon-cDNA, Clontech, USA) PCR geklont, Sequenz-verifiziert und in den bakteriellen Phagemid-Vektor pBluescript SK-untergeklont (Stratagene, USA). Die Sequenzinformation ist aus dem DNASTAR-Programm erhalten worden (Genbank-Zugriff # X14420; Ala-Kokko et al, 1989, 1).
Stand der Technik: Messungen von Kollagenfragmenten
Kollagen(III) ist das charakteristische Kollagen parenchymaler Organe und ist das zweithäufigste Kollagen in fibrotischen Geweben. Obwohl Kollagen(I) das häufigste Narben-bildende Kollagen ist und sogar drastischer als Kollagen(III) bei Leberfibrose vermehrt erzeugt wird, tritt es in großen Mengen im Knochen auf (Uitto et al, 1986) und ist daher nur von begrenztem Wert in der Differenzialdiagnose fibrotischer Vorgänge und Abläufe in parenchymalen Organen. Serumbestimmungen von C-terminalem Prokollagen(I)-Propeptid sind daher hauptsächlich zur Verfolgung und Aufzeichnung von Störungen des Knochenmetabolismus angewandt worden (Eriksen et al, 1993).
Serumgehalte des zirkulierenden N-terminalen Prokollagen(III)-Propeptids (PIIINP) sind bereits als Serumparameter bei Patienten mit Leberfibrose eingeführt, um die Menge der Kollagenabscheidung in diesem Organ abzuschätzen (z. B. Plebani und Burlina, 1991).
Erhöhte zirkulierende PIIINP-Gehaltsmengen können allerdings auch aus der Spaltung von abgeschiedenem Kollagen(III) stammen und somit eher eine Fibrolyse als eine Fibrogenese reflektieren (Schuppan, 1991). Dies gilt aufgrund der Tatsache, dass PIIINP auf der Oberfläche von Kollagen(III) nach seiner Abscheidung in der extrazellulären Matrix vorliegt (Fleischmajer et al, 1986). Die Molekularmassen der PIIINP-Species, die aus einer Fibrolyse hervorgehen, scheinen sich von den aus einer Fibrogenese erzeugten Species zu unterscheiden und schließen Species mit höherer sowie niedrigerer Molekularmasse ein, die im Plasma zirkulieren (Niemelä et al, 1982). Obwohl PIIINP-Serumbestimmungen ziemlich gut zur Aufzeichnung und Verfolgung von Leberfibrose in verschiedenen zugrundeliegenden Krankheiten wie primärer Leberzirrhose (z. B. Davis und Madri, 1987), chronischer Hepatitis B und C (Murawaki et al, 1995, Jeffers et al, 1996) und von alkoholischer Lebererkrankung (Savolainen et al, 1984) eingeführt und etabliert sind, stellen sie eine nur geringe Hilfe zur Erstellung der Diagnose dar. Dies gilt aufgrund von zwei verschiedenen charakteristischen Merkmalen der PIIINP-Serumbestimmungen: 1. Zirkulierende PIIINP-Gehaltsmengen scheinen mit der akuten Phase einer Leberentzündung zu korrelieren, wenn eine übermäßige Kollagenabscheidung histologisch noch nicht sichtbar ist und tatsächlich niemals manifest zu werden braucht (Savolainen et al, 1984, Hansen et al, 1995), und 2. können gesteigerte zirkulierende PIIINP-Gehaltsmengen in klinischen Festlegungen eher eine Fibrolyse als eine Fibrogenese anzeigen, weil ungespaltenes PIIINP auf der Oberfäche von Kollagen(III)-Fasern vorliegt und im Verfahrensablauf eines Kollagenabbaus freigesetzt wird (Davis und Madri, 1987).
Der diagnostische Wert von PIIINP-Bestimmungen ist umfänglich debattiert worden. Aus Molekularsieb-Versuchen mit Patientenseren ist dargelegt worden, dass Serumassays, die PIIINP erkennen, drei unterschiedliche Molekulargewichtsformen nachweisen. Die Fraktion mit der Species mit niedrigerem Molekulargewicht besteht aus monomeren Col1-Domänen. Die Absolutmenge dieser zirkulierenden Col1-Domäne ist relativ konstant bei gesunden freiwilligen Versuchspersonen sowie bei Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis und akuter alkoholischer Hepatitis. Zusätzlich zum zirkulierenden Col1-Domänefragment, erkennen die Antikörper auch PIIINP-Species in den Seren, die höher als Trimer sind. Die exakte molekulare Natur dieser Species mit hohem Molekulargewicht ist nicht bekannt. Der relative Mengenanteil der Species mit hohem Molekulargewicht scheint in Abhängigkeit vom Typ der Leberkrankheit zu schwanken. Trimeres PIIINP, das aus einer Kollagensynthese hervorgeht und durch N-Protease gespalten wird, ist gewöhnlich die häufigste PIIINP-Species, ihr relativer Mengenanteil ist aber nicht konstant (Niemelä et al, 1982).
Ein weiteres Problem mit den undifferenzierten PIIINP-Serumgehaltsmengen ist die ungeklärte Frage, ob PIIINP mit einer fortlaufenden Kollagen(III)-Neosynthese oder besser mit einer manifesten Kollagenabscheidung in der Leber korreliert. Während einige Forscher veröffentlicht haben, dass PIIINP-Gehaltsmengen am besten mit Kollagen(III)-mRNA korrelieren (Hayasaka et al, 1991), stützen weitere Studien diese Beobachtungen nicht.
Eine Anzahl von Patienten betrifft das Problem von PIIINP-Bestimmungen aus Patientenseren sowie Verfahren zur Verbesserung der diagnostischen Gültigkeit dieser Bestimmungen. Bezüglich der Messungen von PIIINP in Seren von Patienten mit Leberkrankheiten ist über verschiedene PIIINP- Radioimmunoassays berichtet worden. EP 0 004 940 A1 von Timpl et al, 1979, beschreibt einen nicht-Gleichgewichts-Inhibierungsradioimmunoassay auf Basis eines Rinder-Antigen-Antikörper-Systems, welches eine Kreuz-Reaktivität mit menschlichem PIIINP zeigt und ergibt. Der in diesem Patent offenbarte Verfahrensablauf wurde anschließend von Rhode et al, 1979, veröffentlicht und zur Entwicklung des RIAgnost-PIIIP-Assay von Behring AG, Marburg, Deutschland, angewandt. Allerdings ermöglicht das Verfahren keine präzise Bestimmung von trimerem PIIINP in Patientenseren, da die im Assay eingesetzten polyklonalen Antikörper sowohl intaktes PIIINP als auch Abbauprodukte von PIIINP, insbesondere die monomere Col1-Domäne, erkennen. Ausserdem ist die Begierde des Antiserums für das monomere Abbauprodukt niedriger als für intaktes PIIINP. Somit zeigen und ergeben Serumproben eine weniger steile Inhibierungskurve im Vergleich mit dem PIIINP-Standard, und die PIIINP-Konzentration muss durch das 50%-Abschnittsverfahren abgeschätzt werden, welches drei Serum-Verdünnungen benötigt.
Zur Überwindung des Problems mit der flachen Inhibierungskurve der Serumkurven ist eine Assayvariante mit Antikörper-Fab-Fragmenten entwickelt worden. Das Verfahren, das in EP 0 089 008 A2 von Timpl et al, 1983, offenbart und anschließend von Rohde et al, 1983 veröffentlicht wurde, nutzt ein Antiserum, das durch Immunisierung von Mäusen mit Col1 erzeugt worden ist. Das Antiserum wird angewandt, um Antikörper-Fab-Fragmente zu erzeugen, die eine nahezu gleiche Begierde für Col1 sowie für intaktes PIIINP aufweisen. Daher werden parallele Inhibierungskurven für Serumproben und -standards erhalten, und es ist nur eine einzelne Verdünnung erforderlich. Allerdings ist der diagnostische wert dieses Assay dem RIAgnost-PIIIP-Assay unterlegen, weil der Fab-Assay zwischen aktiven und inaktiven Leberkrankheiten nicht wirkungsvoll differenziert.
Der niedrige diagnostische Wert des Fab-Assay hat zu der Annahme geführt, dass anstatt der Anwendung eines Antiserum mit gleicher Affinität zu PIIINP und Col1 es besser sein könnte, ein Antiserum anzuwenden, welches Col1 überhaupt nicht erkennt. In der europäischen Patentanmeldung EP 0 298 210 A2 von Brocks und Timpl, 1988, ist ein Verfahren beschrieben, wie ein Antiserum zu erzeugen ist, das intaktes PIIINP und etwas undefinierte Prokollagen-Typ-II2-Species mit einem höheren Molekulargewicht als PIIINP, aber nicht Col1 erkennt. Das Antiserum wird nach Immunisierung von Mäusen mit einem Peptid definierter Sequenz erhalten. Allerdings stammt das beanspruchte Peptid aus der Ratte oder dem Rind, und das nach Immunisierung erhaltene Antiserum zeigt und ergibt keine hinreichende Kreuzaktivität mit PIIINP des Menschen. Daher ist der Assay nicht auf Proben vom Menschen anwendbar (Brocks et al, 1993).
Ebenso wird in der europäischen Patentanmeldung EP 0 304 292 A2 von Risteli und Risteli, 1988, ein Verfahren beansprucht, das die Erzeugung polyklonaler Antikörper ermöglicht, die fast keine Affinität für das PIIINP-Abbauprodukt Col1 aufweisen. Insbesondere wird beansprucht, dass die gewünschten Antikörper nach Immunisierung von Mäusen mit einem trimeren aminoterminalen Propeptid erhalten werden, das frei von proteolytischen Enzymen ist. Außerdem ist in EP 0 304 292 A2 ein Gleichgewichts-RIA beschrieben, welcher leichter durchzuführen ist als die in den früheren Patentanmeldungen genannten nicht-Gleichgewichts-RIAs. Eine detaillierte Beschreibung des Assay, der von Orion Diagnostica, Espoo, Finland, im Handel erhältlich ist, wurde von Risteli et al, 1988, veröffentlicht.
Die Herstellung von zwei monoklonalen Antikörpern, wie beschrieben in EP 0 289 930 A2 von Brocks et al, 1988, und in EP 0 339 443 A2 von Brocks et al, 1989, hat die Entwicklung eines immunoradiometrischen Assay ermöglicht. Das Reaktionsmuster beider Antikörper gegen durch Gelchromatografie aufgetrenntes PIIINP ist sehr ähnlich und durch die Abwesenheit einer Reaktivität gegen Col1 gekennzeichnet. Der Assay ist im Handel als der RIAgnost-PIIIP-Assay mit überzogenem Röhrchen von Behring Diagnostica, Marburg, Deutschland, erhältlich. Die Autoren beanspruchen auch die Kombination dieser zwei Antikörper mit weiteren unspezifischen Antikörpern gegen PIIINP in Sandwich-Immunoassayverfahren.
Stand der Technik: Rekombinante Erzeugung von PIIINP
Alle in der Literatur und in verschiedenen Patenten beschriebenen Antikörper sind gegen PIIINP aufgezogen und erzeugt worden, das aus Quellen des Menschen oder vom Rind gereinigt wurde. Daher ist das Bindungsepitop der Antikörper nicht gut gekennzeichnet.
Eine Anzahl von Veröffentlichungen enthält Berichte über die rekombinante Erzeugung von Prokollagenen. Eine Veröffentlichung (Lee et al, 1990) beansprucht die Erzeugung eines Kollagenα₂(I)-Mutanten in der C-Proteinase-Spaltungsstelle in A2-Zellen, die aus der Rattenleber-Epithelialzelllinie W8 stammen, die defizient für Kollagen α₂(I) ist. Zwei neuere Veröffentlichungen berichten über die rekombinante Exprimierung von Kollagenα₁(III)-Minigenen (Lees und Bulleid, 1994; Bulleid et al, 1996). Über die alleinigliche rekombinante Exprimierung des N-terminalen Prokollagenα₁(III)-Propeptids, z. B. für die Zwecke selektiver Immunisierungen, oder über die Exprimierung von trunkiertem PIIINP für die Zwecke einer Epitop- Planerstellung ist nicht berichtet worden. Immunisierungen sind lediglich mit zufällig gewählten Synthese-Peptiden mit unerforschter Sekundärstruktur durchgeführt worden.
Obwohl Immunisierungen im vorliegenden Fall mit einem Oligopeptid durchgeführt wurden, das vermutlich als ein monomeres Molekül auftritt, können die entstandenen Antikörper vorzugsweise trimeres PIIINP noch erkennen. Dies kann aufgrund der Tatsache gelten, dass 1 Antikörper gleichzeitig an zwei identische Epitope auf benachbarten Ketten gebunden werden kann (Rhode et al, 1983).
Ein synthetisches Peptid aus der Col1-Region (N-ICESCPTGGQNYSP-C) ist angewandt worden, um Antikörper aufzuziehen, von denen beansprucht wird, dass sie gegen intaktes PIIINP gerichtet sind und keine Kreuz-Reaktion mit monomeren PIIINP-Formen einzugehen scheinen ( EP 0 298 210 A2 von Brocks und Timpl, 1988). Erst später haben die gleichen Autoren veröffentlicht, dass die gegen dieses Peptid gerichteten Antikörper menschliches PIIINP nicht erkennen (Brocks et al, 1993).
Aus der oben zitierten Literatur wird es klar, dass über Versuche und Lösungsansätze zur systematischen Epitop-Lageplanerstellung unter Anwendung rekombinanter DNA-Technologie für PIIINP bisher nicht berichtet worden ist.
Stand der Technik: Antikörper gegen PIIINP
Es besteht ein beachtliches Interesse an gegen PIIINP erzeugten Antikörpern. Eine Quelle (Rohde et al, 1979) berichtet über der Erzeugung polyklonaler Antikörper, die gegen PIIINP reaktiv sind, und es wird deren Anwendung als diagnostisches Werkzeug für PIIINP-Bestimmungen in menschlichen Serumproben beansprucht. Für Immunisierungen wurde die aus Rinder-Typ III-Prokollagen gereinigte Col1-Domäne eingesetzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung waren ebenfalls Gegenstand der EP 0 004 940 A1 von Timpl, 1979.
Die Erzeugung von Antikörpern gegen das synthetische Oligopeptid-Fragment (N-ICESCPTGGQNYSP-C) ist Gegenstand der EP 0 298 210 A2 von Brocks und Timpl, 1988, gewesen. von den Antikörpern, die dieses Antigen erkennen, wurde beansprucht, intaktes PIIINP in Seren von Nagern ebenfalls zu erkennen. Allerdings waren die Antikörper nicht kreuzreaktiv mit PIIINP des Menschen (Brocks et al, 1993).
In EP 0 289 930 von Brocks et al, 1988, und in EP 0 339 443 von Brocks et al, 1989, wird die Erzeugung von zwei monoklonalen Antikörpern beansprucht, die selektiv für die Erkennung von intaktem PIIINP des Menschen in verschiedenen Körperflüssigkeiten sind. Insbesondere wird in EP 0 289 930 und in EP 0 339 443 die Erzeugung monoklonaler Antikörper beansprucht, die gegen ein Epitop gerichtet sind, das nicht auf ColI angeordnet ist. Während die in EP 0 289 930 beanspruchten Antikörper ausschließlich Species mit höherem Molekulargewicht und intaktes PIIINP erkennen und nicht mit Col1-Abbauprodukten reagieren, erkennt der in EP 0 339 443 beanspruchte Antikörper eine weitere PIIINP-Species, die ein höheres Molekulargewicht als Col1, aber ein kleineres als intaktes PIIINP aufweist. Die exakte Natur des Antigens und die Basis dieser Wechselwirkung werden nicht weiter erläutert. Die Erkennung einer diskreten Zwischen-PIIINP-Species unterstreicht ferner die Heterogenität der zirkulierenden PIIINP-Antigene und hebt die Notwendigkeit hervor, die Natur des Epitops, das in jedem Fall erkannt wird, klar zu identifizieren.
Aus der verfügbaren Literatur wird klar, dass über monoklonale Antikörper mit gut definierten Bindungsepitopen, die PIIINP des Menschen erkennen, bisher nicht berichtet worden ist. Das Fehlen einer detaillierten Bindungsinformation nährt Zweifel am diagnostischen Wert von PIIINP-Bestimmungen mit diesen Antikörpern.
Stand der Technik: Verfolgung und Aufzeichnung fibrotischer Krankheitsabläufe
Diverse Krankheiten werden mit der unangemessenen oder unregelmäßigen Produktion von Kollagen in Zusammenhang gebracht. PIIINP-Messungen können aus Patientenseren oder weiteren Körperflüssigkeiten von Patienten, die unter diesen Krankheiten leiden, durchgeführt werden. Unter diesen befinden sich Leberfibrose verschiedener Etiologien, alkoholische Zirrhose, Leberzirrhose, Hepatitis, Schistosomiase, Herzmuskelfibrose verschiedener Etiologien, idiopathische Zwischenraumfibrose, idiopathische Lungenfibrose, Zwischenraum-Lungenfibrose, akute Lungenfibrose, akutes Atmungsspannungssyndrom, perimuskuläre Fibrose, perizentrale Fibrose, Dermato-Fibromen, Nierenfibrose, diabetische Nephropathie, Glomerulonephritis, systemische und lokalisierte Sklerodermie, Keloide, hypertrophe Narben, strenge Gelenksadhäsionen, Arthrose, Myelofibrose, korneale Vernarbung, zystische Fibrose, muskuläre Fibrose, Duchenne's Muskeldystrophie, esophageale Striktur, retroabdominale Vernarbung, Crohn's Krankheit, Magengeschwür-Colitis sowie Aneurysmen großer Gefäße.
Weitere fibrotische Störungen können induziert oder ausgelöst werden durch Narbenrevisionen, plastische Chirurgien, Glaukome, Katarakt-Fibrose, Kornealvernarbung, Gelenksverklebungen, Pfropf-vs.-Wirt-Krankheit, Tendon-Chirurgie, Nervenverklemmung, Dupuytren's Kontraktur, OB/GYN-Adhäsionen, Becken-Verklebungen, peridurale Fibrose, Krankheiten der Schilddrüse oder der Parathyroiden, metastatische Knochenerkrankung, multiple Myelome sowie durch Restenose.
Frühdiagnose ist wesentlich für eine potentielle Behandlung dieser Krankheiten. Bis jetzt sind Serumtests für fibrotische Krankheiten nicht gut erstellt, und eine endgültige Diagnose muss sich gänzlich auf invasive Biopsien verlassen.
PIIINP-Messungen können auch durchgeführt werden, um den Umsatz der Kollagen-Synthese bei Patienten zu messen, die unter einer Therapie mit Glucocorticosteroiden stehen.
Ferner können die gegen PIIINP gerichteten Antikörper angewandt werden, um die Kollagen-Synthese in Gewebeproben von Patienten mit fibrotischen Erkrankungen durch immunohistochemische Färbung von Kryostat- und Paraffin-Schnittproben zu bewerten.
Immunoassayanwendungen:
Der Immunoassay der Erfindung umfasst die Reaktion von zwei Antikörpern mit einer menschlichen Fluidprobe, worin der Einfang-Antikörper spezifisch an die 30 meisten N-terminalen Aminosäuren des PIIINP Moleküls gebunden wird. Dieser Einfangantikörper wird vorzugsweise an trimeres PIIINP gebunden. Ein zweiter Antikörper mit anderer Epitop-Spezifität wird zum Nachweis dieses Komplexes verwendet. Vorzugsweise sind die Antikörper monoklonale Antikörper, und beide der genannten zwei Antikörper des Assay werden spezifisch an das Protein gebunden.
Der oder die Antikörper des Assay, die spezifisch an das PIIINP gebunden werden, zeigen und ergeben vorzugsweise weniger als ca. 3% Kreuz-Reaktivität in einem unten in Beispiel 6 beschriebenen Assay oder in einem ähnlichen Assay mit einer Plasmaprobe vom Menschen mit PIIICP, PICP, Kollagen(III), Kollagen(I) und mit Kollagen(VI).
"Antikörper", "Antikörper der Erfindung" oder weitere ähniche Begriffe, welche hierin verwendet werden, schließen ein Gesamt-Immunoglobulin sowie antigene Bindungsfragmente oder immunoreaktive Fragmente ein, die spezifisch an das PIIINP, einschließlich Fab, Fab*', F(ab')₂ und F(v) gebunden werden.
Die fluide Probe vom Mensch, welche im Assay der Erfindung eingesetzt wird, kann eine Probe sein, die das PIIINP enthält, z. B. Blut oder Urin. In typischer Weise wird eine Serum- oder Plasmaprobe angewandt.
Antikörper der Erfindung können mit im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahrenstechniken hergestellt und zubereitet werden, und sie werden in typischer Weise zu einer Probe von PIIINP hergestellt. Die Antikör per können auch aus einem Immunogenen Peptid erzeugt werden, das ein oder mehrere Epitope des PIIINP umfasst, die sich durch natives PIIINP zeigen und ergeben.
Insbesondere können die Antikörper durch Immunisieren eines Säugetiers mit einer gereinigten Probe von PIIINP oder mit einem oben diskutierten immunogenen Peptid allein oder komplexiert mit einem Einfangmittel hergestellt werden. Geeignete Säugetiere schließen typische Labor-Lebewesen, wie Schafe, Ziegen, Kaninchen, Guinea-Schweine, Ratten und Mäuse ein Ratten und Mäuse, besonders Mäuse, sind zum Erhalt monoklonaler Antikörper bevorzugt. Das Antigen kann dem Säugetier auf jedem einer Anzahl geeigneter Wege durch subkutane, intraperitoneale, intravenöse, intramuskuläre oder intrakutane Injektion verabreicht werden.
Vorzugsweise erfolgt die Immunisierung durch subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion. Das optimale Immuniesierungsintervall, die optimale Immunisierungsdosis usw. können in relativ breiten Bereichen schwanken und empirisch auf der Grundlage des vorliegenden Offenbarungsgehalts ermittelt werden. Typische Vorgehensweisen beinhalten eine mehrmalige Injektion des Antigens über eine Anzahl von Wochen. Die Antikörper werden aus dem Serum des immunisierten Lebewesens durch Standard-Verfahrenstechniken geammelt und gerastert, um die für PIIINP spezifischen Antikörper herauszufinden. Die monoklonalen Antikörper können in Zellen, die Antikörper erzeugen, erzeugt und diese Zellen können angewandt werden, um monoklonale Antikörper durch Anwendung von Standard-Fusionstechniken zur Bildung von Hybridoma-Zellen zu erzeugen. In typischer Weise beinhaltet dies, dass eine Antikörper-erzeugende Zelle mit einer unsterblichen Zelllinie, wie einer Myeloma-Zelle, fusioniert wird, um die Hybrid-Zelle zu erzeugen. Alternativ dazu, können die monoklonalen Antikörper aus Zellen mit dem Verfahren von Huse et al (1989) erzeugt werden.
Gemäß einem geeigneten Protokoll erfolgt eine intraperiotoneale Immunisierung einer Maus mit einer Zusammensetzung, die gereinigtes PIIINP aufweist, über eine Zeitdauer von ca. 2 bis 7 Monaten. Milzzellen können dann aus der immunisierten Maus entnommen werden. Seren aus der immunisierten Maus werden bezüglich der Titer der für PIIINP spezifischen Antikörper vor der Entnahme der Milzzellen analysiert. Die entnommenen Maus-Milzzellen werden dann an eine entsprechend geeignete homogene oder heterogene (vorzugsweise homogene) Lymphoid-Zelllinie mit einem Marker wie einem mit Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Defizienz (HGPRT) oder mit Thymidin-Kinase-Defizienz (TK) fusioniert. Vorzugsweise wird eine Myelomazelle als die lymphoide Zelllinie angewandt. Die Myelomazellen und Milzzellen werden vermischt, z. B. mit einem Verhältnis von ca. 1 : 4 Myelomazellen zu Milzzellen. Die Zellen können mit dem Polyethylenglycol (PEG)-Verfahren fusioniert werden. Die so geklonten Hybridomen werden in einem Kulturmedium, z. B. in RPMI-1640 gezüchtet (Moore et al, 1967).
Hybridomen, die nach dem Fusionsverfahren gewachsen sind, werden z. B. durch Radioimmunoassay oder Enzymimmunoassay zur Sekretion von Antikörpern gerastert, welche spezifisch an PIIINP gebunden werden, z.B., werden Antikörper ausgewählt, die an das komplette PIIINP, an die Region I der Untersequenz, aber nicht an die Region II gebunden werden. Vorzugsweise wird ein ELISA zur Auswahl durch Rasterung angewandt. Hybridomen, die positive Ergebnisse bei einem derartigen Rasterauswahlverfahren zeigen, können mit einem limitierenden Verdünnungsverfahren expandiert und geklont werden. Weitere Rasterauswählverfahren werden vorzugsweise durchgeführt, um Antikörper zu selektieren, die an PIIINP in Lösung sowie in fluiden Proben vom Mensch gebunden werden können.
Der Assay der Erfindung wird nun durch das folgende Protokoll unter Anwendung alkalischer Phosphatase als die Markierung des Konjugat-Antikörpers erläutert. Eine Testprobe, z. B. eine menschliche Serumprobe, wird zu einem PIIINP-Antikörper (d. h. einen Antikörper, der an das PIIINP gebunden wird) gegeben, welcher an ein Einfangmittel wie eine Mikrotiterplatte gebunden ist, und es wird die Antikörper-Antigen-Reaktion durchgeführt, worauf die Zugabe des mit alkalischer Phosphatase markierten PIIINP-Antikörper-Konjugats, das wie oben erhalten wurde, und dann eine weitere Durchführung der Antikörper-Antigen-Reaktion erfolgen. Die Antikörper werden in typischer Weise vor Kontakt mit einer Testprobe in einer Lösung aufgelöst und gehalten. Geeignete Verdünnungsmittel schließen die im Stand der Technik zur Anwendung im Immunoassayverfahren bekannten ein. Eine spezifisch bevorzugte Lösung zur Auflösung der Antikörper zum Kontakt mit einer Testprobe enthält 20 mM Tris, 500 mM Natriumchlorid, 0,05 mg/mL Maus-IgG und 5% (G/V) BSA.
Vorzugsweise werden sowohl die Einfang- als auch die Konjugat-Antikörper des Assay der Erfindung spezifisch an das PIIINP gebunden, und der an die Unterlage gebundene Antikörper, die fluide Probe vom Mensch und der markierte Antikörper werden zusammen inkubiert, worauf Wasch-Stufen erfolgen, um jeglichen ungebundenen markierten Antikörper und die Plasmaprobe des Menschen, die sich vom umgesetzten PIIINP unterscheidet, zu entfernen. Geeignete Waschmittel schließen die im Stand der Technik zur Anwendung in Immunoassayverfahren bekannten ein. Eine besonders bevorzugte Wasch-Pufferlösung enthält 27,2 g/L Imidazol, 17,5 g/L Natriumchlorid und 4 mL/L Tween^®20. Nötigenfalls wird ein Substrat für alkalische Phosphatase zum Assay gegeben, und die Reaktionsprodukte werden bezüglich der Enzymaktivität durch Messung der Absorption oder Fluoreszenz des entstandenen Produkts analysiert. Die nachgewiesene Menge des gebundenen markierten Antikörpers ist direkt proportional zur PIIINP-Konzentraton in der analysierten Serumprobe des Menschen. Somit kann eine quantitative Bestimmung der PIIINP-Konzentration in der Plasmatestprobe durch Vergleich der Absorption oder Fluoreszenz der Testprobe mit Absorptionswerten durchgeführt werden, die aus standardisierten Lösungen erhalten werden, die bekannte PIIINP-Mengen enthalten. Es mag wünschenswert sein, Eichkurven aus Absorptionswerten zu erstellen, die aus einer Anzahl standardisierter Lösungen erhalten wurden, um die aus der Testprobe erhaltenen Werte leichter-zu interpretieren.
Ein besonders bevorzugter Immunoassay der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt durchgeführt. Der monoklonale Einfang-Antikörper und der monoklonale Konjugat-Antikörper, der mit Alkali-Phosphatase (AP) markiert war, wurden zusammen mit einer Plasmaprobe vom Mensch bei 37°C 30 min lang inkubiert. Die Platte wurde dann gewaschen und 15 min lang bei Raumtemperatur mit dem AP-Substrat inkubiert, worauf das gebundene Konjugat quantitativ bestimmt wurde.
PIIINP kann aus einer Serumprobe des Menschen durch Anwendung von Einfang-Komplexen gereinigt werden, die mit einem oder mehreren Antikörpern der Erfindung in zur Immunisierung hinreichenden Mengen gekuppelt sind. Hinreichende Mengen wurden gereinigt, und daher schließt die Erfindung Verfahren zum Erhalt von gereinigtem PIIINP unter Anwendung der Antikörper der Erfindung und entsprechende Gerätschaften ein. Ein geeignetes Reinigungsverfahren erfolt durch Kupplung eines Antikörpers der Erfindung an ein entsprechendes Einfangmittel, wie es im Stand der Technik bekannt ist, wie an ein Gel oder Harz, wobei dieses Einfangmittel dann in eine Säule gepackt wird, worauf eine Probenlösung, die PIIINP enthält, durch die Säule eluiert wird, um PIIINP selektiv zu adsorbieren. Der Antikörper kann in geeigneter Weise an das Einfangmittel mit bekannten Verfahren, z. B. das Cyanogen-Bromid-, Glutaraldehyd-, wässrige Cabodiimid-, Aktivester-Verfahren und dgl., gekuppelt werden. Der Antikörper kann auch physikalisch an die Oberfläche des Einfangmittels adsorbiert werden.
Beispiel 1 Herstellung von rekombinantem PIIINP
Klonierung von PIIINP-cDNA
Eine PCR wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers für Pufferbedingungen mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Zwei spezifische Primer mit KpnI- und HindIII-Restriktionsstellen, die an ihren jeweiligen 5'-Enden integriert waren (P1 und P5, Tabelle 1), wurden auf eine Endkonzentration von jeweils 500 fM zugegeben. 1 μL QUICK-Klon-cDNA aus menschlicher Aorta wurde als ein Templat in einer 100 μL PCR-Reaktion angewandt. Die PCR wurde in einem Hochleistungs-UNO-Thermozykler, hergestellt von Biometra, Deutschland, durchgeführt. Das folgende Programm wurde angewandt: Anfängliche Templat-Denaturierungsstufe: 5 min bei 94°C. Die Standard-Zyklusbedingungen waren: 45 s bei 94°C, 60 s bei 55°C, 60 s bei 72°C. 30 Zyklen wurden durchgeführt. Eine 420 s lange Extensionsstufe beendete das Programm. Das entstandene PCR-Fragment wurde aus einem 2%-igen Agarose-Gel mit einem QIAEX IIGelextraktionskit (Qiagen, Deutschland) gereinigt und durch eine T4-Polynucleotid-Kinase Behandlung phosphoryliert (Boehringer Mannheim, Deutschland). Der arterielle Phagemid-Vektor pBluescript SK^– wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI (Boehringer Mannheim, Deutschland) abgebaut, und das linearisierte Plasmid wurde mit Kalbgedärm-Phosphatase von Boehringer Mannheim, Deutschland, entphosphoryliert. Das enzymatisch modifizierte PCR-Fragment und der Vektor wurden mit T4-Ligase (Boehringer Mannheim, Deutschland) 12 h lang bei 16°C ligiert. Alle enzymatischen Modifizierungsstufen wurden gemäß den Empfehlungen des Hertellers durchgeführt. Das ligierte Plasmid wurde in einen E. coli-Stamm sure II (Stratagene, USA) gemäß dem von Sambrook et al, 1988, beschriebenen Verfahren transformiert. Die entstandenen Kolonien wurden in LB-Medium mit 100 μg/mL Ampicillin expandiert, und die Plasmid-DNA wurde gemäß dem Qiagen Mini Kit-Protokoll (Qiagen, Deutschland) isoliert. Das Plasmid wurde beüglich der Integration des Inserts durch Abbau mit KpnI und HindIII (Boehringer Mannheim, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers getestet. Ein positiver Klon (hP5) wurde identifiziert. Der Klon wurde expandiert und durch zweidirektionale Nucleotid-Sequenzierung in einem Applied Biosystems (USA)-Sequenzierer Sequenz-verifiziert, und es wurden größere Mengen des hP5-Plasmids isoliert. Er diente als Templat für alle unten beschriebenen Exprimierungskonstrukte.
Anschließend diente das Plasmid hP5 als Templant für die Erzeugung eines N-terminalen His-tag-Exprimierungskonstrukts, das die gesamte Propeptidregion umfasst, dem aber die N-terminal angeordnete Präsequenz- und die Telopeptidregion fehlten, welche entfernt von der N-Proteinase-Spaltungsstelle vorliegen. Diesbezüglich wurde 1 μg des hP5-Plasmids als das Templat verwendet, und die Vergrößerung wurde mit den Primern P3 und P14 (siehe Tabelle 1 zur Sequenz-Information) durchgeführt. P3 und P14 enthielten KpnI- bzw. HindIII-Restriktionsstellen an ihren jeweiligen Enden. 12 PCR-Zyklen wurden unter den gleichen oben beschriebenen Zyklusbedingungen durchgeführt. Dieses PCR-Produkt wurde in den Phagemid-Vektor pBluescript SK^– blunt-beendet unterkloniert (als Subklon stumpf gemacht). Ein Plasmid, das die cDNA von reifem PIIINP enthielt, wurde erhalten und mit 4.5 bezeichnet. Das Plasmid wurde mit KpnI und HindIII (Boehringer Mannheim, Deutschland) abgebaut, und die PIIINP-cDNA wurde aus einem 2%-igen Agarose-Gel gereinigt. Das Insert wurde anschließend phosphoryliert. Es wurde mit dem His-tag-Expressionsplasmid pQE30 (Qiagen, Deutschland) ligiert, welches vorab mit dem gleichen Satz von Restriktionsenzymen als das Insert abgebaut worden war, worauf es entphosphoryliert wurde. Kompetente E. coli sure II wurden mit dem Plasmid transformiert. Eine Kolonie, die das pQE30-Derivat mit der PIIINP-Sequenz aufwies, wurde identifiziert und expandiert. Alle Modifizierungsstufen wurden analog zum für die Erzeugung des hP5 dargelegten Verfahren durchgeführt. Der Klon wurde mit 4.5.2 bezeichnet.
Exprimierung und Reinigung des rekombinanten N-terminalen His-tag-PIIINP-Fusionsproteins und Erzeugung von N- und C-terminal trunkierten Mutanten
Kurz gesagt, wurde, nach einer zweiten Transformation, das entsprechende N-terminale His-tag-Fusionsprotein im E. coli-Stamm M15, der das pREP4-Plasmid aufwies, exprimiert (gemäß dem QIAexpressionist-Handbuch, S. 35, Qiagen, Deutschland, Inkubationstemperatur: 37°C). Das rekombinante Fuskionsprotein wurde über einer Ni-NTA-Superflow-Säule (Qiagen, Deutschland) gemäß dem Reinigungsprotokoll des Herstellers gereinigt (Protokoll 7, QIAepressionist-Handbuch, S. 45–46, Qiagen, Deutschland).
Zur Erzeugung eines N-terminal trunkierten Proteins wurde ein Primer, der die Sequenz stromabwärts der Sequenz erkannte, die für die ersten 30 N-terminalen Aminosäuren des PIIINP kodierte (P11-2, Tabelle 1), in Kombination mit einem Primer verwendet, der spezifisch für die Sequenz war, die die C-terminal angeordnete N-Proteinase-Spaltungsstelle umfasste (P14, Tabelle 1). Die experimentellen Verfahrens- und Vorgehensweisen waren vollkommen analog zu den für die Konstruktion bzw. Erstellung des Plasmids 4.5.2 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass das Insert in den pQE31-Exprimierungsvektor (Qiagen, Deutschland) unterkloniert wurde und der stromaufwärtige Primer (P11-2) eine PstI-Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende enthielt. Deshalb wurden das Insert und der Vektor mit PstI (Boehringer Mannheim, Deutschland) eher als mit KpnI abgebaut. Dieses Konstrukt wurde als Klon 6 bezeichnet. Nach Induktion mit IPTG wurde ein N-terminales Fusionsprotein, dem die ersten 30 Aminosäuren aus der Col1-Domäne von PIIINP fehlte und das sich vom 4.5.2-abgeleiteten Peptid in der zur N-terminalen His-tag-Aminosäure-Sequenz benachbarten Aminosäure-Sequenz unterschied, über einer Ni-NTA-Säule gereinigt.
Eine weitere trunkierte PIIINP-cDNA-Sequenz wurde durch PCR unter Anwendung eines Primer-Paars erzeugt, das die Sequenz, die für das N-terminale Ende des Moleküls kodierte (P3, Tabelle 1) und die Sequenz knapp stromaufwärts der Sequenz erkannte, die für die gesamte Col2-Domäne kodierte (P12, Tabelle 1). Nach Unterklonierung dieses Fragments in den pQE30-Exprimierungsvektor, Transformation, Exprimierung des rekombinanten Proteins und nach dessen Reinigung wurde ein trunkiertes PIIINP erhalten, dem 21 Aminosäuren an seinem C-Terminus im Vergleich mit dem nicht-trunkierten Molekül fehlten. Das Konstrukt wurde mit 2.8.6 bezeichnet. Wiederum wurden alle experimentellen Verfahrens- und Vorgehensweisen analog zu den zur Herstellung des 4.5.2-Plasmids beschriebenen durchgeführt.
Multimerisierungsversuche mit rhPIIINP
Die gereinigten Proteine wurden durch Elektrophorese an einem 12,5% SDS-Gel aufgetrennt (Sambrook et al, 1989). Zur Ermittlung, welche Disulfid-verbundenen PIIINP-Species und trunkierten Mutanten mit welchen Molekulargewichten rekombinant im Stamm M15 mit dem pREP4-Plasmid exprimiert wurden, wurde Mercaptoethanol [5% (V/V)] als das reduzierende Mittel aus den Probenpuffern weggelassen, und die entstandenen Banden wurden mit einem Molekulargröße-Standard und mit ihren Mercaptoethanol-reduzierten Gegenstücken verglichen.
Durch Vergleich der unreduzierten PIIINP-Specis mit dem reduzierten Protein, das als 1 Bande auf einem SDS-Gel auftrat, wurde es ersichtlich, dass das rekombinante PIIINP größtenteils als ein monomeres Protein synthetisiert wurde. Nur Species mit elektrophoretischen Beweglichkeiten, die Monomeren entsprachen, waren in jedem Fall unterscheidbar (3).
Aminosäure-Sequenzierung der gereinigten rekombinanten Proteine
Eine Probenzubereitung von PIIINP zur Entfernung des Puffers und weiterer Begleitstoffe wurde mit der ProSpin-Probenzubereitungskartusche von Applied Biosystems (USA) und mit den Centricon-Konzentratoren (Amicon, USA) durch Blotten (Aufbringen) auf eine PVDF-Membran nach einer SDS-Gel-Elektrophorese oder durch Gelfiltration in Ameisensäure an einer Kieselgel- Säule durchgeführt. Eine Vertikal-Elektrophorese-Einheit (LKB/Pharmacia, Deutschland), eine Trans-Blot-Zelle und eine Energieversorgung für das Botting-Modell 250/2.5 (BioRad, Deutschland) wurden angewandt. Die Reagenzien für die Elektrophorese und die PVDF-Membran waren von BioRad. Alle weiteren eingesetzten Chemikalien waren pro analysis oder vom biochemischen Reinheitsgrad (Merck, Deutschland). Der vorgefärbte Protein-Marker war von Bio-Rad (Deutschland).
Die N-terminalen Sequenzanalysen der PIIINP-Fragmente wurden mit dem Gas-Flüssig-Fest-Phase-Protein-Sequenziergerät 473A von Applied Biosystems durchgeführt. Das Standard-Sequenzierprogramm wurde angewandt. Das Sequenziergerät, die verschiedenen Durchlaufprogramme, die Zyklen sowie das PTH-Auftrennsystem sind im Detail im jeweiligen Handbuch beschrieben (User's manual protein sequencing system model 473A (1989), Applied Biosystems, USA). Der Nachweis der PTH-Aminosäuren wurde on-line mit einer RP-18-Säule (220 mm × 2 mm, 5 μ-Material), einer PTH-Säule von Applied Biosystems, durchgeführt. Die PTH-Aminosäuren wurden mit einem 50 pM Standard aller PTH-Aminosäuren identifiziert und quantifiziert. Die Daten wurden mittels des Sequenzier-Datensystems 610A von Applied Biosystems gesammelt und integriert. Ca. 20 ng der jeweiligen PIIINP-Fragmente wurden zur Sequenzierung eingesetzt.
Die 4.5.2-, die 2.8.6- und Klon6-Proteine wurden, wie oben beschrieben, N-terminal sequenziert. Die Anzahl der Zyklen war in jedem Fall hinreichend, um die Kollagen-Sequenz des Fusionsproteins zu erreichen.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse aus der Aminosäure-Sequenzierung von drei repräsentativen PIIINP-Proteinen zusammengefasst. Sie war mit der veröffentlichten Sequenz in jedem Fall identisch.
Beispiel 2: Immunisierung
Weibliche BALB/c Mäuse wurden mit PIIINP immunisiert, um Milz-Spender für die folgende PEG-Fusion zu ergeben, mit welcher monoklonale Antikörper erzeugt wurden, die spezifisch an PIIINP gebunden wurden: Die weiblichen BALB/c-Mäuse wurden jeweils mit 10 μg gereinigtem PIINP in einer immunogenen Emulsion sensibilisiert, die auf folgende Weise hergestellt wurde:
0,125 mL Prokollagen-2II-N-terminal-Propeptid (325 μg/mL in 50 mM Tris/50 mM NaCl/0,1 mM EDTA, pH = 7,4),
1,500 mL komplettes Freund's Adjuvans,
1,375 mL Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
Jede Maus wurde mit 0,5 mL dieser immunogener Emulsion i. p. gespritzt. Die Mäuse wurden mit Dosismengen von bis zu 50 μg gereinigtem PIIINP i. p. in einem Immunisierungsprotokoll gespritzt und herausgefodert, welches ca. 6 Monate lang durchgeführt und angewandt wurde.
Beispiel 3: ELISA-Assay für PIIINP-Antikörper
Überziehen von Mikrotiterplatten mit PIIINP
PIIINP wurde in einem Überzieh-Puffer (Carbonat-Puffer, pH = 9) auf eine Konzentration von 1 μg/mL verdünnt. 100 μL jeder Lösung (10 ng PIIINP) wurden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatten gegeben, welche verschlossen und über Nacht bei 2 bis 8°C inkubiert wurden. Die Inhaltsmengen der Vertiefungen wurden dann angesaugt, und die Platten wurden 1mal mit Wasch-/Lagerungspuffer gewaschen, die Waschlösung wurde angesaugt und die Platten wurden erneut verschlossen. Die Platten wurden bei 2 bis 8°C bis zum Gebrauch gelagert.
Beispiel 4: Herstellung von Hybrodiomen
Hybridomen, die monoklonale Antikörper zu Prokollagen-III-N-terminal-Propeptid sekretierten, wurden durch zwei Zellfusionen erzeugt. Die PEG-Fusionstechnik wurde angewandt. Die eingesetzten Myeloma-Zellen waren HRPT-minus P3-X63-Ag8.653 (P3X) (ATCC CRL1580). Die Selektion bezüglich Hybriden wurde unter Anwendung von HAT-Medien (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) durchgeführt. Unfusionierte P3X-Myelomazellen überleben in diesem Medium nicht, da ihnen der Apparat fehlt, um Hypoxanthin zu verwenden, um Purine zu produzieren. Das im Medium vorhandene Aminopterin blockiert die endogene Synthese von Purinen und Pyrimidinen.
Fusion zur Bildung von Hybridoma-Prokollagen III-N-terminal-Propeptid Splenozyt-Zubereitung
Milzzellen wurden von einer wie in Beispiel 1 mit Prokollagen III-N-terminal-Propeptid immunisierten Maus erhalten. Die Zellen wurden aus der Milz mit Pinzette und Nadel freigesetzt, dann in 12 mL kaltem 20%igen Komplett-Medium ohne Serum (RPMI 1640-Basis, Gibco) suspendiert. Die Zellen wurden dann bei 200 g 10 min lang zentrifugiert, worauf der Überstand durch Ansaugen beseitigt wurde, und die Zellen wurden erneut in kaltem Medium resuspendiert. Diese Wäsche wurde 2mal wiederholt, und die Zellen wurden in einem Endvolumen von 10 mL resuspendiert. Der lebensfähige Zell-Zählwert der Splenozyten betrug 1,7 × 10⁸ bei einer Lebensfähigkeit von 98% gemäß Trypan Blau Ausschlusstechnik.
Myeloma-Zubereitung
Die Myeloma-Zellen wurden mechanisch geerntet, zusammengefasst und bei 200 g 10 min lang zentrifugiert, worauf der Überstand durch Ansaugen beseitigt wurde, und die Zellen wurden in 50 mL 20%igem Komplett-Medium resuspendiert. Der lebensfähige Zell-Zählwert der Myelomazellen betrug 2,9 × 106 lebensfähige Zellen pro mL bei einer Lebensfähigkeit von 76%.
Fusion der Splenozyten und Myeloma-Zellen
Die Splenozyten und 15 mL der Myeloma-Zellsuspension wurden bei einem Milzzellen-zu-Myelomazellen-Verhältnis von ca. 4 : 1 mit einem lebensfähigen Zell-Gesamtzählwert von 2,13 × 10⁸ vereinigt. Das Volumen wurde auf 50 mL mit kaltem 20%igen Komplett-Medium ohne Serum gestellt, und die Zellen wurden dann bei 200 g 10 min lang zentrifugiert. Das Zell-Pellet wurde dann 2mal mit diesem Medium bei einem Volumen von 50 mL gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurde der Überstand durch Ansaugen beseitigt, und das Pellet wurde bei 200 g 3 min lang zentrifugiert, worauf der restliche Überstand angesaugt wurde. Die Zellen wurden dann mit 40% PEG (Molekulargewicht: 7000 bis 9000), gepuffert in RPMI 1640, einer Fusion unterzogen, die Fusion wurde in einem Röhrchen durchgeführt, das in einem warmen (37°C) Wasser-Bad gehalten wurde. 1 mL auf 37°C erwärmte PEG-Lösung wurde zum Pellet gegeben, worauf das Ganze 1 min lang inkubiert wurde. Die PEG-Lösung wurde dann durch Zugabe von 20 mL warmem 20%igen Komplett-Medium ohne Serum verdünnt. Die fusionierten Zellen wurden bei 37°C 10 min lang inkubiert und dann bei 200 g 10 min lang zentrifugiert.
Das fusionierte Zell-Pellet wurde dann in 50 mL 20%igem Komplett-Medium resuspendiert und bei Zell-Dichten von 1,09 × 10⁵ bis 4,26 × 10⁵ pro Vertiefung plattiert. Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 200 μL pro Vertiefung von 20%igem Komplett-Medium mit 250 Einheiten/mL IL-6 plattiert. Nach Inkubation bei 37°C und 10% CO₂ über Nacht wurde eine Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung angesaugt, und die Zellen wurden mit 20% HAT, 20% HAT mit 5 μg/mL STM oder mit 20% HAT mit 500 Einheiten/mL IL-6 gefüttert. Die Zellen wurden visuell gerastert und periodisch mit diesen Medien einige Wochen lang gefüttert, wobei das Wachstum der Hybridomen verfolgt und wachsende Vertiefungen bezüglich des Vorliegens von anti-PIIINP-Antikörpern mit Beginn des 12ten bis 14ten Tages nach der Fusion unter Anwendung der vorher beschriebenen PIIINP-überzogenen Mikrotiter-platten und von für die Biochemie-Fachleute gut bekannten Standardverfahren ausgesiebt wurden.
Beispiel 5: Anwendung von rekombinantem PIIINP und der trunkierten PIIINP-Peptide zur Charakterisierung der Epitop-Spezifität monoklonaler Antikörper, die gegen rekombinantes PIIINP aufgezogen waren
Prinzip
Zur Aussiebung bezüglich Epitop-spezifischer monoklonaler Antikörper wurden alle drei rekombinanten Peptide eingesetzt. Diese monoklonalen Antikörper, die alle drei Peptide erkannten, wurden nicht weiter verwendet, weil diese Antikörper entweder gegen das N-terminale His-tag oder gegen die Region zwischen den ganz terminalen Epitopen von Col1 und dem Beginn von Col2 gerichtet waren. Antikörper, die nur das vollständige Peptid (4.5.2) und das C-terminale Löschungspeptid (2.8.6) erkannten, denen die 21 meisten C-terminalen Aminosäuren fehlten, die einer Löschung der gesamten Col2-Domäne entsprechen und nicht mit dem N-terminalen Löschungspeptid (Klon 6) reagierten, dem die 30 meisten N-terminal angeordneten Aminosäuren fehlten, wurden als Epitop-spezifisch für die N-terminale Col1-Region klassifiziert. 2 zeigt die auf allen PIIINP-Konstrukten vorliegenden Epitope, und in Tabelle 4 sind die Ergebnisse aus ELISA- und Western Blot-Assays zusammengefasst, die mit den verschiedenen Antikörpern und Antigenen erhalten wurden.
Mit dem gleichen Beweis wurden Antikörper, die nur das komplette Peptid (4.5.2) und das N-terminale Löschungspeptid (Klon 6) erkannten, wurden als Epitop-spezifisch für die C-terminal angeordnete Col2-Domäne identifiziert.
Zur Charakterisierung der Bindungscharakteristika der neu erzeugten monoklonalen Antikörper wurden sowohl ELISA- als auch Western Blot-Techniken angewandt. Zwei geeignete monoklonale Antikörper (mAb 35J22 und mAb 35J23) wurden ausgewählt, die ausschließlich die 30 meisten N-terminalen Aminosäuren von PIIINP als deren Bindungsepitope erkannten und die empfindliche Löschung von nativem PIIINP aus Patientenproben ermöglichten.
1. ELISA:
Nach Identifizierung des optimalen Titers unter Verwendung des kompletten rekombinanten PIIINP in einem ELISA-Assay, wobei das rekombinante PIIINP mit einer festgelegten Masse-Konzentration aufgebracht wurde, wurden die Löschungspeptide mit der gleichen Konzentration aufgebracht, und die Signalintensität wurde in exakter Analogie zum kompletten PIIINP bestimmt. In Tabelle 4 sind die Ergebnisse dieses ELISA-Assay für den monoklonalen Antikörper 35J23 und die Erkennung der verschiedenen Antigene zusammengefasst.
2. Western Blot:
Nach Bestimmung des optimalen Titers der verschiedenen Antikörper wurden alle drei PIIINP-Varianten einer Elektrophorese in äquimolaren Konzentrationen unterzogen, und es wurden Western Blots durchgeführt. Unterschiede bei der Antigen-Erkennung konnten somit mit der Epitop-Spezifität korreliert werden.
Beispiel 6: Immunisierung mit einem Oligopeptid zum Aufziehen von Antikörpern, die für die Col2-Domäne selektiv sind
Zur Aufzucht von für die Col2-Domäne selektiven Antikörpern wurde eine Oligopeptid-Sequenz, entsprechend den 21 Aminosäuren, die unmittelbar N-terminal an der N-Proteinase-Spaltungsstelle angeordnet waren, gewählt. Die exakte Sequenz des Peptids ist in Tabelle 3 angegeben. Die letzten 14 Aminosäuren der Oligopeptid-Sequenz sind mit der Sequenz der Col2-Domäne von PIIINP identisch. Da das Bindungsepitop eines typischen monoklonalen Antikörpers mindestens 6 Aminoäuren umfasst, erkennen Antikörper, die gegen das Oligopeptid aufgezogen sind, in typischer Weise eine Untersequenz der Col2-Region.
Der monoklonale Antikörper mAb 35JC2 wurde aufgezogen und weiter charakterisiert.
Beispiel 7: Erstellung eines PIIINP-Immunoassay auf Basis der Erkennung von 2 komplementären Epitopen des PIIINP-Moleküls durch 2 unterschiedliche monoklonale Antikörper
Messungen der Konzentrationen des N-terminalen Prokollagen(III)-Propeptids (PIIINP) in Patientenseren wurden unter Anwendung der Sandwich-Technologie durchgeführt. Ein Epitop-spezifischer monoklonaler Antikörper, (mAb 35J23), der ein N-terminales Epitop des PIIINP-Moleküls erkannte, wurde spezifisch an das zirkulierende Serum-PIIINP gebunden und damit immobilisiert. Ein zweiter monoklonaler Antikörper (mAb JC2) wurde zum Nachweis dieses Komplexes angewandt.
Die Kombination der oben beschriebenen Stellenspezifischen monoklonalen Antikörper erkannte in ausschließlicher Weise PIIINP-Species mit höherem Molekulargewicht, die auf die de novo-Abscheidung von Prokollagen(III) in der extrazellulären Matrix in den Seren aller Patienten und Vergleichspersonen bezogen sind. Diese Spezifität für intaktes PIIINP unterscheidet des Weiteren den neuen Assay von Assays, die zusätzlich Species mit niedrigerem Molekulargewicht erkennen. Kürzere PIIINP-Fragmente stellen wahrscheinlich Abbauprodukte dar, die aus PIIINP hervorgehen, und brauchen nicht unbedingt eine neuerliche Kollagen-Synthese darzustellen bzw. zu reflektieren. Daher ist der oben beschriebene neue Assay sehr spezifisch für den Zweck der Aufzeichnung und Verfolgung der Kollagen-Synthese gegenüber einem Kollagen-Zusammenbruch.
Beispiel 8: Erstellung eines PIIINP-Immunoassay auf Basis der Erkennung des PIIINP-Moleküls durch einen monoklonalen Antikörper und des Nachweises dieses Komplexes mit polyklonalem Antiserum
Eine Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorb, Deutschland), wurde mit dem mAb 35J23 oder mit dem mAb 35J22 (2 μg/mL, Gesamtvolumen pro Vertiefung: 100 μL) über Nacht bei 4°C überzogen. Am folgenden Tag wurde der Überstand verworfen, und die Vertiefungen wurden mit 3% BSA (G/V) in PBS (Gesamtvolumen pro Vertiefung: 200 μL) 2 h lang blockiert. Die Vertiefungen wurden 3mal mit Wasch-Puffer (0,05% Tween 20, BioRad, Deutschland) gewaschen. Anschließend wurden 50 μL Patientenserum auf jeder Vertiefung 1 h lang angewandt. Das Serum wurde aus den Vertiefungen entfernt, und die Platten wurden 3mal mit dem oben beschriebenen Wasch-Puffer gewaschen. Das polyklonale anti-PIIINP-Antiserum von Biodesign (UK, Los-# 40331R) wurde zum Nachweis dieses Komplexes verwendet (Verdünnung: 1 : 500 (V/V), Gesamtvolumen pro Vertiefung: 100 μL). Nach 3 Wäschen wurde der Peroxidase-markierte anti-Kaninchen-Antikörper A 0545 von Sigma (Deutschland) angewandt (Verdünnung: 1 : 20000 (V/V), Gesamtvolumen pro Vertiefung: 100 μL). Nach 5 Wäschen wurde der ELISA-Assay mit 100 μL TMB-Peroxidase-Substrat + Peroxidase-Lösung B (1 : 1 (V/V), beide von Kirkegaard & Perry Laboratories, USA) 30 min lang entwickelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μL 1 N H₂SO₄ gestoppt, und die O.D.-Werte wurden bei 450 nm ermittelt.
In höchst überraschender Weise wurden beide monoklonale Antikörper mAb 35J22 und mAb 35J23 vorzugsweise an trimeres PIIINP gegenüber dem monomeren rekombinanten Protein 4.5.2 gebunden.
Beispiel 9: PIIINP-Assay an einem automatisierten Immunoanalysegerät
3 und Tabelle 4 zeigen die Korrelation der O.D.-Werte, die mit diesem Assay erhalten wurden, mit den mit dem Orion-RIA ermittelten PIIINP-Konzentrationen als Proben von den gleichen ausgewählten Patienten mit beiden Verfahren gemessen wurden.
Die in 4 dargestellte Eichkurve wurde mit rekombinantem PIIINP erhalten, als mit dem in Beispiel 8 beschriebenen ELISA-Assay getestet wurde. Der Assay wurde wie oben für Patientenseren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass aufeinanderfolgende Verdünnungen des rekombinanten PIIINP aufgebracht wurden (Gesamtvolumen: 100 μL). Der Titer des polyklonalen anti-PIIINP-Antiserums wurde in diesem Versuch variiert. Beste Ergebnisse wurden mit 1 : 500-Verdünnungen des anti-PIIINP-Antiserums erzielt. Bei Vergleich der Ergebnisse mit den Messungen aus Patientenseren mit bekannten PIIINP-Konzentrationen wird es klar, dass dieser Assay-Typ vorzugsweise intaktes PIIINP erkennt, während er monomeres rekombinantes Material nicht begierig erkennt. Mit dem rekombinanten Antigen lag die Nachweisschwelle bei ca. 100 ng/mL, und der dynamische Bereich des Assay wurde zu PIIINP-Konzentrationen von 20 bis 100 Mal höher als mit dem trimeren Material in den Patientenseren verschoben. Es sei angemerkt, dass die bevorzugte Erkennung des trimeren Materials nicht wegen des polyklonalen Antiserums erfolgt, das nicht zwischen monomerem und trimerem Material unterscheidet, wie dies in einfachen ELISA-Assays dargelegt worden ist, die nur mit dem polyklonalen Antiserum durchgeführt wurden (Daten nicht angegeben).
In Tabelle 5 sind die PIIINP-Konzentrationen in den Seren von Patienten mit Kind-klassifizierter fibrotischer Leberkrankheit angegeben. Die Daten legen eine Korrelation zwischen zirkulierenden PIIINP-Gehaltsmengen, wie bestimmt mit dem oben beschriebenen Sandwich-Immunoassay, und der klinischen Strenge der fibrotischen Leberkrankheit nahe.
Der PIIINP-Assay wurde als ein Sandwich-Immunoassay unter gleichzeitiger Zugabe von sowohl den Antikörper-Reagenzien als auch der Probe und der späten Zugabe von Magnetpartikeln erstellt:

– 10 μL Serumprobe und 10 μL Magnetpartikel-Puffer wurden in die Reaktionsküvette pipettiert.
– 30 s später wurden 65 μL Reagens R1 und 65 μL Reagens R2 in die Küvette eingebracht. Reagens R1 enthält einen fluoreszeinierten monoklonalen anti-PIIINP-Antikörper in einer gepufferten Lösung. Reagens R2 enthält einen anti-PIIINP-Antikörper einer anderen Epitop-Spezifität, welcher an al-kalische Phosphatase in gepufferter Lösung konjugiert war.
– Die Reaktionsmischung wurde 21 min lang bei 37°C inkubiert, um den Sandwich-Immunkomplex zu bilden.
– 10 μL Magnetpartikel, die mit einem anti-Fluorescein-Antikörper überzogen waren, wurden zugefügt, und die Mischung wurde bei 37°C weitere 8 min lang inkubiert.
– Der an die Partikel gebundene Immunkomplex wurde aus der Reaktionsmischung durch Anlegen eines äußeren Magnetfelds abgetrennt. Die Partikel wurden gewaschen, um überschüssige Probe und Reagens zu beseitigen.
– 300 μL p-Nitrophenolat wurden zur Reaktionsmischung gegeben. Das gefärbte p-Nitrophenolat-Anion wurde gebildet, und der Bildungsumsatz war direkt proportional zur in der Probe vorliegenden PIIINP-Konzentration. Bei niedrigen Konzentrationen wurde der Absorptionsanstieg bei 405 nm aufgenom men, bei hoher Farbbildung wurde die Filter-Wellenlänge auf 450 nm verschoben.

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Tabellen Tabelle 1 Primer-Sequenzen hP5 (Templat, das sich aus der Sekretionssequenz zur Telopeptid-Region erstreckt)
P14: 5'-CGCG AAG CTT GGG AGA ATA GTT CTG AGG AC-3'
Klon6 (N-terminale Löschung von 30 aa, C-terminal angrenzend an die Sekretions-Führersequenz)
2.8.6 (C-terminale Löschung von 21 aa, N-terminal angrenzend an die N-Proteinase-Spaltungsstelle)
Tabelle 2

PIIINP 4.5.2: Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-Ala-Cys-Glu-Leu-Gly-Thr-Gln-Glu-Ala.Val-Glu-Gly-Gly- ...
PIIINP 2.8.6: Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-(Ala)(Cys)-Glu-Leu-Gly-Thr-Gln-Glu-Ala-(Val)-Glu-Gly- ...
PIIINP-Klon6: Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Thr-Asp-Pro-His-Ala-Ser-Ser-Val-Pro-Arg-Val-Asp-Leu-Gln-...

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der N-terminalen Sequenzierung der PIIINP-His-tag-Fusionsproteine angegeben. Die Aminosäuren aus der Kollagen-Sequenz sind in fett gedruckten Buchstaben angegeben. Aminosäuren, die nicht direkt im Verfahren unterscheidbar waren, deren Vorliegen aber aus den anschließenden Sequenzierzyklusergebnissen gefolgert werden kann, sind in Klammern angegeben.
Tabelle 3
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse aus ELISA-Assayverfahren zusmamengefasst, mit denen die Reaktivität der zwei monoklonalen Antikörper gegen rekombinantes 4.5.2 und gegen die Löschungsproteine gemessen wurden. Die N-terminalen Aminosäure-Sequenzen waren in allen Fällen bis zum Beginn der Kollagen-Sequenz identisch. Das Vergleichsprotein PIIICP4.1 war ein N-terminales 6 His-tag-Fusionsprotein, das zu den P22INP-Proteinen in seiner N-terminalen nicht-Kollagen-Sequenz identisch war, und es wurde eingesetzt, um zu belegen, dass die Antikörper nicht gegen die His-tag-Sequenz gerichtet waren.
Tabelle 4
In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der PIIINP-Serumkonzentrationsmessungen angegeben, die mit em im Handel erhältlichen Orion-Assay und mit dem Sandwich-ELISA unter Anwendung des monoklonalen Antikörpers mAb 35J23 und des polykonalen anti-PIIINP-Serums durchgeführt wurden. Die Assayverfahren sind in ausgezeichneter Übereinstimmung (r = 0,94). Die dritte Spalte enthält die berechnete PIIINP-Konzentration, wie sie mit dem Sandwich-ELISA-Assay abgeschätzt wurde.
Tabelle 5
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse von PIIINP-Serum-Konzentrationsmessungen in Seren von Patienten mit fibrotischen Leberkrankheiten angegeben. Die Patienten wurden gemäß der klinischen Kind-Klassifikation klassifiziert. Die Messungen wurden mit dem Sandwich ELISA und mit dem monoklonalen Antikörper mAb 35J23 und dem polyklonalen anti-PIIINP-Serum (Biodesign, U. K.) durchgeführt. Der Assay wurde mit Seren geeicht, wobei die PIIINP-Konzentration mit dem Orion RIA-Kit ermittelt wurden, und der Sandwich-ELISA wurde mit dem mAb35J23 und mit polyklonalem anti-PIIINP-Antiserum durchgeführt. Die Korrelation zwischen O.D.-Werten im ELISA-Assay und den Werten aus dem Orion-Kit war ausgezeichnet (r = 0,76, Daten hier nicht angegeben).
Figuren
1 zeigt die N-terminale cDNA-Sequenz von Präprokollagen(III), die sich jenseits der Telomerregion erstreckt. Die oben beschriebenen unterschiedlichen Primeranordnungen sind durch Pfeile angegeben, die in die Richtung der Polynukleotid-Kettenverlängerung zeigen.
2 zeigt schematisch die cDNA-Regionen, die durch jedes der Konstrukte hPS, 4.5.2, 2.8.6 und des Klons 6 kodiert werden.
In 3 sind die Ergebnisse der PIIINP-Serum-Konzentrationsmessungen, die mit dem im Handel erhältlichen Orion-Assay durchgeführt wurden, und deren Korrelation mit den Ergebnissen aus dem Sandwich-ELISA mit dem monoklonalen Antikörper mAb 35J23 und dem polyklonalen anti-PIIINP-Antiserum dargestellt. Die Assays sind in ausgezeichneter Übereinstimmung (r = 0, 94).
4 zeigt die Beziehung zwischen den Absorptionen, die mit dem Sandwich-ELISA-Assay mit dem monoklonalen Antikörper mAb 35J23 in Kombination mit dem polyklonalen anti-PIIINP-Serum gemessen wurden, und den Überzugskonzentrationen des rekombinanten monomeren PIIINP (4.5.2).
Sequenzliste

Claims

Monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen ein Epitop innerhalb der 30 meisten N-terminalen Amiosäuren von PIIINP des Menschen.
In 1. beschriebener monoklonaler Antikörper, gekennzeichnet durch bevorzugte Bindung an trimeres PIIINP.
Monoklonaler Antikörper, aufgezogen gegen ein Oligopeptid mit der Sequenz N-Gly-Ser-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Ile-Cys-Glu-Ser-Cys-Pro-Thr-Gly-Pro-Gln-Asn-Tyr-Ser-Pro-C oder einer Untersequenz aus der Col2-Domäne von PIIINP.
Verwendung eines in 1. und 2. beschriebenen Antikörpers als Einfang-Antikörper und eines in 3. beschriebenen Antikörpers als Nachweis-Antikörper in einem Sandwich-Immunoassay, mit dem intaktes PIIINP nachgewiesen wird.
Immunoassay mit einem in 1. und 2. beschriebenen Antikörper allein oder in Kombination mit weiteren Antikörpern, die gegen PIIINP gerichtet sind, mit welchem timeres PIIINP nachgewiesen wird.