DE60037115T2

DE60037115T2 - Diagnostischer test für menschlisches matrix gla-protein und seine verwendung als biomarker

Info

Publication number: DE60037115T2
Application number: DE60037115T
Authority: DE
Inventors: Cees Vermeer
Original assignee: CARDIOVASCULAR RES INST MAASTR; Cardiovascular Research Institute of Maastrich CARIM
Current assignee: MGP Diagnostics AS
Priority date: 1999-07-04
Filing date: 2000-07-02
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2020-07-03
Also published as: AU6688700A; DE60037115D1; ES2296634T3; ATE378601T1; EP1190259A1; US6746847B1; EP1190259B1; WO2001002863A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt im Bereich der Molekularbiologie und Diagnostik. Insbesondere betrifft die Erfindung einen diagnostischen Assay für das menschliche Matrix-Gla-Protein („MGP") und dessen Verwendung als ein Biomarker für einen vaskulären Zustand und eine vaskuläre Neubildung.
Hintergrund der Erfindung
Eine kardiovaskuläre Krankheit ist eine der wichtigsten lebensbedrohlichen Krankheiten in der westlichen Bevölkerung, aber derzeit sind keine Biomarker verfügbar, um die Schwere oder das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. Die Zahl der biochemisch nachweisbaren Risikofaktoren (z. B. Serum-Cholesterin, Triglyceride, ApoE-Genotyp) ist auch überraschend niedrig.
Vitamin K ist ein Co-Faktor in der post-translationellen Konversion von Glutamat-Resten in γ-Carboxyglutamat (Gla). Derzeit sind 10 Gla-enthaltende Säuger-Proteine detailliert beschrieben worden, und die Zahl an Gla-Resten pro Molekül variiert von 3 (Osteocalcin) bis 13 (Protein Z). In allen Fällen, in denen ihre Funktion bekannt war, war die Aktivität der verschiedenen Gla-Proteine streng abhängig von der Anwesenheit der Gla-Reste (Shearer, M. J., Brit. J. Haematol. (1990) 75: 156–162; Vermeer, C., Biochem. J. (1990) 266: 625–636). Gla-Proteine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert, zum Beispiel in der Leber, dem Knochen und der Gefäßwand. Die Blutgerinnungsfaktoren II (Prothrombin), VII, IX und X sind Beispiele von Gla-Proteinen, die in der Leber synthetisiert werden, Beispiele von sogenannten extrahepatischen Gla-Proteinen sind Osteocalcin und das Matrix-Gla-Protein (Hauschka, P. V. et al., Phys. Rev. (1989) 69: 990–1047).
Das Matrix-Gla-Protein ist ein Vitamin K-abhängiges Protein, das im Knochen und in einer Reihe von Weichgeweben, einschließlich Herz und Gefäßwand, synthetisiert wird. In Versuchstieren ist seine Weichgewebe-Expression unmittelbar nach der Geburt hoch, sinkt aber in den Monaten danach ab. Nur im Knorpel und in Arterien scheint seine Expression lebenslang fortzubestehen. Obwohl die genaue Funktion von MGP bis jetzt auf einer molekularen Ebene unbekannt geblieben ist, haben Experimente mit MGP-defizienten transgenen Tieren („Knock-out"-Mäusen) gezeigt, dass MGP eine bedeutende Rolle in der Verhinderung der vaskulären Mineralisierung hat: MGP-defiziente Tiere wurden zum Geburtstermin geboren, entwickelten aber in den ersten Lebenswochen eine schwere Aorta-Verkalkung (durch Röntgen-Untersuchung analysiert); letztendlich starben alle Tiere innerhalb von 6–8 Wochen nach der Geburt aufgrund einer Ruptur der Aorta oder einer der anderen Hauptarterien (Luo, G. et al., Nature (1997) 386: 78–81).
MPG wurde im Knochen entdeckt (Price, P. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 117: 765–771), aber in situ-Hybridisierungs-Experimente zeigten, dass es auch in anderen Geweben, einschließlich der Gefäßwand, exprimiert wird (Fraser, D. J. et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 11033–11036). Mit polyclonalen Antikörpern, die gegen ein synthetisches Peptid errichtet wurden, das homolog zum C-Terminus von Rinder-MGP ist, wurde das Protein durch immunhistochemische Färbung auch im Knorpel gefunden (Loeser, R. F. et al., Biochem. J. (1992) 282: 1–6). Ein Radioimmunassay wurde für den Nachweis von Serum-MGP in der Ratte entwickelt, aber in diesen Experimenten wurde das zirkulierende MGP mit der Reifung von Ratten-Knochen und nicht mit der vaskulären Biologie korreliert (Otawara, Y. et al., J. Biol. Chem. (1986) 261: 10828–10832).
Die Erforschung betreffend die Rolle von MGP in der Gefäßwand hat nicht vor der Entdeckung durch Luo et al. (vorstehend), dass MGP ein starker Inhibitor der vaskulären Verkalkung in Mäusen ist, begonnen. Seither haben sich Hinweise angehäuft, die nahelegen, dass eine Knochenverkalkung und atherosklerotische Gefäßwandverkalkung durch sehr ähnliche Mechanismen fortschreiten, in denen dieselben Proteine (einschließlich MGP) verwendet werden (Proudfoot, D. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1998) 18: 379–388; Proudfoot, D. et al., J. Pathol. (1998) 185: 1–3). Die meisten Untersuchungen über die Regulierung der MGP-Expression sind in glatten Muskelzell-Kulturen durchgeführt worden, wobei der mRNA-Nachweis als ein Maß für die MGP-Synthese dient. Neue Untersuchungen an Menschen haben gezeigt, dass, obwohl MGP-mRNA konstitutiv durch normale vaskuläre glatte Muskelzellen exprimiert wird, es in Zellen, die benachbart sowohl zu medialer als auch intimaler Verkalkung sind, beträchtlich hochreguliert ist (Shanahan, C. M. et al., Crit. Rev. in Eukar. Gene Expr. (1998) 8: 357–375).
Dhore, C. et al., Faseb J. (1999) 13, S. A203, offenbaren, dass MGP in atherosklerotischen Plaques produziert wird. Die Bezugnahme lehrt weder, dass MGP von dem Plaque in die Blutbahn eintreten könnte, noch legt sie dies nahe.
Dhore, C. et al., FASEB Journal, (1999) 13, Seite A203, haben durch immunhistochemische Techniken gezeigt, dass MGP sich um atherosklerotische Läsionen in den Arterien anhäuft. Die Bezugnahme lehrt weder, dass MGP von dem Plaque in die Blutbahn eintreten könnte, noch legt sie nahe, dass zirkulierendes MGP als ein Biomarker für eine vaskuläre Krankheit verwendet werden kann.
Price, P. A. et al., Arterioscler. Thrombos. Vasc. Biol., (1998) 18: 1400–1407, haben gezeigt, dass MGP in Rattenserum nachgewiesen werden kann. Die Autoren lehren nicht, dass MGP mit Atherosklerose assoziiert ist, da das Rattenmodell kein Modell für die Atherosklerose vom menschlichen Typ ist. Durch Verwenden von nicht-spezifischen polyclonalen Antikörpern können sie nicht zwischen aktiven und inaktiven Fraktionen von MGP unterscheiden.
Sadowski, J. A. und O'Brien, M., Faseb J. (1991) 5, S. A944, offenbaren die Produktion von polyclonalen Antikörpern gegen ein Vitamin K-abhängiges Epitop von MGP. Das Verfahren ist sehr allgemein und kann für jedes Protein verwendet werden. Es wurde keine spezifische Verwendung von solchen Antikörpern für die Bewertung von MGP in menschlichem Serum vorgeschlagen.
Price, P. A. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1998) 18: 1400–1407, offenbaren eine künstliche Verkalkung in einem Ratten-Modellsystem. Dieses System ist kein Modell für Atherosklerose, weil es nicht mit einer vaskulären Entzündung und Plaque-Bildung assoziiert ist. Die Schlussfolgerung, die in diesem Modell erhalten wurde, dass die vaskuläre Verkalkung mit erniedrigten Serum-MGP-Spiegeln assoziiert ist, ist entgegengesetzt zu den Ergebnissen gemäß der vorliegenden Erfindung in atherosklerotischen Patienten, d. h. erhöhtes Serum-MGP bei Atherosklerose.
Der Stand der Technik lehrt weder die Verwendung von MGP als einen Marker für die Angiogenese oder eine kardiovaskuläre Krankheit oder dergleichen oder legt diese nahe, noch offenbart er einen Assay für zirkulierendes menschliches MGP.
Wie oben festgestellt, sind bis jetzt keine Biomarker erhältlich, um die Schwere oder das Fortschreiten einer kardiovaskulären Krankheit zu überwachen, und die Zahl der biochemisch nachweisbaren Risikofaktoren ist sehr niedrig. Daher besteht eindeutig ein Bedarf für Biomarker für vaskuläre Charakteristika, für die Bewertung der Schwere oder des Fortschreitens einer Atherosklerose oder von damit verwandten Krankheiten sowie für das Überwachen der Wirkung einer Behandlung während einer vaskulären Krankheit.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines diagnostischen Assays für den Nachweis und die Bestimmung von MGP in einer menschlichen Serumprobe bereitgestellt, wobei der Assay die Verwendung von einem oder mehreren Antikörper, insbesondere von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch Epitope auf und/oder Konformationen von menschlichem Matrix-Gla-Protein erkennen, umfasst.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Produktion von solchen Antikörpern bereit.
In einem anderen Aspekt der Erfindung umfasst der Assay die Verwendung der Antikörper für den Nachweis irgendeines Matrix-Gla-Proteins in menschlichem Serum als das immunreaktive Gesamt-Antigen oder für den Nachweis von Matrix-Gla-Protein in menschlichem Serum als die Fraktion von carboxyliertem Matrix-Gla-Protein (= 5 Gla-Reste/Mol) oder für den Nachweis von Matrix-Gla-Protein in menschlichem Serum als die Fraktion von untercarboxyliertem MGP (≤ 4 Gla-Reste/Mol).
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Verwendung von MGP-verwandten Antigenen als Biomarker für bestimmte Krankheiten, zum Beispiel Atherosklerose und andere vaskuläre Krankheiten und Angiogenese/Neogenese in der Tumorentwicklung, bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden monoclonale Antikörper der Klasse IgG für die Verwendung in dem diagnostischen Immunassay bereitgestellt, wobei die Antikörper durch Hybridome erhältlich sind, die durch die Fusion von Zellen eines Maus-Myeloms und von Milzzellen einer Maus, die vorher mit einem Peptid immunisiert wurde, das homolog zu bestimmten menschlichen MGP-Resten, insbesondere einem der menschlichen MGP-Reste 3-15, der menschlichen MGP-Reste 35-49 und der menschlichen MGP-Reste 54-84 ist, gebildet werden, und wobei die Antikörper hierin auch als mAb3-15, mAb35-49 beziehungsweise mAb54-84 bezeichnet werden. Von diesen sind mAb3-15 und mAb35-49 bevorzugte Antikörper.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in der detaillierten Beschreibung, die folgt, vollständiger ausgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die bewertete DNA-Nucleotidsequenz und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz der Insertion dar, z. B. MGP, verknüpft mit der murinen Dihydrofolat-Reduktase („DHFR") und ausgestattet mit einem N-terminalen 6-His-Marker. Die „Xa-Stelle" zeigt einen Linker von -He-Glu-Gly-Arg- an, der empfindlich auf die proteolytische Spaltung durch den Gerinnungsfaktor Xa ist. Siehe auch SEQ ID NOS: 1 und 2.
2 zeigt eine Dosis-Antwort-Bezugskurve für MGP in menschlichem Bezugsserum. Die Punkte sind Mittelwerte von doppelten Messungen, die an 12 verschiedenen Tagen gemacht wurden; die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
3 zeigt die Spezies-Spezifität des MGP-Assays. Eine Dosis-Antwort-Kurve für menschliches Serum-MGP wurde mit unverdünntem Ratten-(∎) und Maus-(☐) Serum verglichen. Es wurde keine Antwort für die Nager-Seren erhalten.
4 zeigt Variationen in den Serum-MGP-Spiegeln zwischen Individuen. Fünf Freiwillige (30–50 Jahre alte Männer) wurden getestet.
5 zeigt das Blockieren von MGP-Antikörpern mit Peptid 3-15. Die Bestandslösung (100%) der Peptide war 1,3 μg/ml. Die Peptid-Verdünnungen (o) wurden anstelle des Serums mit Antikörpern inkubiert, und der Überschuss der Antikörper wurde mit dem Mikrotiterplatten-Assay bewertet. Zum Vergleich wurde Bezugsserum in verschiedenen Verdünnungen (•) im selben Lauf genommen.
Die 6–9 zeigen die Serum-MGP-Konzentrationen von Patienten, die an Atherosklerose, Coronar-Atherosklerose, Diabetes mellitus beziehungsweise bösartigen Tumoren leiden, und von vergleichenden Gruppen von gesunden Leuten. Diese Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst.
10 zeigt die Reaktivität von mAb^3-15-Antikörpern mit gereinigtem rMGP (A) und rOC (B). Die Menge an rekombinantem Protein auf der Mikrotiterplatte wurde mit anti-6His-Antikörpern (•) quantifiziert, die Reaktivität mit mAb^3-15 wurde in derselben Platte getestet (o). In beiden Fällen wurde das Färben durch Inkubieren mit einem zweiten Antikörper (Kaninchen-anti-Maus-Gesamt-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase) durchgeführt, wie unten in Materialien und Verfahren beschrieben.
11 zeigt das Fehlen eines tagesrhythmischen Musters für zirkulierendes menschliches MGP. Die Punkte repräsentieren Mittelwerte ± SA von zwölf verschiedenen Subjekten; neun Blutproben wurden während der ersten 24 Stunden erhalten, und 5 Proben wurden um 9 Uhr morgens während der folgenden zwei Monate erhalten.
12 illustriert die Antigen-Fang-Technik: dreifache Messungen der Standard-Bezugskurve wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen hergestellt. Unbekannte Plasma- oder Serumproben können aus der Kurve abgelesen werden. In dieser Technik wurde ein markiertes Tracer-Peptid (MGP^3-15) zum Serum zugefügt, wohingegen monoclonale Antikörper (mAb3-15) auf die Mikrotiterplatte beschichtet wurden. Die offensichtlichen MGP-Konzentrationen in der Testprobe basieren auf der Annahme, dass die Affinitäten des Tracers und des natürlichen MGPs für den Antikörper ähnlich sind.
13 zeigt die Mittelwerte von dreifachen MGP-Messungen in gepooltem Plasma bei verschiedenen Plasma-Verdünnungen unter Verwendung der Sandwich-ELISA-Technik. In dieser Technik wurden monoclonale Antikörper gegen die mittlere MGP-Sequenz (mAb35-49) auf die Mikrotiterplatte beschichtet, wohingegen der biotinylierte mAb3-15 als ein zweiter Antikörper verwendet wurde. Fehlerbalken repräsentieren SA.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass das Vitamin K-abhängige Matrix-Gla-Protein, MGP, eine Schlüsselrolle im Verhindern der vaskulären Verkalkung zu spielen scheint. MGP wird in einer Vitamin K-abhängigen Weise in glatten Muskelzellen der gesunden Gefäßwand synthetisiert, und seine mRNA-Transkription wird in atherosklerotischen Läsionen beträchtlich hochreguliert.
Um den potenziellen Wert von MGP oder eines funktionellen Teils oder Derivats davon als ein Biomarker für vaskuläre Charakteristika zu untersuchen, wurden MGP und Fragmente davon synthetisch hergestellt, und Assays für den Nachweis von sowohl MGP im Gewebe, insbesondere in vaskulärem Gewebe, als auch von zirkulierendem MGP wurden entwickelt.
MGP oder funktionelle Fragmente davon können auf verschiedenen Wegen erhalten werden, zum Beispiel durch Gewinnen aus einer natürlichen Quelle, chemische Synthese oder unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken.
Im Knochen akkumuliert MGP in relativ hohen Mengen, weshalb der Knochen das einzige Gewebe ist, von dem bis jetzt natürliches MGP isoliert worden ist (Price, vorstehend). Dennoch ist unter physiologischen Bedingungen MGP, das von menschlichem oder Rinder-Knochen stammt, eines der unlöslichsten, bekannten Proteine.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von menschlichem MGP sind in 1 gezeigt. Ein Vergleich zwischen seiner primären Struktur und der Aminosäuresequenz, die von der cDNA stammt, die MGP codiert, zeigt, dass im vom Knochen stammenden MGP die letzten 7 C-terminalen Aminosäuren fehlen (Haie, J. E. et al., J. Biol. Chem., (1991) 266: 21145–21149).
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung wurden synthetische Peptide, die homolog zu bestimmten Sequenzen von menschlichem MGP, zum Beispiel zu den MGP-Sequenzen 3-15, 35-49, 63-75 und 54-84, sind, chemisch synthetisiert und gereinigt. Sequenzen wie jene, die oben erwähnt sind, werden hierin nachstehend als MGP^3-15, MGP^35-49 MGP^63-75 beziehungsweise MGP^54-84 genannt werden.
MGP kann auch unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Wenn es durch rekombinante Techniken produziert wird, können Standardvorgehensweisen zum Konstruieren der DNA, die das Antigen codiert, Clonieren jener DNA in Expressionsvektoren, Transformieren von Wirtszellen wie Bakterien, Hefe, Insekten- oder Säugerzellen und Exprimieren solch einer DNA, um das Antigen zu produzieren, angewendet werden. Es kann wünschenswert sein, das Antigen als ein Fusionsprotein zu exprimieren, um die Expression zu verstärken, die Reinigung zu erleichtern oder die Löslichkeit zu verstärken.
Zum Beispiel wird zuerst eine DNA erhalten, die das reife Protein (hier verwendet, um jede Reifungsform einzuschließen) codiert. mRNA, die das MGP codiert, kann z. B. von kultivierten menschlichen Osteoblasten isoliert und unter Verwendung von wohlbekannten Techniken in die entsprechende cDNA konvertiert werden. Alternativ kann die mRNA, die MGP codiert, von anderen Zelltypen wie Chondrocyten oder glatten Muskelzellen erhalten werden. Wenn die Sequenz nicht durch Introns unterbrochen ist, ist die genomische oder cDNA für die Expression in jedem Wirt geeignet. Wenn es Introns gibt, ist die Expression in eukaryontischen Systemen erhältlich, die zur Prozessierung derselben in der Lage sind. Diese Sequenz sollte in einer ausschneidbaren und gewinnbaren Form vorliegen. Die ausgeschnittene oder gewonnene codierende Sequenz wird dann in eine funktionelle Verknüpfung mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem replizierbaren Expressionsvektor platziert. Der Vektor wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, und der transformierte Wirt wird unter günstigen Bedingungen gezüchtet, um die Produktion des rekombinanten Proteins zu bewerkstelligen. Um die Wirksamkeit der prokaryontischen MGP-Expression zu verbessern, kann die cDNA mit einer Extension ausgestattet werden, die ein zweites Protein codiert, sodass die Expression ein chimäres Fusionsprotein hervorbringen wird.
Genomische oder cDNA-Fragmente werden erhalten und direkt in geeigneten Wirten, zum Beispiel E. coli, verwendet. Die Konstrukte für die Expressionsvektoren, die in einer Vielfalt von Wirten funktionell sind, werden unter Verwendung von geeigneten Replikations- und Kontrollsequenzen gemacht, wie unten beispielhaft dargestellt. Geeignete Restriktionsstellen können, wenn sie normalerweise nicht verfügbar sind, zu den Enden der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um ein ausschneidbares Gen zum Inserieren in diese Vektoren bereitzustellen.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformierungsverfahren sind abhängig vom Typ der Wirtszelle, die verwendet wird, um das Gen zu exprimieren. Im Allgemeinen sind derzeit prokaryontische, Hefe- und andere eukaryontische Zellen (z. B. Pilze, Säuger-, Insekten- und Pflanzenzellen) als Wirte verfügbar. Wirtssysteme, die zum korrekten post-translationellen Prozessieren in der Lage sind, werden bevorzugt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird MGP passend als ein chimäres Protein exprimiert, das mit der murinen Dihydrofolat-Reduktase („DHFR") verknüpft und mit einem N-terminalen 6-His-Marker für eine schnelle Reinigung ausgestattet ist; siehe 1 und SEQ ID NOS: 1 und 2. Das erhaltene 6-His-markierte chimäre Protein war unter physiologischen Bedingungen schwer löslich. Es wird für das Beschichten der Mikrotiterplatten im Assay, der unten beschrieben werden wird, verwendet. Anstelle von DHFR können andere Proteine von ausreichender Größe, um ein chimäres Protein mit MGP wirksam zu exprimieren, ausgewählt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie das Maltose-Bindungsprotein.
Der Nachweis und die Quantifizierung von MGP in vaskulärem Gewebe kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein immunhistochemisches Nachweisverfahren verwendet, das einen oder mehrere monoclonale Antikörper anwendet. Der monoclonale Antikörper kann geeigneterweise ein monoclonaler Mensch-, Maus-, Ratten- oder Cameliden-(z. B. Lama)Antikörper, der durch konventionelle Verfahren, einschließlich jener Verfahren, die derzeit für das Produzieren von monoclonalen Antikörpern im kommerziellen Rahmen verfügbar sind, hergestellt wurde, ein gentechnisch hergestellter monoclonaler Antikörper oder Antikörperfragmente oder ein Antikörper, der durch in vitro-Immunisierung durch bestimmte Zellen und durch Phasen-Display-Techniken produziert wird, sein. Es können auch ein oder mehrere polyclonale Antikörper geeigneterweise angewendet werden, vorzugsweise Antikörper, die im Kaninchen oder in der Ziege hergestellt werden.
Die monoclonalen Antikörper werden praktischerweise von Mäusen hergestellt, die mit menschlichem MGP oder einem Fragment davon, zum Beispiel MGP^3-15, MGP^35-49 oder MGP^54-84 immunisiert werden. Geeignete und bevorzugte monoclonale Antikörper gegen menschliches MGP werden von den Seren von zum Beispiel Balb/C-Mäusen erhalten, die z. B. mit dem Peptid MGP^3-15 oder dem Peptid MGP^35-49 immunisiert werden, wobei ein Post-Immunseren-Screening auf ihre Affinität gegenüber gereinigtem rekombinantem MGP, das als chimäres Konstrukt mit DHFR verwendet wurde, verwendet wird; siehe unten.
Der Nachweis und die Quantifizierung von zirkulierendem MGP, das ein MGP-verwandtes Antigen einschließt, kann auch auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden. Übereinstimmend mit der vorliegenden Erfindung haben wir einen ELISA-basierenden Serum-Assay, einen sogenannten „Antikörper-Fang"-Assay entwickelt, in dem das Proben-MGP mit einem Überschuss eines gereinigten monoclonalen anti-MGP-Antikörpers einen Komplex bildet, während die verbleibenden ungebundenen Antikörper in einem zweiten Schritt nach der Bindung an unlöslich gemachtes rekombinantes MGP quantifiziert werden. Es stellte sich heraus, dass das aufgezeichnete immunreaktive MGP unabhängig von der Probenherstellung ist und kleine Schwankungen innerhalb eines Tags und von Tag zu Tag zeigte.
Neben der Antikörper-Fang-Technik und der kompetitiven ELISA-Technik, die beide Einzel-Antikörper-ELISA-Assays sind, kann auch der Sandwich-ELISA-Assay geeigneterweise für den Nachweis und die Quantifizierung von zirkulierendem MGP verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten zweiten Antikörpers. Unten werden wir zuerst die Entwicklung der Antikörper-Fang-Technik beschreiben, gefolgt von einer detaillierteren Beschreibung des Antigen-Fangens beziehungsweise der Sandwich-ELISA-Techniken, wie in den 12 und 13 illustriert.
Dosis-Antwort-Kurven wurden mit verschiedenen Verdünnungen eines normalen gepoolten Serums und Plasmas hergestellt. Wir fanden, dass diese Kurven in der Zeit mit den linearen Kurven zwischen den 2- und 10-fachen Verdünnungen reproduzierbar waren. Intra- und Inter-Assay-Variationen in Kontrollproben waren 12 und 15%, und es wurde keine Kreuzreaktion mit Serum von Ratten und Mäusen beobachtet.
Es wurden keine tagesrhythmischen Schwankungen in einer Gruppe von 6 Männern und 6 Frauen beobachtet (siehe 11). Es wurde gefunden, dass der Bereich in der erwachsenen männlichen Population zwischen 60 und 150% des Durchschnitts ist. MGP war in einer Bezugsgruppe von Männern und Frauen, die >55 Jahre alt waren, unabhängig vom Alter. Nach der immunhistochemischen Färbung von vaskulärem Material wurde eine niedrige, aber deutliche MGP-Ablagerung in medialen glatten Muskelzellen beobachtet. Eine stark erhöhte Ablagerung von MGP wurde im Zentrum des Lipid-Kerns in fortgeschrittenen Plaques und in den Randzonen von Mineral-Ablagerungen beobachtet.
Da es schwer scheint, sich vorzustellen, dass ein auf einen bestimmten Teil des Körpers beschränkter Schub der MGP-Synthese eine Verkalkung auslösen würde, scheint es wahrscheinlich, dass die MGP-Expression eine Antwort auf das präzipitierende Mineral ist. Diabetiker bilden eine hohe Risikogruppe für das Entwickeln einer Media-Sklerose, und daher haben wir das zirkulierende MGP in dieser Patientengruppe überwacht. Es stellte sich heraus, dass die zirkulierenden MGP-Konzentrationen in Typ I-Diabetikern (n = 12) signifikant höher waren als in Alters- und Geschlechts-angepassten gesunden Kontrollen, und der Unterschied war statistisch signifikant. In einer Gruppe von 26 Patienten mit coronarer Atherosklerose war das Serum-MGP noch weiter erhöht. In einer Gruppe von 200 Subjekten wurde keine Korrelation zwischen Serum-MGP und der Intima-Dicke (Intima/Media-Verhältnis) gefunden. In Subjekten mit Osteoporose nach der Menopause oder einer anderen metabolischen Knochenkrankheit lagen die Serum-MGP-Spiegel im normalen Bereich.
Von den Daten, die bis jetzt erhalten wurden, schlossen wir, dass unser Assay für Serum-MGP reproduzierbar ist, dass eine arterielle Verkalkung mit einer erhöhten MGP-Ablagerung assoziiert ist und dass in einer fortgeschrittenen Atherosklerose die erhöhte MGP-Synthese in ihrer Serum-Konzentration widergespiegelt wird. Abgesehen von einer weiteren Ausschmückung und Feinabstimmung, die wohl im Bereich des Fachwissens von Personen, denen die vorliegende Erfindung bekannt ist, und des Stands der Technik liegen, ist der MGP-Assay nützlich als ein diagnostisches Mittel für die Diagnose oder eine Patienten-Folgeuntersuchung während der Behandlung von Atherosklerose und möglicherweise von verwandten Krankheiten.
Das Folgende ist ein typisches Beispiel und eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, das/die die Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch Epitope und/oder Konformationen am menschlichen Matrix-Gla-Protein erkennt, und verschiedene andere Aspekte illustriert.
A. Herstellung von rekombinantem, menschlichem MGP
Für das Clonieren und die Expression des chimären Konstrukts der murinen Dihydrofolat-Reduktase und von MGP (DHFR-MGP) wurde das kommerziell erhältliche QIAexpress-System (Qiagen, Inc.) verwendet. Fusionsproteine wurden unter Verwendung des pQE40-Vektors konstruiert, der eine Expressionskassette enthält, die aus dem Phagen T5-Promotor, fusioniert an das Maus-DHFR-Protein, besteht. Um die Proteinreinigung durch Metall-Chelat-Affinitätschromatographie zu erleichtern, wurde das rekombinante Protein gestaltet, um einen sechs Reste-langen Histidin-Schwanz zu enthalten, der dem DHFR vorangeht. Für eine in-Rahmen-Fusion mit dem Startcodon der 6-His-Region wurde der Expressionsvektor pQE40 mit den Restriktionsenzymen SphI und HindIII (Gibco BRL) linearisiert. Danach wurde der linearisierte Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese gemäß Standard-Vorgehensweisen gereinigt.
Für das Clonieren der menschlichen MGP-cDNA wurden 5'-SphI- und 3'-HindIII-Verdaustellen durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingebracht. Die Primer MGPHUMT1 und MGPHUMT3 (für Details siehe unten) wurden für die Amplifizierung der cDNA, die Ile-Glu-Gly-Arg-MGP codiert, verwendet. Jede PCR-Reaktion bestand aus 5 μl cDNA, 1 mM von jedem dNTP, 1 μg von jedem Primer, 4 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,01% Gelatine und 2,5 E Taq-Polymerase (Pharmacia) in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Jeder PCR-Zyklus bestand aus 1 min bei 95°C, 2 min bei 60°C und 2 min bei 72°C. Die amplifizierte cDNA wurde mit SphI und HindIII (Gibco-BRL) verdaut, und die resultierenden Fragmente wurden dann durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Elektro-Elution derselben isoliert. Die isolierten Fragmente und der linearisierte Vektor wurden dann in Reaktionen ligiert, die 1 μl verdautes Fragment, 1 μl verdauten pQE40-Vektor (in einem Gewichtsverhältnis von 3:1) enthielten, und danach in den E. coli-Stamm M15[pREP4] transformiert. Die Reaktionsbedingungen waren: 1 × T4-DNA-Ligase-Puffer, 1 mM ATP und 1 Weiss-Einheit T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech). Die Ligierungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt. Für die Identifizierung der Clone, die ein 6His-markiertes DHFR-Protein, das an MGP fusioniert ist, exprimieren, wurde das Kolonie-Blot-Vorgehen gemäß dem QIA-Expressionist-Handbuch verwendet.
Die Sequenzanalysen wurden auf einem genetischen ABI 310-Analysegerät (Perkin Elmer) gemäß dem Zyklus-Sequenzierungsvorgehen des Herstellers durchgeführt. Kurz, ungefähr 0,5 μg CsCl₂-gereinigte ds-DNA wurde zu einem Reaktionsgemisch zugefügt, das 8 μl Terminator Ready Reaction Mix (Perkin Elmer) und 5 pMol eines geeigneten Primers in einem Gesamtvolumen von 20 μl, angepasst mit H₂O, einschloss. Die Zyklus-Sequenzierung wurde auf einem Thermo Cycler 9600 (Perkin Elmer) gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 30 sec bei 95°C, 15 sec bei 60°C und 4 min bei 72°C. Nach 25 Zyklen wurde das Verfahren durch ein schnelles Abkühlen auf 4°C beendet. Danach wurden die Produkte auf MicroSpin S-200 HR-Säulen (Pharmacia Biotech), die in H₂O voräquilibriert wurden, gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Schließlich wurden die Proben mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 25 μl Template Suppression Reagent (Perkin Elmer) resuspendiert. Vor dem Laden der Proben auf den ABI Prism 310 Genetic Analyser wurden die Proben für 2 min bei 95°C erhitzt. Die Sequenzanalyse der Proben wurde gemäß dem Handbuch des Herstellers durchgeführt.
Alle Primer, die für die PCR und das Zyklus-Sequenzieren nötig waren, wurden kommerziell von Perkin Elmer oder Eurogentec mit den folgenden Sequenzen hergestellt:

– MGPHUMT1 (5' → 3'), für die SphI-Restriktionsstelle am 5'-Ende des menschlichen Xa-MGP:
– MGPHUMT 3 (5' → 3'), für die HindIII-Restriktionsstelle am 3'-Ende des menschlichen Xa-MGP:

B. Charakterisierung des Expressionsprodukts
Alle DNA-Fragmente, die durch Restriktionsenzym-Verdau erhalten wurden, wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen) gereinigt.
Ile-Glu-Gly-Arg-MGP-cDNA wurde in pQE40 ligiert und resultierte in einem korrekten Plasmid-Produkt: pQE40-Ile-Glu-Gly-Arg-MGP, wie es mit CsCl₂-gereinigter DNA des Konstrukts, sequenziert auf einem ABI Prism 310-Sequenziergerät, etabliert wurde. Es wurde bestätigt, dass das Konstrukt pQE40 Ile- Glu-Gly-Arg-MGP entspricht und dass es im korrekten Leserahmen war (siehe 1; SEQ ID NO: 1). Die berechneten Charakteristika des rekombinanten Fusionsproteins 6His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP sind: MG = 34,787 kD, 297 Aminosäurereste; pl = 9,59. Das resultierende Plasmid wurde in den E. coli-Stamm M15 [pREP4] transformiert.
Das Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm BL21 [DE3, pREP4] transformiert, dem die Ion- und ompT-Proteasen fehlen. Die Selektion der rekombinantes Protein-produzierenden Clone durch das Kolonie-Blotverfahren und unter Verwendung der monoclonalen 6His-Antikörper zeigte einige MGP-produzierende Clone. Aus Expressionsexperimenten im kleinen Rahmen, gefolgt von einer Analyse des Produkts durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotten, zeigte eine Kreuzreaktion mit monoclonalen 6His-Antikörpern eine spezifische Bindung gegen ein Protein mit dem erwarteten Molekulargewicht von ungefähr 35 kD und eine geringe Bande von 28 kD.
Aus dem Vorhergehenden kann geschlossen werden, dass eine gute Expression der Ile-Glu-Gly-Arg-MGP-Konstrukte als ein Teil eines 6His-DHFR-Fusionsproteins im pQE-Expressionsvektor im E. coli-Stamm BL21 [DE3, pREP4] erreicht wurde.
C. Herstellung von monoclonalen Antikörpern
Balb/C-Mäuse wurden intraperitoneal entweder mit einem synthetischen Peptid, das zum N-Terminus des menschlichen MGP (Reste 3-15) homolog ist, oder einem synthetischen Peptid, das zu einem mittleren Fragment des menschlichen MGP (Reste 35-49) homolog ist, oder einem synthetischen Peptid, das zum C-Terminus des menschlichen MGP (Reste 54-84) homolog ist, immunisiert, die alle an KLH (keyhole limpet hemacyanin; KLH von Pierce, Produktnr. 77107) gekoppelt wurden. Das Antigen (20 μg) wurde mit komplettem Freund-Adjuvans gemischt und für die erste Immunisierung verwendet. Die Tiere erhielten jede zweite Woche eine Auffrischung mit 20 μg Antigen in inkomplettem Freund-Adjuvans. Postimmun-Seren wurden mit einem indirekten ELISA unter Verwendung von gereinigtem, rekombinantem 6-His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP, das von E. coli abgeleitet wurde, gescreent, wie unten beschrieben.
Für das Screenen der Postimmun-Seren der Mäuse und Zell-Überstände wurde ein indirekter ELISA verwendet, in dem das gereinigte, rekombinante Protein 6-His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP an die feste Phase gebunden war. Die Bestandslösung des Proteins wurde mit Natriumcarbonat-Puffer (0,067 M NaHCO₃, 0,033 M Na₂CO₃, pH 9,6) auf die benötigte Konzentration (z. B. 50-fach) verdünnt und verwendet, um die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar, Kat.-Nr. 3590) durch Inkubation für 1 Stunde bei 37°C zu beschichten. Nach dem Beschichten wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer (0,3% Tween-20 in phospatgepufferter Salzlösung) gewaschen, und 50 μl entweder des Postimmun-Serums oder des Zell-Überstands wurden in die beschichteten Mikrotiterplatten transferiert und für eine Stunde bei 37°C inkubiert, um eine vollständige Bindung der Antikörper zu erzielen. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen und danach für eine Stunde bei 37°C mit 50 μl einer Lösung, enthaltend 1 μg/ml Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (Dako, Produktnr. P0161), in Waschpuffer inkubiert. Nicht-gebundene, konjugierte Antikörper wurden durch Waschen entfernt, und 50 μl TMB-Substrat (Roche) wurden in jede Vertiefung transferiert; nach 10 Minuten wurde die Reaktion mit 100 μl H₂SO₄ gestoppt. Die optischen Dichten wurden bei 450 nm in einem EIA-Lesegerät (Bio-Rad, Modell 550) abgelesen. Das Postimmun-Serum wurde vor der Verwendung 100-fach in 2% Magermilchpulver (Protifar von Nutricia Holland) in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt.
Milzzellen von gut antwortenden Mäusen wurden mit Sp 2/0 Ag 14-Myelomzellen fusioniert. Die Zellsuspensionen wurden in zehn Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen dispensiert, und die Hybridome wurden für die ersten 5 Tage in selektivem HAT-Medium, enthaltend RPMI 1640-Medium (Gibco, Kat.-Nr. 21060-017), 15% fötales Clonserum (Hyclone-Greiner, Kat.-Nr. A-6165), 1 mM Pyruvat (Gibco, Kat.-Nr. 11840-048), 2 mM L-Glutamin (Serva, Produktnr. 22942), Wachstumsfaktor ESG (Costar), 1 mg/ml Gentamycin (A. U. V. Cuijk Holland, Kat.-Nr. VPK 62389) und 2% (V/V) 50 × HAT, gezüchtet. Nach 5 Tagen wurde die Hälfte des Mediums mit Medium mit denselben Inhaltsstoffen, mit der Ausnahme, dass HAT durch 2% (V/V) 50 × HT (Gibco, Kat.-Nr. 41065-012) ersetzt wurde, aufgefrischt. Nach 11 Tagen wurden die Zellüberstände der Hybridomzellen unter Verwendung der ELISA-Technik, die oben beschrieben wurde, gescreent. Einzelzell-Clonieren von positiven Hybridomkulturen wurde durch limitierende Verdünnung durchgeführt (siehe: Antibodies, a laboratory manual von E. Harlow und D. Lane, 1986, S222). Diese Technik wurde für das Erhalten einer monoclonalen Hybridom-Zelllinie noch zweimal wiederholt.
Der Antikörper-produzierende Hybridom-Clon wurde in einer Roll-Flasche mit 1 Liter RPMI 1640-Medium, enthaltend 3% fötales Clonserum, 1 mM Pyruvat, 2 mM L-Glutamin und Gentamycin, bei 37°C für zwei Wochen gezüchtet. Die Kulturmedien wurden von den Zellen durch Zentrifugation getrennt, und IgG wurde von den Zellüberständen durch Protein-G-Sepharose-Säulenchromatographie (Pharmacia, Kat.-Nr. 17-0618-02) isoliert. Die Eluat-Fraktionen mit A₂₈₀ > 0,1 wurden gepoolt und unter Verwendung eines Konzentrationsfilters mit einem 10 kD-Ausschlusswert konzentriert. Der Ertrag war ungefähr 20 mg IgG pro Liter Kulturmedium, das erhaltene Material wurde bei –20°C in einer Konzentration von 1 mg/ml gelagert.
Auf eine ähnliche Weise wurden Antikörper gegen zwei andere Peptide, MGP^35-49 und MGP^54-84, hergestellt.
D. Charakterisierung der Antikörper
Die Antikörper wurden durch die Western-Blot-Technik charakterisiert, in der Gesamt-Bakterienlysate unter Verwendung eines SDS-PAGE-Minigel-Elektrophorese-Apparats (Bio-Rad) aufgetrennt wurden. Nachdem die Elektrophorese beendet worden war, wurden die Proteine durch Blotten auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Das Färben mit dem Antikörper resultierte in einer deutlichen Proteinbande bei 35 kDa. Dies ist das erwartete Molekulargewicht des Fusionsproteins 6-His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP. Die monoclonalen Antikörper gehören zur Unterklasse Typ IgG, bestimmt mit dem Isotypisierungs-Kit für monoclonale Maus-Antikörper (Gibco, Kat.-Nr. 10126-027). Die so hergestellten monoclonalen Antikörper werden auch als mAb3-15, mAb35-49 beziehungsweise mAb54-84 bezeichnet werden. Die bevorzugten monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind mAb3-15 und mAb35-49.
E. Die Verwendung der Antikörper in Assays für zirkulierendes MGP
Drei Vorgehensweisen für den MGP-Assay wurden ausgearbeitet: der Antikörper-Fang-ELISA und der kompetitive ELISA, die beide den Nachweis von Volllängen- und fragmentiertem MGP ermöglichen, und der Sandwich-ELISA, der das spezifische Erkennen nur von intakten Molekülen ermöglicht.
E1. Vorgehen für den Antikörper-Fang-ELISA.
In diesem Assay wird ein bekannter Überschuss des Antikörpers mit der Testlösung, die eine unbekannte Menge des Antigens enthält, gemischt, und das Gemisch wird zu einer Mikrotiterplatte, die mit Antigen beschichtet ist, zugefügt. Nicht-gebundener Antikörper aus der Testprobe wird an die Mikrotiter-Vertiefung gebunden werden und wird mit einem zweiten (markierten) Antikörper quantifiziert.

– Harnstoff-solubilisiertes rekombinantes 6-His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP wird 50-fach mit Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,6) verdünnt und für das Beschichten eines Überschusses von 6-His-DHFR-Ile-Glu-Gly-Arg-hMGP der Mikrotiterplatten (50 μl in jede Vertiefung) verwendet, die Platten werden für 1 h bei 37°C stehen gelassen;
– Verbleibende aktive Stellen werden mit Blockierungspuffer (Roche Diagnostics Blocking-Reagens, Kat.-Nr. 1 112 589) blockiert, 100 μl/Vertiefung für 1 h bei 37°C;
– Nach wiederholtem Waschen mit Waschpuffer (0,3% (Gew/V) Tween-20 in phosphatgepufferter Salzlösung) sind die Platten fertig für die Verwendung;
– Serum- oder Plasmaproben werden mit Antikörper-Lösung (1 μg/ml in 3% (Gew/V) Rinder-Serumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung) ergänzt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert;
– Die Proben (50 μl) werden dann auf die Mikrotiterplatten transferiert und für 1 h bei 37°C inkubiert;
– Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween-Puffer (siehe oben) wird die Menge des Antikörpers, der an die Platte gebunden ist, unter Verwendung eines zweiten Antikörpers: Kaninchen-anti-Maus-Gesamt-IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase (Dako, 1 μg/ml in PBS-Tween-Puffer) für das TMB-Färben (enzymatischer TMB-Kit von Roche), quantifiziert;
– Nach 15 min Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 1 M H₂SO₄ gestoppt, wonach die Platte bei 450 nm abgelesen wird.

E2. Vorgehen für den kompetitiven ELISA.
In diesem Assay wird eine bekannte Menge des markierten Antigens (des Tracers) mit der Testlösung, die eine unbekannte Menge des Antigens enthält, gemischt, und das Gemisch wird zum Mikrotiterplatten-gebundenen Antikörper zugefügt. Das Antigen in der Testlösung wird mit dem Tracer um die Bindung an die Antikörper-Matrix konkurrieren.

– Biotinylierung des Tracers. Ein synthetisches Peptid, das zu der Aminosäuresequenz 3-15 im menschlichen MGP homolog ist (MGP^3-15), wird als ein Tracer verwendet. Biotin-X-NHS (Calbiochem #2031188) wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml verdünnt und zu MGP^3-15 (2 mg/ml in 0,1 M Na-Borat-Puffer pH 8,5) zugefügt. Inkubiere bei Raumtemperatur für 3 h im Dunkeln. Entferne das ungebundene Biotin durch Über-Nacht-Dialyse gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und lagere das markierte Peptid nach Zugabe von Natriumazid auf eine Endkonzentration von 0,1% (Gew/V) im Dunkeln bei 4°C.
– Beschichten der Mikrotiterplatten. mAb3-15-Antikörper (5 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,6, 0,1 ml pro Vertiefung) werden in den Vertiefungen einer Hoch-Bindungs-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Corning # 3590) immobilisiert. Nach der Inkubation für 1 h bei 37°C werden die verbleibenden aktiven Stellen mit Blockierungs-Reagenz (Roche, 0,125 ml für 1 h bei Raumtemperatur) blockiert. Alle folgenden Waschschritte zwischen den verschiedenen Inkubationen werden mit 0,05% (V/V) Tween-20 in 0,225 ml PBS durchgeführt.
– Probenherstellung. Stelle die folgenden Probenröhrchen her: – nicht-spezifisches Signal-Röhrchen (leer): 0,250 ml PBS/Tween (0,05%, V/V) – Gesamtsignal-Röhrchen: 0,125 ml PBS-Tween (0,05% V/V) – unbekanntes Proben-Röhrchen: 0,120 ml PBS-Tween (0,05%, V/V) + 0,05 ml Probe – Standard-Röhrchen, enthaltend 0,125 ml unmarkiertes MGP^3-15 in den Konzentrationen: 20, 10, 4, 2, 1, 0,4 und 0,2 nM. Füge 0,125 ml des Tracers (0,2 nM in PBS/Tween (0,05%, V/V) zu allen Röhrchen mit Ausnahme des nicht-spezifischen Signal-Röhrchens zu und mische auf dem Vortex-Gerät. Übertrage 0,1 ml jedes Röhrchens in eine Vertiefung der oben erwähnten Mikrotiterplatte und inkubiere für 1 h bei 37°C.
– Messung. Nach dem Waschen werden 0,1 ml Avidin-markierte Meerrettich-Peroxidase (0,1 μg/ml) in PBS, enthaltend 10 mg/ml Rinder-Serumalbumin) zugefügt. Inkubiere für 30 min bei 37°C. Nach zwei zusätzlichen Waschschritten mit PBS (um das gesamte Tween-Detergenz zu entfernen) werden 0,1 ml frisch hergestelltes TMB-Substrat (TMB Substrat Kit, Pierce) zu jeder Vertiefung zugefügt. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zufügen von 0,1 ml 2 N H₂SO₄ beendet, und die optische Dichte wird bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts gemessen.
– Berechnung. – Subtrahiere OD₄₅₀ des nicht-spezifischen Signal-Röhrchens von allen anderen – Dividiere die korrigierte OD₄₅₀ der Standards und Unbekannten durch die OD des Gesamtsignals: A/A0 (%) = OD des Unbekannten oder des Standards × 100%/OD des Gesamtsignals – Stelle eine logistische Kurvenanpassung mit den Standards her und interpoliere die MGP-Werte der unbekannten Proben.

E3. Vorgehen für den Sandwich-ELISA (1).
In diesem Assay werden zwei Antikörper, die gegen verschiedene Epitope von einem Antigen gerichtet sind, verwendet. Ein Antikörper wird gereinigt und an die feste Phase einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gebunden, und dem Antigen in einer Testlösung wird erlaubt, zu binden. Ungebundene Proteine werden durch Waschen entfernt, und der markierte zweite Antikörper kann an das Antigen binden. Nach dem Waschen wird der Assay durch Messen der Menge des markierten zweiten Antikörpers, der an die Matrix gebunden ist, quantifiziert. Das hier beschriebene Vorgehen ist für die Antikörper mAb35-49 und mAb3-15, ist aber auch für andere Antikörper anwendbar.

– Beschichten der Mikrotiterplatten. mAb35-49-Antikörper (5 mcg/ml in Carbonat-Puffer, pH 9,6, 0,1 ml pro Vertiefung) werden in den Vertiefungen einer Hoch-Bindungs-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Corning # 3590) immobilisiert. Nach der Inkubation für 1 h bei 37°C werden die verbleibenden aktiven Stellen mit Blockierungs-Reagenz (Roche, 0,125 ml für 1 h bei Raumtemperatur) blockiert. Alle folgenden Waschschritte zwischen den verschiedenen Inkubationen werden mit 0,05% (V/V) Tween-20 in 0,225 ml PBS durchgeführt.
– Probenherstellung. – 0,075 ml unbekanntes Plasma werden mit 0,225 ml Waschpuffer ergänzt – Bezugsproben werden durch Verdünnen von gepooltem Plasma mit Waschpuffer in den Konzentrationen von: 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1%, 0,5% und 0,1% hergestellt – nicht-spezifisches Signal-Röhrchen: 0,3 ml Waschpuffer – übertrage 0,1 ml jeder Probe in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen, inkubiere 1 h bei 37°C
– Messung. Nach dem Waschen werden 0,1 ml der zweiten Antikörperlösung (5 mcg/ml biotinylierter mAb3-15) zu jeder Vertiefung zugefügt und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen werden 0,1 ml Vectastain^TM ABC-Reagenz (Vector laboratories) zu jeder Vertiefung zugefügt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS, um das gesamte Tween-Detergenz zu entfernen, werden 0,1 ml frisch hergestelltes TMB-Substrat (TMB-Substrat-Kit, Pierce) zu jeder Vertiefung zugefügt. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml 2 N H₂SO₄ gestoppt, und die optische Dichte wird bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts gemessen.
– Berechnung. – Subtrahiere die durchschnittliche OD₄₅₀ des nicht-spezifischen Signal-Röhrchens von allen anderen – Stelle eine logistische Kurvenanpassung mit den Standards her und interpoliere die MGP-Werte der unbekannten Proben.

E4. Vorgehen für den Sandwich-ELISA (2).
Für das Prinzip dieses Tests siehe die Einleitung unter E3, oben.

– Maus-anti-MGP^3-15 (1 μg/ml in 0,1 M Na-Carbonat-Puffer, pH 9,6) wurde durch Pipettieren von 50 μl dieser Lösung pro Vertiefung und Inkubieren der Platten für 1 h bei 37°C an die Mikrotiterplatte gekoppelt;
– Verbleibende aktive Stellen werden mit Blockierungspuffer (Roche Diagnostics Blocking Reagent, Kat.-Nr. 1 112 589) blockiert, 100 μl/Vertiefung für 1 h bei 37°C;
– Nach wiederholtem Waschen mit Waschpuffer (0,3% (Gew/V) Tween-20 in phosphatgepufferter Salzlösung) sind die Platten fertig für die Verwendung: entweder Serum oder gereinigtes MGP werden in die Vertiefung pipettiert (50 μl), Inkubation für 60 min bei 37°C;
– Nicht gebundenes Material wird durch Waschen mit PBS-Tween-Puffer entfernt;
– Der zweite Antikörper (Maus-anti-MGP^54-84, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase) wird pipettiert (50 μl, 1 μg/ml), und die Platten werden für 60 min bei 37°C inkubiert;
– Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween-Puffer wird die Menge des Antikörpers, der an die Platte gebunden ist, unter Verwendung der TMB-Färbung (enzymatischer TMB-Kit von Roche) quantifiziert;
– Nach 10 min Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 1 M H₂SO₄ gestoppt, wonach die Platte bei 450 nm abgelesen wird.

F. Kalibrierungskurve und Test-Charakteristika
Ein Beispiel von Serum- und Plasma-Verdünnungskurven, die mit dem Antikörper-Fang-ELISA erhalten wurden, ist in 2 gezeigt. Die Kalibrierungskurven wurden an 12 verschiedenen Tagen unter Verwendung von sechs verschiedenen Verdünnungen von gepooltem Bezugsserum hergestellt. Jede Verdünnung wurde doppelt gemessen, und die mittleren optischen Dichten (OD) bei 450 nm (SA) wurden als eine Funktion der Serumkonzentration ausgedrückt (2). Bei steigenden Verdünnungen der Serumprobe wurde mehr anti-MGP an die Platte gebunden, wobei der Puffer-Wert ein theoretisches Maximum war. Die untere Nachweisgrenze wurde als die mittlere OD + dreimal die Standardabweichung des Pufferwerts definiert und betrug 2,096 – 3 × 0,089 = 1,829, was einer MGP-Konzentration von 8,5 E/L entspricht. Die Intra- und Inter-Assay-Variation des Tests wurden unter Verwendung einer vierfachen Verdünnung des Bezugsserums bestimmt. Die Intra-Assay-Variation wurde durch Ausdrücken der Standardabweichung als ein Prozentsatz des Mittelwerts, der von 21 Wiederholungen, an drei verschiedenen Tagen wiederholt, erhalten wurde, berechnet und ergab 5,4%. Für die Bewertung der Inter-Assay-Variation wurden doppelte Messungen an 14 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt, wonach die Standardabweichung als ein Prozentsatz der Mittelwerte ausgedrückt wurde, um einen Wert von 12,6% zu ergeben.
In späteren Experimenten kann eine stufenweise Verbesserung gesehen werden, d. h. die Puffer-Werte (kein Serum zugegeben) sind etwas höher, und die Plateau-Werte bei hohen MGP-Konzentrationen sind niedriger. Dies ist abhängig von Faktoren wie der Färbedauer usw.
G. Validität des Tests
Ein Beweis für die Validität des Tests wurde von seiner Spezies-Spezifität erhalten: während mit menschlichem Serum eine gute Antwort erhalten wurde, gaben Ratten- und Mausserum gar keine Antwort (3). Dies muss aufgrund des 2 Aminosäurerest-Unterschieds zwischen der Ratten- und der menschlichen MGP-Sequenz 3-15 sein.
Proben von fünf verschiedenen Freiwilligen wurden in doppelter Ausführung getestet, was eine gute Reproduzierbarkeit und Kurven zeigte, wobei vier davon im selben Bereich waren, während es einen Ausreißer gab (4).
Für die Bewertung des normalen Bereichs und der Bezugsgruppen wurden offensichtlich gesunde Subjekte unter der Masstrichter Bevölkerung rekrutiert. Der ,normale Bereich' für MGP wurde in 80 offensichtlich gesunden Männern im Alter zwischen 20 und 84 Jahren etabliert. Es wurde gefunden, dass der Mittelwert für Serum-MGP in dieser Gruppe 96 ± 17 E/L war. Daher wurde der normale Bereich (definiert als der Mittelwert ± 2 SA) berechnet, dass er zwischen 62 und 130 E/L liegt. Es wurde keine offensichtliche Altersabhängigkeit für MGP in dieser Gruppe beobachtet. Ähnliche Daten wurden für ältere Frauen (> 60 Jahre alt) beobachtet, aber bei Frauen zwischen 20–55 Jahren wurde ein größerer Bereich gefunden. Dies kann mit hormonellen Änderungen in Beziehung stehen und bildet die Basis für unsere Entscheidung, dass Frauen, die < 60 Jahre alt sind, nicht in die hier präsentierten Experimente eingeschlossen wurden.
Die Tag-zu-Tag-Variationen und die innerhalb eines Tages wurden in einer Gruppe von 12 gesunden Männern (20–35 Jahre alt) bestimmt, von denen an neun Zeitpunkten eines Tages und an 4 verschiedenen Tagen um 9:00 Uhr früh in wöchentlichen Abständen Blut durch Venenpunktion genommen wurde. Die Tag-zu-Tag-Variationen und die innerhalb eines Tages wurden in einer Gruppe von 12 gesunden Männern (20–35 Jahre alt) bestimmt, von denen an neun Zeitpunkten eines Tages und an 4 verschiedenen Tagen um 9:00 Uhr früh in wöchentlichen Abständen Blut durch Venenpunktion genommen wurde. Die Variation innerhalb eines Tages wurde durch Ausdrücken der Standardabweichung als ein Prozentsatz des Mittelwerts der neun Zeitpunkte getrennt für jedes Subjekt berechnet und ergab 11%. Es wurde kein deutliches tagesrhythmisches Muster beobachtet. Die Tag-zu-Tag-Variation wurde auf eine ähnliche Weise aus den vier Proben berechnet, die in wöchentlichen Abständen erhalten wurden, und es wurde gefunden, dass sie 8% ist.
Die Antikörper wurden weiterhin durch Inkubieren derselben mit hochverdünntem Peptid MGP3-15 getestet. Sogar in Konzentrationen, die so niedrig wie 0,09 μg/ml waren, war der Pufferwert fast vollständig blockiert (5).
H. Proben-Herstellung
Um weiterhin die Robustheit des Assays zu bewerten, haben wir den Einfluss der Variationen in der Probenherstellung bei den folgenden Schritten überprüft: Zentrifugationsgeschwindigkeit (1500 und 10000 × g) während der Serumherstellung, Zentrifugation (10000 × g) nach dem Zufügen von mAb^3-15, Frieren und Auftauen der Serumprobe (bis zu 8 Zyklen des Frierens und Auftauens) und Inkubationsdauer (zwischen 3 und 60 Minuten bei Raumtemperatur) der Serumprobe mit mAb^3-15. In keinem dieser Fälle beeinflusste die Proben-Behandlung die beobachtete MGP-Konzentration messbar.
I. Assay-Spezifität
Der mAb^3-15, der im Assay verwendet wurde, wurde auf seine Fähigkeit getestet, zwischen den zwei rekombinanten Knochen-Gla-Proteinen: Osteocalcin und MGP (beide als chimäre Konstrukte, verknüpft mit 6-His-DHFR) zu unterscheiden. Mikrotiterplatten wurden entweder mit gereinigtem rekombinantem MGP (1 μg/Vertiefung) oder äquimolaren Mengen von gereinigtem rekombinantem Osteocalcin beschichtet. Die Kopplungswirksamkeit beider Proteine wurde mit anti-6His-Antikörpern überprüft. Wie in 10 gezeigt, enthielten beide Platten ähnliche Mengen an rekombinantem Protein (A: MGP; B: Osteocalcin), und mAb^3-15 reagierte gut mit MGP, nicht aber mit Osteocalcin. Die Spezies-Spezifität von mAb^3-15 wurde weiterhin durch Vergleichen ihrer Reaktion mit menschlichem, Ratten- und murinem Serum getestet. Die Kreuzreaktion mit Nagerseren war in allen getesteten Verdünnungen unter der Nachweisgrenze (< 8,5 E/L).
J. Anwendung und potenzieller diagnostischer Wert des MGP-Assays
J1. Cardiovaskulär
In einer Gruppe von über 500 nicht-hospitalisierten Männern im Alter zwischen 40 und 60 Jahren wurde die Verkalkung der abdominalen Aorta durch Röntgenuntersuchung gemessen, und 28 Subjekte mit schweren Verkalkungen wurden ausgewählt. Das zirkulierende MGP war bei jenen mit Verkalkungen signifikant höher als bei jenen in einer offensichtlich gesunden, alters- und geschlechtsangepassten Bezugsbevölkerung (p < 0,0001, siehe 6).
J2. Coronar-Atherosklerose
Patienten mit Coronar-Atherosklerose (n = 26) wurden von der Universitätsklinik rekrutiert, und ihr Serum-MGP wurde mit jenem der Bezugsbevölkerung verglichen. Das Serum-MGP war in der Patientengruppe signifikant erhöht (p < 0,001, siehe 7).
J3. Diabetes mellitus
Patienten mit Typ I-Diabetes mellitus (n = 23) wurden von der Universitätsklinik rekrutiert, und ihr Serum-MGP wurde mit jenem der Bezugsbevölkerung verglichen. Diabetes mellitus ist ein starker Risikofaktor für Atherosklerose. Das Serum-MGP war in der Patientengruppe signifikant erhöht (p < 0,01, siehe 8). Die Patienten wurden unabhängig von der Dauer der Krankheit ausgewählt.
J4. Bösartige Tumore
Patienten mit verschiedenen bösartigen Tumoren (n = 15) wurden vom Universitätsspital rekrutiert, und ihr Serum-MGP wurde mit jenem der Bezugsbevölkerung verglichen. Das Serum-MGP war in der Patientengruppe wesentlich und signifikant erhöht (p < 0,0001, siehe 9). Bösartige Tumore werden oft zu einer Angiogenese (neuen Bildung von Blutgefäßen) führen.
J5. Andere Krankheiten

Es wurden keine Korrelationen mit frühen Zeichen einer Atherosklerose (erhöhte Intima-Media-Dicke) oder mit verschiedenen Krankheiten gefunden, die nicht mit dem cardiovaskulären System in Beziehung stehen (siehe Tabelle 1). Dies legt nahe, dass der neu entwickelte Test spezifisch für Krankheiten des cardiovaskulären Systems ist, viele andere Patientengruppen müssen jedoch in dieser Hinsicht bewertet werden. Tabelle 1 Serum-MGP-Konzentrationen in Patienten

Zustand	Anzahl	Serum-MGP (% der alters- und geschlechtsangepassten Kontrollen)
Hohe Femur-BMD (Mittel + > 1 SA) Niedrige Femur-BMD (Mittel – < 1 SA) Alters-Osteoporose Erhöhte Intima/Media-Dicke	40 38 28 43	98,5 ± 5,7 102,0 ± 5,2 101,8 ± 6,8 97,3 ± 6,1

Die Daten sind ± SF angegeben. Eine erhöhte Intima/Media-Dicke war das höchste Quartil einer Gruppe von 200 offensichtlich gesunden älteren Subjekten. Die Subjekte mit hoher und niedriger BMD des Femurhalses wurden aus einer Bezugsbevölkerung (n = 250) erhalten, die unter der Maastrichter Bevölkerung rekrutiert wurde. Patienten mit Osteoporose, Diabetes mellitus und Atherosklerose wurde durch verschiedene Abteilungen der Universitätsklinik Maastricht erhalten.

In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit bereit gestellt, der ein Instrument umfasst, das für das Ausführen des diagnostischen Assays gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, einschließlich eines oder mehrerer Antikörpers, die spezifisch Epitope auf dem und/oder Konformationen des menschlichen Matrix-Gla-Protein(s) erkennen, chemischer Agenzien, die für das Ausführen des Tests nützlich oder notwendig sind und die dem Fachmann bekannt sind, und vorzugsweise Anweisungen, wie der Test auf optimale Weise ausgeführt werden soll.
Die vorliegende Offenbarung soll in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht als einschränkend angesehen werden, wobei der Rahmen der Erfindung durch die angefügten Ansprüche angezeigt wird, und alle Änderungen, die in der Bedeutung und im Bereich der Gleichwertigkeit liegen, sollen darin einbezogen sein. Sequenzprotokoll

Claims

Assay zum Nachweis und zur Bestimmung von Matrix-Gla-Protein in einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe, wobei der Assay die Verwendung eines oder mehrerer Antikörper umfasst, die spezifisch Epitope auf dem und/oder Konformationen des menschlichen Matrix-Gla-Proteins erkennen.
Assay gemäß Anspruch 1, wobei die Antikörper monoclonale Antikörper sind.
Assay gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Assay die Verwendung eines oder mehrerer der monoclonalen Antikörper umfasst, die gegen ein Epitop in den Resten 3-15, 35-49 bzw. 54-84 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins gerichtet sind.
Verwendung von Matrix-Gla-Protein oder einem mit Matrix-Gla-Protein verwandten Antigen oder einem Fragment des Matrix-Gla-Proteins oder eines mit Matrix-Gla-Protein verwandten Antigens, wie durch den Assay gemäß Anspruch 1 nachgewiesen, als ein Biomarker für eine Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe aus Atherosklerose, vaskulärer Verkalkung, bösartigen Tumoren, Diabetes mellitus und Angiogenese/Neogenese in der Tumorentwicklung.
Diagnostischer Kit zum Testen von menschlichem Matrix-Gla-Protein in einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe, umfassend: einen oder mehrere Antikörper, die gegen ein Epitop in den Aminosäureresten 3-15, 35-49 oder 54-84 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins gerichtet sind, wobei der eine oder die mehreren Antikörper von einem Hybridom hergestellt werden, das durch Fusion von Zellen aus einem Mausmyelom und Milzzellen einer Maus gebildet wurde, die vorher mit einem Peptid immunisiert wurde, das homolog zu den Aminosäureresten 3-15, 35-49 bzw. 54-84 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins ist.
Verfahren zur Bestimmung von Matrix-Gla-Protein, das in einer menschlichen Serum oder Plasmaprobe vorhanden ist, umfassend: a) Mischen eines bekannten Überschusses eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch ein Epitop in den Aminosäureresten 3-15, 35-49 oder 54-84 des Matrix-Gla-Proteins erkennt, mit einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe, die eine unbekannte Menge Antigen enthält; Einbringen des resultierenden Gemischs in eine Mikrotiterplatte, die mit einem bekannten Antigen beschichtet ist, Ermöglichen der Bindung von nicht gebundenem Antikörper an die Mikrotiter-Vertiefung; Messen der Menge an nicht gebundenem Antikörper mit einem zweiten markierten Antikörper, um das Matrix-Gla-Protein in der menschlichen Serum- oder Plasmaprobe zu bestimmen; oder b) Mischen einer bekannten Menge eines markierten Tracer-Antigens, wobei das Tracer-Antigen ein Peptid ist, das analog zu den Aminosäuresequenzen 3-15, 35-49 oder 54-84 in menschlichem Matrix-Gla-Protein ist, mit einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe, die eine unbekannte Menge Antigen enthält; Einbringen des resultierenden Gemischs in eine Mikrotiterplatte, die mit einem monoclonalen Antikörper beschichtet ist, der spezifisch ein Epitop in den Aminosäureresten 3-15, 35-49 oder 54-84 des Matrix-Gla-Proteins erkennt, um eine Antikörpermatrix zu bilden, Ermöglichen des Konkurrierens des Antigens in der menschlichen Serum- oder Plasmaprobe mit dem markierten Tracer-Antigen um die Bindung an die Antikörpermatrix; Messen der Menge von Antigen-gebundenem Antikörper in dem Gemisch, um das Matrix-Gla-Protein in der menschlichen Serum- oder Plasmaprobe zu bestimmen; oder c) Ermöglichen, dass ein erster Antikörper an die feste Phase einer Mikrotiterplatte bindet; Hinzufügen einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe, die eine unbekannte Menge von Antigen enthält, zu dem gebundenen ersten Antikörper, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden; Hinzufügen eines markierten zweiten Antikörpers zu dem Antigen-Antikörper-Komplex und Ermöglichen der Bindung an ein anderes Epitop des Antigens des Antigen-Antikörper-Komplexes; Messen der Menge des markierten zweiten Antikörpers, die an die Matrix gebunden ist, um das in der menschlichen Serum- oder Plasmaprobe vorhandene Matrix-Gla-Protein zu bestimmen; wobei mindestens einer des ersten Antikörpers und des zweiten Antikörpers ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der spezifisch ein Epitop in den Aminosäureresten 3-15, 35-49 oder 54-84 des Matrix-Gla-Proteins erkennt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in Schritt c) der erste Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der spezifisch ein Epitop in den Aminosäureresten 3-15, 35-49 oder 54-84 des Matrix-Gla-Proteins erkennt, und wobei der zweite Antikörper ein anderes Mitglied dieser Gruppe ist.
Monoclonaler Antikörper der IgG-Klasse, umfassend einen monoclonalen Antikörper, der gegen ein Epitop in den Resten 3-15 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins gerichtet ist, wobei der Antikörper von einem Hybridom hergestellt wird, das durch Fusion von Zellen eines Mausmyeloms und Milzzellen einer Maus gebildet wurde, die vorher mit einem Peptid immunisiert worden ist, das homolog zu den Aminosäureresten 3-15 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins ist.
Monoclonaler Antikörper der IgG-Klasse, umfassend einen monoclonalen Antikörper, der gegen ein Epitop in den Resten 35-49 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins gerichtet ist, wobei der Antikörper von einem Hybridom hergestellt wird, das durch Fusion von Zellen eines Mausmyeloms und Milzzellen einer Maus gebildet wurde, die vorher mit einem Peptid immunisiert wurde, das homolog zu den Aminosäureresten 35-49 des menschlichen Matrix-Gla-Proteins ist.