DD276165A5 - Verfahren zur detektion maligner zellen - Google Patents
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Abstract
Erfindungsgemaess wird ein Verfahren zur Detektion maligner Zellen mit Hilfe von monoklonalen Antikoerpern bereitgestellt, welche stark an ein Proteinantigen binden, das mit menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen ("NSCLC"), menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinomen und anderen menschlichen Karzinomen einschliesslich vieler Karzinome des Colons und der Brust assoziiert ist. Die Antikoerper binden wesentlich weniger stark an normale Humanzellen als an Turmorzellen. Erfindungsgemaess umfasst ist auch ein neues Glykoprotein-Antigen mit 110 000 Dalton, das auf der Zelloberflaeche menschlicher nicht-kleinzelliger Lungenkarzinomtumorzellen und auf Zellen bestimmter anderer Humankarzinome zu finden ist. Die aminoterminale Aminosaeuresequenz dieses Antigens ist:1-X-V-Q-5-P-E-X-P-10V-A-L-V-15T-D-A-X-20L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-Lworin X eine nicht-identifizierte Aminosaeure bedeutet.
Description
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Detektion maligner Zellen bereitgestellt. Der zur Detektion verwendete monoklonal Antikörper ist spezifisch für Karzinomantigene. Dieser monoklonal Antikörper ist insbesondere imrnunospezifisch für und/oder immunoreaktiv mit einem Proteinantigen, das beim nicht-kleinzelligen Lungen-Karzinom beim Menschen (human nonsmall cell lung carcinoma NSCLC) und bei bestimmten anderen Karzinomen beim Menschen einschließlich bei Brust· und Colonkarzinomen auftritt.
Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper reagiert mit einer Determinante eines Glycoprcteinantigens, das mit NSCLC-Zellen und auch mit anderen Karzinomen assoziiert ist, wozu Brust-, Colon- und kleinzellige Lungenkarzinome gehören. Der erfindungsgemäß verwendete monoktonale Antikörper besitzt klar unterscheidbaro Eigenschaften und Fähigkeiten und findet daher Anwendung sowohl bei in vivo- als auch bei in vitro-klinischen Diagnosen. Der erfindungsgemäß verwendete Antikörper kann außerdem therapeutisch eingesetzt werden. So kann der Antikörper ein zielselektiver Träger verschiedener Agentien sein, welche gegen Tumore wirken, wozu beispielsweise chemotherapeutische Arzneimittel, Toxine, Immunmodulatoren und Radioisotope gehören.
Ferner können die durch diesen Antikörper produzierten Hybridomzellen unter Einsatz der rekombinante DNA verwendenden Technik so modifiziert werden, daß die erhaltenen Antikörper eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität vermitteln oder für Tumorzellen in Anwesenheit von Komplementkomponenten zytolytisch sind.
Männer, die ihrem Krebsleiden erliegen, sterben vorwiegend an Lungenkrebs. Dabei sterben mehr Männer an Lungenkrebs als Frauen an Brustkrebs, welcher die bei Frauen häufigste Krebserkrankung ist. Der Lungenkrebs bzw. die Lungenkarzinome können in die folgenden vier histologischen Haupttypen unterteilt werden:
(1) Epidermoides oder Plattenepithelkarzinom (30%),
(2) Adenokarzinom (35%),
(3) undlfferenzlerte· großzelllges Karzinom (15%) und
(4) kleinzelliges Karzinom (20%).
Zum sogen, nicht-kleinzelligen Lugenkarzinom (NSCLC) gehören dio folgenden Zelltyr sn: epidermoide Karzinonizellen, Adenokarzinomzallan und große undifferenzierte Karzinomzellen.
In den meisten Fällen sind Lungenkarzinome durch Chemotherapie oder Bestrahlung nicht heilbar. Kleinzellige Lungenkarzinome können auf eine Chemotherapie und eine Bectrahlungsthercpio durch Reduktion ihrer Größe ansprechen. Jedoch stellt dies keine endgültige Heilung der. Nur durch eine vollständige ch!<urgi>che Entfernung des Tumors scheint eine wirksame Therapie möglich zu sein. Leider habsn jedoch weniger als 30% der Lungenkrebspatienten Tumore, die, nachdem sie diagnostiziert worden sind, auch völlig reseziert werden können. Von denjenigpn Patenten, denen der Tumor chirurgisch vollständig (soweit feststellbar) entfernt wurde, überleben nur Vj mehr als fünf Jahre. Es besteht daher ein großes Bedürfnis danach, Lungonkrebs in einem frühoron Stadium diagnostizieren zu können, die Ausbreitung des Krebses besser definieren zu können und eine wirksamere Therapie zur Hand zu haben.
Monoklonale Antikörper, die homogene Antikörpermolekülo darstellen, welche an eine einzelne molekulare Stelle (d.h. ein Epitop) an einem Antigen mit einer spezifischen Bindungs- oder Affinitätskonstant a bindon, kann man nach droi im Stand der Technik beschriebenen Verfahren herstellen.
Man kann monoklonal Antikörper nach der Hybrldomtechnik herstellen, die von Köhler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature256:495; 1976, Eur. J.lmmunol.6: 511).
Durch Verschmelzen antlkfirper-produzierender Zellen (Milz-Lymphozvten) mit Myelomzellen schufen Köhler und Milstein Hybridzellen, wobei immortalisierte Zellinien entstanden, welche einerseits die Fähigkeit zur Antikörperherstellung besitzen und andererseits in einer Zellkultur permanent wachsen können. Die Hybridoma secernieren einen einzelnen Typ von Immunoglobulin einer prädefinierten Antigenspezifizität in Abhängigkeit von dem Antigen, dem die Lymphozyten zuvor ausgesetzt waren.
In alternativer Weise kann man monoklonal Antikörper durch in vitro-Trancformation von B-Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Säugetieren mit beispielsweise dem Epstein Barr Virus (EBV) produzieren. Das Virus immortalisiert die antikörperproduzierenden Lymphozyten. Derartige Transformationstechniken sind im Stand der Technik bekannt, man vgl. beispielsweise Steinmetz et al.. 1977, Nature 269:420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).
Schließlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper unter Einsatz von Techniken zu produzieren, bei denen die EBV-Immortalisierung und die Zellfusion oder die Hybridomtechnik kombiniert werden. CoIe et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., S. 77-96) beschreiben Techniken zum Verschmelzen einer menschlichen Plasmazytom- oder lymphoblastoiden Zellinie als Fusionspartner eines EBV-transformierten Donorlymphozyten, welche zuvor als eine Zellinie erkannt worden sind. In einem solchen System sind beide ursprünglichen Zellinien unsterblich. Der Fusionspartner muß somit geeignete Arzneimittel-Marker aufweisen, um gegenüber den ursprünglichen Zellinien selektioniert werden zu können, wenn das fusionierte Hybridom kultiviert wird. Die entstehenden EBV-Hybridome produzieren Antikörper, welche spezifisch für die eingesetzte EBV-Lymphozyten-Zellinie ist.
Monoklonale Antikörper können in großen Mengen durch in vitro-Zellkultivierung bestimmter Hybridome oder transformierter Zellinien hergestellt werden. Außerdem führt die Inokulierung einer Hybridomzellinie in die Peritonealhöhle geeigneter Säugetiere, beispielsweise Mäu»e, zu einem Tumor, der hohe Konzentrationen (1-20 mg/ml) des monoklonalen Antikörpers in die Tumoraszitesflüssigkoit sekretiert. Durch Entfernen dar Aszitesflüssigkeit und Reinigen des monoklonalen Antikörpers kann eine einzelne Maus eine ausreichende Menge eines Antikörpers bereitstellen, die für Tausende von Diagnose-Assays genügt. Monoklomle Antikörper für menschliche Lungenkrebsantigene sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Sikoraetal., 1981, Brit. J.Cancer 43:696; Cuttita et al., 1981, Pfoc. Nat'IAcad. Sei. USA 78:4591 ,Moody et al.,1981, Science 214: 1246; Minna et al., 1981, In Vitro 17:1058; Kennel et al., 1981, Cancer Res. 41:3465; Chem. Abst.95 (15): 1308502; Baylin et al.,
1982, Proc. Nat'l Ai:ad. Sei. USA 79: 4650; Carney et al., 1982, Pathobiology Annual 12:115; Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology 10:3; Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Prevent β: 185; Mulshine et al.; 1983, J. Immunol. 131:497; Huang et al.,
1983. Arch. Biochem. Biophys.220:318; Saji et al., 1984, Hybridoma 3:119; Bio. Abst.79005569; Bosslet et al., Behring, Ins. Mitt.74:27; Chem. Abst. AC 101 (9): 706686; Rosetetal., 1984, Cancer Res.44: 2052; Bio. Ast.79023605; Princleretal., 1982, Cancer Ros.42:843; Mazauric et al., 1982, Cancer Res.42:150; Braatz et al., 1982, Cancer Res.42:849; Sobel et al., 1982, Fed. Pfoc.41:409, Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., S.77-96 und Varki et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., S. 207.
In den US-Patentanmeldungen mit den Ssr.Nos.667521 (eingereicht am 2. November 1984); 785177 (eingereicht am 7. Oktober 1985); 684759 (eingereicht am 21.Dezember 1984); 776321 (eingereicht am 18. Oktober 1985) und 738612 (eingereicht am 28. Mai 1985) sind bestimmte monoklonale Antikörper gegen menschliche nicht-kleinzellige Lungenkarzinome beschrieben. Monoklonale Antikörper können zur früheren Diagnose von Lungenkrebs, zur genaueren Bestimmung des Ausbreitungsgrades von Krebs und für eine wirksamere Therapie von Lungenkrebs eingesetzt werden. Voraussetzung dafür ist jedoch, daß man Antikörper für Antigene findet, die in Lungenkrebsgewebe stärker exprimiert werden als in normalem Gewebe von Erwachsenen. Angesichts der bekannten Heterogenität von Tumorzellenpopulationen, der Anwesenheit verschiedener Determinanten auf demselben Antigenmolekül, der zu erwartenden Unterschiede zwischen Antigenen bezüglich ihrer Stabilität als diagnostische Marker und als therapeutische Targets und des untdrschiedlichen biologischen Verhaltens verschiedener Antikörper zu demselben Antigen müssen für mehrere unterschiedliche Antikörper auch mehrere unterschiedliche Antigone zum Einsatz gebracht werden.
Ziel der Erfindung ist es, Diagnose und Therapie von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen und von bestimmtun anderen Humankarzinomen mit Hilfe monoklonaler Antikörper zu ermöglichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung Ist es, ein neues Verfahren zur Diagnose und Therapie von Lungenkrebs, Brustkrebs und Colonkrebs bereitzustellen.
Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper gehört zu einer neuen Klasse, die als 1.20 bezeichnet ist. Dieser monoklonale Antikörper ist spezifisch für eine Determinante (Determinantenstelle) an einem Glycoproteinantigen, das mit menschlichen nlcht-kleinzelligen Lungenkarzinomzellen (NSCLC) assoziiert ist. Zu diesen Zelle/t, die nachstehend als .NSCLC-Zellen" bezeichnet sind, gehören epldermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenziert großzellige Karzinomzellen. Die Determinante kann auch an Antigenen von einigen anderen Karzinomen vorhanden sein, beispielsweise bei einigen Karzinomen der Brust und des Colon und beim kleinzelligen Lungenkarzinom. Somit bindet der erfindungsgemäß verwendete Antikörper auch an Zellen von anderen Karzinomen und kann zur Diagnose und Therapie von allen anderen Tumoren eingesetzt werden, die das durch den Antikörper L 20 identifizierte Antigen exprimieren. Der erfindungsgemäß verwendate monoklonale Antikörper bindet wesentlich weniger stark an normale erwachsene Zellen als an Tumorzellen. Mit dem Ausdruck .bindet wesentlich weniger stark an" soll zum Ausdruck gebracht werden, daß ein Binden überhaupt nicht detektierbar ist oder nur als sehrschwaches Anfärben detektierbar ist, falls immunohistologische Techniken zur Anwendung kommen. Der Antikörper ist somit in hohem Maße spezifisch für das Antigen, das charakteristisch für NSCLC und bestimmte andere Karzinome ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch.das neue L20-Antigen, das durch den Antikörper L20 identifiziert wird, und die Klasse von Antikörpern, die an dieses Antigen binden, dafür immunospezifisch sind oder damit immunoreaktiv sind. Erfindungsgemäß werden Verfahren zur Verwendung des gereinigten oder Monierten L20-Antigens als Vakzin zum Immunisieren gegen bestimmte Karzinome bereitgestellt.
Der erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper kann bei bestimmten Diagnosevorfahren eingesetzt werden. So kann dieser Antikörper zur Bestimmung malignen Lungengewebes und anderer maligner Humangewebe eingesetzt werden. Dabei untersucht man das Gewebe auf die Anwesenheit eines Antigens mit den Charakteristika eines durch den Antikörper L20 definierten Glycoproteins mit 110000 Dalton. So kann das Gewebe mit einem Antikörper in Kontakt gebracht werden, der eine Determinantenstelle auf einer Zelle definiert, welche mit dem Antigen assoziiert ist, das die Charakteristika des Antigens besitzt, das durch den Antikörper L20, ein funktionelles Äquivalent oder ein Fragment dieses Antikörpers definiert ist. So kann jede Interaktion des Antikörpers und der Antigendeterminanten detektiert werden. Bei einer solchen Arbeitsweise wird die Anwesenheit von NSCLC-Zellen in einer Probe untersucht, von der angenommen wird, daß sie derartige Zellen enthält. Die Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, oer derartige Zellen von anderen Zelltypen unterscheiden kann, welche in der Probe ebenfalls vorhanden sein können. Den Antikörper bringt man bei solchen Bedingungen mit der Probe in Kontakt, bei denen er an die Zellen binden kann. Nach dem Inkontaktbringen wird bestimmt, ob der Antikörper an die Zellen in der Probe bindet oder nicht. Ob der Antikörper bindet, hingt davon ab, ob NSCLC-Zellen in der Probe vorhanden sind oder nicht. Im allgemeinen wird die Probe mit einarn markierten spezifischen Bindungspartner des monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht. Diese Markierung ist in der Lage, ein detektierbares Signal zu liefern.
Bei einem weiteren Diagnoseverfahren unter Anwendung der in vivo-Lokalisierung eines Tumors wird ein erfindungsgemäß anwendbarer, gereinigter Antikörper oder ein Antikorperfragme.it, der (das) mit einem Agens markiert ist, das ein detektierbares Signal liefert, an einen Patienten verabreicht. Die Lokalisation wird dann durch externe Szintographie, k-missionstomographie oder Scannen auf Radionuklide delektiert. Dieses Verfahren kann auch dazu eingesetzt werden, bösartige Geschwülste bei Krebspatienten in pathologische Stadien anhand deren Ausbreitung einzuteilen und die Veränderungen beim Ansprechen auf die Therapie zu überwachen.
Der erfindungsgem&ß verwendete Antikörper kann auch therapeutisch eingesetzt werden, da der L20-Antikörper und ähnliche Antikörper mit dsm L20-Antigen reagieren, welches in hohen Konzentrationen an der Oberfläche der Tumorzelle exprimiert wird. Antikörper können daher als Träger verschiedener Agentien eingesetzt werden, welche Antitumorwirkung besitzen. Dazu zählen chemotherapeutische Arzneimittel, Toxine, Immunmodulatoren und Radioisotope.
Außerdem kann der L20-Antikörper derart modifiziert werden, daß er eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) vermittelt; d. h. er kann NSCLC-Zellen in Anwesenheit von Humanlymphozyteii oder Makrophagen toten oder er wirkt für Tumorzellen in Anwesenheit des Humankomplements zytolytisch.
Eine derartige Modifikation kann beispielsweise mit Hilfe von Techniken erzielt werden, die kürzlich iür die Produktion von „chimeren Antikörpern" entwickelt wurde. Demgemäß werden Gene, die für die variable Region des L20-Antikörpermoleküls kodieren, mit Humangenen verknüpft, die für die Fc-Region eines Antikörpers mit einer geeigneten biologischen Aktivität (beispielsweise die Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln« kodieren. Es können auch neue Antikörper, die von der Maus oder vom Menschen stammen, für das L20-Antigen mit den geeigneten biologischen Funktionen hergestellt werden.
Erfindungsgemäß wird ein neuer monoklonaler Antikörper verwendet, der als L20 bezeichnet ist 'und der immunospezifisch für und/oder Immunoreaktiv mit einem Antigen an menschlichen NSCLC-Zellen und Zellen von verschiedenen anderen Humankarzinomen ist, wozu Karzinome des Colons und der Brust und klelnzellige Lungenkarzinome zählen. Erfindungsgemäß werden somit Verfahren zur Verwendung eines derartigen neuen monoklonalon Antikörpers bereitgestellt, der für bestimmte diagnostische und therapeutische Zwecke Anwendung finden kann.
Die Erfindung betrifft auch ein neuos Zelloberflächenantigen, das für menschliche NSCLC-Zellen und bestimmte andere Humankarzinome der Brust, des Colons und der Lunge charakteristisch ist.
Monoklonale Antikörper gegen Human-NSCLC und bestimmte andere Humankdrzinome können nach der Hybridom-Fusionstechnik, durch EBV-Transformotion von humanen Lymphozyten, weiche Antikörper produzieren, oder nach Techniken, bei denen die Zellverschmelzung und EBV-Immortalisationstechniken kombiniert werden, hergestellt werden.
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Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der Hybridomzell-Fusionstechnik hergestellt. So werden beispielsweise menschliche Lungenkarzinomzellon von pleuralen Ergüssen, kultivierte Zellen von explantierten menschlichen NSCLC-Tumoren oder Zellen von einer normalen fötalen Lunge oder Lysate von durirtigen Zellen als Immunogen eingesetzt. So wurden beispielsweise explantierte Zellen von einem NSCLC, menschliches Lungenadenokarzinom Nr. 3082, als Immunogen eingesetzt, man vgl. die weiter unten gemachten Ausführungen. Die Zellen wurden beispielsweise einer Maus injiziert. Nachdem genügend Zeit verstrichen war, wurde die Maus getötot. Es wurden somatische Antikörper-produzierende Lymphozyten erhalten. Die AntikÖrper-produzierenden Zellen können von den Lymphknoten, dor Milz und dem peripher") Blut der primlerten Tiere stemmen, wobei jedoch Milzzellen bevorzugt sind. Mäuselymphozyten führen zu oinem höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit den unten beschriebenen Mäusemyelomen. Es ist auch möglich, somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen einzusetzen. Die Milz-Zellchromosomen, die für die gewünschten Immunoglobuline kodieren, werden durch Verschmelzen der Milzzeilen mit Myelomzeüen, im allgemeinen in Anwesenheit von Polyethylenglycol, immortallslert. Es können verschiedene Myelomzellinien zur Herstellung fusionierter Zellhybride eingesetzt werden. Dazu zählen NSI-Ag4/l, X63-Ag8, MPC11-45.6TG U, X63-Ag.653, Sp2/0-Ag 14, Fo und S194/ BXXO.Bu.1, von Mäusen erhalten, und 210.RCY3.Ag 1.2.3, U-226AR und GM1500GTGAL2, von Ratten erhalten (Hammerling et al.; 1981, .Monoclonal Antibodies and T-cell hybrldomas" In Research Monographs In Immunology, Band 3, J.L.Turk, Hrsg. Elsevier/North Holland Biomedlcal Press, New York). So wurden beispielsweise NS 1 -Zellen eingesetzt. Die erhaltenen Zellen, die die fusionierten Hybridoma umfassen, läßt man in einem selektiven Medium wachsen, wozu beispielsweise HAT-Medium zählt. Die überlebenden Zellen werden In diesem Medium unter Einsatz limitierender Verdünnungstechniken vermehrt. D'a
Zellen wachsen in einem geeigneten Behälter, beispielsweise den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Der Überstand wird auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifität gescreent.
Es existieren verschiedene übliche Verfahren, um die monoklonalen Antikörper zu isolieren und zu reinigen und um sie beispielsweise von anderen Proteinen oder anderen Verunreinigungen zu befreien.
Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der EBV-Transformationstechnik hergestellt. So werden beispielsweise Lymphozyten, die aus dem peripheren Blut, aus Tumor· hhpebenden Lymphknoten, aus aus Markknochen gewonnenen Aspiraten, aus Tumoren oder aus pleuralen Ergüssen ve ί Patienten mit NSCLC stammen, unter Verwendung von EBV immortalisiert, gemäß den von CoIe et al., 1984, Cancer Her U: 2750, beschriebenen Methoden. Wie dort bereits ausgeführt ist, sind B-Lymphozyten, die für Tumorantigene spezifisch '.;nd, in Lungenkrebspatienten selten. Es ist daher insbesonders wichtig, die Zahl der Antikörper-produzierenden Lympho; v'en zu erhöhen, indem man Lymphozyten, welche den Antikörper gegen das relevante Antigen produzieren, prSseleki-i. Öle EBV-Transformationstechnik umfaßt somit zwei Stufen:
(1) Anrv.T>,-r\ ng von Zellen mit Rezeptoren für das gegebene Antigen, i.e. L20-Antigen, das nachstehend beschrieben ist; und
(2) Imme -·<<, - 'orurcg derartiger Zellen durch Infektion mit EBV. ·
Die erfindungsgomäß verwendeten Antikörper gegen NSCLS können erfindungsgemäß euch durch Kombination der Transformations- und Hybridom-Fusionstechnik hergestellt werden, man vgl. CoIe et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96. So kann man beispielsweise eine Myelomzellinie mit Donorlymphozyten von NSCLC-Patlenten verschmelzen, welche zuvor durch EBV-transformiert und als eine Zellinie erkannt worden sind, die unter Kulturbedingungen wachsen und sich entwickeln kann. Um in der Lage sein zu können, die erhaltenen EBV-Hybridom-Fusionszellinien zu selektieren, ist es erforderlich, daß der Fusionspartner dominante geeignete selektierbare Arzneimittelmarker, beispielsweise Ouabain- oder Neomycinresistenz, besitzt, so daß sich keine parentale Zellen entwickeln, wenn die verschmolzenen Hybridomzellinien kultiviert werden. Eine geeignete Linie ist die thioguaminresistente GM-150, ouabainresistente lymphoblastoide Zellinie, KR-4, beschrieben von CoIe et al., s. oben. Die erhaltenen Hybridomzellen werden nach üblichen Techniken kloniert.
Sobald dia gewünschten verschmolzenen Zellhybride oder transformierten Zellinien selektiert und kloniert sind in einzelne Antikörper-produzierende Zellinien, kann jede Zellinie nach beiden von zwei üblichen Wegen vermehrt werden. Die einzelne Zellinie kann in vitro, beispielsweise in Laboratoriums-Kulturgefäßen, vermehrt werden. Das Kulturmedium, das hoho Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen werden. In alternativer Weise kann die Ausbeute an monoklonalem Antikörper durch Injizieren einer Probe des Hybridoms in ein histokompatibles Tier des gewählten Typs erhöht werden, um so die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Verschmelzung bereitzustellen. Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper socernieren, der durch das fusionierte Zellhybrid produziert wird, entwickeln sich im infizierten Tier. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, beispielsweise Aszitesflüssigkeit oder Serum, stellen monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen bereit. Wie bereits von CoIe et al. in der oben angeführten Literaturstelle ausgeführt ist, ist es dann, falls Humanhybridome oder EBV-Hybridome eingesetzt werden, erforderlich, eine Abstoßung des den Tieren, beispielsweise Mäusen, injizierten Xenotransplantats zu verhindern. Es können immunodefiziente oder nackte Mäuse eingesetzt werden oder das Hybridom kann zuerst eine Passage in bestrahlten nackten Mäusen als fester subkutaner Tumor durchlaufen, in vitro kultiviert werden und dann intraperitoneal in mit Prittan primierte, bestrahlte nackte Mäuse injiziert werden, welche Aszitestumore entwickeln, die große Mengen spezifischer monoklonal Humanantikörper sekretleren, man vgl. die ober, aufgeführte Literaturstello von CoIe 6t al. Dor erfindungsgemäß verwendete monoklonale Antikörper bindet an ein neues Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen, das als L 20-Antigen bezeichnet ist und charakteristisch für menschliche NSCLC-Zellen und Zellen von bestimmten anderen menschlichen Karzinomen ist, wie dies nachstehend beschrieben ist. Das Glycoprotein-Antigen besitzt ein Molekulargewicht von etwa 110000 Dalton, wenn es einer Immunopräzipiution in einer Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wird, wie dies ebenfalls nachstehend beschrieben ist. Durch Verdauung des L20-Antigens mit Glycanase konnte gezeigt werden, daß es N-verbundene Oligosaccharidketten enthält.
Der L20-Antikörper wird beispielsweise von dem nachstehend beschriebenen L20-murinen Hybridom produziert. Der L20-Antikörpor ist vom Isotyp IgGI (dies ist ebenfalls nachstehend beschrieben) und besitzt einen Avidität von etwa 3 χ 10*. Dar Antikörper bindet nicht detektierbar an normale Zellen, wozu beispielsweise Fibroblasten, endotheliale Zellen oder Epitholzellen in den Hauptorganen zählen. Mit dem Ausdruck .er bindet nicht detektierbar" soll zum Ausdruck gebracht werden, daß immunohistologisch nur eine sehr schwacho Anfärbung oder überhaupt keine Anfärbung detektierbar ist. Erfindungsgemäß umfaßt sind auch nützliche bindende Fragmente des obigen monoklonalen Antikörpers, beispielsweise Fab, F(ab')t, Fv-Frigmunte usw. Die Antikörperfragmente erhält man nach üblichen Techniken. So kann man beispielsweise nützliche bindende Fragmente herstellen und durch Peptidaseverd&uunu, des Antikörpers unter Einsatz von Papain oder Pepsin. Ähnlich' Antikörper, wozu auch Antikörper unterschiedlicher isotypen, unterschiedlicher Affinität und mit neuen biologischen Funktionen, wie der Fähigkeit Tumorzellen in Anwesenheit des Komplements oder von Effektorzellen, beispielsweise I ymphoi/ten oder Makrophagon, zu töten, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt. Das oben aufgeführte spezifische Beispiel fur einen neuen erfindungsgemäßen Antikörper, das auf einen Antikörper gerichtet ist, der an eine spezifische Determinante an (!em entsprechenden Antigen bindet und zu der IgGI-Unterklasse aus einer murinen Quelle stammt, soll die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Sowohl dieser üben beschriebene Antikörper als auch solche Antikörper, die über eine funktionolle Äquivalenz mit dem obon beschriebenen Antikörper verfügen, unabhängig davon, ob sie auch einer murinen Quölle, aus einer „Säugetiurquelle" einschließlich des Menschen odor aus anderen Quellen oder aus
Kombinationen davon stammen, sind erfindungsgemäß umfaßt. Dies gilt auch für die Antikörper anderer Isotypen. Mit dem Ausdruck .funktioneile Äquivalenz* wird ein Antikörper bezeichnet, der in der Lage ist, an die oben beschriebene Determinante zu binden und mit einem bestimmten erfindungsgemäß erhaltlichen Antikörper um diese Determinante bzw. Determinanten^tellung in Wettbewerb zu treten. Dies bedeutet, daß ein derartiger Antikörper, falls er mit einer Probe vereinigt wird, die eine Zelle oder ein Fragment mit einer derartigen Determinante enthält, an diese Determinante bindet und einen erfindungsgemäß erhältlichen Antikörper davon abhält, an diese Determinante bzw. an diese Stelle zu binden. Da außerdem das erf.rdungsgemäße Antigen mehr als eine Determinante aufweisen kann, umfaßt die Erfindung auch monoklonal Antikörper, welche andere Determinanten als die durch den zuvor genannten monoklonalen Antikörper definierte Determinante definieren und die durch im Stand der Technik bekannte sequentielle Immunopräzipitations-Assays identifiziert werden können. Zur Erfindung gehörig sind auch Antikörper, die in Antwort auf die Antiken-bindenden Stellen hergestellt wurden, oder Idiotypen des L20-Antikörpers,da derartige anti-idiotypische Antikörper zur Analyse des Immunansprechens auf Tumorantigene für diagnostische Zwecke und zum Induzieren eines Immunansprechens für therapeutische oder prophylaktische Zwecke eingesetzt werden können (man vgl. Nepom et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. 81: 2664).
Das durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannte Antigen weist ein neues Zellobet flächen-Glycoprotein-Antigen auf, das für NSCLC-Zellen und andere Karzinome, einschließlich Brust· und Colonkarzinomen sowie kleinzelligen Lungenkarzinom charakteristisch ist. Das Antigen besitzt ein Molekulargewicht von etwa 110000 Dalton. Die aminoterminale Aminosäuresequenz des neuen Glycoprotein-Antigens ist die folgende:
15 10 15 20
Dabei bedeutet X eine Aminosäure, die bis jetzt noch nicht identifiziert worden ist. Die übrigen Buchstaben stellen die üblichen Abkürzungen für Aminosäuren dar. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denjenigen, die in der Prcteindatenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, zeigt keine signifikante Übereinstimmung mit irgendeiner der anderen bekannten Sequenzen.
Die erflndungsgemäßen monoklonalen Antikörper können als Sonden zum Detektieren diskreter Antigene in mensch icnen NSCLC und anderen Humantumoren eingesetzt werden. So kann man die Anwesenheit eines malignen Zustande in Lungengewebe oder anderen Humangeweben bestimmen, indem man das Gewebe auf die Expression oder auf das Fehlem einer derartigen Expression eines Glycoprotein-Antigens mit den Charakteristika des L20-Antigens untersucht. Der Ausdruck .mit den Charakteristika des" bezeichnet, daß das Antigen mit einem Antikörper reagieren kann, der das 120-Antigen erkennt. Die Expression oder das Fehlen der Expression dieses Antigens kann ein J für klinische Zwecke verwertbare Information darstellen, die mit Hilfe von üblichen histopathologischen Techniken nicht erhalten werden kann. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können beispielsweise dazu eingesetrt werden, nicht-kleinzellige Lungenkarzinomzellen in histclogischen und zoologischen Proben zu detektieren. Bringt man beispielsweise die nachstehend beschriebene Technik zum Anfärben mit Immunoperoxidase zur Anwendung, dann zeigen exzisierte Gewebeproben von Adenokarzinomen, epldermolden und kleinzelligen Karzinomen der Lunge eine intensive positive Verfärbung. Normales Lungen-, Milz, Brust-, Colon-, Nieren, Leber-, Hirn-, Herz-, Haut-, Schilddrüsen-, Hoden- und Vaginagewebe sowie normale Lymphozyten waren negativ.
Eine weitere wichtige in vitro diagnostisch» Anwendungsmöglichkeit für die erfindungsgemäßen monoklonalen Artikörper besteht in der Bewertung von Karzinomen, die sich von den NSCLC unterscheiden. Der Antikörper wurde eingesetzt, um das Epitop bbi Brust- und Colonkarzinomsn und in kleinzelligen Lungenkarzinomen zu detektieren. Normale Proben dieser Gewebe exprimiertun die Determinante nicht. Somit ist der monoklonal Antikörper nützlich zum Detektieren einer mit dem Tumor assoziierten antigenischen Determinante bzw. Antigendeterminante in diesen Karzinomen. Der monoklonal^ Antikörper kann somit ein nützliches diagnostisches Reagens für Brust- und Colonkarzinome und für kleinzellige Lungenkarzinome sein. In alternativer Weise können Immunofluoreszenztechniken zur Anwendung gebracht werden, um Humangewebeproben mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern zu untersuchen. So wurden beispielsweise Objektträger mit Kryostatschnitten einer gefrorenen, nicht-fixierten Gewebebiopsie oder exzisierten Tumorproben oder zytologischen Ausstrichen an der Luft getrocknet und mit dem monoklonalen Antikörper in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur inkubiert. Die zytologischen Ausstriche enthielten exfoliative Zellproben. Der Ausdruck .exfoliativ" bringt zum Ausdruck daß die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen enthält, die durch Kratzen oder Waschen der Gewebeoberfläche erhalten wurden, wobei diese Zellen einzeln oder als Schuppen oder als Plättchen entfernt wurden. Die exfoliative Zellprobe kann unterschieden werden von exisiertem Gewebe, wie demjenigen, das bei der Biopsie erhalten wurde. Dieses Verfahren findet Anwendung bei der Detektion eines malignen Zustande in gxfoliativen Zellproben aus der Lunge, beispielsweise Sputumprobe, aus den Bronchen, dem Gastrointestinaltrakt ein» ließlich Rachen und Mund, aus einem zervikaten Ausstrich usw.
Nach dem Trocknen wurden die Objektträger mit einem Antikörperpräparat gegen den monoklonalen Antikörper über schientet. Es handelt eich dabei gewöhnlich um eine Art von Antimauslmmunoglobulin, falls der eingesetzte monoklonal Antikörper aus der Verschmelzung von Milzlymphozyten von einer Maus mit einer Myelomlinie von der Maus stammt. Dieses Antirnausimmunoglobulin wurde nach bekannten Techniken mit einer Verbindung konjugiert, beispielsweise Rhodamin oder Fluoresceinisothiocyanat, die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Das Färbungsmuster und die Intensitäten innerhalb der Probe wurden dann mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops bestimmt und gegebenenfalls photographisch festgehalten. Obige Ausführungen beschreibet, primär die Verwendung der erfindungsgemaßen Antikörper in Immunofluore&zenztechniken. Die erflndungsgemäßen Antikörper können jedoch auch in den meisten Assays eingesetzt werden, bei denen Antigen· Antikörper-Reaktionen stattfinden. Es kann sich dabei um homogene oder heterogene Assays handeln. In einem homogenen Assay kann die Probe ein Gewebe sein, das lysiert und geklärt ist, um Debris zu entfernen. An der immonologisch·, η Reaktion nehmen gewöhnlich der spezifische Antikörper, ein mit einer Markierung ausgestatteter Analyt und die interessierend« Probe teil. Das von der Markierung stemmende Signal wirkt direkt oder indirekt modifiziert, sobald dar Antikörper an den mi* der Markierung ausgestatteten Analyt bindet. Sowohl die immunologische Reaktion als auch die Untersuchung darauf, wia stark diesa Reaktion war, werden in einor homogenen Lösung durchgeführt. Zu den
immunochemischen Markierungen, die Anwendung finden können, zählen freie Radikale, Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, Bakteriophagen, Coenzyme usw. '
Bei einem heterogenen Assay werden normalerweise die Probe, der spezifische Antikörper und Mittel zur Produktion eines detektierbaren Signals eingesetzt. Der monoklonal Antikörper ist gewöhnlich in Form eines Überzugs auf einem festen Träger oder einer festen Phase aufgebracht. Die Probe wird dann in flüssiger Phase mit dem Antikörper in der Fostphase in Kontakt gebracht. Der Träger für die Festphase wird dann von der flüssige Phase abgetrennt. Entweder die Festphase oder die flüssige Phase wird auf ein detektierbarns Signal untersucht, wobei Mittel zum Erzeugen eines derartigen Signals eingesetzt werden. Das Signal steht mit der Anwesenheit des Analyts in der Probe in Beziehung. Zu den Mitteln zu Erzeugung eines detektierbaren Signals gehören radioaktive Markierungen, fluoreszenzierende Agontien, Enzyme usw. Derartige heterogene Immunoassays sind beispielsweise Radioimmunoassays, Immunofluoreszenzverfahren, Enzyrn-Iinked-Immunoassays und dergleichen. Eine genauere Beschreibung obiger Immunoacsaytechniken findet sich in „Enzyme-Immunoassay" von Edward T.Magßio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. Diesbezüglich wird auch auf die folgenden US-PSen verwiesen: 3690834,3791932, 3817837,3850578,3853987,3867 517,3901654,3935074,3984533,3996345 und 4098876. Obige Aufzählung ist nicht vollständig.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch für in vivo diagnostische Anwendungen eingesetzt werden. So können beispielsweise Antikörper oder Fragmente, die aus den Antikörpern erhalten wurden, z. B. Fab- und F(ab')2-Fragmente, ι um Sichtbarmachen von Tumoren, einschließlich von metastatischen Einlagerungen, bei Patienten mit NSCLC eingenetzt werden, und zwar in ähnlicher Welse, wie dies für maligne Melanoma beschrieben ist von Larson et al., 1983, J. Nucl. Med.24·, 1231 nd von Larson et al.; 1983, J. Clin. Invest, 72: 2101. Der gereinigte Antikörper oder die Fragmente davon werden mit einem Age ns markiert, das ein deteKierbares Signal liefert. Es kann sich dabei um ein Radioisotop, beispielsweise n'Jod handeln. De Antikörper wird dann in einom geeigneten Träger, beispielsweise intravenös, an einen Patienten verabreicht. Die Lokalit ation des an den Tumor gebundenen Antikörpers wird durch externe Szintigrephie, Emissionstomographie oder durch Radioi iotop-Scannen unter Verwendung beispielsweise einer Gamma-Kamera detektiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch therapeutisch eingesetzt werden. Die monoklonalen Antikörper können in Verbindung mit einem breiten Spektrum pharmazeutischer oder zytotoxischer Agentien eingesetzt werden. So kann der Antikörper beispielsweise an ein Toxin zur Bildung eines Immunotoxlns (Jansen et al. 1982, Immunol. Rev. 62:185) oder tn ein radioaktives Material, z. B. 126I, '11I usw. (Order, 1984, Compr. Thor. 10:9; Larson et al., 1983, J. din. Invest. 72:2101; Carrasqi. illo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68:317) oder an ein Arzneimittel (Rowland et al., 1985, Cancer Immunol, lmmunother. 19: 1) zur Bildung eines Radiopharmakons oder eines Pharmakons gebunden werden. Konjugierte Antikörper können an Patiei ten verabreicht werden, um die tumorzerstörenden Wirkungen durch die zytotoxische Wirkung des chemotherapeutischen Agem zu unterstützen, welches aufgrund der bindenden Affinität der Antikorpereinheit zu dem Tumor transportiert wird. Sogenannte „chimere Antikörpermoleküle" des erfindungsgemäßen Antikörpers können hergestellt werden, die eine Maus· Antigen-bindende Domäne mit menschlichen Konstantregion-Domänen enthalten (Morrison et a!, 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A. 81:6851; Takeria et al., 1985, Nature, 314:452). Man kann so neue Antikörpermoleküle konstruieren, die wünschenswerte Effektorfunktionen besitzen. Sie haben beispielsweise die Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren oder ADCC zu vermitteln (Neuberger et al., 1984, Nature 312:604).
Eine weitere therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper besteht darin, einen ar.tiidiotypischen Antikörper unter Verwendung des L2u-Antikörpers als Immunogen herzustel.en (man vgl. beispielsweise Nepon et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A., 81:2864, Lee et al., 1985, Proc. Nat'l Acad. Sei. «2:6286).
Erfindungsgemäß ist ferner vor Interesse, daß die erfindungsgemäßen Antikörper mit anderen Antikörpern für NSCLC oder für andere Tumoro kombiniert werden können.. \ zu zählen diejenigen, die beschrieben sind in den U.S.-Patentanmeldungen mit d jn Ser. No. 667 521 foiogerelcht am 2. November 1984); 684759 (eingereicht am 21.Dezember 1984) und 738612 (eingereicht am 28.Mai 1985). Die Kombination ist wirksam beim Detektieren der oben genannten Typen von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinorren, nämlich undifferenzi vian großzelligen Lungenkarzinomen, Adenokarzinomen und epidermoiden Karzinomen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definieren auch Determinanten (Determinantenstollen) an einem Antigen, das mi. anderen Karzinomen assoziiert Ist, wozu Brustkarzinome, Colonkarzinorte und kleinzeUige Lungenkarzinome zählen (man vfll. die nachstehend aufgeführte Tabelle I). Die 6rfindungsgomäßen Antikörper können folglich für therapeutische Verfahren und In therapeutischen Produkten eingesetzt werden, die für diese Karzinome bestimmt sind. Das neue Antigen Ier vorliegenden Erfindung, das als Antigen L20 bezeichnet ist, kann auch für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden. Das Antigen kann von Tumoren gewonnen werden oder durch die rekcmbinan'a DNA-Technik hergestellt werden (Brcwn et al., U.S.-Pa1 - >tanmeldung mit der Sor. No. 827313, eingereicht am 7. Februar 1986, worauf hiermit bezug genommen wird). Das für das L&ü-Antigen kodierende Gen kann nach Verfahren kloniert werden, bei denen zuerst die mRNA des L20-Antigens angereicheit wird. Bei einem derartigen Verfahren können Polysome (bestehend aus mRNA, Ribosomen und nasziorendon Poly pep. iJnolien) mit Hilfe der ImmunoaffinitStschromatogrephie unter Anwendung des Antikörpers, der die L20-Antigon-Deierminnnte Auf der nasziorenden Kette erkennt, gereinigt werden. Die mRNA wird durch Immunopräzipitation mit beispielsweise 1.20-Antikörpor isoliurt und die cDNA wird in einem geeigneten Expressionsvektor kloniert. In alternativer Weise kann der L *O-Antik*rper oder das Antiserum für das L20-Antigen dafür eingesetzt werden, eine cDNA-Library unter Vorwendung oines Expressionsvektors zu screenan. Das gereinigte oder klonlerte L20-An'igen kann alleine als Immunogen oder zusammon mit olnom geeignoton immunologischen Adjuvans verabreicht werden. In alternativer Weise kann man das Gen, das für das Antigon kodiert, in das Gen für oin Virus, wio das Vaccinla-Virus, insertioren, um ein Rokombinante-DNA-Produkt zu produzieren, das als Immunogon eingesetzt wird (man vgl. Brown et al., U.S.-Pntentanmaldung Ser. No. 8273V 3, eingereicht am 7.Februar 198C).
Diagnostische Kit·
(a) einen wie oben näher beschriebenen monoklonalen Antikörper und
(b) ein Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den monoklonalen Antikörper und eine Markierung, die ein detektierbares Signal liefern kann.
Zu den Reagentien gehören auch zusätzliche Agentien, wie Puffermittel und proteinstabilisierende Mittel, z.B. Polysaccharide und dergleichen. Das diagnostische Kit bzw. das Diagnosekit kann außerdem, soweit erforderlich, andere Komponenten des das Signal liefernden Systems enthalten, wozu auch Agentien zur Reduktion der Wechselwirkungen mit dem Untergrund, Kontrollreagentien, eine Vorrichtung zur Durchführung eines Tests usw. enthalten. Der Diagnosekit kann ferner ein Konjugat eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers und einerein detektierbares Signal liefernden Markierung enthalten. Auch in diesem Fall können die oben genannten zusätzlichen Agentien vorhanden sein.
menschlichen Adenokarzinom der Lunge, bezeichnet mit 3082, eis Immunogen immunisiert. Die Maus erhielt vier
beimpft, um Kulturen mit niedriger Dichte zu bilden, die aus einzelnen verschmolzenen Zellen (Klonen) stammen.
(Brown et al., 1979, J. Immunol. Moth., 31:201).
wurden mit PBS gewaschen und die Zellen von intakten Tumoren wurden suspendiert durch Pressen durch ein rostfreies
weiterhin auf ihre Antikörperspezifität getestet. Diese Hybridome, die Antikörper mit einer deutlichen Spezifität für
wo sie als Aszitestumore wuchsen.
entwickeln. Der in die Aszites sekretierte Antikörper wurde an Protein A-Separose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, 15:429) oder durch Gelfiltration in Sephacryl S-300 gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde für die weitere Charakterisierung eingesetzt.
Die uubzelluläre Lokalisation des Antigens wurde durch Messen der Antikörperbindung an Zellen vor oder nach der Permeabilisierung mit einem nicht-ionischen Detergens bestimmt. Antikörper, die an die Zelloberfläche intakter kultivierter Zellen binden, wurden entweder durch direkte Bindungsascays mit '"!-markiertem Antikörper (Brown et al., 1981, Proc. Nat'l Acad. Sic. U.S.A., 78:539) oder mit Hilfe der indirekten Fluoreszenz unter Anwendung des f:uoreszunzaktivierten Zelhiortierers (FACS) Il (cell sorter (FACS) II) identifiziert. Antikörper, die an intrazelluläre Stellen binden, v, urden durch direkte Bindung des '"!-markierten Antikörpers an Zellen nach Fixierung mit Paraformaldehyd und anschließende Permeabilisierung mit dem nicht-ionischen Detergens NP-40 bestimmt.
Für die durchgeführten Bindungsassays unter Anwendung radiomarkierter Antikörper (Brown et al., s. oben) wurden kultivierte Zellen (10*) auf Eis 30min mit 10'cpm von '"!-markiertem Antikörper in 100μΙ bindenden Puffer inkubiert. Die Suspension wurde auf 0,2ml Dinonylphthalat: Dibutylphthalat (1:1 V/V) geschichtet und zentrifugiert. Das Pellet und die wäßrige Phase wuroon ausgezählt ('"I). Zur Untersuchung der nicht-Rpezifit "-nen Bindung wurden parallele Inkubationen mit nicht-markiertem Antikörper als Kompetitor durchgeführt (man vgl. Brown et al., s. oben).
| Zellen | spezifische |
| Bindung | |
| CaIu-I Lungenadenokarzinom | 45400 |
| H 3082 Lungonadonokarzinom | 50100 |
| H 2981 Lungonadonokarzinom | 64100 |
| H 2984 Lungenadonokarzinom | 119300 |
| MCF7 Brustkarzinom | 78800 |
| 3017Molanom | 2200 |
| Normale T-Zellen | 200 |
| JurkatT-Leukämle | 200 |
| DaudiB-Lymphom | 200 |
Zur Bestimmung der Klasse der durch die L20-Hybridomzellin!e produzierten Immunoglobuline wurden die folgenden Techniken eingesetzt:
(a) Ouchterlöny-Immunodiffusion
Ein Aliquot des Überstandes bestimmter Hybridomzellen wurde in die zentrale Vertiefung einer 25% Agarplatte gegeben. Monospezifische Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Isotypen-Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) wurden in die Außenvertiefungen gegeben und die Platte wurde 2 h bei Raumtemperatur und über Nacht bei 40C inkubiert.
(b) Isotypisierung mit ELISA
Dynatech Immuolon-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Immuolon 96-well plates) wurden beschichtet mit jeweils Antiserum in einer Konzentration von 1 Mg/ml, SOpl/Vertiefung in PBS und über Nacht bei 43C stehengelassen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20,0,05% gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur blockiert mit Medium ΙΟΟμΙ/Vertiefung.
Nach Waschen der Platten wurden die Überstände von dem L20-Hybridom hinzugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden Rindersorumalbumin-(BSA)-Platten 2 h bei 37"C mit monospezifischen Kaninchen-Anti-Maus-Igleotyp-Antikörpern inkubiert, die an Peroxidase (Zymed) gekuppelt waren. Nach Waschen Wurden die Platten mit 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,03% H2O1 in 0,1 M Citratpuf fer pH 4,5 inkubiert. Die optische Dichte bei 630 nm wurde mit einer Dynatex-ELISA-Plattenlesevorrichtung bestimmt.
Der monoklonale Antikörper L20 ist vom IgGflsotyp.
Antlgenerkennung durch den L20 Antikörper
Um Proteinantigene zu identifizieren wurden Lungenkarzinomzellen an der Oberfläche mit radioaktivem Jod oder motabolisch mit 36S-Methionin markiert. Die Antigene wurden auä Zr'' 'taten durch Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper, Addition von Anti-Maus-IgG von der Ziege und Adsorption an St&^./Iococcus aureus isoliert. Die Immunprazipitate wurden gewaschen und einer präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) an einem 10-20% Acrylamidgel unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brillant Blue (0,5Gew.-% zu 10% Essigsäure und 30% leopropanol) angefärbt und in einer Lösung von Essigsäure (5%, V:V) und Methanol (17%, V:V) entfärbt. Das angefärbte L20-Antigenband wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und unverzüglich einer Clektroelution mit einem ECU-040-Elektroeluator/Konzentrator (ECU040 Electroelutor/Concentrator; C.B.S. Scientific Co., San Diego. CA) unterworfen, wobei nach den Verfahren vorgegangen wurde, die beschrieben sind von Hungapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. 91:227-236. Ein automatisierter Edman-Abbau (automated Edman degradation) wurde mit etwa 23pmol des L20-Antigens (auf Basis der Ausbeute des identifizierten L-1) in einer Gasphasen-Sequentierungsvorrichtung (g&s-phase sequencer; Model 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Die Phenylthiohydatoinaminosäurederivate wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Model 120A on-line HPLC-Einheit (Applied Biosystems, INc.) mit einer PTH-C 18-Säule (2,1 x 220mm, Applied Biosystems, Inc.) und einem Natriumacetat/Tetrahydrofuran/ Acetonitrü-Gradienten für die Elution durchgeführt
Die aminoterminale Aminosäuresequenz ist die folgende: ' ~
15 10 15 20
L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L ,
worin X eine Aminosäure bedeutet, die bis jetzt noch nicht identifiziert wurde.
Ein Vergleich dieser Sequenz mit denjenigen, die in der derzeitigen Proteindatenbank (PIR Relase 6.0; November 1985) gespeichert sind, ergab keine signifikante Ähnlichkeit hinsichtlich der Sequenz mit irgendeiner anderen Sequenz.
Das durch den L20-Antikörper erkannte Antigen ist ein Glycoproteinantigen mit einem Molekulargewicht von etwa 110000 Dalton.
Nachstehend ist die in vitro immunohistologische Anwendung beschrieben.
Die einen nicht-markierten Antikörper verwendende Technik von Sternberger (1979 in Immunochsmistry, John Wiley & Sons, New York, S. 104-169, modifiziert durch Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511) wurde für die immunohistologischen Untersuchungen an gefrorenen Schnitten eingesetzt. Die Target-Gewebe für diese Tests wurden durch chirurgische Eingriffe erhalten und innerhalb von 4h nach der Entnahme in Isopentan, das in flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist, eingefroren. Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff odor bei mindestens 70°C bis zur Verwendung gelagert. Kaninchen-Anti-Maus IgG (rabbit anti-mouse IgG; Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde in einer Verdünnung von 1/50 eingesetzt. Maus-Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexe (PAP, Sterngerger-Meyer Immunochemicals, Inc.) mit einem Gehalt von 2 mg/ml an spezifisch gereinigtem PAP wurde in einer Verdünnung von 1/80 zur Anwendung gebracht. Es wurden gefrorene Schnitte hergestellt, getrocknet, mit Aceton behandelt und getrocknet (Garrigues et al., s. oben). Die für die histologische Bewertung verwendeten Schnitte wurden mit Hematoxylin angefärbt. Um den nicht-spezifischen Untergrund .zu vermindern", wurden die Schnitte mit Vi verdünntem normalen Humanserum präinkubiert (Garrigues et al., s. oben). Antikörper von der Maus, Anti-Maut-IgG von der Ziege und PAP von der Maus wurdon in einer Lösung von 10% normalem Humanserum und 3% Kaninchenserum verdünnt.
Zum Anfärben wurden Serienschnitte entweder mit spezifischem Antikörper oder Kontrollantikörper 2,6 h behandelt, 30min mit Kenlnchen-Anti-Maui-IgG (verdünnt 1/60) inkubiert und 30min einem Maus-PAP-Komplex (verdünnt 1/80) ausgesetzt.
Nach jeder Behandlung mit dom Antikörper wurdon die Objoktträgnr zweimal in PBS gewaschen. Die immunohistochemischo Reaktion wurde entwickelt mit frisch hergestelltem 0,5%igom 3,3'-üiaminobenzidin-tetrahydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01 % H1O] in 0,05M Tris-Puffer, pH 7,0, während 8min. Die Anfärbung konnte intensiviert werden, indem man die Schnitte 20min einer 1%igen OsO4-Lösung in dustilliortom Wasser aussetzte. Die Schnitte wurdon mit Wassor gospült, in Alkohol vom Wasser befreit, in Xylol geklärt und auf Objektträgern bofestigt.
Die Objektträger wurden jewoils mit Hilfe eines Kodes bewertet. Die kodierten Proben wurden durch oine unabhängige Person überprüft. Typische Objoktträgor wurdon photographiort, wobei die differentiolle Intorferenz-Kontrast-Optik (Zeiss-Nomarski) oingosotzt wurdo. Das Ausmaß dor Antikörperanfärbung wurde wie folgt bewertet:
+ bedeutet wenige schwach positive Zellen;
+ + bedeutet, daß mindestens Vj der Zellen positiv sind;
+++ bedeutet., daß die meisten Zellen positiv sind;
+++ + bedeutet, daß etwa alle Zellen stark positiv sind.
und++bewertet wurden, wurde eine mit++oder mehr bewertete Anfärbung als positiv angesehen. Sowohl neoplastische als auch Stromazellen wurden in Tumorproben untersucht. Die aufgeführte Anfärbung ist diejenige von Tumorzellen, da die
| Lungenkarzinom: | 18/20 |
| Adenokarzinom | ' 3/3 |
| epidermoid | 0/1 |
| bronchial | 4/4 |
| kleinzellig | 3/3 |
| Lungenkarzinom: Zellinien | 4/7 |
| Brustkarzinom | S/8 |
| Cclonkarzinom | 5/8 |
| Melanom | 1/1 |
| renales Karzinom | 0/1 |
| Llposarcom | schwache Anfärbung von einer |
| normaleLunge | der drei getesteten Proben |
| negativ | |
| normale Milz | negativ |
| normale Brust | negativ |
| normales Colon | negative |
| normale Niere | negativ |
| normale Leber | negativ |
| normales Hirn | negativ |
| normales Herz | negativ |
| normale Haut | negativ |
| normale Schilddrüse | negativ |
| normaler Hoden | negativ |
| normaleVagina | negativ |
| normales Lymphozytpellet | |
* Bei allen untersuchten Proben handelte es sich um Gefrierschnitte von Geweben, die durch chirurgischen Eingriff erhalten wurden. Die eingeteilten immunohtstologlschen Verfahren sind im Text näher beschrieben. Eine mit 2+ bewertete Anfärbung (jeigt an, daß mindesten« ein Drittel der Zellen positiv sind) wurde als positiv betrachtet.
Eine hier beschriebene Zellinie, L 20, wurde bei der American Type Trissue Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und hat die ATCC Nr. HB 8913 erhalten. Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist hinsichtlich ihres Umfangs nicht auf die hinterlegte Zellinie beschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform nur eine einzelne Illustration eines Aspekts der Erfindung darstellt und jede äquivalente Zellinie, die einen funktionell äquivalenten monoklonalen Antikörper produziert, erfindungsgemäß umfaßt ist. Insbesondere dienen die hier beschriebenen Ausführungsformen nur zur beispielhaften Erläuterung.
Claims (6)
1. Verfahren zur Detektion maligner Zellen in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie derartige Zellen enthält, gekennzeichnet dadurch, daß man die Probe mit einem gemäß einem der vorhergehenden Punkte hergestellten monoklonalen Antikörper unter Reaktionsbedingungen in Kontakt bringt, die es dem monoklonalen Antikörper ermöglichen, an die Determinante zu binden; die nichtgebundenen monoklonalen Antikörpermoleküle aus der Probe entfernt und dio Probe auf die Anwesenheit gebundener monoklonaler Antikörper untersucht, wobei die Bindung des monoklonalen Antikörpers die Anwesenheit maligner Zellen in der Probe anzeigt.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man maligne Zellen bestimmt, die nichtkleinzellige Lungenkarzinomzellen aufweisen.
3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Probe einsetzt, die Lungengewebe enthält.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man. maligne Zeilen einsetzt, die Brustkarzinomzellen aufweisen.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man maligne Zellen einsetzt, die Colonkarzinomzellen aufweisen.
6. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Bindung durch immunohistologisches Anfärben detektion.
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