NL8700415A - Monoclonale antilichamen en antigeen voor humane niet-kleincellige longcarcinoma en bepaalde andere humane carcinoma's. - Google Patents

Description

-1- VO 8498

Monoclonale antilichamen en antigeen voor humane niet-kleincellige longcarcinoma en bepaalde andere humane carcinoma's,_ 1. Gebied van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw mono-clonaal antilichaam, en op werkwijzen voor het produceren en gebruiken van een dergelijk nieuw monoclonaal antilichaam, dat specifiek is voor carcinoma antigenen, Meer in het bijzonder is het monoclonale antilichaam 5 volgens de uitvinding immunospecifiek voor en/of immunoreactief met een eiwitantigeen, verbonden aan humane niet-kleincellige longcarcinoma (NSCLC) en bepaalde andere humane carcinoma's, met inbegrip van enkele carcinoma's van de borst, het colon, enz.

Het monoclonale antilichaam volgens de onderhavige uitvinding is 10 reactief ten opzichte van een determinant van een glycoprotelne antigeen dat verbonden is aan NSCLC-cellen, en ook ten opzichte van andere carcinoma's met inbegrip van borst,coIon en kleincellige longcarcinoma's. Het monoclonale antilichaam volgens de uitvinding bezit bijzondere eigenschappen en mogelijkheden waardoor dit antilichaam geschikt is voor zo-15 wel in vivo als in vitro klinische diagnostische doeleinden. Bovendien is het antilichaam volgens de onderhavige uitvinding geschikt voor therapeutische toepassingen. Bijvoorbeeld kan het nieuwe antilichaam worden gebruikt als een doelwit selectieve drager voor verschillende middelen die anti-tumoreffecten bezitten, waaronder, zonder daartoe beperkt te 20 zijn: chemotherapeutische geneesmiddelen, toxinen, immunologische respons -wijzigende middelen, en radio-isotopen. Bovendien kunnen de hybridoma's die een dergelijk antilichaam produceren, onder toepassing van recombinant DNA-technologie zodanig worden gewijzigd dat de resulterende antilichamen een antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit kunnen 25 bevorderen of cytolytisch kunnen zijn voor tumorcellen in tegenwoordigheid van complement componenten.

2. Achtergrond van de uitvinding.

2.1. Humane longcarcinoma.

Longcarcinoma1s zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen van 30 sterfte door kanker bij de mens en beginnen borstcarcinoma ’ s te overtreffen als meest voorkomende oorzaak voor sterfte door kanker onder vrouwen. Deze ziekte kan in vier histologische hoofdtypen worden onderverdeeld: (1) epidermoïde of squameuze (30 %), (2) adenocarcinoma (35 %), (3) groot-cellige ongedifferentieerd (15 %), en (4) klein-cellig 870 0 41 5 «r V "* -2- (20 %) . De term niet-kleincellige longcarcinoma ("NSCLC") omvat de volgende celtypen: epidermolde carcinomacellen, adeno carcinomacellen, en grote ongedifferentieerde carcinomacellen.

De meeste gevallen van longcarcinoma's kunnen door chemotherapie 5 en stralingstherapie niet worden genezen. Kleincellige longcarcinoma's kunnen op chemotherapie en stralingstherapie reageren met een afname van de grootte, maar dit geeft geen totale genezing.Een volledige chirurgische verwijdering van de tumor lijkt de enige effectieve therapie te zijn. Ongelukkigerwijze echter heeft minder dan 30 % van de longkanker-10: patiënten tumoren die volgens diagnose volledig kunnen worden wegge sneden. Hiervan blijft minder dan één-derde langer dan 5 jaar na de schijnbaar volledige chirurgische verwijdering van de tumor in leven.

Er bestaat derhalve een grote- behoefte aan methoden waardoor een vroegere diagnose van longkanker, een betere definitie van de verspreidings-15 graad van de kanker, en een effectievere therapie mogelijk wordt gemaakt.

2.2. Monöclonale antilichamen.

Monoclonale antilichamen die homogene antilichaammoleculen vertegenwoordigen welke aan één enkele moleculaire plaats ( dat wil zeggen een epitoop) op een antigeen binden met een specifieke bindings- of 20 affiniteitsconstante., worden volgens drie op zichzelf bekende methoden bereid.

Monoclonale antilichamen kunnen worden bereid door hybridoma-technieken zoals ontworpen door Kohier en Milstein (1975, Nature 256: 495; 1976, Eur. J. Immunol. 6_: 511). Door antilichaam-producerende cel-25 len (milt lymfocyten) te fuseren met myeloma cellen, werden door Kohier en Milstein hybridecellen gecreëerd, die aanleiding gaven tot onsterfelijke cellijnen met zowel het vermogen om antilichaam te produceren als het vermogen om permanent in celculture te groeien. De hybridoma's scheiden één enkel type immunoglobuline met vooraf bepaalde antigeen-30 specificiteit uit, afhankelijk van het antigeen waaraan de lymfocyten tevoren zijn blootgesteld.

Anderzijds kunnen monoclonale antilichamen worden bereid door in vitro transformatie van perifere bloed B-lymfocyten van zoogdieren, bijvoorbeeld mét Epstein Barr virus (EBVj. Het virus maakt de antili- 3.5 chaam-producerende lymfocyten onsterfelijk. Technieken voor een derge- ' lijke transformatie zijn op zichzelf bekend (zie bijvoorbeeld, Stein-metz et al., 1977, Nature 269: 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, 87 0 0 4 1 5 , * i -3- i: 386).

Tenslotte kunnen monoclonale antilichamen worden geproduceerd onder toepassing van technieken waarbij zowel de EBV-immörtalisatie als de celfusie of hybridoma-technologie worden gecombineerd. Door Cole et 5 al. (1985), in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., biz. 77-96 worden technieken beschreven voor het fuseren van een humane plasmacytoma of lymfoblastoxde-cellijn fusiepartner met EBV-getransfor-meerde donorlymfocyten die tevoren zijn gerealiseerd als cellijn. In een dergelijk systeem zijn beide ouder-cellijnen onsterfelijk. De fusiepart-10 ner moet daarom geschikte geneesmiddelmerkers bezitten om een tegen-selectie .mogelijk te maken tegen de ouderlijnen wanneer de gefuseerde hybridoma wordt gekweekt. De resulterende EBV-hybridoma's produceren antilichamen met de specificiteit van de gebruikte EBV-lymfocyt-cellijn. Monoclonale antilichamen kunnen in grote hoeveelheden worden be~ 15 reid door in vitro celkweek van bijzondere hybridoma of getransformeerde cellijnen. Bovendien leidt inenting van een hybridoma-cellijn in de buikholte van compatibele zoogdieren zoals muizen tot een tumor die hoge concentraties (1 tot 20 mg/ml) monoclonaal antilichaam afscheidt in de tumor ascites-vloeistof* Door de ascites-vloeistof te verwijderen en het 20 monoclonale antilichaam te zuiveren, kan één enkele muis voldoende antilichaam leveren voor gebruik in duizenden diagnostische analyses.

2.3. Monoclonale antilichamen en antigenen, verbonden aan longkanker. Monoclonale antilichamen tegen humane longkanker antigenen zijn beschreven door Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer 43:696; Cuttica et 25: al., 1981, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 4591; Moody et al., 1981,

Science 214: 1246; Minna et al., 1981, In Vitro 17_: 1058; Kennel et al., 1981, Cancer Res. 41: 3465; Chem. Abst. 95(15):1308502; Baylin et al., 1982, Proc. Nat‘1 Acad. Sci. USA 79: 4650; Carney et al., 1982,

Pathöbiology Annual 12: 115; Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology 30 10: 3; Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Prevent 6_i 185; Mulshine et al., 1983, J. Immunol. 131: 497; Huang et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 220: 318; Saji et al., 1984, Hybridoma 3_: 119; Bio. Abst.

79005569; Bosslet et al., Behring. Inst. Mitt. 74: 27; Chem. Abst. AC101 (9): 706686; Roset et al., 1984, Cancer Res. 44: 2052; Bio. Ast. 79023605; 35 Princler et al., 1982, Cancer Res. 42: 843; Mazauric et al., 1982, Cancer

Res. 42: 150; Braatz et al., 1982, Cancer Res·. 42: 849; Sobel et al-, 1982, Fed. Proc. 41_: 409, Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and ~7 λ .· -- ê J V y 4 ! „ V ·? -4-

Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., biz. 77-96; en Varki et al., 1985, in. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., biz. 207.

Door de Amerikaanse octrooiaanvragen 667.521 (ingediend op 2 november 1984) en 785.177 (ingediend op 7 oktober 1985), en de Amerikaanse 5 octrooiaanvragen 684.759 (ingediend op 21 december 1984) en 776.321 (ingediend op 18 oktober 1985), en de Amerikaanse octrooiaanvrage 738.612 (ingediend op 28 mei 1985) worden bepaalde monoclonale antilichamen tegen humane niet-kleincellige longcarcinoma beschreven.

Monoclonale antilichamen kunnen worden gebruikt voor methoden 10 die een. vroegere diagnose van longkanker, een betere definitie van de verspreiding van de kanker, en effectievere methoden voor therapie van longkanker mogelijk zouden maken. Een vereiste is echter om antilichamen te vinden tegen antigenen die sterker tot expressie komen in longkanker-weefsels dan in normale weefsels van volwassenen. In verband met de 15 bekende heterogeniteit van tumorcelpopulaties, de aanwezigheid van verschillende determinanten op hetzelfde antigeenmolecuul, de verwachte verschillen tussen antigenen met betrekking tot hun stabiliteit als di-• agnostische merkers en therapeutische doelwitten, en de verschillende biologische eigenschappen van verschillende antilichamen tegen hetzelfde 20 antigeen, kan een aantal verschillende antilichamen tegen een aantal verschillende antigenen nodig zijn.

3. Samenvatting van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe klasse van monoclonale antilichamen, toegelicht aan de hand van L20, dat spe-25 cifiëk is voor een determinantenplaats op een glycoproteine antigeen, verbonden aan humane niet-kleincellige longcarcinoma (NSCLC)cellen.

De term "NSCLC-cellen" omvat epidermolde carcinoma cellen, adenocarcinoma cellen en groot-cellige ongedifferentieerde carcinoma cellen. De de-termintantenplaats kan ook worden aangetroffen op antigenen van enkele 30 andere carcinoma's, bijvoorbeeld enkele carcinoma's van de borst en het colon en klein-cellige longcarcinoma. Het antilichaam volgens de uitvinding zal derhalve ook binden aan cellen van andere carcinoma's en bruikbaar zijn voor de diagnose en therapie van alle andere tumoren die het door antilichaam L20 geïdentificeerde antigeen tot expressie brengen.

35 Het onderhavige monoclonale antilichaam bindt in veel geringere mate aan normale cellen van volwassenen dan aan tumorcellen. De woorden "bindt in veel geringere mate" betekenen dat de binding in het geheel «70 0 4 1 δ.

<5- * -5- niet waarneembaar is, of alleen waarneembaar is als een zeer zwakke kleuring wanneer immunohistologische technieken worden gebruikt. Het antilichaam heeft derhalve een hoge mate van specificiteit voor antigeen dat karakteristiek is voor NSCLC en bepaalde andere carcinoma's.

5 De uitvinding omvat ook het nieuwe L20 antigeen, dat geïdentifi ceerd wordt door antilichaam L20 an de klasse van antilichamen die binden aan, immunospecifiek zijn voor of immunoreactief zijn met dit antigeen. Verder worden werkwijzen omvat voor het gebruiken van het gezuiverde of gedoneerde L20 antigeen als vaccin voor het immuniseren IQ' tegen bepaalde carcinoma's.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op bepaalde diagnostische methoden waarbij het monoclonale antilichaam volgens de uitvinding wordt gebruikt. Bijvoorbeeld kan het antilichaam worden gebruikt in methoden voor het bepalen van de aanwezigheid van de kwaadaardige 15 conditie in humaan longweefsel en andere humane weefsels. De methoden omvatten een onderzoek van het weefsel op aanwezigheid van een antigeen met de eigenschappen van een een 110.000 dalton glycoproteïne, dat door antilichaam L20 wordt gedefinieerd. Het weefsel kan bijvoorbeeld in contact worden gebracht met een antilichaam dat een determinantenplaats 20 definieert op een cel-verbonden antigeen met de eigenschappen van het antigeen dat door antilichaam L2Q, een funtioneel equivalent of een fragment van dit antilichaam wordt gedefinieerd, waarbij eventuele interacties tussen dit antilichaam en de antigene determinanten worden gedetecteerd. Bij één zo’n methode wordt de aanwezigheid bepaald van NSCLC 25 cellen in een monster waarvan de verdenking bestaat dat het dergelijke cellen bevat. Het monster wordt in contact gebracht met het monoclonale antilichaam, dat in staat is om dergelijke cellen te onderscheiden van andere celtypen die in het monster aanwezig kunnen zijn. Het contact wordt uitgevoerd onder condities waarbij het antilichaam aan dergelijke 30 cellen wordt gebonden. Na contact wordt de aanwezigheid of afwezigheid van een binding van het antilichaam aan de cellen in het monster vastgesteld. Deze binding is gerelateerd aan de aanwezigheid of afwezigheid van de NSCLC cellen in het monster. In het algemeen wordt het monster in contact gebracht met een gelabelde specifieke bindingspartner van het 35 monoclonale antilichaam. Dit label is in staat om een waarneembaar signaal te geven.

870 0 3 ί ϊ -6-

Ben andere diagnostische methode omvat de in vivo localisatie van een tumor door aan een patiënt een gezuiverd antilichaam of anti-lichaamfragment volgens de uitvinding, gelabeld met een middel dat een waarneembaar signaal geeft, toe te dienen. De localisatie wordt vervol-5 gens uitgevoerd met behulp van uitwendige scintografie, emissie tomografie of radionucleaire aftasting. Deze methode kan ook betere mogelijkheden bieden om kankerpatiënten in te delen met betrekking tot de omvang van de ziekte en om wijzigingen in de reactie op therapie te volgen.

De uitvinding heeft ook therapeutische toepassingen, omdat het 10 L20 antilichaam en soortgelijke antilichamen kunnen reageren met het L20 antigeen dat in hoge concentraties aan het oppervlak van de tumorcel .tot expressie komt. Antilichamen kunnen derhalve worden gebruikt als dragers voor verschillende middelen die een anti-tumorwerking bezitten, met inbegrip van, zonder daartoe beperkt te zijn, chemotherapeutische 15 geneesmiddelen, toxinen, immunologische respons-wijzigende middelen, en radio-isotopen.

Verder kan het L20 antilichaam zodanig worden gewijzigd dat het antilichaam afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC), kan bevorderen, dat wil zeggen, dat het NSCLC cellen in tegenwoordigheid van humane 20 lymfocyten of macrofagen kan doden of dat het cytolytisch wordt voor tumorcellen in tegenwoordigheid van humaan complement. Dergelijke modificaties kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd met technieken die onlangs zijn ontwikkeld voor de bereiding van "chimaere antilichamen". Daardoor kunnen genen die coderen voor het variabele gebied van het L20 25 antilichaam molecuul worden samengevoegd met humane genen die coderen voor het Fc-gebied van een antilichaam met een geschikte biologische activiteit (zoals het vermogen om humaan complement te activeren en ADCC te bevorderen). Ook kunnen nieuwe antilichamen met de geschikte biologische functies tegen het L20 antigeen worden bereid, die afkomstig 30 zijn van muizen of mensen.

4. Beschrijving van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw monoclo-naal antilichaam, aangeduid als L20, dat inmiddels specifiek is voor en/of immunoreactief is met een antigeen op humane NSCLC cellen en cel-35 len van verschillende andere humane carcinoma's,met inbegrip van carcinoma ' s ·νηη het colon en de borst en klein-cellige longcarcinoma's, alsmede e 7 0 fj λ 4 9 « v ν' "ï ί Ό « ί- -7- ορ werkwijzen voor het produceren van dergelijke nieuwe moncclonale antilichamen en bepaalde diagnostische en therapeutische methoden waarbij het antilichaam wordt gebruikt.

De uitvinding heeft verder betrekking op een nieuw celoppervlak-5 antigeen dat karakteristiek is voor humane NSCLC en bepaalde andere humane carcinoma's van de borst,co Ion en longen, alsmede op werkwijzen voor het gebruiken van dit nieuwe antigeen.

4.1. Methoden voor het produceren van monoclonaal antilichaam tegen NSCLC. __ 10 Monoclonale antilichamen tegen humaan NSCLC en bepaalde andere humane carcinoma's kunnen worden bereid door hybridoma-fusietechnieken, door EBV-transformatie van humane antilichaam-producerende lymfocyten.

of door technieken waarbij celfusie en EBV-immortali satietechnologieën worden gecombineerd.

15 4.1.1. Fusietechnieken.

Volgens één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding worden monoclonale antilichamen tegen NSCLC bereid onder toepassing van hybri-domacelfusietechnieken. Bijvoorbeeld worden als immunogeen humane long-carcinomacellen van longafscheidingen, gekweekte cellen van geëxplan-20 teerde humane NSCLC-tumoren, of cellen van een normale foetale long of lysaten van dergelijke cellen gebruikt. In een ter toelichting dienend voorbeeld, werden geëxplanteerde cellen van een NSCLC, humane long-adenocarcinoma No. 3082 als immunogeen gebruikt (zie Hoofdstuk 5.1.).

De cellen worden bijvoorbeeld in een muis geïnjecteerd en na een vol-25 doende tijd wordt de muis gedood, en worden somatische antilichaam-producerende lymfocyten verzameld. Antilichaam-producerende cellen kunnen worden verkregen uit de lymfklieren, milten en perifeer bloed van ingeente dieren. Miltcellen hebben de voorkeur. Lymfocyten van de muis geven een hoger percentage stabiele fusies met de onderstaand beschreven 30 nyeloma's van de muis. Het gebruik van somatische cellen van ratten, konijnen en kikkers is eveneens mogelijk. De miltcel-chromosomen die voor de gewenste immunoglobulines coderen, werden onsterfelijk gemaakt door fusie van de miltcellen met myelomacellen, in het algemeen in tegenwoordigheid van polyêthyleenglycol. Verschillende myelomacellijnen kun-35 nen worden gebruikt voor het produceren van gefuseerde ceUiybriden, met inbegrip van NSI-Ag4/l, X63-Ag8, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag.653, Sp2/0-Agl4, Fo, en Sl94/5XXO.Bu.l, afgeleid van muizen, en 210.RCY3.Agl.2.3, ü- 8·*·? λ m t / <J y : ; j

It. ' ► 5 -8- 226AR en GM1500GTGAL2 afgeleid van ratten, (Hammerling, et al., 1981, "Monoclonal Antibodies and T-cell hybridomas" in Research Monographs in Immunology, Vol. 3, J.L. Turk, ed; Elsevier/North Holland Biomedial Press. New York). In een ter toelichting dienend voorbeeld, werden Nsl-5 cellen gebruikt (Zie Hoofdstuk 5.1.). De resulterende cellen, die de.

gefuseerde hybridoma's omvatten, laat men groeien in een selectief medium, bijvoorbeeld HAT-medium, en de overlevende cellen laat men op een dergelijk medium groeien onder toepassing van limiterende verdunningscondi-ties. De cellen laat men groeien in een geschikte houder, bijvoorbeeld 10 in microtiter putjes, en het supernatant wordt onderzocht op monoclonale antilichamen met de gewenste specificiteit.

Verschillende conventionele methoden bestaan voor het isoleren en zuiveren van de monoclonale antilichamen, teneinde ze te bevrijden van andere eiwitten en andere verontreinigingen.

15 4.1.2, EBV-transformatietechnieken♦

Volgens een alternatieve uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, worden monoclonale antilichamen tegen NSCLC bereid onder toepassing van EBV-transformatietechnieken. Bijvoorbeeld worden lymfocyten, ' afkomstig van perifeer bloed, tumor-afvoerende lymfklieren, opgezogen 20 beenmerg, tumoren of longuitscheidingen van patiënten met NSCLC gelmmor-taliseerd onder toepassing van EBV volgens methoden die ontworpen zijn door Cole et al., 1984, Cancer Res. 44: 2750. Zoals opgemerkt door Cole et al., zijn B-lymfocyten, specifiek voor tumorantigenen, in longkanker-patiënten zeldzaam. Het is daarom bijzonder belangrijk om het aantal 25 lymfocyten dat antilichaam produceert, te vergroten door een voorselectie van lymfocyten die antilichaam tegen het relevante antigeen produceren. De EBV-transformatietechnieken omvatten derhalve twee stappen: (1) verrijking van cellen met receptoren voor het bepaalde antigeen, bijvoorbeeld L20 antigeen beschreven in Hoofdstuk 4.2.; en 30 (2) immortalisatie van dergelijke cellen door infectie met EBV.

4.1.3. EBV-hybridomatechnieken.

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding,· worden monoclonale antilichamen tegen NSCLC bereid onder toepassing van een combinatie van EBV-transformatie en hybridomafusietechnieken zoals 35 beschreven door Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc; biz. 77-96. Bijvoorbeeld wordt een myeloma-cellijn gefuseerd met donorlymfocyten van NSCLC-patiënten die tevoren 8700415 £· + -9- met EBV zijn getranformeerd en gerealiseerd als cellijn die in staat is om te groeien en zich te ontwikkelen in kweekomstandigheden, Om de resulterende EBV-hybridomafusie-cellijnen te kunnen selecteren, is het nodig dat de fusiepartner dominante geschikte selecteerbare geneesmiddel-5 merkers bezit, zoals ouabain of neomycine-resistentie zodat oudercellen zich niet ontwikkelen wanneer de gefuseerde hyhridoma-cellijnen worden gekweekt. Een geschikte lijn is de thioguamine-resistente GM-150, ouabain-resistente lymfoblastolde-cellijn, KR-4 beschreven door Cole et al., supra. De resulterende hybridoma's worden met conventionele technieken 10 gedoneerd.

4.1.4. Celvermenigvuldiging en antilichaamproduktie.

Wanneer eenmaal de gewenste gefuseerde celhybriden of getransformeerde cellijnen zijn geselecteerd en gedoneerd tot individuele anti-lichaam-producerende cellijnen, kan elke cellijn op één van twee conven-15 tionele wijzen worden vermenigvuldigd. De individuele cellijn kan in vitro worden vermenigvuldigd, bijvoorbeeld in laboratoriumkweekvaten, en het kweekmedium dat hoge concentraties van één enkel specifiek mono-clonaal antilichaam bevat kan door decanteren, filtreren of centrifugeren worden geoogst. Anderzijds kan de opbrengst aan monoclonale anti-20 lichamen worden vergroot door een monster van de hybridoma te injecteren in een histocompatibel dier van het type dat gebruikt was om de somatische en myelomacellen voor de oorspronkelijke fusie te verkrijgen.

In het geïnjecteerde dier ontwikkelen zich tumoren die de specifieke monoclonale antilichamen, geproduceerd door de gefuseerde hybridecel, 25 uitscheiden. De lichaamsvloeistoffen van het dier, zoals ascites-vloei-stof of serum leveren monoclonale antilichamen in .hoge concentraties.

Zoals door Cole et al., supra, is besproken, is het bij gebruik van humane hybridoma's of EBV-hybridoma's nodig om afstoting van de in dieren zoals muizen geïnjecteerde xenograft te voorkomen. Men kan immu-30 nodeficiënte of naakte muizen gebruiken of de hybridoma eerst door bestraalde naakte muizen voeren als een vaste subcutane tumor, welke in vitro werd gekweekt, en daarna intraperitoneaal te injecteren in met pristaan voorbehandelde bestraalde naakte muizen die ascites-tumoren ontwikkelen welke grote hoeveelheden specifieke humane monoclonale anti-35 lichamen uitscheiden (zie Cole et al.,supra).

8700413 -10- 4.2. Monoclonale antilichamen♦

De· antilichamen volgens de onderhavige uitvinding binden aan een nieuw celoppervlak glycoproteïne antigeen, aangeduid als L20-antigeen, dat karakteristiek is voor humane NSCLC cellen en cellen van bepaalde 5 andere humane carcinoma's (zie Hoofdstuk 4.2.1). Het glucoprotelne-antigeen heeft een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton indien onderworpen aan immunoprecipitatie op polyacrylamide gel elektroforese (zie Hoofdstuk 5.3.). Digestie van het L20-antigeen met glycanase liet zien dat het N-gebonden oligosaccharideketens bevat.

10 Als illustratief voorbeeld van de onderhavige uitvinding, wordt L2.0-antiIichaam geproduceerd door de L20-muizenhybridoma, die in Hoofdstuk 5.1 wordt beschreven. Het L20-antilichaam is van het IgGl-isotype g en (zie Hoofdstuk 5.2.2.) heeft een aviditeit van ongeveer 3 x 10 . Het bindt niet detecteerbaar aan normale cellen zoals fibroblasts, endotheel-15 cellen, of epitheelcellen in de belangrijkste organen. Met de woorden "bindt niet detecteerbaar" wordt bedoeld dat slechts een zeer zwakke kleuring of in het geheel geen kleuring wordt gedetecteerd bij immuno-histologie.

Tot de omvang van de uitvinding behoren ook bruikbare bindende 20 fragmenten van het bovengenoemde monoclonale antilichaam, zoals Fab, F(ab') , Fv-fragmenten etc. De antilichaam-f ragmen ten worden met conventionele technieken verkregen. Bijvoorbeeld kunnen bruikbare bindende fragmenten worden bereid door digestie met peptidase van het antilichaam, waarbij papaïne of pepsine wordt gebruikt.

25 Soortgelijke antilichamen, met inbegrip van antilichamen van ver schillende isotypen, verschillende affiniteiten, en nieuwe biologische fünsties, zoals het vermogen om tumorcellen in tegenwoordigheid van complement of effectorcellen zoals lymfocyten of macrofagen te doden, behoren eveneens tot de omvang van de uitvinding. Hoewel het bovengenoemde 30 specifieke voorbeeld van het nieuwe antilichaam volgens de uitvinding gericht is op een antilichaam dat aan een specifieke determinantenplaats op het overeenkomstige antigeen is gericht en tot de IgGl-subklasse met ' muizenafkomst behoort, moet dit niet als een beperking worden opgevat.

Het genoemde antilichaam en antilichamen die functioneel equivalent zijn 35 aan het genoemde antilichaam, of ze nu afkomstig zijn van muizen of van andere zoogdieren met inbegrip van de mens, of andere bronnen, of combinaties daarvan, behoren tot de omvang van de uitvinding, evenals antilichamen van andere isotypen. Met de woorden "functioneel equivalent" 8700415 -11- wordt bedoeld dat het antilichaam in staat is om aan. de bovenstaand beschreven determinantenplaats te binden en in staat is om met een bepaald antilichaam volgens de uitvinding te concurreren voor een dergelijke plaats. Dat wil zeggen dat een dergelijk antilichaam, indien het • 5 gecombineerd wordt met een monster dat een cèl of celfragment bevat met een dergelijke determinantenplaats, aan deze determinantenplaats zal binden en een antilichaam volgens de uitvinding zal verhinderen om aaii een dergelijke plaats te binden. Omdat het antigeen volgens de uitvinding verder meer dan één determinantenplaats kan hebben, omvat de uit-10 vinding monocionale antilichamen die andere determinantenplaatsen definiëren dan de determinantenplaatsen dié door het eerder genoemde monocionale antilichaam worden gedefinieerd en die door sequentiële immuno-precipitatieproeven, die op zichzelf bekend zijn, kunnen worden geïdentificeerd.

15 De uitvinding omvat ook antilichamen, die bereid zijn in respons op antigeen-bindende plaatsen, of idiotypen van het L2Q-antilichaam, omdat dergelijke anti-idiotype antilichamen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de immuunrespons op tumorantigenen voor diagnostische doeleinden en om immuunreacties op te wekken voor therapeutische of pro-20 fylactische doeleinden (Nepom et al., 1984, Proc. Nat'l Acad.Sci. 81; 2664).

4.2.1. L20-antigeen, herkend door monocionale antilichamen.

Het antigeen, dat door de monocionale antilichamen volgens de onderhavige uitvinding wordt herkend, omvat een nieuw celoppervlak glyco-25 prote!ne-antigeen,dat karakteristiek is voor NSCLC-cellen, en bepaalde andere carcinoma's met inbegrip van borst-,coIon- en klein-cellige long-carcinoma. Het antigeen heeft een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton.

De aminozuursequentie van het nieuwe glycoprotelne-antigeen is 30 aan de amino terminus als volgt: 15 10 15 20

L—X-V-Q-V-P—E-X-P-V-V-A-L—V-G-T—D—A-X-L

waarin X een nog niet geïdentificeerd aminozuur voorstelt, en de rest van de letters de conventionele een-letterafkortingen voor aminozuren voorstellen. Een vergelijking van deze sequentie met de sequenties die opge-35 slagen zijn in de huidige eiwitdatabank (PIR Release 6.0, november 1985) laat geen significante sequentie-homologie met enige andere bekende sequenties zien.

0700415 -12- 4.3. Toepassingen voor monoclonale antilichamen en het L20-antigeen.

4.3.1. Diagnostische toepassingen.

De monoclonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt als probes voor het detecteren van discrete antigenen in hu-5 mane NSCLC en andere humane tumoren. Eén werkwijze volgens de uitvinding omvat de bepaling van de aanwezigheid van een kwaadaardige conditie in longweefsel en andere humane weefsels·door het weefsel te onderzoeken op de expressie of het ontbreken van expressie van een glycoprotelne-antigeen met de eigenschappen van het L20-antigeen. Met de woorden "met 10; de eigenschappen van" wordt bedoeld dat het antigeen reageert met een antilichaam dat het L20-antigeen herkent. De expressie of het ontbreken van expressie van dit antigeen kan klinisch bruikbare informatie verschaffen die met standaard histopathologische technieken niet ter beschikking staat.· 15 Monoclonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor het detecteren van niet-kleincellige longcarcinoma-cellen in histologische en cytologische monsters. Bijvoorbeeld vertoonden uitgesneden weefselmonsters van adenocarcinoma, epidermoïde en klein-cellig carcinoma van de long bij gebruik van de in Hoofdstuk 5.4 beschre-20 ven immunoperoxydase-kleuringstechniek, een intensieve positieve kleuring. Normale long, milt, borst,coIon, nier, lever, hersenen, hart, huid, thyrolde, testis, vagina en normale lymfocyten waren negatief.

Een andere belangrijke in vitro diagnostische toepassing van de monoclonale antilichamen volgens de uitvinding is de beoordeling van 25' andere carcinoma's dan de NSCL. Het antilichaam is gebruikt voor het detecteren van de epitoop in carcinoma's van de borst, het colon en in klein-cellige longcarcinoma. Normale monsters van deze weefsels vertoonden geen expressie van de determinant. Het monoclonale antilichaam is derhalve bruikbaar voor het detecteren van een antigene determinant 30 in die carcinoma's, welke aan tumoren zijn gebonden. Het monoclonale antilichaam kan derhalve een bruikbaar diagnostisch reagens zijn voor borst- en coloncarcinoma en voor klein-cellige longcarcinoma.

Anderzijds kunnen immunofluorescentie-technieken worden gebruikt om humane weefselmonsters te onderzoeken met behulp van de monoclonale 35 antilichamen volgens de onderhavige uitvinding. In een typerend protocol werden glaasjes die cryostaatsecties van ingevroren, niet-gefixeerd weefselbiopsie of weggesneden tumormonsters of cytologische uitstrijkjes 8700415 * -13- » * bevatten, aan de lucht gedroogd en geïncubeerd met het monoclonale antilichaam in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. De cytologische uitstrijkjes omvatten exfoliatieve celmonsters. Met de term "exfolia-tief" wordt bedoeld dat de monsters geïsoleerde cellen of celklompjes 5 omvatten, verkregen door het weefseloppervlak af te schrapen of te wassen, welke cellen individueel of in schilfers of laagjes worden verwijderd. Het exfoliatieve celmonster moet worden onderscheiden van weggesneden weefsel zoals dat wat bij biopsie wordt verkr.egen. De methode kan worden gebruikt in de detectie van een kwaadaardige conditie in exfolia-10 tieve celmonsters uit de long zoalseen sputummonster, uit de bronchus, het maagdarmkanaal met inbegrip van de orale pharynx, de mond, een cervi-caal uitstrijkje enz.

Na drogen wordt op de glaasjes een laag aangebracht van een anti-lichaampreparaat tegen het monoclonale antilichaam, gewoonlijk een of 15 ander type anti-muis immunoglobuline wanneer het gebruikte monoclonale antilichaam afgeleid is van fusie van een muizemilt lymfocyt en een muize-myelomalijn. Dit anti-muis immunoglobuline is met bekende technieken geconjugeerd met een verbinding zoals rhodamine of fluoresceïne iso-. thiocyanaat die bij een bepaalde golflengte fluoresceert. Het kleurings-20 patroon en de intensiteiten in het monster worden daarna met behulp van fluorescentie-lichtmicroscopie bepaald en desgewenst fotografisch vastgelegd.

De bovenstaand gegeven beschrijving is primair gericht op·het gebruik van de antilichamen volgens de uitvinding in immunofluorescentie-25 technieken. De antilichamen volgens de uitvinding kunnen echter in de meeste tests worden gebruikt waarbij antigeen-antilichaamreacties optreden. De tests kunnen homogene en heterogene tests zijn. In een homogene test kan het monster een weefsel zijn, dat gelyseerd en geklaard is om celresten te verwijderden. De immunologische reactie omvat gewoonlijk 30 het specifieke antilichaam, een labelanalyt, en het van belang zijnde monster. Het van het label afkomstige signaal wordt gemodificeerd, direct of indirect, na de binding van het antilichaam aan de gelabelde analyt.

Zowel de immunologische reactie als de detectie van de omvang daarvan worden in een homogene oplossing uitgevoerd. Immunochemische labels 35 die gebruikt kunnen worden, omvatten vrij radicalen, fluorescerende kleurstoffen, enzymen, bacteriofagen, coenzymen, enz.

In een heterogene testbenadering, bestaan de reagentia gewoonlijk 87004jö - *· ft -14- uit het monster, het specifieke antilichaam, en een middel voor het produceren van een detecteerbaar signaal. Het monoclonale antilichaam is gewoonlijk als bekleding aangebracht op een vaste drager of vaste fase. Het monster wordt vervolgens in een vloeibare fase in contact ge-5 bracht met het antilichaam in de vaste fase. De vaste fasedrager wordt daarna van de vloeistoffase afgescheiden en hetzij de vaste fase, hetzij de vloeibare fase, wordt onderzocht op een detecteerbaar signaal waarbij een middel wordt gebruikt voor het produceren van een dergelijk signaal. Het signaal is gerelateerd aan de aanwezigheid van de analyt in 10· het monster. Middelen voor het produceren van een detecteerbaar signaal omvatten het gebruik van radioactieve labels, fluorescerende stoffen, enzymen, enz. Voorbeelden van heterogene immuno-assays zijn de radio-immuno-assay,immunofluorescentie methoden, enzym-gekoppelde immuno-assays, en dergelijke.

15 Voor een meer gedetailleerde bespreking van de bovenstaand ver melde immuno-assaytechnieken, wordt verwezen naar "Enzyme-Immunoassay," door Edward T. Maggio 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. Zie bijvoorbeeld ook de Amerikaanse octrooischriften 3.960.834; 3.791.932; 20 3.817.837; 3.850*578; 3.853.987; 3.867.517; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; en 4.098.876,welke lijst niet uitputtend bedoeld is.

De antilichamen volgens de uitvinding kunnen ook worden gebruikt voor in vivo diagnostische toepassingen. Bijvoorbeeld kunnen anti-25 lichamen of van antilichamen bereide fragmenten, bijvoorbeeld Fab en F(ab1)^-fragmenten worden gebruikt voor imaging van tumoren, met inbegrip van meta-statische afzettingen in humane patiënten met NSCLC op een analoge wijze als beschreven is voor kwaadaardige melanoma door Larson et al., 1983, J. Nucl. Med. 24; 123 en Larson et al., 1983, J.

30 Clin. Invest., 72: 2101. Het gezuiverde antilichaam of fragmenten daarvan worden gelabeld met een middel dat een detecteerbaar signaal geeft, 131 bijvoorbeeld een radio-isotoop zoals I en toegediend in een geschikte drager, bijvoorbeeld intraveneus, aan een patiënt. De localisatie van het aan de tumor gebonden antilichaam wordt gedetecteerd met uitwendige 35 scintografie, emissie-tomografie of radionucleaire aftasting, waarbij bijvoorbeeld een gamma camera wordt gebruikt.

8700415 ·» * -15- 4.3.2. Therapeutische toepassingen.

De antilicharaen volgens de uitvinding kunnen ook therapeutisch worden gebruikt. De monoclonale antilichamen kunnen samen met een breed spectrum van farmaceutische of cytotoxische middelen worden toegepast.

5 Bijvoorbeeld kan een antilichaam worden gebonden aan een toxine om een immunotoxine te vormen (Jansen et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 185 of aan een radioactief materiaal bijvoorbeeld ^^1, *^I, etc. (Order, 1984, Compr. Ther. _10: 9; Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 742: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68: 317) of aan 10 een geneesmiddel (Rowland et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 19:.l) ter vorming van radiofarmaca of farmaca. Geconjugeerde antilichamen kunnen worden toegediend aan patiënten om sterkere tumoricide effecten te realiseren door de cytotoxische werking van het chemotherapeutische middel dat aan de tumor wordt afgeleverd op basis van de bindingsaffini-15 text van het antilichaamgedeelte.

Zogenaamde "chimaere antilichaam" moleculen van het antilichaam volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden bereid welke een antigeen-bindend domein van de muis bevatten samen met constant, gebied domeinen van de mens (Morrison-et al., 1984, Proc. Nat'l Acad, Sci. U.S.A. 81: 20 6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452) en deze benadering kan worden gebruikt voor het construeren van nieuwe antilichaam moleculen met gewenste effector functies zoals het vermogen om humaan complement te activeren en ADCC te bevorderen (Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604).

25 Een andere therapeutische toepassing van de monoclonale anti- ÜËhamen volgens de onderhavige uitvinding is het bereiden van anti-idio-type antilichamen waarbij het L20 antilichaam als immunogeen wordt gebruikt (zie bijvoorbeeld Nepom et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci.

Ü.S.A., £1_: 2864; Lee et al., 1955, Proc. Nat'l Acad. Sci, 82: 6286) 30 Een aantrekkelijk aspect van de onderhavige uitvinding is dat de onderhavige antilichamen kunnen worden gecombineerd met andere antilichamen tegen NSCLC of andere tumoren, zoals die welke beschreven zijn in de Amerikaanse octrooiaanvragen 667.521; 684.759; en 738.612. De combinatie is effectief in het detecteren van de typen van niet-kleincellige long-35 carcinoma's die bovenstaand vermeld zijn, namelijk groot-cellige niet-gedifferentieerde longcarcinoma, adenocarcinoma, en epidermoxde carcinoma.

870 0 4 1 3 -16-

De monocloiiale antilichamen volgens de uitvinding definiëren ook determinantenplaatsen op een antigeen dat met andere carcinoma's is gebonden, zoals borstcarcinoma's,coloncarcinoma's en klein-cellige long-carcinoma's (zie Hoofdstuk 5, tabel A). De onderhavige uitvindingen kun-5 nen derhalve worden gebruikt in therapeutische methoden en therapeutische produkten die op dergelijke carcinoma's zijn gericht.

Het nieuwe antigeen volgens de onderhavige uitvinding, aangeduid als antigeen L20 kan ook voor therapeutische toepassingen worden gebruikt.

Het antigeen kan uit tumoren worden gezuiverd of worden geproduceerd door 1Ό, recombinant DNA-technologie (Brown et al., samenhangende Amerikaanse oc-pr. Sz^-ïi3 trooiaanvrage/, ingediend op 7 februari 1986) . Het voor het L20 antigeen-coderende gen kan worden gedoneerd met methoden waarbij eerst het mRNA van het L20 antigeen wordt verrijkt. Volgens één van deze methoden kunnen polysomen (bestaande uit mRNA, ribosomen en nascente polypeptide-15 ketens) worden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie met antilichamen die de L20 antigene determinant op de nascente keten herkennen.

Het mRNA wordt geïsoleerd door immunoprecipitatie met bijvoorbeeld L20 antilichaam en het cDNA wordt gedoneerd in een geschikte expressievec-tor. Anderzijds kan L20 antilichaam of antiserum tegen L20 antigeen 20 worden gebruikt voor het screenen van een cDNA bibliotheek waarbij een expressievector wordt gebruikt. Het gezuiverde of gedoneerde L20 antigeen kan alleen als een immunogeen of samen met een geschikt immunologisch adjuvans worden toegediend. Anderzijds kan het voor het antigeen-coderende gen worden ingevoegd in het gen voor een virus, zoals het 25 vaccinia-virus, teneinde een recombinant DNA-produkt te produceren dat als het immunogeen kan worden gebruikt (Brown et al., samenhangende

nr. δ 23- IC

Amerikaanse octrooiaanvrage», ingediend op 7 februari 1986) 4.4. Diagnostische kits.

De uitvinding omvat ook diagnostische kits voor het uitvoeren van 30 bovenstaand besproken methoden In één uitvoeringsvorm omvat de diagnostische kit (a) een monoclonaal antilichaam, meer in het bijzonder zoals bovenstaand gedefinieerd, en (b) een conjugaat van een specifieke bindingspartner voor het monoclonale antilichaam en een label dat in staat is om een detecteerbaar signaal te produceren. De reagentia kunnen 35 ook hulpmiddelen omvatten, zoals buffermiddelen en eiwit-stabiliserende middelen, bijvoorbeeld polysacchariden en dergelijke. De diagnostische kit kan verder indien nodig andere componenten van het signaal-produce- 8700415 * * -17- rende systeem omvatten, met inbegrip van middelen voor het verminderen van de achtergrond-interferentie, controlereagentia, een inrichting voor het uitvoeren van een test, enz. In een andere uitvoeringsvorm omvat de diagnostische kit een conjugaat van een monoclonaal antilichaam volgens 5 de uitvinding en een label dat in staat is om een detecteerbaar signaal te produceren. Hulpmiddelen als bovenstaand vermeld kunnen eveneens aanwezig zijn.

5. Voorbeelden.

De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de hierna 10 volgende, niet beperkende voorbeelden.

5.1. Bereiding van monoclonale antilichamen.

Monoclonale antilichamen werden bereid onder toepassing van hybri-doma fusietechnieken zoals eerder beschreven door Yeh et al., 1979, int.

J. Cancer 29: 299. Een drie maanden oude Balb/c-muis werd geïmmuniseerd 15 met behulp van geëxplanteerde gekweekte cellen van een humane adenocarcinoma van de long, aangeduid als 3082, als het immunogeen. De muis kreeg vier intraperitoneale injecties van ongeveer 107 cellen. Drie dagen nadat de laatste immunisatie had plaatsgevonden, werd zijn milt verwijderd, in kweekmedium gesuspendeerd en gefuseerd met NSl-muizen myeloma-20 cellen (Kohier en Milstein, supra). Het mengsel werd geënt om cultures met lage dichtheid te vormen, afkomstig van enkele gefuseerde cellen (clones).

De supematanten van hybride-cellen werden gescreend voor directe bindingsactiviteit aan longkankercellijnen waarbij zowel een ELISA-assay 125 25 als een autoradiografische indirecte Ι-gelabelde proteïne A-assay (Brown et al., 1979, J. Immunol. Meth., 31: 201) werden gebruikt. Extracten van celmembranen van de voor immunisatie gebruikte tumor werden bereid onder toepassing van een gemodificeerde procedure van Colcher et al., 1981, Cancer Res. 42: 1451); Yeh et al., supra. De weefsels werden 30 gewassen met PBS en cellen van intacte tumoren werden gesuspendeerd door ze door een roestvrij stalen zeef te persen. Hierna werd 1 mM NaHCO^ dat 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride bevatte (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA)toegevoegd, en werd het materiaal daarna gehomogeniseerd op ijs, met 50 slagen van de B-stamper van een Dounce-homogenisator.

35 Na 15 minuten centrifugeren bij 27.000 x g, werd het supernatant verwijderd, en werd het pellet opnieuw gesuspendeerd in PBS, gesoniteerd ge-, durende 1 minuut, en bewaard bij -70°c.

870 0 4 1.5 -18-

Hybridoma's, die aan de celmembraan-extracten-bindende antilicha-men produceerden, werden gedoneerd,in vitro geëxpandeerd, en verder getest op antilichaam specificiteit. De hybridoma's die antilichaam produceerden met een schijnbare specificiteit voor humane longkanker werden 5 opnieuw gedoneerd, geëxpandeerd, en geïnjecteerd in met pristaan behandelde drie maanden oude BALB/c-muizen, waarin ze groeiden als ascites-, tumoren.

Na deze procedure werd de hybridoma cellijn L20 verkregen, gedoneerd en geïnjecteerd in muizen om te ontwikkelen als een ascites tumor. IQ' In de ascites uitgescheiden antilichaam werd gezuiverd op proteïne A

Sefarose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, JJ3, 429) of door gelfiltra-tie in Sefacryl S-300. Gezuiverd antilichaam werd voor verdere karakterisering gebruikt.

5.2. Karakterisering van het L20 monoclonale antilichaam.

15 5.2.1. Detectie en binding van L20 aan gekweekte cellen.

De sub-cellulaire localisatie van antigeen werd bepaald door anti-lichaambinding te meten aan de cellen voor of na permeabilisatie met behulp van een niet-ionogeen detergent. Antilichamen die aan het celopper- vlak van intacte gekweekte cellen binden, werden geïdentificeerd door 125 20 directe bindingsassays met Ι-gelabeld antilichaam (Brown et al., 1981,

Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 2§.: 539) of door indirecte fluorescentie met behulp van de fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) II.

Aan intra-eellulaire locaties-bindende antilichamen werden bepaald door 125 directe binding van Ι-gelabeld antilichaam aan cellen na fixatie met 25 paraformaldehyde en daaropvolgende permeabilisatie met het niet-ionogene detergens NP-40.

Voor bindingsassays, uitgevoerd onder toepassing van radio-gela- belde antilichamen (Brown et al., supra), werden gekweekte cellen(10^) 6 125 gedurende 30 minuten op ijs gelncubeerd met 10 cpm I-gelabeld antilichaam in 100 μΐ bindingsbuffer. Van de suspensie werd een laag aange- 30 bracht op 0,2 ml dinonylftalaat : dibutylftalaat (1:1 v/v) en gecen- 125 trifugeerd.. Het pellet en de waterige fase werden geteld op I. Om niet-specifieke binding te meten werden parallelle incubaties uitgevoerd met niet-gelabeld antilichaam als concurrerend materiaal (Brown et al., supra).

8703415 *· * -19- TABEL A.

Binding van radioactief jodium gelabeld L20 antilichaam aan gekweekte cellen._______'_;__;_- 5 Cellen Specifieke binding

Calu-1 long adenocarcinoma 45.400 H3082 long adenocarcinoma 50.100 H2981 long adenocarcinoma 64.100 10 H2984 long adenocarcinoma 119.300 MCF7 borst carcinoma 78.800 3017 melanoma 2.200

Normale T cellen 200

Jurkat T leukemia 200 15 Daudi B lymphoma 200 5.2,2. Isotype-bepalittg van L20 antilichaam.

Om de klasse te bepalen van de door de L20 hybridoma cellijn ge-20 produceerde immynoglobulinen, werden de volgende technieken gebruikt: (a) Ouchterlony immunodiffusie.

Een gedeelte van het supernatant van bepaalde hybridoma cellen werd in het centrale putje van een 25 % agarplaat gebracht. Monospeci-fieke konijne anti-muis Ig isotype antilichamen (Southern Biotechnolo-25 gy, Birmingham, AL) werden in de buitenste putjes geplaatst en de plaat werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en gedurende een nacht bij 4°C gelncubeerd.

(b) ELISA isotypering.

Dynatech Immuolon platen met 96 putjes werden bekleed met elk 30 antiserum in een concentratie van 1 y g/ml, 50 μΐ/putje in PBS en gedurende een nacht op 4°C bedekt gelaten. De platen werden gewassen met PBS/Tween 20, 0,05 % en geblokkeerd met medium 100 μΐ/putje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na wassen van de platen, werden supernatanten van de L20 hybridoma toegevoegd en werd gedurende 1 uur tij kamertemperatuur 35 gelncubeerd. Na wassen met PBS, werden runderserum albumine (BSA) platen gedurende 2 uur bij 37°C gelncubeerd met monospecifieke konijne anti-muis Ig isotype antilichamen gekoppeld aan peroxydase (Zymed). Na wassen §700415 • Y * -20- werden de platen geïncubeerd met 1 mg/ml orthofenyleendiamine en 0,03 % M citraatbuffer pH 4,5. De optische dichtheid bij 630 nm werd bepaald tot een Dynatec ELISA plaataflezer.

Het L20 monoclonale antilichaam was van het IgG^ isotype.

5 5.3. Antigeen herkend door L20 antilichaam.

Om eiwitantigenen te identificeren werden longarcinomacellen aan het oppervlak radioactief gelabeld met jodium of metabolisch gelabeld 25 met S-methionine. Antigenen werden van cellysaten geïsoleerd door incubatie met monoclonaal antilichaam, toevoeging van geite anti-muis IgG, 10 en adsorptie aan Staphylococcus aureus. Immuun precipitaten werden gewassen en onderworpen aan preparatieve natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) op een 10 - 20 % acrylamidegel. Na elektroforese werd de gel gekleurd met Coomassie Brillant Blue (0,5 gew.% tot 10 % azijnzuur en 30 % isopropanol) en ontkleurd in een oplos-15 sing van azijnzuur (5 %,· v:v) en methanol (17 %, v:v) . De gekleurde L20 antigeenband werd uitgesneden met een scheermesje en onmiddellijk onderworpen aan elektro-elutie met een ECU-040 Electroelutor/Concentra-tor (C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) volgens methoden beschreven door Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. _91_: 227 - 236.

20 Geautomatiseerde Edman-afbraak werd uitgevoerd met ongeveer 23 pmol van L20 antigeen (gebaseerd op de ppbrengst van geïdentificeerd L-l) in een gasfase sequentie bepalingsinrichting(Model 470A, Applied Biosystems, Inc., Poster City, CA).De fenylthiohydatoïne aminozuur-derivaten werden geanalyseerd door reverse-fase high performance liquid 25 chromatography (HPLC) met behulp van een Model 120A on-line HPLC unit (Applied Biosystems, Inc.) met een PTH-C18 kolom (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Ine.) en een natriumacetaat/tetrahydrofuran/acetonitrile gradiënt voor elutie.

De aminozuursequentie aan de amino terminus was als volgt: 30 1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

waarin X een aminozuur voorstelt dat nog niet geïdentificeerd is.

Vergelijking van deze sequentie met sequenties die opgeslagen zijn in de huidige eiwitdatabank (PIR Release 6.0, november 1985), liet geen 3:5 significante sequentiehomologie zien met enige andere bekende sequentie.

Het door L20 antilichaam herkende antigeen is een glycoproteïne antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton.

5700415 -21- 5.4. In vitro immunohistologische toepassing.

De ongelabelde antilichaamtechniek volgens Stemberger, 1979, in Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, blz: 104 - 169, zoals gemodificeerd door Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511,werd ge-5 bruikt voor imnunohistologische onderzoeken aan ingevroren secties. De doelweefsels voor deze proeven werden verkregen door chirurgie en binnen 4 uur na verwijdering ingevroren in isopentaan, vooraf gekoeld in vloeibare stikstof. De weefsels werden daarna in vloeibare stikstof of bij -70°C bewaard totdat ze gebruikt werden. Konijne anti-muis IgG (Stem-10 berger-Meyer Immunochemicals, Inz., Jarettsville, MD) werd gebruikt als een verdunning van 1/50. Muize-peroxydase-antiperoxydase complexen (PAP, Stemberger-Meyer Immunochemicals, Inc.),'bevattende 2 mg/ml specifiek gezuiverd PAP werd gebruikt in een verdunning van 1/80. Ingevroren secties werden geprepareerd, gedroogd, behandeld met aceton en gedroogd 15 (Garrigues et al., supra). Secties die voor histologisch onderzoek moesten worden gebruikt, werden gekleurd met hematoxyline. Om niet-specifieke achtergrond-interferenties te verminderen, werden de secties vooraf ge-incubeerd met normaal humaan serum,verdund 1/5 (Garrigues et al., supra). Muize-antilichamen, geite anti-muis IgG, en muize-PAP werden 20 verdund in een oplossing van 10 % normaal humaan serum en 3 % konijne-serum.

De kleuringsprocedure bestond uit het behandelen van sectie-series met specifieke of controle-antilichamen gedurende 2,5 uur, incu-beren gedurende 30 minuten met konijne anti-muis IgG verdund 1/50 en 25 blootstellen aan muize-PAP complex, verdund 1/80, gedurende 30 minuten.

Na elke behandeling met antilichaam werden de glaasjes twee keer in PBS gewassen. De immunohistochemische reactie werd ontwikkeld met vers bereid 0,5 % 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma, St. Louis, MO) en 0,01 % H2°2 ^ 0Ό5 M trisbuffer, pH 7,6 gedurende 8 minuten.

30 Verdere blootstelling aan een 1 %-ige oplossing van OsO^ in gedestilleerd water gedurende 20 minuten leide tot een intensiever worden van de kleuring. De secties werden gespoeld met water, ontwaterd in alcohol, geklaard in xyleen, en op glaasjes gebracht.

De glaasjes werden elk geëvalueerd onder een code en gecodeerde 35 monsters werden door een onafhankelijke onderzoeker gecontroleerd. Typerende glaasjes werden gefotografeerd onder toepassing van differentiële interferentie-contrastoptica (Zeiss-Nomarski). De mate van antilichaam- 8 7 A n 4'? n V » V w 7 i v -22- kleuring werd geëvalueerd als O (geen reactiviteit), + (een paar zwak-positieve cellen), ++ (ten minste 1/3 van de cellenpositief) , +++ (de meeste cellen positief), ++++ (nagenoeg alle cellen sterk positief) .

Omdat verschillen tussen + en O-kleuring minder duidelijk waren dan 5 tussen + en ++-kleuring, werd een kleuring die als ++ of meer werd gekwalificeerd "positief" geacht. Zowel neoplastische als stroma cellen werden in tumormonsters waargenomen. De opgenomen kleuring is die van de tumorcellen, omdat de stroma cellen in het geheel geen kleuring gaven, of veel zwakker werden gekleurd dan de tumorcellen.

87 fl Λ £ A ST ' i? 'J Η ί -J

> * -23- TABEL B, ïmmunoperoxydasekleuring van tumoren en normale weefselmonsters met L2Q monoclonale antilichamen.____;___ 5 Wëefseltype Aantal positieve geteste __aantal x

Long carcinoma: adenocarcinoma .18/20 epidermoïde .3/3 10 bronchiaal 0/1 klein-cellig . 4/4

Long carcinoma: .

cellijnen 3/3 15 Borst carcinoma 4/7

Colon carcinoma 5/8

Melanoma 5/8

Nier carcinoma 1/1

Liposarcoma 0/1 20 Normale longen zwakke kleuring van 1 uit 3 geteste monsters

Normale milt negatief

Normale borst "

Normale colon "

Normale nier ” 25 Normale lever "

Normale hersenen "

Normaal hart "

Normale huid "

Normale thyroide ” 30 Normale testis ”

Normale vagina ”

Normale lymfocyt pellet " x Alle onderzochte monsters waren ingevroren secties van weefsels die door chirurgie waren verkregen. Zie de tekst voor een gedetailleerde beschrijving van de immunohistologische methoden. Een kleuring van 35 ++ (hetgeen vertegenwoordigt dat ten minste 1/3 van de cellen positief was) werd als positief beschouwd.

87ÖÖ ilï -24-

Het is duidelijk dat veel modificaties en variaties van de uitvinding zoals bovenstaand beschreven mogelijk zijn zonder dat daarmede de idee en omvang van de uitvinding verlaten wordt. De beschreven specifieke uitvoeringsvormen zijn slechts ter voorbeeld gegeven en de uitvin-5 ding wordt dan ook alleen beperkt door de bewoordingen van de conclusies.

Een hierin beschreven cellijn L20 is gedeponeerd bij American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland onder het nummer ATCC No. HBS913. De hierin beschreven uitvinding is echter niet beperkt tot de gedeponeerde cellijn omdat de gedeponeerde uitvoeringsvorm slechts IQ- als één enkele illustratie van één aspect van de uitvinding is beoogd en omdat eventuele equivalente cellijnen die een functioneel equivalent monoclonaal antilichaam produceren, tot de omvang van de uitvinding behoren. In feite zullen verscheidene modificaties van de uitvinding naast de reeds getoonde en beschreven mogelijkheden duidelijk zijn aan de des-15 kundigen op basis van de voorgaande beschrijving. Dergelijke -modificaties worden beoogd binnen de omvang van de uitvinding te behoren.

8700415

Claims (59)

1. Monoclonaal antilichaam, geproduceerd door een continue cellijn met de identificerende eigenschappen van A.T.C.C. No. .HB8913, welk antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen 5 en functionele equivalenten, bindende fragmenten en immunocomplexen van dit antilichaam.

2. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 1, geconjugeerd met een label dat eeri detecteerbaar signaal kan geven.

3. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 2, waarin het label een 10 fluorescerend label of een chromofoor is.

4. Monoclonaal antilichaam, geproduceerd door een continue cellijn met de identificerende eigenschappen van A.T.C.C. No. HB8913, welk antilichaam bindt aan een celdeterminantenplaats op een oppervlak glycopro-telne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, welk 15 antigeen gekarakteriseerd is door een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton, zoals bepaald met polyacrylamide gel elektroforese, een aminozuursequentie van de aminoterminus als volgt: 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L 20 waarin X een niet-geïdentificeerd aminozuur voorstelt, alsmede functionele equivalenten, bindende fragmenten en immunocomplexen van dit antilichaam.

5. Monoclonaal antilichaam, geproduceerd door een hybridoma cellijn, gevormd door fusie van een myelomacel en een cel die antilichaam kan pro- 25 duceren, dat bindt aan een determinant op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, welk antigeen een molecuulgewicht heeft van ongeveer 110.000 dalton zoals bepaald met polyacrylamide gel elektroforese, en een aminozuursequentie van de aminoterminus heeft als volgt: . 30 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geïdentificeerd aminozuur voorstelt, alsmede functionele equivalenten, bindende fragmenten en immunocomplexen van dit antilichaam. 8700413 k. . V *· -26-

6. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 5, dat tot de klasse IgG behoort.

7. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 5, dat tot de subklasse igGl behoort.

8. Monoclonaal antilichaam, geproduceerd door de hybridoma cellijn L20, A.T.C.C. No. HB8913, welk monoclonaal antilichaam gekarakteriseerd is door de binding aan een determinant van een celoppervlak glycopro- teïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, welk antigeen een molecuulgewicht heeft van ongeveer 110.000 dalton zoals 10 bepaald door polyacrylamide gel elektroforese, en een aminozuursequentie . van de aminoterminus heeft als volgt: 15 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geidentificeerd aminozuur voorstelt, alsmede functio-15 nele equivalenten, bindende fragmenten en immunocomplexen van dit antilichaam.

9. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 8, dat tot de klasse IgG behoort.

10. Monoclonaal antilichaam volgens conclusie 8, dat tot de subklasse 20 IgGl behoort.

11. Werkwijze voor het detecteren van niet-kleincellige longcarcinoma, omvattende het in contact brengen van het monoclonale antilichaam volgens één van de conclusies 1, 4, 5 of 8 met een humaan weefselmonster, en het detecteren van de interactie van dit antilichaam met eventuele antige- 25 nisch corresponderende carcinomacellen of antigene determinanten daarvan in het monster.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin het humane weefsel long-weefsel is.

13. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin de interactie gedetecteerd 30 wordt door immunohistologische kleuring.

14. Werkwijze voor het detecteren van kleincellige longcarcinoma, omvattende het in contact brengen van het monoclonale antilichaam volgens één van de conclusies 1, 4, 5 of 8 met een humaan weefselmonster, en het detecteren van de interactie van dit antilichaam met eventuele anti- 35 genisch corresponderende carcinomacellen of antigene determinanten daarvan in het monster. 67 0 0 41 S -s Jt -27-

15. Werkwijze voor het detecteren van borstcarcinoma, omvattende het » in contact brengen van het monocionale antilichaam volgens één van de conclusies 1, 4, 5 of 8 met een humaan weefsel of vloeistof monster, en het detecteren van interactie van het antilichaam met eventuele anti-5 genisch corresponderende carcinomacellen of antigene determinanten daarvan in het monster.

16. Werkwijze voor het detecteren van coloncarcinoma, omvattende het in contact brengen van het monocionale antilichaam volgens één van de conclusies 1, 4, 5 of 8 met een humaan weefsel of vloeistofmonster, en 10 het detecteren van interactie tussen het antilichaam met eventuele anti-genisch corresponderende carcinomacellen of antigene determinanten daarvan in het monster.

17. Werkwijze voor het localiseren van humane niet-kleincellige long-carcinoma's in vivo, omvattende: 15 (a) het zuiveren van het monocionale antilichaam volgens één van de con clusies 1, 4, 5 of 8; (b) het radiolabelen van het antilichaam; (c) het toedienen van het antilichaam aan een humane patiënt in een geschikte drager; en 20 (d) het localiseren van het monocionale antilichaam door uitwendige scintografie, emissie-tomografie of radionucleaire aftasting.

18. Glycoprotelne antigeen in nagenoeg 'gezuiverde vorm, welk antigeen afgeleid is van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen en een molecuulgewicht heeft van ongeveer 110.000 dalton,zoals bepaald met poly- 25 acrylamide gel elektroforese, en een aminozuursequentie van de amino- terminus heeft als volgt: 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-gexdentificeerd aminozuur voorstelt, alsmede immuno- 30 complexen van dit antigeen.

19. Glycoprotelne antigeen in nagenoeg gezuiverde vorm, omvattende een glycoprotelne antigeen met êen molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton zoals bepaald door polyacrylamide gel elektroforese en met een aminozuursequentie van de aminoterminus als volgt: 35 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L 8700413 -28- waarin X een niet-geldentificeerd aminozuur voorstelt, alsmede immumo-complexen van dit antigeen.

20. Werkwijze voor immunotherapie voor de behandeling van niet-klein-cellige longcarcinoma, omvattende: 5 (a) het zuiveren van het monoclonale antilichaam volgens één van de con clusies 1,4, 5 of 8; (b) het conjugeren van dit monoclonale antilichaam met een cytotoxisch middel, een toxine, of een radiofarmaceuticum? en (c) het toedienen van dit geconjugeerde monoclonale antilichaam aan een 10 humane longcarcinoma patiënt in een geschikte drager.

21. Werkwijze voor immunotherapie, voor de behandeling van tumoren die het door het L20 antilichaam gedefinieerde antigeen tot expressie brengen, omvattende: (a) het zuiveren van het monoclonale antilichaam volgens één van de con- 15 clusies 1, 4, 5 of 8; (b) het bereiden van anti-idiotype antilichamen tegen dit monoclonale antilichaam; en (c) het toedienen van deze anti-idiotype antilichamen aan een humane longcarcinoma.patiënt in een geschikte drager.

22. Continue cellijn die een monoclonaal antilichaam produceert, ge kenmerkt door de mogelijkheid om te binden aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, omvattende een hybridoma van een lymfocyt, afgeleid van een muis die geïmmuniseerd is met longcarcinomacellen, of een 25 immunogene determinant daarvan, en een muize-myelomacel.

23. Continue cellijn die een monoclonaal antilichaam produceert, dat gekenmerkt is door de mogelijkheid om te binden aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, omvattende een hybridoma van een lymfocyt, 30 afgeleid van een mens met longcarcinoma, en een myelomacel.

24. Continue cellijn welke een monoclonaal antilichaam produceert, dat gekenmerkt wordt door zijn vermogen om te binden aan een determinanten- . plaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane klein-cellige longcarcinomacellen, omvattende een hybridoma van een lymfocyt, 35 afgeleid van een mens met langcarcinoma, en een myelomacel.

25 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geïdentificeerd aminozuur voorstelt.

25. Continue cellijn die een monoclonaal antilichaam produceert, dat gekenmerkt wordt door het vermogen om te binden aan een determinanten- 8700415 - .«fc -29- plaats op een celoppervlak glycoproteine antigeen van humane borstcarci-nomaceilen, omvattende een hybridoma van een lymfocyt, afgeleid van een mens met longcarcinoma, en een myelomacel.

26. Continue cellijn welke een moncclonaal antilichaam ptoduceert, 5 dat gekenmerkt wordt door het vermogen om te binden aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteine antigeen van humane coloncarci-nomacellen, omvattende een hybridoma van een lymfocyt, afgeleid van een mens met longcarcinoma/ en een myelomacel.

27. Hybridomacellijn L20, A.T.C.C. No. HB8913, gevormd door fuseren 10 van een. NS1 muize-rayelomacel met een muize-splenocyt, verkregen uit een Balb/c muis geïmmuniseerd met humane longcarcinoma 3082-cellen, welke een monoclonaal antilichaam produceert dat bindt aan èen determinant van celoppervlak glycoproteine antigeen van humane niet-kleincellige long- carcinomacellen met een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton en 15 met een aminozuursequentie van de aminoterminus als volgt: 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-p-V-A-V-A-L-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geïdentificeerd aminozuur voorstelt/ zoals bepaald met polyacrylamide gel elektroforese.

28. Continue cellijn, welke een monoclonaal antilichaam produceert, dat gekenmerkt wordt door het vermogen om te binden aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteine antigeen van een humane niet-kleincellige longcarcinoma, welk antigeen een molecuulgewicht heeft van ongeveer 11Q.0CQ dalton en een aminozuursequentie van de 25 aminoterminus heeft als volgt: 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geïdentificeerd aminozuur voorstelt, omvattende een hybridoma van een lymfocyt die in staat is om antilichaam te produceren 30 tegen dit antigeen, en een myelomacel.

29. Werkwijze voor het produceren van een monoclonaal antilichaam dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteine antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, omvattende: a) het vermenigvuldigen van een hybridoma met de identificerende eigen-35 schappen van A.T.C.C. No. HB 8913, verkregen door fuseren van (i) een antilichaam-oroducerende cel, afgeleid van de milt van een dier dat geïmmuniseerd is met longafscheidingen, gekweekte cellen, of long-weefsel van een patiënt met niet-kleincellige longcarcinoma, met (ii) 8700413 k. __ - V & -30- een myelomacel; en b) het oogsten van de door de hybridoma geproduceerde monoclonale anti-lichamen.

30. Werkwijze volgens conclusie 29, waarin de hybridoma in vivo wordt 5 vermenigvuldigd.

31. Werkwijze volgens conclusie 30, waarin de hybridoma wordt vermenigvuldigd door injectie van een met pristaan-behandelde BALB/c muis en het groeien van een ascites tumor, en de in de ascites uitgescheiden monoclonale antilichamen worden gezuiverd door adsorptie aan proteïne 10. sefarose of door gelfiltratie.

32. Werkwijze volgens conclusie 29, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een celopper-vlak glycoprotelne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinoma-cellen, waarin het antigeen een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 15 dalton heeft, zoals bepaald door polyacrylamide gelelektroforese en de volgende amino-terminale aminozuursequentie heeft: 15 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geldentificeerd aminozuur voorstelt.

33. Werkwijze volgens conclusie 32, waarin de hybridoma hybridoma- cellijn L20, A.T.C.C. No. HB 8913 omvat.

34. Werkwijze volgens conclusie 33, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam van de klasse IgG is.

35. Werkwijze volgens conclusie 34, waarin het geproduceerde monoclo-25 nale antilichaam van de subklasse IgGl is.

36. Werkwijze voor het produceren van een monoclonaal antilichaam dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoprotelne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, omvattende: a) het vermenigvuldigen van een getransformeerde B-cellijn, verkregen 30 door onsterfelijk maken van een antilichaamproducerende cel, verkre gen uit een patiënt met niet-kleincellige longcarcinoma; en b) het oogsten van de door de getransformeerde B-cellijn-geproduceerde monoclonale antilichamen.

37. Werkwijze volgens conclusie 36, waarin de immortalisatie wordt ge-35 realiseerd door EBV infectie.

38. Werkwijze voor het produceren van een monoclonaal antilichaam dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoprotelne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, omvattende: b /1 u 41 a * V __ _ ^ * -31- a) het vermenigvuldigen van een hybridoma, verkregen door fuseren van (i) een getransformeerde B-cellijn, verkregen door immortalisatie van een antilichaam-producerende cel, verkregen uit een patiënt met niet-kleincellige longcarcinoma, met (ii) een myelomacel; en 5 b) het oogsten van de door de hybridoma geproduceerde monoclonale anti-lichamen.

39. Werkwijze volgens conclusie 38, waarin de immortalisatie wordt gerealiseerd door EBV infectie.

40. Werkwijze volgens conclusie 36, waarin het geproduceerde mono-10 clonale antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een celopper- vlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinoma- cellen, waarin het antigeen een molecuulgewicht van 110.000 dalton heeft, zoals bepaald door polyacrylamide gelelektroforese, en de volgende aminoterminale amino zuursequentie heeft: 15 1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geidentificeerd aminozuur voorstelt.

41. Werkwijze volgens conclusie 38, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak 20 glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacllen, waarin het antigeen een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton heeft, zoals bepaald door polyacrylamide gelelektroforese, en de volgende aminoterminale aminozuursequentie bezit: 15 10 15 20

42. Werkwijze volgens conclusie 32, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam van de klasse igG is.

43. Werkwijze volgens conclusie 40, waarin het geproduceerde monoclo-30 nale antilichaam van de klasse igG is.

44. Werkwijze volgens conclusie 41, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam van de klasse IgG is.

45. Werkwijze volgens één van de conclusies 42, 43 en 44, waarin het geproduceerde monoclonale antilichaam van de subklasse IgGl is.

46. Werkwijze voor het produceren van een oonocionaal antilichaam dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane niet-kleincellige longcarcinomacellen, met een molecuulgewicht van ongeveer 110.000 dalton zoals bepaald door polyacrylamide 8700415 «Γ η -32- geleltroforese, en met de volgende aminoterminale aminozuursequentie: 15 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L waarin X een niet-geidentificeerd aminozuur voorstelt, omvattende: 5 a) het vermenigvuldigen van hybridomacellijn L20, A.T.C.C. No. HB 8913, verkregen door fuseren van (i) een antilichaam-producerende cel, afgeleid van de milt van een BALB/c muis, geïmmuniseerd met humane long-carcinoma 3082 cellen met (ii) een NSl muize-myelorna cel; en b) het oogsten van de door de hybridoma geproduceerde monoclonale anti-lichamen.

47. Werkwijze volgens één van de conclusies 29, 36 en 38, waarin het monoclonale antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een cel-oppervlak glycoproteïne antigeen van humane borst carcinomacellen.

48. Werkwijze volgens één van de conclusies 29, 36 en 38, waarin het monoclonale antilichaam bindt aan een determinantenplaats op een cel- 15 oppervlak glycoproteïne antigeen van humane colon carcinomacellen.

49. Werkwijze voor het produceren van een monoclonaal antilicham dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane borst carcinomacellen, omvattende: a) het vermenigvuldigen van een hybridoma met de identificerende eigen- 20 schappen van A.T.C.C. No. HB 8913, verkregen door fuseren van (i) een antilichaam-producerende cel, afgeleid van de milt van een dier dat geïmmuniseerd is met longafscheidingen, gekweekte cellen, of longweefsel van een patiënt met niet-kleincellige long carcinoma, met (ii) een myelomacel; en 25 b) het oogsten van de door de hybridoma geproduceerde monoclonale anti-lichamen.

50. Werkwijze voor het produceren van een monoclonaal antilichaam dat bindt aan een determinantenplaats op een celoppervlak glycoproteïne antigeen van humane colon carcinomacellen, omvattende: 30. a) het vermenigvuldigen van een hybridoma met de identificerende eigenschappen van A.T.C.C. No. HB 8913, verkregen door fuseren van (i) een antilichaam-producerende cel, afgeleid van de milt van een dier dat geïmmuniseerd is met longafscheidingen, gekweekte cellen, of longweefsel van een patiënt met niet-kleincellige long carcinoma, 35 met (ii) een myelomacel; en b) het oogsten van de door de hybridoma geproduceerde monoclonale anti-lichamen. •S 7 0 0 41 5 & ·* -33- ·>

51. Werkwijze voor het detecteren van kwaadaardige cellen in een monster dat ervan verdacht wordt dergelijke cellen te bevatten, omvattende: a) het in contact brengen van het monster met een monoclonaal antilichaam, geproduceerd volgens de werkwijze volgens één van de conclusies 29, 5 32, 33, 36 en 38, onder reactie-condities die toestaan dat het mono clonale antilichaam zich bindt aan de determinantenplaats; b) het verwijderen van niet-gebonden raonoclonale aritilichaammoleculen van het monster; en c) het onderzoeken van het monster op de aanwezigheid van gebonden mono- 10 clonaal antilichaam, waarbij de binding van het monoclonale anti lichaam een indicatie is voor de aanwezigheid van kwaadaardige cellen in het monster.

52. Werkwijze volgens conclusie 51, waarin de kwaadaardige cellen niet-kleincellige long carcinomacellen omvatten.

53. Werkwijze volgens conclusie 52, waarin het monster longweefsel omvat.

54. Werkwijze volgens conclusie 51, waarin de kwaadaardige cellen borst carcinomacellen omvatten.

55. Werkwijze volgens conclusie 51, waarin de kwaadaardige cellen 20 colon carcinomacellen omvatten.

56. Werkwijze volgens conclusie 51 of 52, waarin de binding wordt gedetecteerd door immuno-histologische kleuring.

57. 'Werkwijze voor het localiseren van humane niet-kleincellige long carcinoma's in vivo, omvattende: 23 a) het zuiveren van het monoclonale antilichaam, geproduceerd volgens de werkwijze van één van de conclusies 29, 32, 33, 36 en 38; b) het voorzien van het monoclonale antilichaam van een radiolabel; c) het toedienen van het monoclonale antilichaam aan een humane patiënt in een geschikte drager; en 30 d) het localiseren van het monoclonale antilichaam door uitwendige scin-tografie, emissie tomografie of radionuclaire aftasting.

58* Werkwijze van immunotherapie voor de behandeling van niet-kleincellige long carcinoma, omvattende: a) het zuiveren van het monoclonale antilichaam, geproduceerd volgens de 35 werkwijze van één van de conclusies 29, 32, 33, 36 en 38; b) het conjugeren van het monoclonale antilichaam aan een cytotoxisch middel, een toxine, of een radiofarnaceuticum; en 870 0 -415 k • a — i -34- c) het toedienen van het geconjugeerde monoclonale antilichaam aan een humane long carcinoma patiënt in een geschikte drager.

59. Werkwijze van immunotherapie voor de behandeling van tumoren, die het door het L20 antilichaam gedefinieerde antigeen tot expressie brengen, 5 omvattende: a) het zuiveren van het monoclonale antilichaam geproduceerd volgens de werkwijze van één van de conclusies 29, 32, 33, 36 en 38; b) het bereiden van anti-idiotype antilichamen tegen het monoclonale % antilichaam; en ΙΟ· c) het toedienen van de anti-idiotype antilichamen aan een humane long carcinoma patiënt in een geschikte drager. 8700415