JPH0813840B2 - 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体 - Google Patents
抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体Info
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- JPH0813840B2 JPH0813840B2 JP62078186A JP7818687A JPH0813840B2 JP H0813840 B2 JPH0813840 B2 JP H0813840B2 JP 62078186 A JP62078186 A JP 62078186A JP 7818687 A JP7818687 A JP 7818687A JP H0813840 B2 JPH0813840 B2 JP H0813840B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lung adenocarcinoma
- cells
- human lung
- monoclonal antibody
- antibody
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、IgGクラスに属し、ヒト肺腺癌に対して反
応性を有する単クローン性抗体ALC−390およびこれを用
いる肺腺癌の検出および治療方法に関する。本発明は肺
腺癌の病理診断、肺腺癌の治療に使用することができ、
診断薬，医薬の分野で利用可能である。
応性を有する単クローン性抗体ALC−390およびこれを用
いる肺腺癌の検出および治療方法に関する。本発明は肺
腺癌の病理診断、肺腺癌の治療に使用することができ、
診断薬，医薬の分野で利用可能である。
従来技術 従来、肺癌については、良い腫瘍マーカーがないとさ
れていたが、本発明者は、ヒト正常肺トレラントマウス
を用いる効率的な抗−ヒト肺癌単クローン性抗体の作製
法（特開昭60−190721）により、肺癌の血清診断に有効
な抗−ヒト肺癌単クローン性抗体SLC−１（特願昭60−7
6045）、ALC−１（特願昭60−76046）、ALC−186（特願
昭60−220861）、ALC−454（特願昭61−163415）などを
確立した。しかし、これらの単クローン性抗体は、肺癌
患者の血清中に放出される抗原を認識するため、血清診
断には有用でも、細胞診、組織診、更には治療には、必
ずしも適しているとはいえなかった。これらの目的の為
には、放出抗原でなく、癌細胞膜表面抗原を認識する単
クローン性抗体が望ましい。
れていたが、本発明者は、ヒト正常肺トレラントマウス
を用いる効率的な抗−ヒト肺癌単クローン性抗体の作製
法（特開昭60−190721）により、肺癌の血清診断に有効
な抗−ヒト肺癌単クローン性抗体SLC−１（特願昭60−7
6045）、ALC−１（特願昭60−76046）、ALC−186（特願
昭60−220861）、ALC−454（特願昭61−163415）などを
確立した。しかし、これらの単クローン性抗体は、肺癌
患者の血清中に放出される抗原を認識するため、血清診
断には有用でも、細胞診、組織診、更には治療には、必
ずしも適しているとはいえなかった。これらの目的の為
には、放出抗原でなく、癌細胞膜表面抗原を認識する単
クローン性抗体が望ましい。
発明が解決すべき問題点 上述のごとく、現在のところ肺腺癌細胞膜と特異性が
高く、かつ高率に反応するような単クローン性抗体は知
られていない。一方、元来欧米型の癌といわれた肺癌
は、日本でも急激に増加しつつあり、肺癌細胞膜に特異
性の高い単クローン性抗体があれば、診断，治療上非常
に有益である。
高く、かつ高率に反応するような単クローン性抗体は知
られていない。一方、元来欧米型の癌といわれた肺癌
は、日本でも急激に増加しつつあり、肺癌細胞膜に特異
性の高い単クローン性抗体があれば、診断，治療上非常
に有益である。
問題点を解決するための手段 本発明者は、ヒト肺腺癌膜成分を免疫源として樹立し
たハイブリドーマが生産する単クローン性抗体ALC−390
が、肺腺癌細胞膜に高い特異性を示し、肺腺癌の病理診
断および治療に極めて有用であることを見出し本発明を
完成した。
たハイブリドーマが生産する単クローン性抗体ALC−390
が、肺腺癌細胞膜に高い特異性を示し、肺腺癌の病理診
断および治療に極めて有用であることを見出し本発明を
完成した。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明は、ヒト肺腺癌組織膜成分で免疫したマウスの
脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドー
マを作製し、ヒト肺腺癌細胞膜に反応性を有する単クロ
ーン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養
するかマウスに投与して該マウスで腹水化し、該培養物
または腹水より採取することにより得られる抗ヒト肺腺
癌反応性単クローン性抗体を提供する。
脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドー
マを作製し、ヒト肺腺癌細胞膜に反応性を有する単クロ
ーン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養
するかマウスに投与して該マウスで腹水化し、該培養物
または腹水より採取することにより得られる抗ヒト肺腺
癌反応性単クローン性抗体を提供する。
本発明の単クローン性抗体は、IgGクラスに属し、肺
腺癌細胞膜に反応し、蛋白質を抗原として認識する。
腺癌細胞膜に反応し、蛋白質を抗原として認識する。
本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリ
ドーマ細胞株ALC−390（昭和62年３月26日付で英国のEu
ropean Collection of Animal Cell Cultures にECACC
No.87032601として寄託してある）が生産するALC−390
があげられる。
ドーマ細胞株ALC−390（昭和62年３月26日付で英国のEu
ropean Collection of Animal Cell Cultures にECACC
No.87032601として寄託してある）が生産するALC−390
があげられる。
以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明
する。
する。
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜10週令、望ましくは８週令のマウスに、ヒト肺腺
癌の細胞，組織あるいはそれらの膜成分を免疫して、そ
の動物の脾，リンパ節，末梢血中の抗体産生細胞を調製
する。免疫するマウスはヒト正常肺細胞で前処理して免
疫寛容にしたマウスを用いるのが好ましい。免疫の方法
は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当
なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバン
ト（Complete Freund's Adjuvant）または、水酸化アル
ミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともにヒト肺
腺癌細胞（106〜107細胞／匹），ヒト肺腺癌組織もしく
はそれらの膜成分（膜断片）（10〜500μg/匹）を投与
する。以後、１〜２週間おきに抗原を２〜５回投与す
る。各免疫後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その
血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に示す酵素免疫
測定法〔酵素免疫測定法（ELISA）：医学書院刊1976
年〕などで調べる。
癌の細胞，組織あるいはそれらの膜成分を免疫して、そ
の動物の脾，リンパ節，末梢血中の抗体産生細胞を調製
する。免疫するマウスはヒト正常肺細胞で前処理して免
疫寛容にしたマウスを用いるのが好ましい。免疫の方法
は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当
なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバン
ト（Complete Freund's Adjuvant）または、水酸化アル
ミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともにヒト肺
腺癌細胞（106〜107細胞／匹），ヒト肺腺癌組織もしく
はそれらの膜成分（膜断片）（10〜500μg/匹）を投与
する。以後、１〜２週間おきに抗原を２〜５回投与す
る。各免疫後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その
血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に示す酵素免疫
測定法〔酵素免疫測定法（ELISA）：医学書院刊1976
年〕などで調べる。
酵素免疫測定法： 96穴のEIA用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flo
w Laboratories）社製〕に、正常あるいは腫瘍細胞，組
織の膜成分（蛋白量として10〜1,000μg/ml含有する膜
断片）を100〜200μl/穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放
置して、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、PBS
（リン酸二ナトリウム1.83g,リン酸一カリウム0.21g,食
塩7.65g,蒸溜水１,pH7.2）でよく洗浄後、１％BSA
（牛血清アルブミン）−PBSを100〜200μl/穴分注し、
４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質と
の結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、
BSA−PBSを捨て、レジン水あるいはPBSでよく洗浄した
後、第１抗体として、BSA−PBSで希釈した試料（マウス
血清，ハイブリドーマ培養上清，粗精製モノクローナル
抗体）を100μl/穴分注し、４℃で１晩放置する。レジ
ン水で１回、2M NaCl溶液で６回洗浄した後、第２抗体
としてウサギの抗マウスイムノグロブリンIgG−ペルオ
キシダーゼ結合物〔ダコ（DAKO）社製、販売元協和メデ
ックス〕の100倍希釈液を100μl/穴分注し、室温で２時
間放置する。
w Laboratories）社製〕に、正常あるいは腫瘍細胞，組
織の膜成分（蛋白量として10〜1,000μg/ml含有する膜
断片）を100〜200μl/穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放
置して、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、PBS
（リン酸二ナトリウム1.83g,リン酸一カリウム0.21g,食
塩7.65g,蒸溜水１,pH7.2）でよく洗浄後、１％BSA
（牛血清アルブミン）−PBSを100〜200μl/穴分注し、
４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質と
の結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、
BSA−PBSを捨て、レジン水あるいはPBSでよく洗浄した
後、第１抗体として、BSA−PBSで希釈した試料（マウス
血清，ハイブリドーマ培養上清，粗精製モノクローナル
抗体）を100μl/穴分注し、４℃で１晩放置する。レジ
ン水で１回、2M NaCl溶液で６回洗浄した後、第２抗体
としてウサギの抗マウスイムノグロブリンIgG−ペルオ
キシダーゼ結合物〔ダコ（DAKO）社製、販売元協和メデ
ックス〕の100倍希釈液を100μl/穴分注し、室温で２時
間放置する。
PBSでよく洗浄後、ABTS基質液〔2,2′−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二ア
ンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）１に
溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μl/mlを加え
た溶液〕を用い、発色をOD415nmの吸光度で測定する。
このとき、肺腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に
対して強く反応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとし
てハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞の供給源と
して用いる。
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二ア
ンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）１に
溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μl/mlを加え
た溶液〕を用い、発色をOD415nmの吸光度で測定する。
このとき、肺腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に
対して強く反応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとし
てハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞の供給源と
して用いる。
酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞
そのものを用いる場合は、ファルコン（Falcon）3072プ
レート中で、標的細胞を培養し、0.25％グルタールアル
デヒド−PBSを加え、室温に１〜２時間放置し、PBSでよ
く洗浄後、１％BSA−PBS100〜200μｌを加え、２時間放
置し、レジン水またはPBSでよく洗浄し、そのプレート
を用いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様
の方法にて、抗体価の測定を行った。
そのものを用いる場合は、ファルコン（Falcon）3072プ
レート中で、標的細胞を培養し、0.25％グルタールアル
デヒド−PBSを加え、室温に１〜２時間放置し、PBSでよ
く洗浄後、１％BSA−PBS100〜200μｌを加え、２時間放
置し、レジン水またはPBSでよく洗浄し、そのプレート
を用いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様
の方法にて、抗体価の測定を行った。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処
理の３〜４日前に、ヒト肺腺癌細胞，組織あるいはその
膜成分を２〜５×106細胞／匹あるいは20〜400μg/匹腹
腔内に投与し、脾臓細胞を摘出し、脾細胞を調製する。
脾臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットで
ほぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、上清を捨
て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜
２分間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄して融合
用脾細胞として提供する。
理の３〜４日前に、ヒト肺腺癌細胞，組織あるいはその
膜成分を２〜５×106細胞／匹あるいは20〜400μg/匹腹
腔内に投与し、脾臓細胞を摘出し、脾細胞を調製する。
脾臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットで
ほぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、上清を捨
て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜
２分間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄して融合
用脾細胞として提供する。
ヒト肺腺癌組織の膜成分の調製は下記のとおり行う。
すなわち−80℃に凍結保存しておいた組織片を融解
後、鋏で細切りし、Ultra−Disperser（Yamato）で機械
的に破砕後、グラステフロンホモジナイザーでホモジナ
イズしたものを４℃100,000×ｇ、20分間遠心分離し、
その上清をさらに４℃100,000G、１時間遠心分離し得た
沈殿を0.01M リン酸バッファー（pH7.2）に懸濁し、こ
れを膜成分として使う。
後、鋏で細切りし、Ultra−Disperser（Yamato）で機械
的に破砕後、グラステフロンホモジナイザーでホモジナ
イズしたものを４℃100,000×ｇ、20分間遠心分離し、
その上清をさらに４℃100,000G、１時間遠心分離し得た
沈殿を0.01M リン酸バッファー（pH7.2）に懸濁し、こ
れを膜成分として使う。
（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を
使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（BA
LB/c由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カ
レント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アン
ド・イムノロジィ−１（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ（European J.Immunology）6,5
11−519（1976）〕、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチャ
ー（Nature）276,269−270（1978）〕、P3−X63−Ag865
3（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immuno
logy）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X6
3）〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕な
どが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン
培地〔RPMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）,2メルカ
プトエタノール（５×10-5Ｍ），ジェンタマイシン（10
μg/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製）（10％）
を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg/
ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２×107以上の細胞数
を確保する。
使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（BA
LB/c由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カ
レント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アン
ド・イムノロジィ−１（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ（European J.Immunology）6,5
11−519（1976）〕、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチャ
ー（Nature）276,269−270（1978）〕、P3−X63−Ag865
3（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immuno
logy）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X6
3）〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕な
どが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン
培地〔RPMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）,2メルカ
プトエタノール（５×10-5Ｍ），ジェンタマイシン（10
μg/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製）（10％）
を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg/
ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２×107以上の細胞数
を確保する。
（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨
髄腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるよう混合
し、遠心分離（1,200rpm 5分）した後、上清を捨て、沈
殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃
で、ポリエチレングライコール1,000（PEG−1,000）2g,
MEM2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1m
l/103抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2mlを
数回加えた後、MEMを加えて全量が50mlになるようにす
る。遠心分離（900rpm ５分）後、上清を捨て、ゆるや
かに細胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640,FCS10
％）100mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出し
でゆるやかに細胞を懸濁する。
髄腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるよう混合
し、遠心分離（1,200rpm 5分）した後、上清を捨て、沈
殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃
で、ポリエチレングライコール1,000（PEG−1,000）2g,
MEM2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1m
l/103抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2mlを
数回加えた後、MEMを加えて全量が50mlになるようにす
る。遠心分離（900rpm ５分）後、上清を捨て、ゆるや
かに細胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640,FCS10
％）100mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出し
でゆるやかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を24穴培養用プレートに1ml/穴ずつ分注
し、５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養す
る。培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポ
キサンチン（10-4Ｍ），チミジン（1.5×10-5Ｍ）およ
びアミノプテリン（４×10-7Ｍ）を加えた培地〕を加
え、さらに24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、
培養上清1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2
インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
し、５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養す
る。培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポ
キサンチン（10-4Ｍ），チミジン（1.5×10-5Ｍ）およ
びアミノプテリン（４×10-7Ｍ）を加えた培地〕を加
え、さらに24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、
培養上清1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2
インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴に
ついて、上清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプ
テリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎
にHT培地への変換を行う。
ついて、上清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプ
テリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎
にHT培地への変換を行う。
HT培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺腺癌に対する抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常細胞，
組織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト
肺腺癌細胞，組織あるいはその膜成分に特異的に反応す
るものを選択する。ヒト肺腺癌細胞，組織あるいはその
膜成分に強く反応し、ヒト正常細胞，組織あるいはその
膜成分などに反応しない穴について、限界希釈法により
クローニングを２回繰り返し、安定してヒト肺腺癌細
胞，組織あるいはその膜成分に強い抗体価の認められた
ものを抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ株として選択する。
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺腺癌に対する抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常細胞，
組織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト
肺腺癌細胞，組織あるいはその膜成分に特異的に反応す
るものを選択する。ヒト肺腺癌細胞，組織あるいはその
膜成分に強く反応し、ヒト正常細胞，組織あるいはその
膜成分などに反応しない穴について、限界希釈法により
クローニングを２回繰り返し、安定してヒト肺腺癌細
胞，組織あるいはその膜成分に強い抗体価の認められた
ものを抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ株として選択する。
（４）単クローン性抗体の調製 プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のヌード雌マウスに、（３）で得ら
れた抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体産生ハイブリドーマ
細胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21日
でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水
を採取し、遠心分離（3,000rpm,5分）して固形分を除去
後、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04Mリン酸緩
衝液（pH8.0、0.03M NaClを含む）で透析後、DE52（Wha
tman社製）のカラムに通塔し、IgG画分を集め、精製単
クローン性抗体とする。
カン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のヌード雌マウスに、（３）で得ら
れた抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体産生ハイブリドーマ
細胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21日
でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水
を採取し、遠心分離（3,000rpm,5分）して固形分を除去
後、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04Mリン酸緩
衝液（pH8.0、0.03M NaClを含む）で透析後、DE52（Wha
tman社製）のカラムに通塔し、IgG画分を集め、精製単
クローン性抗体とする。
抗体のイソタイプの決定は、オクタロニィ（Ouchterl
ony）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化
学実験法15、学会出版センター刊,P.74,1981年）によっ
て行う。
ony）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化
学実験法15、学会出版センター刊,P.74,1981年）によっ
て行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmでの吸光
度〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mg/ml〕より算出
する。
度〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mg/ml〕より算出
する。
得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検
体から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫
瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常あ
るいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしく
はそれらの膜成分との反応性、従来から知られている癌
胎児性抗原（例えばCEA）との反応性を酵素免疫測定
法，免疫組織学的判定法（PAP法）などにより行い、い
ずれの測定法においてもヒト腺癌以外とは、なるべく反
応しないものを選択する。
体から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫
瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常あ
るいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしく
はそれらの膜成分との反応性、従来から知られている癌
胎児性抗原（例えばCEA）との反応性を酵素免疫測定
法，免疫組織学的判定法（PAP法）などにより行い、い
ずれの測定法においてもヒト腺癌以外とは、なるべく反
応しないものを選択する。
（５）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法の実施
に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺腺癌培養細胞株、肺
腺癌組織）をノイラミニダーゼ（neuraminidase），プ
ロテアーゼ（protease）などの酵素や過ヨウ素酸などの
試薬で前処理した後、単クローン性抗体と反応させ、そ
れらの処理をしていない元の抗原と単クローン性抗体の
反応性との差より、抗原の化学的性状（単クローン性抗
体の認識する抗原部位の化学的性状）を明らかにした。
すなわち、ノイラミニダーゼ処理により抗原性が消失す
ればシアル酸が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋
白質が、また過ヨウ素酸処理により消失すれば糖鎖が、
抗原決定基に関与していると推定される。
に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺腺癌培養細胞株、肺
腺癌組織）をノイラミニダーゼ（neuraminidase），プ
ロテアーゼ（protease）などの酵素や過ヨウ素酸などの
試薬で前処理した後、単クローン性抗体と反応させ、そ
れらの処理をしていない元の抗原と単クローン性抗体の
反応性との差より、抗原の化学的性状（単クローン性抗
体の認識する抗原部位の化学的性状）を明らかにした。
すなわち、ノイラミニダーゼ処理により抗原性が消失す
ればシアル酸が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋
白質が、また過ヨウ素酸処理により消失すれば糖鎖が、
抗原決定基に関与していると推定される。
以下本発明の実施例を示す。
実施例1. （１）抗体産生細胞の調製 ヒト正常肺膜成分（100μｇ蛋白質／匹）を、生後24
時間以内の新生仔BALB/cマウス（静岡実験動物製）に静
脈内投与した。８週間経過後のマウスにヒト肺腺癌膜断
片100μｇ（蛋白質換算）／匹を水酸化アルミニウムゲ
ル2mg/匹，百日咳菌死菌ワクチン１×109／匹とともに
腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同一抗原100μ
ｇ（蛋白質換算）／匹で３〜５回免疫した。これら免疫
処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト肺腺癌細胞
または組織あるいはそれらの膜断片と強く反応したマウ
スを免疫マウスとして、そのマウスより、脾細胞を調製
して、細胞融合に供した。
時間以内の新生仔BALB/cマウス（静岡実験動物製）に静
脈内投与した。８週間経過後のマウスにヒト肺腺癌膜断
片100μｇ（蛋白質換算）／匹を水酸化アルミニウムゲ
ル2mg/匹，百日咳菌死菌ワクチン１×109／匹とともに
腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同一抗原100μ
ｇ（蛋白質換算）／匹で３〜５回免疫した。これら免疫
処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト肺腺癌細胞
または組織あるいはそれらの膜断片と強く反応したマウ
スを免疫マウスとして、そのマウスより、脾細胞を調製
して、細胞融合に供した。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−U1を正
常培地で培養し、細胞融合時に２×107以上の細胞を
得、細胞融合に親株として供した。
常培地で培養し、細胞融合時に２×107以上の細胞を
得、細胞融合に親株として供した。
（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを5:
1の割合で用い、前述した方式で融合させ、HAT培地で37
℃、14日間CO2５％下で培養して、融合細胞を選択し、H
T培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺腺癌に対する抗
体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに正常培地に
変え、２回クローニングを繰り返して、種々の測定法に
より、ヒト正常細胞や組織に全く反応せず、ヒト肺腺癌
に反応する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ
株ALC−390を選択した。
1の割合で用い、前述した方式で融合させ、HAT培地で37
℃、14日間CO2５％下で培養して、融合細胞を選択し、H
T培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺腺癌に対する抗
体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに正常培地に
変え、２回クローニングを繰り返して、種々の測定法に
より、ヒト正常細胞や組織に全く反応せず、ヒト肺腺癌
に反応する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ
株ALC−390を選択した。
（４）単クローン性抗体の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウスに（３）で
得られたハイブリドーマ株ALC−390を４×106細胞／匹
腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水
癌化する。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（５
〜10ml/匹）し、遠心分離（3,000rpm,5分）して固形分
を除去した。40％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04M
リン酸緩衝液（pH8.0、0.03M NaClを含む）で透析後、D
E52（Whatman社製）（ベットボリューム50ml）のカラム
に流速20〜30ml/hrで通塔しIgG画分を集め、精製単クロ
ーン性抗体とする。
得られたハイブリドーマ株ALC−390を４×106細胞／匹
腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水
癌化する。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（５
〜10ml/匹）し、遠心分離（3,000rpm,5分）して固形分
を除去した。40％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04M
リン酸緩衝液（pH8.0、0.03M NaClを含む）で透析後、D
E52（Whatman社製）（ベットボリューム50ml）のカラム
に流速20〜30ml/hrで通塔しIgG画分を集め、精製単クロ
ーン性抗体とする。
（５）ALC−390の特異性 このようにして得られた抗ヒト肺腺癌反応性単クロー
ン性抗体ALC−390の反応特異性を第１表に示した。
ン性抗体ALC−390の反応特異性を第１表に示した。
測定は、酵素結合免疫分析（ELISA）により以下のと
おり行った。
おり行った。
組織（膜成分）を標的とする場合： 酵素免疫分析用96穴プレート（Linbro社製）に0.1mg/
mlの組織（膜成分）液を50μl/穴入れ、37℃で２時間ま
たは４℃で１晩放置して組織（膜成分）を固定した。PB
Sで洗浄後、10％牛胎児血清含有PBSを100μl/穴分注
し、固定組織（膜成分）の活性残基を保護した。PBSで
洗浄後、第１抗体（ALC−390）50μl/穴を入れ、37℃で
１〜２時間または４℃で１晩放置して標的と抗体を反応
させた。0.05％Tween−20（和光純薬工業社製）含有PBS
で５回洗浄して未反応の抗体を除去した。第２抗体とし
てパーオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン
（Miles−Yeda社:200倍希釈）50μl/穴を入れ、37℃で
１時間反応させた。0.05％Tween−20含有PBSで５回洗浄
後、レジン水で３回洗浄した。
mlの組織（膜成分）液を50μl/穴入れ、37℃で２時間ま
たは４℃で１晩放置して組織（膜成分）を固定した。PB
Sで洗浄後、10％牛胎児血清含有PBSを100μl/穴分注
し、固定組織（膜成分）の活性残基を保護した。PBSで
洗浄後、第１抗体（ALC−390）50μl/穴を入れ、37℃で
１〜２時間または４℃で１晩放置して標的と抗体を反応
させた。0.05％Tween−20（和光純薬工業社製）含有PBS
で５回洗浄して未反応の抗体を除去した。第２抗体とし
てパーオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン
（Miles−Yeda社:200倍希釈）50μl/穴を入れ、37℃で
１時間反応させた。0.05％Tween−20含有PBSで５回洗浄
後、レジン水で３回洗浄した。
ABTS50μl/穴を加えて反応を開始し、５％ラウリル硫
酸ナトリウム水溶液50μl/穴を加えて反応を停止させ
た。
酸ナトリウム水溶液50μl/穴を加えて反応を停止させ
た。
培養株細胞を標的とする場合： 細胞を培養用96穴プレート（Linbro社製）で培養し、
コンフルエントになった時点で上記の組織（膜成分）の
場合と同様に反応させた。ただし第１抗体、第２抗体と
も反応条件は室温で30分間とし、発色後に反応液を分析
用96穴プレートに移すことにより反応を停止させた。
コンフルエントになった時点で上記の組織（膜成分）の
場合と同様に反応させた。ただし第１抗体、第２抗体と
も反応条件は室温で30分間とし、発色後に反応液を分析
用96穴プレートに移すことにより反応を停止させた。
抗原CEAの場合は組織（膜成分）に替えてCEAを用いる
以外は組織の場合と同様に行った。いずれの場合も、49
0nmを対照波長として415nmの吸光度を測定した。
以外は組織の場合と同様に行った。いずれの場合も、49
0nmを対照波長として415nmの吸光度を測定した。
第１表に示すごとく、ALC−390は、腺癌細胞に高い特
異性を有していた。しかし、CEAと反応しないことか
ら、抗−CEA抗体とは異なることがわかる。
異性を有していた。しかし、CEAと反応しないことか
ら、抗−CEA抗体とは異なることがわかる。
実施例2. ミクロトームで５μｍにスライスした各種正常成人，
胎児臓器および癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋
組織切片を、卵白アルブミンでコートしたスライドグラ
スに固定し、キシレンで脱パラフィン後、アルコール−
水で段階的に親水化した。レジン水で５分間すすぎ、0.
3％H2O2を含むメタノール中で室温30分間静置し、内因
性ペルオキシダーゼをブロックした。次に切片を20分間
PBSで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で室温20分間静
置した。切片から過剰の血清を吸い取り、第１抗体（抗
−ヒト肺腺癌単クローン性抗体ALC−390,10μg/ml）と3
0分間反応させた。洗浄後、希釈ビオチン化抗体（ビオ
チン化ウサギ抗IgG抗体）を30分間反応させ、さらに洗
浄後、アビジン−ビチオン−ペルオキシダーゼ複合体
（ベクター社製）を30分間反応させた。よく洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ基質〔0.02％H2O2を含む0.1Mトリス−塩
酸バッファ−（pH7.2）で調整した0.1％ジアミノベンジ
ジンテトラヒドロクロライド（diaminobenzedine tetra
hydrocloride）〕を２分間反応させ、氷冷中で反応を停
止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール−水および
キシレンで脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡し
た。その結果を第２表に示す。
胎児臓器および癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋
組織切片を、卵白アルブミンでコートしたスライドグラ
スに固定し、キシレンで脱パラフィン後、アルコール−
水で段階的に親水化した。レジン水で５分間すすぎ、0.
3％H2O2を含むメタノール中で室温30分間静置し、内因
性ペルオキシダーゼをブロックした。次に切片を20分間
PBSで洗浄後、希釈したウマ正常血清中で室温20分間静
置した。切片から過剰の血清を吸い取り、第１抗体（抗
−ヒト肺腺癌単クローン性抗体ALC−390,10μg/ml）と3
0分間反応させた。洗浄後、希釈ビオチン化抗体（ビオ
チン化ウサギ抗IgG抗体）を30分間反応させ、さらに洗
浄後、アビジン−ビチオン−ペルオキシダーゼ複合体
（ベクター社製）を30分間反応させた。よく洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ基質〔0.02％H2O2を含む0.1Mトリス−塩
酸バッファ−（pH7.2）で調整した0.1％ジアミノベンジ
ジンテトラヒドロクロライド（diaminobenzedine tetra
hydrocloride）〕を２分間反応させ、氷冷中で反応を停
止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール−水および
キシレンで脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡し
た。その結果を第２表に示す。
第２表に示すようにALC−390は、肺扁平上皮癌，肺大
細胞癌組織でも１部の癌細胞に弱く反応したが、肺腺癌
とは高率に強く反応した。正常・胎児組織（心，膵，
胃，大腸，腎，甲状腺，脳，脾，肝，小腸など）では、
一部の細胞と極めて弱く反応するものがみられたが、そ
の他の組織とは全く反応しなかった。
細胞癌組織でも１部の癌細胞に弱く反応したが、肺腺癌
とは高率に強く反応した。正常・胎児組織（心，膵，
胃，大腸，腎，甲状腺，脳，脾，肝，小腸など）では、
一部の細胞と極めて弱く反応するものがみられたが、そ
の他の組織とは全く反応しなかった。
発明の効果 本発明によれば肺腺癌の病理診断、さらに、肺腺癌の
治療に有用な単クローン性抗体が供給される。
治療に有用な単クローン性抗体が供給される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭60−199830（ＪＰ，Ａ) Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，４［１］（1985) Ｐ．76 Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，32［４］（1984) Ｐ．776Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，47［１ ］（1987）Ｐ．241−250 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，45［11ＰＡＲ Ｔ２］（1985）Ｐ．5808−5812 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，45［11ＰＡＲ Ｔ２］（1985）Ｐ．5813−5817 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，46［９ ］（1986）Ｐ．4438−4443 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，47［５ ］（1987）Ｐ．1267−1272 ＡＭ Ｊ．ＰＡＴＨＯＬ．，122［２ ］（1986）Ｐ．252−260 ＪＡＮ Ｊ．Ｍｅｄ．，25［２ ］（1986）Ｐ．127−134
Claims (2)
- 【請求項１】IgGクラスに属し、ヒト肺腺癌細胞膜に対
して反応性を有する抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体ALC
−390（ECACC No.87032601）。 - 【請求項２】抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体ALC−390
（ECACC No.87032601）を生産する能力を有するハイブ
リドーマを培地中に培養するかマウスに投与して腹水化
し、培養物または腹水中に抗ヒト肺腺癌単クローン性抗
体ALC−390（ECACC No.87032601）を蓄積させ、該培養
物または腹水からこれを採取することによる抗ヒト肺腺
癌単クローン性抗体ALC−390（ECACC No.87032601）の
製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62078186A JPH0813840B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体 |
| CA 562828 CA1287811C (en) | 1987-03-31 | 1988-03-29 | Antihuman pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |
| EP19880105199 EP0285143B1 (en) | 1987-03-31 | 1988-03-30 | Antihuman pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |
| DE19883882066 DE3882066T2 (de) | 1987-03-31 | 1988-03-30 | Monoclonaler Antikörper gegen menschliches Lungenadenokarzinom. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62078186A JPH0813840B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63243760A JPS63243760A (ja) | 1988-10-11 |
| JPH0813840B2 true JPH0813840B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=13654946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62078186A Expired - Lifetime JPH0813840B2 (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 抗ヒト肺腺癌単クロ−ン性抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0285143B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0813840B2 (ja) |
| CA (1) | CA1287811C (ja) |
| DE (1) | DE3882066T2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5081032A (en) * | 1988-06-30 | 1992-01-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60199830A (ja) * | 1984-03-23 | 1985-10-09 | Sanetoshi Akiyama | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6283898A (ja) * | 1985-10-09 | 1987-04-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 |
| US5185432A (en) * | 1986-02-26 | 1993-02-09 | Oncogen | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and other certain human carcinomas |
| JPS6319561A (ja) * | 1986-07-11 | 1988-01-27 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト肺癌単クロ−ン性抗体 |
-
1987
- 1987-03-31 JP JP62078186A patent/JPH0813840B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-29 CA CA 562828 patent/CA1287811C/en not_active Expired
- 1988-03-30 EP EP19880105199 patent/EP0285143B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-30 DE DE19883882066 patent/DE3882066T2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| ＡＭＪ．ＰＡＴＨＯＬ．，１２２［２（１９８６）Ｐ．２５２−２６０ |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４５［１１ＰＡＲＴ２（１９８５）Ｐ．５８０８−５８１２ |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４５［１１ＰＡＲＴ２（１９８５）Ｐ．５８１３−５８１７ |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４６［９（１９８６）Ｐ．４４３８−４４４３ |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４７［１（１９８７）Ｐ．２４１−２５０ |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４７［５（１９８７）Ｐ．１２６７−１２７２ |
| Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３２［４（１９８４）Ｐ．７７６Ａ |
| Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，４［１（１９８５）Ｐ．７６ |
| ＪＡＮＪ．Ｍｅｄ．，２５［２（１９８６）Ｐ．１２７−１３４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1287811C (en) | 1991-08-20 |
| DE3882066T2 (de) | 1994-03-24 |
| JPS63243760A (ja) | 1988-10-11 |
| EP0285143A2 (en) | 1988-10-05 |
| EP0285143A3 (en) | 1990-03-14 |
| DE3882066D1 (de) | 1993-08-05 |
| EP0285143B1 (en) | 1993-06-30 |
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