JPS6280558A - 抗ヒト肺腺癌特異的単クロ−ン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト肺癌、特にヒト肺腺癌に特異性を有し、
その認識する抗原（エピトープ）がシアル酸化された糖
タンパクあるいは糖脂質であることを特徴とする単クロ
ーン性抗体およびその肺腺癌の病理診断ならびに血清診
断・モニタリングへの利用に関するものである。

従来技術 最近、免疫動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融
合させて得られるハイブリドーマを培養して特異的に腫
瘍と反応する単クローン性抗体を得る方法が報告されて
いる。ヒト肺癌に対する単クローン性抗体をこのような
手法で得ることもすでに報告されている〔キャンサー・
リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）　４２．１５０（１
９８２）、　　キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅ５ｊ　４２．３１８７（１９８２）、　　ジャーナ
ル・オブ・サージカ／ｌ、−リサーチ（Ｊ、Ｓｕｒｇｉ
ｃａｌ　Ｒｅｓ、）、３Ｑ。

４０３（１９８１）、　）ランスプランテーション・プ
ロシイ−ディング（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　
Ｐｒｏｃｅｅｄ、）、　　ＸＩＩＴ（４）。

１９４２（１９８１）、　　ジャーナル・オブ・イムノ
ロシイ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　１３１　　（１）　４９７　（
１９８３）、免疫学会要旨Ｐ、２１２（演題番号１０７
番）　（１９８３）京泉誠之〕。しかし、それらの単ク
ローン性抗体の多くは、肺癌以外の癌や、ヒト正常細胞
とも反応するものがほとんどで肺癌特異的といえるもの
は少ない。また、比較的肺癌に特異的といえるもの〔ジ
ャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　）旦ｓ　（ｏ　４９７（１９８３））でも、小細胞
癌と非小細胞癌を識別することができるのみで扁平上皮
癌、腺癌などの組織型を判別することはできない。また
、肺癌の血清診断へ応用できる単クローン性抗体につい
ての報告はない。

最近、抗ヒト消化器癌（胃癌、膵癌、大腸癌）単クロー
ン性抗体を用いる消化器癌の血清診断が報告されている
。これらの単クローン性抗体はいずれも、血清中抗原と
してシアル酸化された諸タンパクを認識しているもので
ある〔ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノロシイ（
Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）。

上、　１３５（１９８２）、　　フェデレーンヨン・プ
ロシイ−ディンゲス（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ
、）’、　　４１．　８９８　（１９８２）　。

キャンサー・リチーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、　
　４２．６０１（１９８２）、　　バイブリド−？　　
（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、　　２．　１１０（１９８３
）　Ｅ。一方、肺癌に対する単クローン性抗体で、シア
ル酸化された糖蛋白質あるいは糖脂質を認識するものは
これまで全く報告がない。

発明が解決すべき問題点および解決方法肺癌に特異的に
反応する単クローン性抗体が得られれば、肺癌の診断に
有用である。肺癌の単クローン性抗体は知られているけ
れども、さらに優れた抗体の開発が望まれている。本発
明者はヒト肺腺癌組織膜成分で免疫した抗体産生マウス
の肺細胞とマウス骨髄腫細胞とが融合したハイブリドー
マが生産するモノクローナル抗体が、肺腺癌に対して特
に優れた反応性を有し、肺癌の血清診断に応用できるこ
とを見出し本発明を完成した。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、ヒト肺腺癌組織膜成分で免疫したマウスの肺
細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ
を作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単クローン性抗
体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養するかマ
ウスに投与して該マウスで腹水化し、該培養物または腹
水より採取することにより１尋られ、かつシアル酸化さ
れた糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識する抗ヒト
肺腺癌特異的単クローン性抗体を提供する。

本発明の単クローン性抗体は、１ｇＭクラスに属し、肺
腺癌細胞に対して特異的に反応し、ンアル酸化された糖
蛋白質または糖脂質を抗原として認識する。

本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ΔＬＣ１８６（ＮＣＡＣＣ）が生産するＡＬ
Ｃ−１８６があげられる。

以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明す
る。

（１）　　動物の免疫と抗体産生細胞の潤製３〜１０退
会、望ましくは８週令のマウスに、ヒト肺腺癌の細胞１
組織あるいはそれらの膜成分を免疫して、その動物の牌
、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫
するマウスはヒト正常肺細胞で前処理して免疫寛容にし
たマウスを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の
皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）ま
たは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど
〕とともにヒト肺腺癌細胞（１０６〜１０７細胞／匹）
、ヒト肺腺癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（
１０〜５００μｇ／匹〉を投与する。以後、１〜２週問
おきに、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目
に眼底静脈叢より採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応
することを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）：医学書院列１９７６年〕などで調べる
。

酵素免疫測定法： ９６穴のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞２組織の膜成分（蛋白量として１０〜
１．０００μｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００〜２０
０μβ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、牛血
清アルブミンをプレート穴底面にコートし、上清を抜き
去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ（ＩＪン酸二ナト
リウム１．８３ｇ、リン酸−カリウム０．２１ｇ、食塩
７．６５ｇ、蒸溜水１ｆ、ｐＨ７，２）でよく洗浄後、
第１抗体として、１％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）−
ＰＢＳを１００〜２００μβ／穴分注し、４℃で１〜２
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを捨て、レジン水あるいはＰＢＳでよく洗浄した後、
第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料（マウ
ス血清、ハイブリドーマ培養上清、粗精製モノクローナ
ル抗体）を１００μｌ／穴分注し、４℃で１晩放置する
。レジン水で１回、２Ｍ　　ＮａＣβ溶液で６回洗浄し
た後、第２抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリ
ンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ）
社製、販売元協和メデックス〕の１００倍希釈液を１０
０ρ／穴分注し、室温で２時間放置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，２）１／に溶かした溶液に、使用直前に過酸
化水素１ρ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発色をＯＤ、
、、イ、の吸光度で測定する。このとき、肺腺癌細胞、
組織あるいはそれらの膜成分に対して強く反応するマウ
スをヒト肺腺癌免疫マウスとしてハイブリドーマ作製の
ための抗体産生細胞の供給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、Ｉ％ＢＳＡ−ＰＢＳ　
１００〜２００μｐを加え、２時間放置し、レジン水ま
たはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一般
の抗原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、抗
体価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト肺腺癌細胞。

組織あるいはその膜成分を２〜５Ｘ１０’細胞／匹ある
いは２０〜４００μｇ／匹腹腔内に投与し、膵臓細胞を
摘出し、肺細胞を調製する。

膵臓をＭＥＭ　（田水製薬社製）中で細断し、ピンセッ
トでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離にかけ、
上清を揄で、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７
，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで
３回洗浄して融合用肺細胞として提供する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−ｔＪ
１　（Ｐ３−［１１）〔カレント・トピックス・イン・
ミクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃｕ
ｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　−１）　）〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　６　５１
１−５１９（１９７６））　、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　
（ＳＰ−２）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２７６
、２６９−２７０　（１９７８））、Ｐ：３−ｘ１３３
−Ａｇ８６５３　（６５３）　（ジャーナル・オブ・イ
ムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１２３．１
５４８−１５５０　（１９７９）　）　、Ｐ　３−Ｘ　
６３−Ａｇ　８　（Ｘ６３）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２５６．４９５−４９７（１９７５）　Ｅなど
が用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培
地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ
）、２メルカプトエタノール（５Ｘ　１０−’Ｍ）　、
ジェンタマイシン（１０μｇ　／ｍｌ　）および牛胎児
血清（Ｆ’Ｃ３）（Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正
常培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ　／ｍｌ
　）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞
数を確保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ　５分）した後
、上清を捨て、沈殿した細胞群をよ（はぐした後、攪拌
しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１．０
００（ＰＥＣ，−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよ
びジメチルスルホキシドＱ、７ｍｌの混液０．２〜１ｍ
ｌ／　Ｉ　Ｑ３３抗産生細胞を加え、１〜２分間毎にＭ
ＥＭ　Ｉ〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量
が５Ｑｍｌになるようにする。遠心分離（９００ｒｐ５
分）後、上清を揄で、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地（ＲＰＭ１１６４０．ＦＣ５１０％）　１００ｍ
１ｔ４０え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆる
やかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ｍ１／穴ずつ分
注し、５％ＣＯ□インキュベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔
正常培地にヒボキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（
１，５Ｘ　１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４Ｘ１
０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養
する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｍｌを捨
て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、Ｃ０２インキユベ
ーター中、３７℃で１０〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト肺腺癌に対する抗体価
を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常線胞１
組織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト
肺腺癌細胞組織あるいはその膜成分に特異的に反応する
ものを選択する。ヒト肺腺癌細胞１粗織あるいはその膜
成分に強く反応し、ヒト正常線胞１組織あるいはその膜
成分などに反応しない穴について、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定してヒト肺腺癌績胞１
組織あるいはその膜成分に強い抗体価の認められたもの
を抗ヒト肺腺癌単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　３．５ｍｌを腹腔内
投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令の退会ＬＢ
／ｃ雌マウスにカマウスで得られた抗ヒト肺腺癌単りロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４　Ｘ　１０６
細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ　５分）して固形分を除去後
、５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳにＮａＣ
β０．５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル５３００
（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）（ベットボ
リューム７５０ｍ１　）のカラムに流速１５ｍ１／ｈｒ
で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製単クローン性抗体と
する。

抗体のインタイブの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒ　Ｉｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入
門、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、　Ｐ、
　７４１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度（１，４（ＯＤ２．０　）　＃イムノゾロ１９フ１
０ 得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それらの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性，正常。

患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法，螢光
抗体法，免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト肺腺癌以外とは、反
応しないものを選択する。

また、このようにして得られた、ヒト肺腺癌に特異的に
反応する単クローン性抗体は、血清検査１組織診断，イ
メージーングなどによる肺癌の診断、さらには、抗体そ
のものを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた
、いわゆるイムノトキンンを癌患者に投与することによ
り肺癌の治療を行うことができるものと期待される。さ
らに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフィ
ニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その抗
原の解析ひいては、肺癌ワクチンの開発にも使用できる
ものと期待される。

（５）肺癌血清診断法 血清診断は次の通り行う ９６穴ＥｒＡ用プレートに、第一抗体１０〜１０（ｂｃ
ｇ／ｍｌを５０〜２００ｘ／穴ずつ分注し、４℃で１〜
２晩あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳで洗
浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ２　０　０威／穴を加え、さらに
４℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。このプレー
トをＰＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１００
倍希釈で、５０〜１００ｍを加える。４℃で１晩あるい
は室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、
ビオチン化した第二抗体あるいは、ペルオキシダーゼ標
識した第二抗体（１０〜１００犀／４）を５０〜１　０
　０ｘ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜
４時間放置する。第二抗体として、ビオチン化抗体を使
用した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビ
ジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０１１ｇ／ｍｌ
）を５０〜１００ｍ／穴加え、室温で３０分間放置後Ｐ
ＢＳでよく洗浄する。次に基質液として、ＡＢＴＳ基質
液を５０〜１００ρ／穴加え、室温で１０〜３０分間放
置し、５％ＳＤＳ溶液５０〜１００ρ／穴を加え反応を
停止する。各穴の０ＤＡ１Ｓ値を測定し、その発色度よ
り、血清検体中の抗原量を算出する。このようにして得
られた健常人血清中の抗原量と肺癌患者血清中の抗原量
を比較することにより、正常値を決定し、その正常値を
超えるものを肺癌陽性とした。

（６）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺癌
培養細胞株、肺癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒ
ａｍｉｎｉｄａｓｅ）、　　プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅ
ａｓｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理し
た後、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をし
ていない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差よ
り、抗原の化学的性状（単クローン性抗体の認識する抗
原部位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイ
ラミニダーゼ処理により抗原性が消失すれば、シアル酸
が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また
過ヨウ素酸処理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に
関与していると推定される。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 〔１）抗体産生細胞の調製 ヒト正常肺組織膜成分（１００■蛋白質／匹）を、生後
２４時間以内の新生仔ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与
した。８週間経過後のマウスにヒト肺腺隔膜断片１００
■（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミニウムゲル２■／
匹、百日咳菌死菌ワクチン１×１０９／匹とともに腹腔
的投与した。以後１〜２週おきに、同一抗原１００μｇ
（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫した。

これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト
肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と強く反
応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスより、肺
細胞を調製して、細胞融合に供した。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを５＝
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ５５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト肺腺
癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さら
に正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種
々の測定法により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌
に全く反応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応する単クロ
ーン性抗体を産生ずるハイプリドーマ株ΔＬＣ−１８６
を選択した。

（４）単クローン性抗体の精製 ブリスタン処理した８退会ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに〔３
）で得られたハイプリドーマ株ＡＬＣ−１８６を４Ｘ１
０６細胞／匹腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化する。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ。

５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　１．：：　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　
　０．５Ｍを加えた液で透析し、セファクリル３００（
ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）（ベット・ボ
リューム７５０ｍ１）のカラムに流速１５ｍ１／ｈｒで
通塔しＩｇＭ画分を集め精製抗体として用いた。

（５）　　ＡＬＣ−１８６の特異性 このようにして得られた抗肺腺癌特異釣車クローン性抗
体ＡＬＣ−１８６の反応特異性を第１表に示した。

第　　　１　　　表 実施例２゜ 実施例１で得られた単クローン性抗体ＡＣＬ−１８６を
用いて、肺腺癌組織の免疫組織化学的染色を行った。１
０例の肺腺癌患者摘出肺腺癌パラフィン包埋ブロック切
片について検討した結果、８例で癌細胞が強く染まった
。以上の結果より、ＡＬＣ−，１８６を用いる免疫組織
化学染色により、肺腺癌の病理診断が可能であった。

実施例３゜ ９Ｇ穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＬＣ
−１８６（１０ｘ／ｍｌ）を５０顧／穴加え、４℃で１
晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢ４２００
ｎ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄したプレート
に、健常人血清（７７検体）および肺癌患者血清（９２
検体）を４倍希釈して４０威／穴加え、４℃で１晩放置
後、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、第二抗体として、ビ
オチン化抗肺癌モノクローナル抗体ＡＬＣ−１８６（１
０Ｊ１ｇ／ｍｌ）を１００ｄ／穴加え、４℃で１晩放置
し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジンービオチンーベ
ルオキンダーゼ〔ヘクトール（ｖ［ＩＣＴＯＲ）社製〕
（１０ｇ／ｍｌ）　１．００ｔｄｌｌ穴加え、室温で１
時間放置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にへＢＴＳ基質
液を１００ｎ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％
ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反応を停止した。

各穴の発色を吸光度計（ＯＤ４＋５）で測定した。

その結果、第１図に示した様に、健常人血清では、０Ｄ
４１Ｓが０．３５をこえる陽性例は７７例中１例しかな
かったが、肺腺癌患者血清では、ＯＤ　Ａ　１５が０．
３５をこえる陽性例が３３例中１６例あった。

このことより、本抗体を用いる血清診断法により、４８
％の確率で肺腺癌患者を見出すことが可能であることが
わかる。肺扁平上皮癌患者血清では、ＯＤ、１５が０．
３５をこえる陽性例が、３３例中１例（３％）、肺小細
胞癌患者血清では、２２例；　　中０例（０％）、肺小
細胞癌患者血清では、４例中０例（０％〉であったが、
肺腺癌患者血清では１６例中θ例（０％）と全く陽性例
はなかった。

また、肺腺癌患者血清をプロットすると、第２図に示す
ごとく、ステージ■では６５％（２０例中１３例）で陽
性となった。この結果は、本抗体による血清診断が、肺
腺癌のモニタリングに有効であることを示している。

実施例４゜ 単クローン性抗体ΔＬＣ−１８６が認識する抗原を解析
するために、肺腺癌組織の膜成分を下記各種酵素および
試薬で処理した後ΔＬＣ−１８６との反応性を調べた。

酵素および試薬 トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製　２．５％溶液）ＰＢＳ中
　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社！り ０．１Ｍ酢酸バッフｙ−（ｐＨ４，５）−３ｍＭＣａＣ
ｊ！２中Ｑ、１０／ｍ＋ α−Ｌ−７コシターセ（ベーリンガー・マイハイム社製
） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ６，３）中Ｑ、ｌＬ
ｌ／＋ｎｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，２）中１０Ｕ／
ｍ１ ＮａＩＯ４（和光純薬社製） ＰＢＳ中５０ｍＭ 肺腺癌組織の膜成分（蛋白１１００■／＋ｒ＋ｌ　）を
５０４／穴ずつ、ＥｒＡ用プレート〔リンプロ（いｎｂ
ｒｏ）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで３
回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＱ／穴分注し
、３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３回洗浄後
、上記酵素液または試薬液を５０〃／穴分注し、３７℃
で１時間反応させた。

ついでＰＢＳで５回洗浄し、単クローン性抗体ΔＬＣ−
１８６（１０ｘ／ｍｌ）を５０４７大分注し、４℃で１
晩放置した。

Ｔｗｅｅｎ−２０−Ｐｕｓ　（Ｔｗｅｅｎ　２０は和光
純薬工業社製）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗
−マウスＩｇＧ（４００倍希釈液）を５０４／穴加え、
室温で２時間反応後、７ｗｅｅｎ−２３−ＰＢＳで５回
洗浄し、ＡＢＴＳ基質１００μを加え、３０分間反応後
、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。

抗原性は、第３図に示したとおり、過ヨウ素酸（Ｎａｌ
○、）、ノイラミニダーゼ、パルオキシダーゼ処−理に
より完全に消失した。この結果より、単クローン性抗体
ＡＬＣ−１８６はシアル酸化された糖蛋白質を認識して
いるものと推定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６による肺腺
癌の血清診断の結果を示す。 第２図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６による肺腺
癌の血清診断におけるステージの影響を示す。 第３図は、肺腺癌組織の膜成分の各種酵素、試薬処理に
よる単クローン性抗体ＡＬＣ−１８６との反応性の消長
を示す。 ・はノイラミニダーゼ０．ＩＵ／ｍｌ、Δはα−Ｌ−フ
コシダーゼ０．　Ｉ　Ｌｌ　／ｍｌ、口はトリプシン０
．２５％、麿はプロテアーゼｌ０ＬＩ／ｍｌ、○はＮａ
ＩＯａ５０ｍＭの処理を示す。×は無処理を示す。 ！＋１ａ’ｌ　　　ＡＬ（、−ＩＩＪ：６１１午１１Ｌ
ｔ：ｑ　ｊ！Ｌ　清Ｎ’Ｉ「ＯＤ引５、− ０Ｄ４１！；−Ｍ 手　　続　　補　　正　　書 昭和６０年７０月９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト肺腺癌の細胞組織または組織膜成分で免疫した
   マウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハイ
   ブリドーマを作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単ク
   ローン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に培
   養するかマウスに投与して該マウスで腹水化し、該培養
   物または腹水より採取することにより得られ、かつシア
   ル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識す
   る抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体。 ２）該ハイブリドーマがＡＬＣ−１８６（ＮＣＡＣＣ）
   である特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。 ３）該単クローン性抗体がＩｇＭクラスに属することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗
   体。 ４）ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒト正常肺組織とは反応
   せず、シアル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原と
   して認識する抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体ＡＬ
   Ｃ−１８６を用いる免疫組織化学的染色法。 ５）ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒト正常肺組織とは反応
   せず、シアル酸化された糖蛋白質または糖脂質を抗原と
   して認識する抗ヒト肺腺癌特異的単クローン性抗体ＡＬ
   Ｃ−１８６を用いるサンドイッチ方式による酵素免疫測
   定法またはラジオイムノアッセイにより肺腺癌の血清診
   断またはモニタリングを行う方法。