JPH0213393A - 抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト肺腺癌に反応性を有し、その認識する抗
原が蛋白質であることを特徴とする単クローン性抗体お
よびこれを用いる肺腺癌の病理診断および血清診断、モ
ニタリングへの利用に関する。

従来の技術 最近、免疫動物からの抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融
合させて得られるハイブリドーマを培養して特異的に腫
瘍と反応する単クローン性抗体を得る方法が報告されて
いる。ヒト肺癌に対する単クローン性抗体をこのような
手法で得ることもすでに報告されている〔キャンサー・
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４２　、１５０
（１９８２）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅｓ、）　４２．３１８７（１９８２）、　　ジャー
ナル、オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ、　Ｓｕｒｇｉ
ｃａｌＲｅｓ、）、　３０　、４０３（１９８１）、　
　）ランスプランテーション・プロシイ−ティング（Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｅｄ、）、　
　Ｘ［Ｉ（４）、　１９４２（１９８１）、　ジャーナ
ル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、
　１３１　　（１）４９７　（１９８３）、免疫学会要
旨Ｐ、２１２　（演題番号１０７番）　（１９８３）京
泉誠之〕。

しかし、それらの単クローン性抗体の多くは、肺癌以外
の癌や、ヒト正常細胞とも反応するものがほとんどで肺
癌特異的といえるものは少ない。

最近、ンアル酸化された糖蛋白質、糖脂質を抗原として
認識する単クローン性抗体を用いる肺腺癌の血清診断が
報告されている〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）　４７　、１２６７−１２７２　（１９８
７）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャン
サ−（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　（：ａｎｃｅｒ）　　３６　　、　４２１
−４２５　（１９８５）　、　　キャンサー・リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４５　、３７１１−３７１
７（１９８５）、特開昭６２−８０５５８３が、蛋白質
を抗原として認識する単クローン性抗体で、肺腺癌の血
清診断を行ったという報告はない。

発明が解決しようとする課題 肺腺癌に特異的に反応する単クローン性抗体が得られれ
ば、肺腺癌の診断および治療に有用である。肺腺癌の単
クローン性抗体は知られているけれども、さらに優れた
抗体の開発が望まれている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、ヒト肺腺癌患者の有水の高分子分画で免
疫した抗体産生マウスの牌細胞とマウス骨髄腫細胞とが
融合したハイブリドーマが生産する単クローン性抗体が
、肺腺癌に対して優れた反応性を示し、肺腺癌の血清診
断、病理診断および治療に有用であることを見出し本発
明を完成させた。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、ヒト肺腺癌患者の有水の高分子分画で免疫し
たマウスの牌細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させてハ
イブリドーマを作製し、ヒト肺腺癌に特異性を有する単
クローン性抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に
培養するかマウスに投与して該マウスを腹水化し、該培
養物または腹水より採取することにより得られる抗ヒト
肺腺癌単クローン性抗体を提供する。

本発明の単クローン性抗体は、Ｉ　ｇ　Ｇ　ｒ　クラス
に属し、肺腺癌細胞に対して反応性を有し、蛋白質を抗
原として認識する。

本発明の単クローン性抗体の具体例としては、バイブド
ーマ細胞株ＡＬＣ−８６４（昭和６３年３月９日付で、
工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＩＩＭ　ＢＰ−
１７８３として寄託しである）が生産するΔＬＣ−８６
４があげられる。

以下に本発明の単クローン性抗体の製造法を詳細に説明
する。

（１）　　動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０週
令、望ましくは８週令のマウスに、肺腺癌患者有水の高
分子分画を免疫して、その動物の牌、リンパ節、末梢血
中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスはヒト正
常肺細胞で前処理して免疫寛容にしたマウスを用いるの
が好ましい。免疫の方法は、動物の皮下あるいは静脈内
あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロ
イントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミ
ニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともにヒト肺腺
癌患者膨水の高分子分画く１０〜５００μｇ／匹）を投
与する。以後、１〜２週問おきに抗原を２〜５回投与す
る。各免疫後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その
血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に示す酵素免疫
測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：医学書腕利１
９７６年〕などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６穴のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１０〜
１．ＯＯＯμｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００〜２０
０μβ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、上清
を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　（リン酸
二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸−カリウム０．２１ｇ
、食塩７．６５ｇ。

蒸溜水１ｆｆｉ、　　ｐＨ７，２）でよく洗浄後、１％
ｆｌｓＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ溶液（ＥＩ
ＳＡ−ＰＢＳ）をｌ０ＣＩ〜２００μｌ／穴分注し、４
℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との
結合残基をブロック（ブロッキング）した。

その後、ＢＳ’Ａ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰ
ＢＳでよく洗浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓで希釈した試料（マウス血清。

ハイブリドーマ培養上清、　＃Ｉ！ｇ製単クローり性抗
体）を１００μｌ／穴分注し、４℃で１晩放置する。レ
ジン水で１回、２ＭＮａＣ１溶液で６回洗浄した後、第
２抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリンＩｇＧ
−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ＞社製、販
売元協和メデックス〕の１００倍希釈液を１００ｄ／穴
分注し、室温で２時間放置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，２）ｉｚに溶かした溶液に、使用直前に過酸
化水素Ｉμ（１／　ｍ　ｌを加えた溶液〕を用い、発色
をＯＤ　４１５ｎ＊の吸光度で測定する。このとき、肺
腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対して強く反
応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとしてハイブリド
ーマ作製のための抗体産生細胞の供給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド〜ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　
ｌ　００〜２００〃を加え、２時間放置し、レジン水ま
たはＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一般
の抗原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、抗
体価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト肺腺癌患者有水の高分子分画１０
〜４００ｑ／匹を腹腔内に投与し、膵臓細砲を摘出し、
肺細胞を調製する。

膵臓をＭＥＭ　（日永製薬社製）中で細断し、ピンセッ
トでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清
を抱で、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，
６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで３
回洗浄して融合用肺細胞として提供する。

免疫原として用いる肺腺癌患者有水の高分子分画の調製
は以下の通り行う。

すなわち−８０℃に保存しておいた肺腺癌患者有水を融
解後、３．　ＯＯＯｒｐｍ、　Ｉ　０分間遠心分離し、
固形分を除いた上清をセルロファインＧＣＬ−２０００
ＳＦ　（生化学工業社製）カラムに通塔し、分子ｉ　１
，０００．０００以上の高分子画分を集め、肺腺癌患者
有水の高分子分画とする。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢΔ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−０１
　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（（：ｕｒ
ｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　ａｎｄ　　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　−１）
］〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（
Ｂｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏｌｏ３ｙ）　
６．　５１１−５１９（１９７６）］　、Ｓ　Ｐ　２　
／　０−Δｇ１４　　（ＳＰ−２）〔ネイチ＋−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）２７６、２６９−２７０　（１９７８）］、
Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａｇ８６５３　（６５３）　Ｃジャ
ーナル・オブ・イムノロシイ　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）　１２３．１５４８−１５５０　（１９７９）　
〕、〕Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）　〔ネイチ＋−
（Ｎａｔ、ｕｒｅ）　２５６．　４９５−４９７（１９
７５）　３などが用いられる。これらの細胞株は、８−
アザグアニン培地ＣＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミ
ン（１，５ｍＭ）、２メルカプトエタノール（５Ｘ１０
−’Ｍ）、　ジエンタマイシン（１０、ＩＪ　ｇ／ｍｌ
＞および牛胎児血清（Ｆｅ２）（ＣＳ　Ｌ社製、１０％
）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５
μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の
３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以
上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、　　５分）し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−
ｉ、ｏｏ。

（ＰＥＧ−１，０００）２　ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジ
メチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜ｌ　ｍｌ
／１０３抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭＩ
〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍ
１になるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、　５分
）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正常
培地（ＦＣ３ＩＯ％を含むＲＰＭＩ−１６４０培地）１
００ｎ＋１を加え、メスピペットによる吸込み、吹出し
でゆるやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００ｕ（１／穴
ずつ分注し、５％ＣＯ２インキユベーター中、３７℃で
２４時間培養する。培養プレートに１００μＱ／穴のＨ
ＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、
チミジン（１，５Ｘ１０−’Ｍ）およびアミノブチリ：
／（４Ｘ１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２
４時間培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清
１００頭を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％
ＣＯ，インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培
養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１００μｇを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地か
らアミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日
間、２４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法〈ΔＢＣ
法）　（酵素抗体法、学際企画刊、１００頁、１９８５
年）により、ヒト肺腺癌に対する抗体価を測定する。こ
のとき、同様の方法で、ヒト正常細胞９紐織あるいはそ
の膜成分などとの反応性も測定し、ヒト肺腺癌細胞１紐
織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選択す
る。ヒト肺腺癌細胞１紐織あるいはその膜成分に強く反
応し、ヒト正常細胞。

組織あるいはその膜成分などに反応しない穴について、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定し
てヒト肺腺癌細胞１紐織あるいはその膜成分に強い抗体
価の認められたものを抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体産
生バイプリドーマ株として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理Ｃ２，６，ｔｏ、　　１４−テトラメチ
ルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５　ｍｌを
腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のＢ
ＡＬＢ／Ｃ雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト肺腺癌
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０
６細抱／匹を腹腔内注射する。

１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマ
ウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、
５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニウムに
て塩析し、０．０４　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０
，０，０３Ｍ　　ＮａＣｊ＋を含む）で透析後、Ｄ　Ｅ
　５２（Ｗｈａｔｍａｎ社製）（ベットボリューム５０
ｍ１）のカラムに流速２０〜３０ｍ１／時で通塔し、Ｉ
ｇＧ画分を集め、精製単クローン性抗体とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、７４頁、
１９８１年）によって行う。

蛋白機の定量は、フォーリン法および２８０ｕｍでの吸
光度（１，４（ＯＤ２Ｉｌｏ　）ζイムノグロブリンｌ
ｆｆ１ｇ／ｍｌ］より算出する。

得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の＆１器由来の正常あるいは腫
瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常あ
るいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしく
はそれらの膜成分との反応性、従来から知られている癌
胎児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性１正常。

患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法、蛍光
抗体法、免疫組織学的判定法（ＡＢＣ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト肺腺癌以外とは、反
応しないものを選択する。

また、このようにして得られた、ヒト肺腺癌に特異的に
反応する単クローン性抗体は、血清診断９組織診断、イ
メージングなどによる肺癌の診断、さらには、抗体その
ものを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた、
いわゆるイムノトキシンを癌患者に投与することにより
肺癌の治療を行うことができるものと期待される。

さらに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフ
ィニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その
抗原の解析ひいては、肺癌ワクチンの開発にも使用でき
るものと期待される。

（５）肺癌血清診断法 酵素免疫測定法による血清診断は次の通り行う。

９６穴ＥＩＡ用プレートに、第１抗体ｌＯ〜１００　μ
ｇ／ｍｌを５０〜２００μ＋！／穴ずつ分注し、４℃で
１〜２晩あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳ
で洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ　２００ｄ／穴を加え、さら
に４℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。このプレ
ートをＰＢＳでよく洗浄後、各式に血清検体を１〜１０
０倍希釈で、５０〜１００４を加える。４℃で１晩ある
いは室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に
、ビオチン化した第２抗体あるいは、ペルオキシダーゼ
標識した第２抗体（１０〜１００■／４）を５０〜１ｏ
ａｄ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜４
時間放置する。第２抗体として、ビオチン化抗体を使用
する場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０μｇ／ｍｌ）を
５０〜１００μＱ／穴加え、室温で３０分間放置後ＰＢ
Ｓでよく洗浄する。次に基質液として、ＡＢＴＳ基質液
を５０〜１００威／穴加え、室温で１０〜３０分間放置
し、５％ＳＯ３溶液５０〜１００μｐ／穴を加え反応を
停止する。

各式の○Ｄ、１３、値を測定し、その発色度より血清検
体中の抗原量を算出する。このようにして得られた健常
人血清中の抗原量と肺癌患者血清中の抗原量を比較する
ことにより、正常値を決定し、その正常値を超えるもの
を肺癌陽性とする。

ラジオイムノアッセイ法による血清診断はキャンサー・
リサーチ（（：ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４５　、４３
５（１９８５）記載の方法に従って行う。

また、この血清診断を用いて、患者の血清中の癌抗原を
経時的に測定（モニタリング）することにより、癌治療
の効果の判定又は再発の予知を行うことができる。

（６）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（肺腺癌膜成分、肺癌
培養細胞株、肺癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒ
ａｍｉｎｉｄａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓ
ｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理した後
、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をしてい
ない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差より、
抗原の化学的性状（単クローン性抗体の認識する抗原部
位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイラミ
ニダーゼ処理により抗原性が消失すればシアル酸が、プ
ロテアーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また過ヨウ
素酸処理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に関与し
ていると推定される。

単クローン性抗体を用いる病理診断法は免疫組織化学的
染色法（ＡＢＣ法〉に従って行う。

以下、本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）　　免疫原の調製 免疫原としての肺腺癌患者有水の高分子分画の調製は、
以下の通り行った。

一８０℃に保存しておいた肺腺癌患者有水を融解後、３
．００Ｏｒｐｍ、　　１０分間遠心分離し、固形分を除
いた上清８ｍｌを０．５Ｍ　　ＮａＣ１を含む１０ｍＭ
’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化したベツドボリ
ューム７５０ｍ１のセルロファインＧＣＬ−２０００Ｓ
Ｆ　（生化学工業社製）カラムに通塔し、分子１１，０
００，０００以上の高分子画分（ボイドフラクション；
フラクション番号４１〜５０）を集め、これを肺腺癌患
者膨水の高分子分画とした。

セルロファインＧＣＬ−２０００ＳＦの溶出パターンを
第１図に示した。

（２）抗体産生細胞のｉ製□ ヒト正常肺組織膜成分（１００μｇ蛋白質／匹）を、生
後２４時間以内の新生仔ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投
与した。８週間経過後のマウスに肺腺癌患者膨水の高分
子分画１００μｇ（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミニ
ウムゲル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチンｌＸｌ０’
／匹とともに腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同
一抗原１００μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫し
た。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清が、
ヒト肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と強
く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスより
、ＩＩＩ細耳包を調製して、細胞融合に供した。

（３）　　マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２ｘｔｏ’以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（４）ハイブリドーマの作製 （２）と（３）で得られた牌細胞と骨髄腫細胞とを５：
ｌの割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７℃、１４日間００２５％下で培養した。融合細目
臼を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、抗ヒ
ト肺腺癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び
、さらに正常培地に変え、２回クローニングを繰り返し
て、酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法（ＡＢＣ
法）により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌に全く
反応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応する単クローン性
抗体を産生ずるハイブリドーマ株ＡＬＣ−８６４を選択
した。

（５）単クローン性抗体の精製 ブリスタン処理した８週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに（４
）で得られたハイブリドーマ株ＡＬＣ−８６４を４Ｘ１
０’細胞／匹を腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分子ｌｉ　（３，００Ｏｒｐｍ。

５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、０．０４　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，
０，０，０３Ｍ　　ＮａＣ６を含む）で透析後、ＤＥ　
５２　（Ｗｈａｔｍａｎ社製）（ヘットボリューム５０
ｍ１）のカラムに流速２０〜３０ｍ１／時で通塔し、Ｉ
ｇＧ画分を集め、精製単クローン性抗体とした。このよ
うにして得られた抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体ΔＬＣ
−８６４はオクタロニイ法によりＩｇＧ１に属すること
が判明した。

（６）ＡＬＣ−８６４の特異性 抗ヒト肺腺癌単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４の反応特
異性を第１表に示した。

第　　　　１　　　　表 実施例２゜ 実施例１で得られた単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４を
用いて、肺腺癌の免疫組織化学的染色を以下のように行
った。

ミクロトームで５μｍにスライスした癌組織のホルマリ
ン固定パラフィン包埋組織切片を、卵白アルブミンでコ
ートしたスライドグラスに固定し、キシレンで脱パラフ
イン後、アルコール−水で段階的に親水化した。レジン
水で５分間すすぎ、０．３％Ｈ２０，を含むメタノール
中で室温３０分間静置し、内因性ペルオキシダーゼをブ
ロックした。次に切片を２０分間ＰＢＳで洗浄後、希釈
したウマ正常血清中で室温２０分間静置した。切片から
過剰の血清を吸い取り、第１抗体（抗ヒト肺腺癌単クロ
ーン性抗体ＡＬＣ−８６４，１０■／巾ｌ）と３０分間
反応させた。

洗浄後、希釈ビオチン化抗体〔ビオチン化つサギ抗１ｇ
Ｇ抗体、　ベク）−ル（ＶＥＣＴＯＲ）社製〕を３０分
間反応させ、さらに洗浄後、アビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼ複合体［へ９　）　−ル（ＶＢＣＴＯＲ）
社製〕を３０分間反応させた。よく洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ基質［０，０２％Ｈ２０，を含む０．１Ｍ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）で調整した０、１％ジアミ
ノベンジジンテトラヒドロクロライド（ｄｉａｍｉｎｏ
ｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｌｏｒｉｄ
ｅ）］を２２分間反させ、水冷中で反応を停止した。ヘ
マトキシレン染色後、アルコール−水およびキシレンで
脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡した。

７例の肺腺癌患者摘出肺腺癌パラフィン包埋ブロック切
片について検討した結果、６例で癌細胞が強く染まった
。以上の結果は、ＡＬＣ−８６４を用いる免疫組織化学
的染色により、肺腺癌の病理診断が可能であることを示
している。

実施例３゜ ９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、第１抗
体としてΔＬＣ−８６４（１０Ｍｇ／ｍｌ）を５０４／
穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ　　２００ｄ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳで
よく洗浄したプレートに、健常人血清（４４検体）およ
び肺癌患者血清（９２検体）を４倍希釈して４０薦／穴
加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。次に
、第２抗体として、ビオチン化抗肺腺癌単クローン性抗
体ＡＬＣ−８６４（１０Ｍｇ／ｍｌ＞を１００００薦／
穴加４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビ
ジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（１０４／ｍ
ｌ）　　ｌ　００μｆｆ／穴加え、室温で１時間放置し
た後、ＰＢＳで洗浄した。次にＡＢＴＳ基質液を１００
ｄ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％ＳＤＳ溶液
１００ｍ／穴を加え反応を停止した。各式の発色を吸光
度計（ＯＤ＝＋ｓ、、−）で測定した。その結果、第２
図に示した様に、健常人血清では、ＯＤ、、い、が０．
５０をこえる陽性例は４４例中１例もなかったが、肺腺
癌患者血清ではＯＤｎ＋ｓｎａが０．５０をこえる陽性
例が′、３３例中１７例あった。このことより、本抗体
を用いる血清診断法により、５１．５％の確率で肺腺癌
患者を見出すことが可能であることがわかった。肺扁平
上皮癌患者血清では、ＯＤ４１ｓｈｍが０．５０をこえ
る陽性例が、３３例中８例（２４％）、肺小細胞癌患者
血清では、２２例中２例（９，１％）、肺小細胞癌患者
血清では、４例中２例（５０％）であった。肺腺癌患者
血清では１６例中６例（３７，５％）であった。

実施例４゜ 単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４が認識する抗原を解析
するために、肺腺癌組織の膜成分を下記各種酵素および
試薬で処理した後ＡＬＣ−８６４との反応性を調べた。

酵素および試薬 トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製　２．５％溶液）ＰＢＳ中
　　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社！Ｉ！
り ０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）−３ｍＭＣａＣｊ！
、中０．ＩＵ／ｍｌ α−Ｌ−フコシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製
） ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，３）中０、ＩＵ／ｍｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中１００／ｍ１ ＮａｌＯ＝（和光純薬工業社製） ＰＢＳ中５０ｍＭ 肺腺癌組織の膜成分（蛋白質１００μｇ　／　ｍ　Ｉ　
）を５０μｇ／穴ずつ、ＥｒＡ用プレート〔リンプロ（
Ｌｉｎｂｒｏ）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＱ／
穴分注し、３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３
回洗浄後、上記酵素液または試薬液を５０μｇ／穴分注
し、３７℃で１時間反応させた。ついでＰＢＳで５回洗
浄し、単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４（１０４／ｍｌ
＞を５０ｍ／大分注し、４℃で１晩放置した。

Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ　（０，０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＰＢＳ溶液、　Ｔｗｅｅｎ−２０は和光純薬
工業社製）で５回洗浄後、ウサギの抗マウスイムノグロ
ブリンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫ
Ｏ）社製、販売元協和メデックス〕（４００倍希釈液）
を５０頭／穴加え、室温で２時間反応後、Ｔｗｅｅｎ−
２０−ＰＢＳで５回洗浄し、ＡＢＴＳ基質１００頭を加
え、３０分間反応後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定
した。

抗原性は、第３図に示した通り、トリプシン。

プロテアーゼ処理により完全に消失した。この結果より
、単クローン性抗体Ａ　Ｌ　Ｃ−８６４は、蛋白質を抗
原として認識しているものと推定された。

発明の効果 本発明によれば、肺腺癌の病理診断、血清診断、モニタ
リングに有用な単クローン性抗体が供給される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、セルロファインＧＣＬ−２０００ＳＦの溶出
パターンを示す。 第２図は、単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４による肺■
癌の血清診断の結果を示す。 第３図は、肺腺癌組織の膜成分の各種酵素、試薬処理に
よる単クローン性抗体Ａ　Ｌ　Ｃ−８６４との反応性の
消長を示す。 ・はノイラミニダーゼ０．　Ｉ　Ｕ／ｍ！、△はα−Ｌ
−フコシダーゼＯ，ｌ　Ｕ／ｍｌ、口はトリプシン０．
２５％、閣はプロテアーゼ１０　Ｕ／ｍｌ、○はＮａ　
ＩＯ＝　５０ｍＭの処理を示す。×は無処理を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 ４０　　ｈｏ　　６０　　ｒ７０　８０フラ７：／１ン
’ｈ　”ｊ　（ｒｍＱ　／１−１ｅ　）第２図 ＱＣ）４ｒ５ｎｍ 訊漿漂晟崎状借や２

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＩｇＧ＿１に属し、ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒ
   ト正常細胞と反応せず、蛋白質を抗原として認識する抗
   ヒト肺腺癌単クローン性抗体。
2. （２）ＩｇＧ＿１に属し、ヒト肺腺癌細胞と反応し、ヒ
   ト正常細胞と反応せず、蛋白質を抗原として認識する抗
   ヒト肺腺癌単クローン性抗体ＡＬＣ−８６４。
3. （３）請求項（２）記載の単クローン性抗体ＡＬＣ−８
   ６４を用いるサンドイッチ方式による酵素免疫測定法ま
   たはラジオイムノアッセイ法により肺腺癌の血清診断ま
   たはモニタリングを行う方法。
4. （４）請求項（２）記載の単クローン性抗体ＡＬＣ−８
   ６４を用いる免疫組織化学的染色法。
5. （５）請求項（１）記載の単クローン性抗体を生産する
   ハイブリドーマ。
6. （６）ハイブリドーマ株ＡＬＣ−８６４（ＦＥＲＭＢＰ
   −１７８３）。