JPH01277498A - 抗ヒト胃癌モノクローナル抗体ａｍｃ−８４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト胃癌に反応し、その認識する抗原（エピ
トープ）が、糖蛋白質であることを４６徴とするモノク
ローナル抗体および該抗体を用いる胃癌の病理診断なら
びに胃癌、肝癌、胆嚢・胆管癌の血清診断法、モニタリ
ングへの利用に関するものである、。

従来の技術 抗ヒト消化器癌モノクローナル抗体を用いる消化器癌の
血清診断が報告されている〔ジャーナル・メブ・クリニ
カル・イ１１）ｒ：Ｉシイ　（，１゜Ｃｌ１ｎ、　　１
ｍｍｕｎｏ１．、＞　２．１３５（１９Ｂ２）、フエデ
レーション・プロシーディング（ｌｉｅｄｅｒａｔｉｏ
ｎ　Ｉ’ｒｏｃ、　）。

４１　　Ｂ９８（１９８２）ｌ−＋ン勺−・り勺−チ（
ＣａｎｃｅｒＲｔ：ｓ、）　４２．６（１１（１！１８
２）、ハイブリドーマ（ｌｌｙｂｒ　ｉｄｏｍａ）２　
、　１１０（１９８３）　　：］　。

これらのモノク［７−ナル抗体はいずれも、血中抗原と
してシー１′ル酸化された糖蛋白質を認識しているもの
であり、これらのモノクローナル抗体を利用した癌血清
診断系に′Ｊｉいては、いずれの場合にもｌＩｊ＃癌に
おける陽性率が他の消化器癌に、Ｌｉける陽性率よりも
高い。

）１１癌の１１重瘍マーカーとしては、アルファ・フェ
トプロデイン（以下Ａ　Ｉ”　Ｐと略記する）が知られ
、臨床検査」−最も有用な腫瘍マーカーの一つとなって
いる。Ａ　Ｆ　Ｐの肝癌における陽性率は７５〜９０％
であるが、肝炎では３０〜４０％。

肝硬変では３０〜５（）％の偽陽性が出るといわれてい
る。また、ＡＩ＝”　Ｐの胃癌での陽性率は、数％程度
である。

発明が解決すべき課題および解決するだめの手段 胃癌に肪異的に反応ずろモノク［Ｊ−ナル抗体が得られ
れば、胃癌の診断に有用である。胃癌の千ツクＴ’ｌ−
ナル抗体は知られているが、さらに優れた抗体の開発が
望まれている。本発明者らは、ヒト胃癌組織膜成分が免
疫した抗体産生マウスの肺細胞とマウス骨髄腫細胞株と
が融合したハイブリドーマが生産するモノクロ−リール
抗体が胃癌に対してｆ＆れた反応性を有し、さらにその
モノクローナル抗体を利用したザンドイッチ方式による
酵素免測定法が、胃癌、肝癌。

胆嚢・胆管癌の血清診断に応用できることを見い出し本
発明を完成した。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、ヒト胃癌組織膜成分で免疫したマウスの肺細
胞とマウス・冑髄腫細胞株とを融合させてハイブリドー
マを作製し、ヒト胃癌細胞膜成分に反応性を有するモノ
クロ−ナル抗体を選択し、該ハイブリドーマを培地中に
培養するかマウスに投与して該マウスを腹水化し、該培
養物または腹水より採取することによりｊ￥）られる抗
ヒト胃癌反応性モノクローナル抗体を提供す本発明の千
ツクｒ１−ナル抗体は、１ｇＭクラスに属し、胃癌細胞
膜成分に反応し、糖蛋白質を抗１ｊ；〔とじて請識する
。

本発明のモノクし］−ナル抗体の具体例としては、ハイ
ブリドーマ細胞株ＡＭＣ−８４（昭和６３年２　Ｊｌ　
２５０付で上葉技術院微生物工業技術研究所にＦＩＥｆ
ｉＭ　Ｏ＋’−１７６１として寄託しである）が生！≧
ＣするΔＭＣ−Ｆ１４があげられる。

以ドに本発明のモノクローナル抗体の製造法を詳細に説
明する。

（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０週令、
調合しくは８調合のマウスに、ヒト胃癌の細胞１組織あ
るいはそれらの膜成分を免疫して、その動物のｌｌ’ｌ
ｔ、　　ＩＪンパ節。

末梢血中の抗体産（１細胞を調製ずろ。免疫するマウス
はヒ）　ｉＥ常胃細胞で０ｆｊ処理して免疫寛容にした
マウスを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮
下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジ１．バ
ンド〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏ町
１ｅａｐＰｒ＋！ｕｎｄ’　ｓ　八ｄＪｕｖａｎＬ）ま
た（ま、水酸化Ｔ）レミニーウトゲルと杓１コ咳閑ワク
チンなど〕とともにヒト胃癌１１ＩＩＩ包（１（１６〜
ｌ　（１’　！＋１１１包／匹）。

ヒト胃癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（１０
〜５００μｇ／匹）４投５する。

以後、１〜２週問おきに抗原を２〜５回投与する。各免
疫後３〜７日目ロー底静脈叢より採血し、その血清がヒ
ト胃癌と反応することを以下に示す酵素免疫測定法〔酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：医学書院刊　１９７６年
〕などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６穴のＥ　ＩΔ用プレート〔）■】−・ラボラトリー
ズ（Ｆｌｏｗ　ｌ、ａｂｏｒａＬｏｒｉ＋ｇｓ）ネ」製
〕に、正常あるいは胛瘍細胞９組織の膜成分（蛋白量と
して１０〜１，０００μｇ／ｍ１含有する膜断片）を１
００〜２　［］　、４１μｌ／穴ずつ分注し、４℃で１
〜２晩放置して、」−清を抜き去った後、レジン水ある
いは、Ｐ１４Ｓ（ＩＪン酸二すトリウ７ｘ　１８ａ　ｇ
、　　リン酸−カリウｌ、０．２１ｇ２食塩７．６５ｇ
、蒸溜水１ｃ　　ｐＨ７，２）でよく洗浄後、１％ＢＳ
Ａ（牛血清アルブミン）−ＰＨ８を１００〜２００μｌ
／穴分注し、４℃でＩ〜２晩放置して、プレート」二に
残−っだ蛋白質との結合残基をブロック（ブロワ：１−
ンク）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水
あるいはＩ）　Ｂ　Ｓでよく洗浄した後、第１抗体とし
て、ｌ’３　Ｓ　Ａ　−Ｐ　Ｂ　Ｓで希釈した試料（マ
ウス血清、ハイブリドーマ培養上清、精製千ツクローナ
ル抗体）を１００μＱ／穴分注し、４℃で１晩放置する
。レジン水で１回、２Ｍ　　ＮａＣｊ２溶液で６回洗浄
した後、第２抗体としてウツギの抗マウスイトツクＴコ
ブリンＩｇＧ−ペルオ・トシダーセ結合物〔ダニ」（１
）ΔＫＯ）社製、飯売元協和メデックス〕の１００倍希
釈液をｌ００ｕＱ／大分注し、室温で２時間放置する。

Ｐ　Ｂ　Ｓでよく洗浄後、八Ｂ　ＴＳ基質液〔２゜２′
−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）二γンモーウノ、５５　ｌ１１１ｇを［１，ｌ
　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ１４，２）１．＆に溶かした
溶液に、使用直前に過酸化水素１μＱ　／　ｍ　ｌを加
えた溶液〕を用い、発色をＯｆ）、、、。。

の吸光度で測定する。このとき、胃１１’ｉｉ細胞。

組織あるいはそれらの膜成分に対して強く反応するマウ
スをヒト胃癌免疫マウスとじ−Ｃハイブリドドーマ製の
だ約の抗体産生細胞の供給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細；泡を培養し、［１，２
５％ゲルタールアルデヒド−１）　Ｂ　Ｓを加え、室温
に１〜２時間放ｉξし、１）　Ｂ　Ｓでよく洗浄後、１
％ＢＳ△−Ｉ）　Ｂ　５１００〜２００μＱを加え、２
時間放置し、レジン水またはＩ）　Ｂ　Ｓでよく洗浄し
、そのプレートを用いて、一般の抗原コートプレートを
用いるのと同様の方法にて、抗体価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４０前に、ヒト胃癌細胞。

組織あるいはその１漠成分を２〜５ＸＩＯ’細胞／匹あ
るいは２０〜４００μｇ／匹腹腔内に投与し、肺臓細胞
を摘出し、牌細胞を調製する。ｌｌ１ｌ！１８をＭＥＭ
（日永製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１
２　Ｄ　Ｏｒｐｍ。

５分間遠心分離にかけ、上清を捨て、トリス−塩化アン
モニウム緩衝液（ｐｌ−１７，６５）で１〜２分間処理
し赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞
として提供する。

ヒト胃癌組織の膜成分の調製は下記のとおり行う。

すなわち−８０℃に凍結保存しておいた組織片を融解後
、鋏で細切りし、旧ｔｒａ−ロｉｓｐｃｒｓｅｒ（Ｙａ
ｍａｔｏ社製）で機械的に破砕後、グラステフし１ンホ
モジナイザーでホモジナイズしたものを４℃、　１００
．００［１ｘ　ｇ　、　２０分間遠心分離し、その」−
清をさらに４℃、　＋００．０ＯＯＸ　ｇ　、　１時間
遠心分離し得た沈殿をＯ，ＯＩＭＩＪン酸バッフγ−（
ｐＨ７、２）に懸陶し、これを膜成分として使う１゜ （２）　　’ｆ１髄腫細胞の調製 旧制肝細胞としては、マウスから１１ノられた株化細胞
を使用する。たとえば、８−了ザクアニン耐性マウス（
ＢΔ１．　Ｂ　／　ｃ由来）旧髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３
Ａｇ８−ＩＩ　　（Ｐ：３−Ｕｌ）［カレント・トピッ
クス・イン・ミクロバイオ■コジイ・アンド・イムノロ
シイ−１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　’「ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
　−１）　］　　［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
イｌ、）■コシ＜　（［’、ｕｒｏｐｃａｎ　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　　６．　５１１−５１９　
　（＋９７６）］　　、　Ｓ　　Ｐ　　２／（）−Ａｇ
１４　　（ＳＰ−２）［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　
　２７６、２６９−’２７０　（１９７８）］　、Ｐ　
：３−Ｘ　６３−　Ａ　ｇ　８６５３　（［１５３）　
ＣジャーナＪＬ、・Ｊブ・イトノロシイ（、Ｊ、　１ｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ）　１２３．１５４８−１５５０　（
１９７９）　）　、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）Ｃ
ネイチャ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６．４９５−４９
７　（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株
は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭｌ−１６４０培地に
クルクミン（］、５５ｍＭ。

２−メルカプトエタノール（５ＸｌＯ−５Ｍ）。

ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児＋ｌ
ｎ清（ＦＣ８）（Ｃ３Ｌ社製、１０％）を加えた正常培
地に、さらに８−アザクアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加
えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常
培地に継代し、融合当日２Ｘ］０７個以上の細胞数を確
保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた旧制
腫細胞をＭ　Ｅ　Ｍ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細
胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞−・５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、　　５
分）した後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐし
た後、撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコ
ール−１，１］　００　　（ＰＥＧ−１，０００）　２
　ｇ、　ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０７
ｍ１の混液０．２〜１ｍｌ／ＩＱ″抗体産生細胞を加え
、１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２ｍｌを数回加えた後、Ｍ
　ｒニー　Ｍを加えて全量が５０ｍ１になるようにする
。遠心分離（９ＩＩ　ＩＩ　ｒｐｍ、　５分）後、十清
を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正常）ｒｆ、地
（ＩマＰＭ　ｌ−１６／Ｉ　Ｏ，ＦＣ３ＩＯ％）Ｎｌｌ
ｌｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆ
るやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を１］に穴Ｊ？〜養用プレートに１００ノＬ
ｐ／穴ず−）分注し、５％Ｃ０２インキュベーク−中、
３７℃で２４時間培養する。ｊｉ：ｉ養プレートにＩ０
０μｆ＋／穴のＩＩΔ′ｌ″Ｊ、ｌ’４地〔正常ｊ７ｊ
９地にヒポキシンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（１，
５ｘ　Ｉ　０−５Ｍ＞およびアミツブゾリン（４ＸＩＯ
−’Ｍ＞を加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養す
る。以後２１Ｘ１間、２４時間毎に、培養」１清１００
μＱ４捨で、新たに同量のＩＩＡＴ培地を加え、ＣＯ２
インキ；、ベーター中、３７℃で１０〜１４［１間培養
する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、」１清１００μＱを捨て、トＩＴ培地（１−１△
Ｔ培地からアミツブゾリンを除いた培地）を同量加え、
以後２日間２４時間毎にＩＩ　′Ｆ培地への変換を行う
。

！１Ｔ培地で３〜４１］間培養後、培養上清の一部をと
り一ヒ記の酵素免疫測定法により、ヒト胃癌に対する抗
体価を測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常細
胞１紐織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、
ヒト胃癌細胞１組織あるいはその膜成分に特異的に反応
するものを選択する。ヒト胃癌細胞１組織あるいはその
膜成分に強く反応し、ヒト正常細胞９紐織あるいはその
膜成分などに反応しない穴について、限界希釈法により
クローニングを２回繰り返し、安定してヒト胃癌細胞９
紐織あるいはその膜成分に強い抗体価の認必られたもの
を抗ヒト胃癌モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 ブリスタン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン　（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５　ｍｌを腹
腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令の調合
ド雌マウスに、（３）で１１１られた抗ヒト胃癌モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ］０’細
胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドー
マ（ま１復水）晶化する。このマウスから腹水を採取し
、遠心分離（３，旧１０ｒｐｍ、　　５分）して固形分
を除去後、５０％０％硫酸アンモニラ１て塩析し、Ｐ　
Ｂ　ＳにＮａＣＲ０，５Ｍを加えた液で透析し、セルロ
ファインＧＳＬ２０００　（生化学工業社製）　（ベツ
ドボリューム７５０ｍ１）のカラｌ、に流速１５ｍ１／
時で通塔し、ＩｇＭ画分を集め、精製千ツク［１−ナル
抗体とする３、抗体のイソタイプの決定は、オフタロエ
イ（Ｏｕｃｔ＋ｔ、ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法
）（免疫学実験入門、生物化学実験法１５、学会出版セ
ンター刊、７４頁、１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度［１，０（ＯＤ２．、　）　”、イムツクＶＪプリ
ンＩｍｇ／ｍｌ］より算出する。

得られたモノクローナル抗体の特異性の決定は複数の検
体から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫
瘍組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常あ
るいは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしく
はそれらの膜成分との反応性、従来から知られている癌
胎児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性を酵素免疫測定
法、免疫組織学的判定法（ＡＢＣ法）などにより測定し
た。

（５）　　血清診断法 血清診断は次の通り行う。

９６穴ＥｌΔ用プレートに、第一抗体１０〜１００μｇ
／…１を５０〜２００μｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜
２晩あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳで洗
浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ２００μＱ／穴を加え、さらに４
℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。このプレート
をＰ　Ｂ　Ｓでよく洗浄後、８穴に血清検体を１〜Ｉｔ
）０倍希釈で、５０〜１（１０μＱを加える。４℃で１
晩あるいは室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する
。次に、ビオチン化した第二抗体あるいは、ペルメ：ト
シダーセ標識した第二抗体（１（］〜１００μｇ／μｐ
）を５０〜１００μＱ／穴加え、さらに４℃で１晩ある
いは室温で２〜４時間放置する。第二抗体として、ビオ
チン化抗体を使用した場合には、プレートをＰＢＳでよ
く洗浄後、アビジンーベルオキシダーセまたはアビジン
−ビ」ヂンーベルオキシダーゼ（，１０μｇ／ｍｌ＞を
５（１〜＋００μＱ／穴加え、室温で３０分間放置後１
）　Ｂ　Ｓでよく洗浄する。次に基質液として、ΔＢＴ
Ｓ基質液を５０　”−１（］　０μｐ／穴加え、室温で
１０〜３０分間放置し、５％Ｓ　ｌ）　Ｓ溶液５０〜１
００μＱ／穴を加え反応を停止させる。８穴のＯＤ、＋
５値を測定し、その発色度より、血清検体中の抗原量を
算出する。このようにして得られた健常人血清中の抗原
量と各種癌患者血清中の抗原量を仕較することにより、
正常値を決定し、その正常値を超えるものを陽性とした
。

また、この１（ＩＬ清診断法を用いて、患者の血〆市中
の癌抗原を経時的に測定（モニタリング）するＪ−とに
より、癌治療の効果の判定又は、再発の予知を行うこと
ができる。

（６）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法の実施に
際して、抗原（胃癌膜成分、胃癌培養細胞株、胃癌組織
）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）
、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの酵素や過Ｅ
ｌつ素酸などの試薬で前処理した後、モノクローナル抗
体と反応させ、それらの処理をしていない元の抗原とモ
ノクし】−ナル抗体の反応性との差より、抗原の化学的
性状（モノクローナル抗体の認識する抗Ｂ；（部位の化
学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイラミニダー
セ処理により抗原性が消失すればシアル酸が、プロプア
ーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また過ヨウ素酸処
理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に関−１ｊして
いると推定される。

モノクローナル抗体を用いろ病理診断法は免疫組織化学
的染色法〔「酵素抗体法」（渡辺慶−３中根−穂編、学
際企画、１９８５年）第１０６頁記載のへＢｃ法〕によ
って１−ｊつだ。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）抗体産生細胞の調製 ヒト正常前膜成分（Ｉ　ｍｇ蛋白質／匹）を、生後２４
時間以内の新生仔Ｂ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　ｃマウス（静
岡実験動物製）に静脈内投与した３、８週間経過後のマ
ウスにヒト胃癌膜断片１００μｇ（蛋白質換算）７匹を
水酸化γルミニラｌ、ゲル２ｍｇ／匹、百日咳閑死菌ワ
クチンｌＸｌ０９／匹とともに腹腔内投与した。以後１
〜２週おきに、同一抗原１００μｇ（蛋白質換算）７匹
で３〜５回免疫した。これら免疫処理したマウスのうち
、その抗血清が、ヒト胃癌細胞または組織あるいはそれ
らの膜断片と強く反応したマウス峻免疫マウスとして選
択し、そのマウスより、朋１細胞を調製して、細胞融合
に供した。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザクγニン耐性マウス・［１髄腫細胞株Ｐ　：３
−　ＩＪ　ｌをｉ「常１？ζ地で培養し、細胞融合時に
２　Ｘ　ｌ　（１７個以上の細胞を得、細胞融合に親株
として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られたＩｊ！Ｉ！細胞と旧制腫細胞
とを５：１の割合で用い、前述した方式で融合させ、Ｉ
Ｉ　Ａ　Ｔ培地で１３７℃、１４０間Ｃ０２５％下で培
養して、融合細胞を選択し、Ｉ−Ｉ　Ｔ培地に費えてさ
らに培養し、ヒト胃癌に対する抗体価のａｌｌｌ定をし
−Ｃ１活性な穴を選び、さらに正常１ｊζ地に変え、２
回クローニングを繰り返して、酵素免疫ｆｉｌ１１定法
、免疫組織学的判定法（ΔＴ３Ｃ法）により、ヒト正常
細胞や組織に全く反応せず、ヒト胃癌に反応するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ株へＭ（，８４
を選択した。

（４）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８調合ヌードがマウスに（３）で街
られたハイプリドーマ株ＡＭＣ−８４を４Ｘ１０６細胞
／匹腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマはｌ＋１水５１７１
化する。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（５−
］Ｏｍｌ／匹）し、遠心分離（３，ＯｔＨｌｒｐｍ、　
５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、ＮａＣｊ！　　（］、５Ｍを添加したＰ　
Ｂ　Ｓで透析後、セルロファインＧＳＬ２０００　　（
ベットボリューム　７５０ｍ１）のカラムに流速１５ｍ
１／時で通塔しＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル
抗体とした。

（５）　　ＡＭＣ−８４の特異性 このようにして得られた抗ヒト胃Ｊｆ；’ｉ反応性モノ
クｎｊ−ナル抗体ＡＭＣ−８４の反応１ｊＩ異性を第１
表に示した。

測定は、酵素結合免疫分析（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）によ
り以下のとおり行った。

組織（膜成分）を社的とする場合： 酵素免疫分析用９Ｇ穴プレート（ＬｉｎｂｒｏｌＪ製）
に［１，Ｉｍｇ／ｍｌの組織（膜成分）液を５０μｅ／
穴入れ、３７℃で２時間または４℃で１晩放置して組織
（膜成分）を固定した。ＰＢＳで洗浄後、１０％Ｉ”　
ＣＳ含有１）　Ｂ　Ｓを１００μＱ／穴分注し、固定組
織（膜成分）の活性残Ｍを保護した。、ＰＢＳで洗浄後
、第１抗体（ＡＭＣ−８／Ｉ）５０μＣ／穴を入れ、３
７℃で１〜２時間または４℃で１晩放置して標的と抗体
を反応させた。０．０５％゛Ｉ″ｗｅｅｎ　−２０（和
光純桑工業社製）含有ＰＢＳで５回洗浄して未反応の抗
体を除去した。第２抗体としてペルオ・１−シダーゼ結
合つ勺ギ抗マウス免疫グロブリジ（Ｍｉｌ［！５−Ｙｅ
ｄａ社、２００倍希釈）５（）μ０／穴を入れ、３７℃
で１時間反応させた。００５％’Ｉ’　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ
−２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、レジン水で３回洗浄し
た。

Ａ　Ｒ’ｒＳ　基質液５０μＱ／穴を加えて反応を開始
し、５％ラウリル硅酸ナトリウム水溶液５０μＱ／穴を
加えて反応を停止させた。

培養株細胞を標的とする場合： 細胞を培養用９６穴プレート（１Ａｎｂ団社製）テ培養
し、コンフルエントになった時点で上記の組織（膜成分
）の場合と同様に反応させた。ただし第１抗体、第２抗
体とも反応条４ノ１は室温で３０分間とし、発色後に反
応液を分析用９６穴プレートに移すことにより反応４停
止させた。

抗原ＣＥ　ＡおよびΔＦＦ〕の場合は組織（膜成分）に
替えて、それぞれＣＩルΔ、八Ｆ　Ｐを用いる以外は組
織の場合と同様に行った。いずれの場合も、４９（ｌｎ
ｍを対照波長として４１５ｎｒｎの吸光度を測定した。

第　　　　１　　　　　表　　　　　　　　　′第１表
に示すごとく、ＡＭＣ−８４は、胃癌に高い反応性を杓
していた。しがし、ＣＥＡおよび八Ｆ　Ｉ）と反応しな
いことから、抗−ＣＩＸ、Δ抗体および抗−Ａ　Ｆ”　
Ｐ抗体とは異なることがわかる。

実施例２ ミクロトートで５μｍにスライスした各種正常成人、胎
児ｊ臓器および癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋
組織切片を、卵白アルブミンで二ノートしたスライドク
ラスに固定し、キシレンで脱パラフイン後、アルコール
−水で段階的に親水化した。レジン水で５分間ずずぎ、
０３％Ｉ」２０゜を含むメタノール中で室温３０分間静
置し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。

次に切片を２０分間ＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常
血清中で室温２０分間静置した。切片から過剰の血清を
吸い取り、第１抗体（抗−ヒト胃癌モノクローナル抗体
ＡＭＣ−８４１０μｇ／＋＋＋Ｉ）と３０分間反応させ
た。ＰＢＳで洗浄後、希釈ビオチン化抗体（ビオチン化
つザギ抗ＩｇＧ抗体、ベクター社製）を３０分間反応さ
せ、さらにＰ　Ｂ　Ｓで洗浄後、アビジン−ビオチン−
ベルオ：トシダーゼ複合体（ベクター社製）を３０分間
反応させた。ＰＢＳでよく洗浄後、ペルオキシダーゼ基
質［：０．０２％［−１２０２４含む０１Ｍトリス−塩
酸バッファー（ｐ　ｌ−１７，２）で調整した０、　１
％ジアミノベンジジンデトラヒドロクロライド（ｄｉａ
ｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅＬｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｌ
ｏｒｉｄｅ　）　］を２２分間反させ、氷冷中で反応を
停止した。ヘマトキシレン染色後、−ｒル：−１−ルー
水およびキシレンで脱水後、カナダハル９４−で固定し
、検鏡した。その結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 組　　織　　陽性例数／検体数　陽性率（％）スキＪｌ
、ス胃癌　　　　１／１　　　１００’１胃印環細胞癌
１　／　ｌ　　　　ｌＯＯ”胃　　腺　　癌　　　　　
８／８　　　　１００“１人　　腸　　癌　　　　　　
３１５　　　　　　６０’＋ｂ）一部の癌細胞、腺腔内
容物が染色された。

第２表に示すようにＡＭＣ−８４は、大腸癌でも一部の
癌細胞に弱く反応したが、胃癌とは高率に強く反応した
。正常・胎児組織（心、膵。

胃、大腸、腎、甲状腺、脳、牌、肝、小腸など）では、
一部の細胞と極めて弱く反応するものがみられたが、そ
の他の組織とは全く反応しなかった。

実施例３ モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４が認識する抗原を解析
するために、胃癌組織膜成分を下記各種酵素および試薬
で処理した後ＡＭＣ−８４との反応性を調べた。

酵素および試薬 トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製　２．５％　溶液）Ｐ［１
Ｓ４１　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンＪｊ−・マンハイム社製）
０．１Ｍ　　酢酸バッフｙ−（ｐＨ４，５）　　−３ｍ
Ｍ　　ＣａＣＲ、中［１，ＩＵ／ｉｎ！ α−１，−プコシダーゼ（ペーリンＪｌ−・マンハイム
ネ上製）０．１Ｍ　　リン酸バッファー（１１１１６，
３）中　０．ＩＩ／ｍｌプロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍ　　リン酸バッフｙ−（ｐＨ７，２）中　　１
０１／ｍ１ＮａｌＯｓ　　（和光純薬工業社製） Ｐ　Ｂ　Ｓ　ｒＨ５０ｍＭ 胃癌組織膜成分（蛋白量１０μｇ／ｍｌ）を５（）ｕＱ
／穴ずつ、ＥｌＡ用プレート〔ｌ、１ｎｂｒｏ社製］に
分注し、４℃で１晩放置し、Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し、
１％Ｉ−，３Ｓ△−Ｐ　Ｉ３　Ｓを１０１ｊμｇ／穴分
注し、：３（］分間〜２時間室温で放置し、ｌｌＢｓで
１３回洗浄後、」、記酵素液にたは試薬液を５０μｅ／
穴分注し、３７　ｔで１時間反応させた。ついでＰ　）
３　Ｓで５回洗浄し、モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４
（Ｉ　［］　μｇ／ｍｌ）を５［］７ｚ＆／穴分注し、
４℃で１晩放置した。

’ｒｗ　ｃ　ｃ　ｎ　−２０−Ｐ　ＩＩＳ　（Ｔ　ｗ　
ＣＱ　ｎ　−２０は和光紬薬工業社製）で５回洗浄後、
ベル」キシダーゼＭ、？ａ抗マウス１ｇＧ［：ダコ（Ｄ
ＡＫＯ）社製、販売元協和メデックス、４００倍希釈液
〕を５０μＱ／穴加え、室温で２時間反応後、’ｌ’ｗ
ｅｃｎ−２０−ＰＢＳで５回洗浄し、八Ｂ′「Ｓ基質液
１０（］μｇを加え、３０分間反応後、４１５ｎｍにお
ける吸光度を測定した。

抗原性は、第１図に示したとおり、Ｎａ１Ｏａ。

トリプシン、プ１１デγ−セ処理により消失した、。

この結果より、モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４はシェ
ル化されていない糖蛋白質を認識しているものと推定さ
れた。

実施例２ ９６穴ＥＩＡ用プレート　〔）Ｌ】−・ラボラトリーズ
（口ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、Ａ　
Ｍ　Ｃｌ−８４（Ｉ　Ｌｚｇ／ｍｌ）を５０ｕＱ／穴加
え、４℃でｌ晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ｒ３　Ｓ
Δ−ＰＢＳ　　２００μＱ／穴加え１晩放置し、Ｐ　Ｂ
　Ｓでよく洗浄したプレートに、健常人血清（Ｉ４４検
体）および癌患者血清（１４０検体）を１０倍希釈して
５０μＱ／穴加え、４℃で１晩放置後、Ｐ　Ｂ　Ｓでよ
く洗浄した。次に、第二抗体として、ビオチン化抗胃癌
モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４（Ｉ　Ｏμｇ／ｍｌ）
を］００μｌ）／水加え、４′ｔ：で１晩放置し、ＰＢ
Ｓでよ＜　？Ａ、　ｆｆ）した後、γビジンーペル處；
１−シダーセしベクター社製］（Ｈ）μｇ／ｍｌ＞　　
１００μｅ／穴加え、室温で１時間数ｉろ゛した後、Ｐ
ＢＳで洗浄した。１次にΔ［３Ｎ’　Ｓ　Ｊ、し負波を
１００μρ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％Ｓ
ＤＳ溶液１００μρ／穴を加え反応を停止した。８穴の
発色を吸光度３（（０１）、、５）で測定した。その結
果、第２表に示した様に、健常人血／Ｉｌｊでは、（月
）４１．がＩ）、　ｆｌ　５を超える陽性例は、Ｉｎ検
体中：３例（２％）しかなく、他の１４１例では、陽性
例は全く検出されなかった。

−力、胃癌患者７８検体１１川：３例（２７％）が陽性
を示したが、肝癌患者では、１２検体中５３例（７５％
）　、ｌＩ＋−！、−充・胆管癌患者では、１９検体１
１１０例（５２，ｆｉ％）が陽性とな−、た。−力、膵
癌患者では、１〕検体中２例（２２％）が陽性を示した
に過ぎなか−、た１゜ 第２表 健常人　　３／＋４／Ｉ　　　２ 冑　　　　　癌　　　　　２＋／７８　　　　　　　　
　２６．９膵　　　　癌　　　　　　２　／　９　　　
　　　　　　２２．０引　　　　癌　　　　　　！］　
／　ｌ　　２　　　　　　　７５結腸ブ１÷’ｒ　　　
Ｏ／　Ｌ　０　　　０直腸１ｉＹｉ　　　ｌ　／　ｌ　
Ｏ１０胆循み胆管癌　　　ＩＩ）／１９　　　　　５２
．６乳　　　　癌　　　　　　（１／　２　　　　　　
　　　　０＊（川、１．のイｏｌｉが、０．０５以十の
ものを陽性とした。

この結果は、本抗体が胃癌、胆嚢・１１−ｊ管；１棺勃
に肝癌の血清診断に有効であることを示している。

発明の効果 本発明によれば胃癌の病理診断、胃癌、胆嚢・胆管癌、
特に肝癌の血清診断に有効なモノクロ−ナル抗体が供給
される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、胃癌組織の１模成分の各柿酵素、試薬処理に
よるモノクローナル抗体ＡＭＣ−８４との反応性の消長
を示す。 ・はノイラミニダーゼ０．　Ｉ　Ｌｌ／ｍｌ、口はα−
１、−フコシダーゼＯ，ｌ　ＩＪ／ｍｌ、　　ｏはトリ
プシン０．２５％。 ムはプロテアーゼ１０１１／ｍｌ、△はＮａ１Ｏｎ　５
　［１ｍＭの処理を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＩｇＭクラスに属し、ヒト胃癌組織と反応し、ヒ
   ト正常組織と反応せず、シアル酸化されていない糖蛋白
   質を抗原として認識し、かつ癌胎児性抗原（ＣＥＡ）お
   よびアルファ・フェトプロティン（ＡＦＰ）と交差反応
   性を示さない抗ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８
   ４。
2. （２）抗ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４を生
   産する能力を有するハイブリドーマを培地中に培養する
   かマウスに投与して腹水化し、培養物または腹水中に抗
   ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４を蓄積させ、
   該培養物または腹水からこれを採取することによる抗ヒ
   ト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４の製造法。
3. （３）抗ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４を用
   いる胃癌の病理診断法。
4. （４）抗ヒト胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−８４を用
   いるサンドイッチ方式による酵素免疫測定法による胃癌
   、肝癌、胆嚢・胆管癌の血清診断法またはモニタリング
   を行う方法。