JPH08333399A - ヌクレオシド二燐酸キナーゼに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヌクレオシド二燐酸キナーゼに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH08333399A JPH08333399A JP14158595A JP14158595A JPH08333399A JP H08333399 A JPH08333399 A JP H08333399A JP 14158595 A JP14158595 A JP 14158595A JP 14158595 A JP14158595 A JP 14158595A JP H08333399 A JPH08333399 A JP H08333399A
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- isoform
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラットＮＤＰＫαアイソフォームおよびβア
イソフォームの機能解明、および癌の転移、心筋梗塞等
のヒトの疾患の診断に有用なモノクローナル抗体を提供
する。 【構成】 ラットＮＤＰＫのＮ末アミノ酸から８６〜１
０４番目に存在するエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体、ラットＮＤＰＫαアイソフォームのＮ末アミノ
酸から１４１〜１５２番目に存在するエピトープを認識
するモノクローナル抗体、ラットＮＤＰＫβアイソフォ
ームのＮ末アミノ酸から１４１〜１５２番目に存在する
エピトープを認識するモノクローナル抗体および該抗体
を生産するハイブリドーマを提供することができる。
イソフォームの機能解明、および癌の転移、心筋梗塞等
のヒトの疾患の診断に有用なモノクローナル抗体を提供
する。 【構成】 ラットＮＤＰＫのＮ末アミノ酸から８６〜１
０４番目に存在するエピトープを認識するモノクローナ
ル抗体、ラットＮＤＰＫαアイソフォームのＮ末アミノ
酸から１４１〜１５２番目に存在するエピトープを認識
するモノクローナル抗体、ラットＮＤＰＫβアイソフォ
ームのＮ末アミノ酸から１４１〜１５２番目に存在する
エピトープを認識するモノクローナル抗体および該抗体
を生産するハイブリドーマを提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラットヌクレオシド二
燐酸キナーゼの機能解明および癌の転移、心筋梗塞等の
ヒトの疾患の診断に有用なラットヌクレオシド二燐酸キ
ナーゼに反応するモノクローナル抗体を提供する。
燐酸キナーゼの機能解明および癌の転移、心筋梗塞等の
ヒトの疾患の診断に有用なラットヌクレオシド二燐酸キ
ナーゼに反応するモノクローナル抗体を提供する。
【０００２】
【従来の技術】ヌクレオシド二燐酸キナーゼ（以下、Ｎ
ＤＰＫと略記する。）は、ヌクレオシド二燐酸とヌクレ
オシド三燐酸の間のγ−燐酸転移を触媒する酵素で、微
生物から高等動物まで広く存在することが知られてい
る。しかし、細胞内での真の役割については十分に解明
されていない（The Enzymes edited by Boyer, P.D. vo
l.8, pp.307-333, Academic Press, New York)。近年、
ＮＤＰＫの遺伝子がクローニングされ、生物進化の過程
で構造が良く保存された酵素であることが明かとなった
〔J. Biol. Chem., 265, 15744-15749（1990）〕。最近
になり、ヒトのＮＤＰＫが、癌の転移に関係しているこ
とが報告されているｎｍ２３と同一もしくは類似した分
子であることが報告された〔J. Biol. Chem., 265, 157
44-15749（1990）、J. Natl. Cancer Inst., 82, 1199-
1202（1990）、J. Natl. Cancer Inst., 80, 200-204
（1988）〕。また、ショウジョウバエのＮＤＰＫはショ
ウジョウバエ形態形成関連遺伝子産物Ａｗｄと相同性を
もつこと〔Nature 342, 177-180（1989）、Cell 63, 93
3-940（1990）〕やＧＴＰの効率的供給にも寄与してい
ることが明らかになりつつある（GTPase in Biology, H
andbook of ExperimentalPharmacology, editted by Di
ckeys, B. and Birnbaumer, L., Springer-Verag,Berli
n, 1993)。これらの研究は、ＮＤＰＫが種々の細胞機能
に調節的役割をはたしていることを示唆している。
ＤＰＫと略記する。）は、ヌクレオシド二燐酸とヌクレ
オシド三燐酸の間のγ−燐酸転移を触媒する酵素で、微
生物から高等動物まで広く存在することが知られてい
る。しかし、細胞内での真の役割については十分に解明
されていない（The Enzymes edited by Boyer, P.D. vo
l.8, pp.307-333, Academic Press, New York)。近年、
ＮＤＰＫの遺伝子がクローニングされ、生物進化の過程
で構造が良く保存された酵素であることが明かとなった
〔J. Biol. Chem., 265, 15744-15749（1990）〕。最近
になり、ヒトのＮＤＰＫが、癌の転移に関係しているこ
とが報告されているｎｍ２３と同一もしくは類似した分
子であることが報告された〔J. Biol. Chem., 265, 157
44-15749（1990）、J. Natl. Cancer Inst., 82, 1199-
1202（1990）、J. Natl. Cancer Inst., 80, 200-204
（1988）〕。また、ショウジョウバエのＮＤＰＫはショ
ウジョウバエ形態形成関連遺伝子産物Ａｗｄと相同性を
もつこと〔Nature 342, 177-180（1989）、Cell 63, 93
3-940（1990）〕やＧＴＰの効率的供給にも寄与してい
ることが明らかになりつつある（GTPase in Biology, H
andbook of ExperimentalPharmacology, editted by Di
ckeys, B. and Birnbaumer, L., Springer-Verag,Berli
n, 1993)。これらの研究は、ＮＤＰＫが種々の細胞機能
に調節的役割をはたしていることを示唆している。
【０００３】ラットＮＤＰＫは、木村らによりラット肝
臓より精製され〔J. Biol. Chem.,263, 4647-4653（198
8）〕、その後遺伝子もクローニングされた〔J. Biol.
Chem., 265, 15744-15749（1990）、J. Biol. Chem., 2
67, 14366-14372（1992）〕。ラットＮＤＰＫには、ヒ
トやマウスと同じく、少なくとも二つのアイソフォーム
α、βが存在することが知られている〔J. Biol. Che
m., 267, 14366-14372（1992）〕。ラットＮＤＰＫに対
する抗体として、二つのアイソフォームを認識するポリ
クローナル抗体〔J. Biol. Chem., 263, 4647-4653（19
88）、Biochim. Biophys. Acta 1205, 113-122（199
4）〕および精製したラットＮＤＰＫを免疫して得られ
たαアイソフォームに特異的なモノクローナル抗体〔Bi
ochim. Biophys. Acta 1205, 113-122（1994）〕が取得
されている。また、ヒトのＮＤＰＫと同一もしくは類似
した分子と推定されているｎｍ２３については、その遺
伝子がLiottaらによりクローニングされ〔Cancer Res.,
48, 6550(1988)〕、該遺伝子は大腸菌で発現されてい
る。更に、大腸菌で発現されたｎｍ２３遺伝子産物を抗
原としてポリクローナル抗体〔Jpn. J. Cancer Rese.,
85, 840(1994)〕およびアイソフォーム特異的モノクロ
ーナル抗体〔Oncogene, 8, 1371(1993)〕が作製されて
いる。ｎｍ２３のアミノ酸配列に特異的なペプチドを抗
原としてアイソフォーム特異的なポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体が作製されたという報告はない。
臓より精製され〔J. Biol. Chem.,263, 4647-4653（198
8）〕、その後遺伝子もクローニングされた〔J. Biol.
Chem., 265, 15744-15749（1990）、J. Biol. Chem., 2
67, 14366-14372（1992）〕。ラットＮＤＰＫには、ヒ
トやマウスと同じく、少なくとも二つのアイソフォーム
α、βが存在することが知られている〔J. Biol. Che
m., 267, 14366-14372（1992）〕。ラットＮＤＰＫに対
する抗体として、二つのアイソフォームを認識するポリ
クローナル抗体〔J. Biol. Chem., 263, 4647-4653（19
88）、Biochim. Biophys. Acta 1205, 113-122（199
4）〕および精製したラットＮＤＰＫを免疫して得られ
たαアイソフォームに特異的なモノクローナル抗体〔Bi
ochim. Biophys. Acta 1205, 113-122（1994）〕が取得
されている。また、ヒトのＮＤＰＫと同一もしくは類似
した分子と推定されているｎｍ２３については、その遺
伝子がLiottaらによりクローニングされ〔Cancer Res.,
48, 6550(1988)〕、該遺伝子は大腸菌で発現されてい
る。更に、大腸菌で発現されたｎｍ２３遺伝子産物を抗
原としてポリクローナル抗体〔Jpn. J. Cancer Rese.,
85, 840(1994)〕およびアイソフォーム特異的モノクロ
ーナル抗体〔Oncogene, 8, 1371(1993)〕が作製されて
いる。ｎｍ２３のアミノ酸配列に特異的なペプチドを抗
原としてアイソフォーム特異的なポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体が作製されたという報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来知られているラッ
トＮＤＰＫの二つのアイソフォームを認識するポリクロ
ーナル抗体はそれぞれのアイソフォームを識別すること
はできず、また、αアイソフォームに特異的なモノクロ
ーナル抗体はウエスタンブロッティングや酵素免疫定量
法でラットＮＤＰＫαアイソフォームと反応することは
可能だが、細胞および組織の免疫染色には用いることが
できないため、応用範囲が限られている。ラットＮＤＰ
Ｋαおよびβアイソフォームを識別でき、ウエスタンブ
ロッティングや酵素免疫定量法ばかりでなく、細胞およ
び組織の免疫染色にも応用可能なモノクローナル抗体が
取得できれば、不明な点の多いラットＮＤＰＫαおよび
βアイソフォームの機能の解明に役立つ。更に、これら
モノクローナル抗体がヒトＮＤＰＫアイソフォームの検
出にも応用できれば、癌の転移、心筋梗塞等のヒトのの
疾患の診断にも有用である。ヒトのＮＤＰＫと同一もし
くは類似した分子と推定されているｎｍ２３に対するポ
リクローナル抗体およびアイソフォーム特異的モノクロ
ーナル抗体に関しては、ＮＤＰＫに対する詳細な特異性
は不明であり、ヒトの種々の疾患の診断に有用であるか
否かはわからない。
トＮＤＰＫの二つのアイソフォームを認識するポリクロ
ーナル抗体はそれぞれのアイソフォームを識別すること
はできず、また、αアイソフォームに特異的なモノクロ
ーナル抗体はウエスタンブロッティングや酵素免疫定量
法でラットＮＤＰＫαアイソフォームと反応することは
可能だが、細胞および組織の免疫染色には用いることが
できないため、応用範囲が限られている。ラットＮＤＰ
Ｋαおよびβアイソフォームを識別でき、ウエスタンブ
ロッティングや酵素免疫定量法ばかりでなく、細胞およ
び組織の免疫染色にも応用可能なモノクローナル抗体が
取得できれば、不明な点の多いラットＮＤＰＫαおよび
βアイソフォームの機能の解明に役立つ。更に、これら
モノクローナル抗体がヒトＮＤＰＫアイソフォームの検
出にも応用できれば、癌の転移、心筋梗塞等のヒトのの
疾患の診断にも有用である。ヒトのＮＤＰＫと同一もし
くは類似した分子と推定されているｎｍ２３に対するポ
リクローナル抗体およびアイソフォーム特異的モノクロ
ーナル抗体に関しては、ＮＤＰＫに対する詳細な特異性
は不明であり、ヒトの種々の疾患の診断に有用であるか
否かはわからない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ラットＮＤＰ
ＫのＮ末アミノ酸から８６〜１０４番目に存在するエピ
トープを認識するモノクローナル抗体、ラットＮＤＰＫ
αアイソフォームのＮ末アミノ酸から１４１〜１５２番
目に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗
体、ラットＮＤＰＫβアイソフォームのＮ末アミノ酸か
ら１４１〜１５２番目に存在するエピトープを認識する
モノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリド
ーマに関する。
ＫのＮ末アミノ酸から８６〜１０４番目に存在するエピ
トープを認識するモノクローナル抗体、ラットＮＤＰＫ
αアイソフォームのＮ末アミノ酸から１４１〜１５２番
目に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗
体、ラットＮＤＰＫβアイソフォームのＮ末アミノ酸か
ら１４１〜１５２番目に存在するエピトープを認識する
モノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリド
ーマに関する。
【０００６】本発明のラットＮＤＰＫに対するモノクロ
ーナル抗体の製造法を以下に示す。ラットＮＤＰＫをコ
ードする遺伝子から明かとなったラットＮＤＰＫのアミ
ノ酸配列〔J. Biol. Chem., 265, 15744-15749（199
0）、J. Biol. Chem., 267, 14366-14372（1992) 〕を
もとに、αアイソフォーム特異的、βアイソフォーム特
異的、αβ共通の配列を見いだし、それに相当するペプ
チドを合成する。一般に、選択されたある配列をもとに
合成したペプチドを抗原とした場合、もとのタンパクと
特異的に反応するモノクローナル抗体が必ず得られると
は限らないため、目的とするモノクローナル抗体を取得
するためには、複数の抗原ペプチドを合成する必要があ
る〔Acta. Pathol. Jpn., 37, 1135 (1987)〕。
ーナル抗体の製造法を以下に示す。ラットＮＤＰＫをコ
ードする遺伝子から明かとなったラットＮＤＰＫのアミ
ノ酸配列〔J. Biol. Chem., 265, 15744-15749（199
0）、J. Biol. Chem., 267, 14366-14372（1992) 〕を
もとに、αアイソフォーム特異的、βアイソフォーム特
異的、αβ共通の配列を見いだし、それに相当するペプ
チドを合成する。一般に、選択されたある配列をもとに
合成したペプチドを抗原とした場合、もとのタンパクと
特異的に反応するモノクローナル抗体が必ず得られると
は限らないため、目的とするモノクローナル抗体を取得
するためには、複数の抗原ペプチドを合成する必要があ
る〔Acta. Pathol. Jpn., 37, 1135 (1987)〕。
【０００７】合成したペプチドで免疫した動物の脾細胞
と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドー
マを作製し、該ペプチドに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、該ハイブリド
ーマを培地中に培養するか動物に投与して腹水癌化し、
培養上清または腹水を採取することによりモノクローナ
ル抗体を得る。本方法によりＩｇＧあるいはＩｇＭのす
べてのサブクラスのモノクローナル抗体を取得可能であ
る。得られた該モノクローナル抗体のサブクラスの決定
はペプチドで免疫した動物に対する抗体のタイピングキ
ットを用いて決定する。また該モノクローナル抗体がα
またはβアイソフォームを識別して認識することの可能
な抗体であるか、あるいは両アイソフォームと等しく反
応する抗体であるかを、酵素免疫定量法、ドットブロッ
ティング法により確認する。さらに、これらのモノクロ
ーナル抗体がヒトＮＤＰＫの検出にも応用可能であるこ
とをウエスタンブロッティング法で確認する。
と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドー
マを作製し、該ペプチドに特異的に反応するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、該ハイブリド
ーマを培地中に培養するか動物に投与して腹水癌化し、
培養上清または腹水を採取することによりモノクローナ
ル抗体を得る。本方法によりＩｇＧあるいはＩｇＭのす
べてのサブクラスのモノクローナル抗体を取得可能であ
る。得られた該モノクローナル抗体のサブクラスの決定
はペプチドで免疫した動物に対する抗体のタイピングキ
ットを用いて決定する。また該モノクローナル抗体がα
またはβアイソフォームを識別して認識することの可能
な抗体であるか、あるいは両アイソフォームと等しく反
応する抗体であるかを、酵素免疫定量法、ドットブロッ
ティング法により確認する。さらに、これらのモノクロ
ーナル抗体がヒトＮＤＰＫの検出にも応用可能であるこ
とをウエスタンブロッティング法で確認する。
【０００８】このようにして得られるモノクローナル抗
体は、ラットＮＤＰＫαおよびβアイソフォームの機能
解明および癌の転移、心筋梗塞等のヒトの疾患の診断に
有用である。以下に本発明を詳細に説明する。 （１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 抗原として用いるペプチドの合成は特開平０６−００７
１９２等の方法に準じて実施することができる。即ち、
ペプチド自動合成機を用いた固相法により合成し、固相
担体に結合したペプチドを、フッ化水素、トリフルオロ
酢酸／チオアニソール／エタンジチオール（９０：５：
５）混合液またはトリフルオロ酢酸／水／チオアニソー
ル／エタンジチオール／エチルメチルサルファイド／チ
オフェノール（８２．５：５：５：２．５：３：２）混
合液等を用い遊離させると同時にアミノ酸側鎖の保護基
を除去する。得られたペプチドの粗生成物は、逆相系カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰ
ＬＣと略す。）で精製し、抗原ペプチドとして用いる。
体は、ラットＮＤＰＫαおよびβアイソフォームの機能
解明および癌の転移、心筋梗塞等のヒトの疾患の診断に
有用である。以下に本発明を詳細に説明する。 （１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 抗原として用いるペプチドの合成は特開平０６−００７
１９２等の方法に準じて実施することができる。即ち、
ペプチド自動合成機を用いた固相法により合成し、固相
担体に結合したペプチドを、フッ化水素、トリフルオロ
酢酸／チオアニソール／エタンジチオール（９０：５：
５）混合液またはトリフルオロ酢酸／水／チオアニソー
ル／エタンジチオール／エチルメチルサルファイド／チ
オフェノール（８２．５：５：５：２．５：３：２）混
合液等を用い遊離させると同時にアミノ酸側鎖の保護基
を除去する。得られたペプチドの粗生成物は、逆相系カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰ
ＬＣと略す。）で精製し、抗原ペプチドとして用いる。
【０００９】抗原として用いる合成ペプチドの例として
は、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列より
なるペプチド、配列番号１、２または３に記載のアミノ
酸配列を含有する３０アミノ酸残基以下のペプチドまた
はこれらペプチドのＣ末端にＣｙｓを結合させたアミノ
酸配列よりなるペプチド等をあげることができる。合成
した抗原ペプチドを、キーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（以下、ＫＬＨと略す。）、ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す。）、サイログロブリン（以下、
ＴＨＹと略す。）、卵白アルブミンまたはヒト血清アル
ブミンなどのキャリア蛋白質と、グルタールアルデヒド
やｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサク
シル（以下、ＭＢＳと略す。）などの架橋剤を用いて公
知の方法〔Cell, 28, 477 (1982)等〕に準じて結合させ
抗原・キャリア蛋白複合体を作成し、免疫原として用い
る。
は、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列より
なるペプチド、配列番号１、２または３に記載のアミノ
酸配列を含有する３０アミノ酸残基以下のペプチドまた
はこれらペプチドのＣ末端にＣｙｓを結合させたアミノ
酸配列よりなるペプチド等をあげることができる。合成
した抗原ペプチドを、キーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（以下、ＫＬＨと略す。）、ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す。）、サイログロブリン（以下、
ＴＨＹと略す。）、卵白アルブミンまたはヒト血清アル
ブミンなどのキャリア蛋白質と、グルタールアルデヒド
やｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサク
シル（以下、ＭＢＳと略す。）などの架橋剤を用いて公
知の方法〔Cell, 28, 477 (1982)等〕に準じて結合させ
抗原・キャリア蛋白複合体を作成し、免疫原として用い
る。
【００１０】免疫原を、３〜２０週令のマウスまたはハ
ムスターに、５０〜１００μｇ／匹で、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例
えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水
酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕と共に
投与する。
ムスターに、５０〜１００μｇ／匹で、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例
えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水
酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕と共に
投与する。
【００１１】免疫原の投与は、１回目の投与の後１〜２
週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底
静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵
素免疫定量法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学
書院刊 １９７６年〕などで調べる。免疫原として用い
たペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマ
ウスまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として供
する。
週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底
静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵
素免疫定量法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学
書院刊 １９７６年〕などで調べる。免疫原として用い
たペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマ
ウスまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として供
する。
【００１２】脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあた
って、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫した動
物より脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ
培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐ
し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）した後、上清を
捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６
５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で
３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
って、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫した動
物より脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓をＭＥＭ
培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐ
し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）した後、上清を
捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６
５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で
３回洗浄して融合用脾細胞として提供する。
【００１３】（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａ
ｌｂ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔Current Topics in Microbiology and
Immunology, 18, 1-7 (1978) 、European J. Immunolo
gy, 6, 511-519 (1976)〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓ
Ｐ−２）〔Nature, 276, 269-270 (1978)〕、Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔J. Immunology, 123,
1548-1550 (1979)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
〔Nature, 256, 495-497 (1975)〕などが用いられる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−
１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカ
プトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン
（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＣＳＬ社製、１
０％）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さ
らに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培
地〕で継代するが、ハイブリドーマの作成のために行う
細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、細胞融合当
日２×１０7個以上の細胞数を確保する。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａ
ｌｂ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔Current Topics in Microbiology and
Immunology, 18, 1-7 (1978) 、European J. Immunolo
gy, 6, 511-519 (1976)〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓ
Ｐ−２）〔Nature, 276, 269-270 (1978)〕、Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔J. Immunology, 123,
1548-1550 (1979)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
〔Nature, 256, 495-497 (1975)〕などが用いられる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−
１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカ
プトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン
（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＣＳＬ社製、１
０％）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さ
らに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培
地〕で継代するが、ハイブリドーマの作成のために行う
細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、細胞融合当
日２×１０7個以上の細胞数を確保する。
【００１４】（３）ハイブリドーマの作成 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ緩衝液（リン酸水素二
ナトリウム １．８３ｇ、リン酸二水素カリウム ０．２
１ｇおよび塩化ナトリウム ７．６５ｇを蒸留水に溶か
し１リットルとした緩衝液、ｐＨ７．２）でよく洗浄
し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：
１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５
分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコー
ル−１，０００（以下、ＰＥＧ−１，０００と略す。）
２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド ０．
７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０8抗体産生細胞を加
え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた
後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌとなるように調
製する。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨
て、沈殿した細胞をゆるやかにほぐした後、メスピペッ
トによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地
〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン
（１．５×１０-5Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０
-7Ｍ ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ緩衝液（リン酸水素二
ナトリウム １．８３ｇ、リン酸二水素カリウム ０．２
１ｇおよび塩化ナトリウム ７．６５ｇを蒸留水に溶か
し１リットルとした緩衝液、ｐＨ７．２）でよく洗浄
し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：
１になるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５
分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコー
ル−１，０００（以下、ＰＥＧ−１，０００と略す。）
２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド ０．
７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０8抗体産生細胞を加
え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた
後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌとなるように調
製する。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨
て、沈殿した細胞をゆるやかにほぐした後、メスピペッ
トによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地
〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン
（１．５×１０-5Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０
-7Ｍ ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
【００１５】この懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清
の一部をとり酵素免疫定量法（酵素免疫測定法）等によ
り、免疫に用いた抗原ペプチドに対し特異的に反応する
抗体を産生するハイブリドーマ株を選択する。ついで、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目
は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた
培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強
い抗体価の認められたものを抗ラットＮＤＰＫαアイソ
フォームモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株、抗
ラットＮＤＰＫβアイソフォームモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ株または抗ラットＮＤＰＫモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清
の一部をとり酵素免疫定量法（酵素免疫測定法）等によ
り、免疫に用いた抗原ペプチドに対し特異的に反応する
抗体を産生するハイブリドーマ株を選択する。ついで、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目
は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた
培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強
い抗体価の認められたものを抗ラットＮＤＰＫαアイソ
フォームモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株、抗
ラットＮＤＰＫβアイソフォームモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ株または抗ラットＮＤＰＫモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００１６】当該抗ラットＮＤＰＫαアイソフォームモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の具
体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２０およ
びＫＭ１１２１等を、抗ラットＮＤＰＫβアイソフォー
ム抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の具体例として
は、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０９９およびＫＭ１１
０３等を、抗ラットＮＤＰＫαアイソフォームとβアイ
ソフォームに共通して反応するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株の具体例としては、ハイブ
リドーマ細胞株ＫＭ１１７８等をあげることができる。
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２１、ＫＭ１０９９およ
びＫＭ１１７８は平成７年３月１６日付で工業技術院生
命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５０
３７、ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３６、ＦＥＲＭ ＢＰ−５
０３８として寄託されている。
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の具
体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２０およ
びＫＭ１１２１等を、抗ラットＮＤＰＫβアイソフォー
ム抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の具体例として
は、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０９９およびＫＭ１１
０３等を、抗ラットＮＤＰＫαアイソフォームとβアイ
ソフォームに共通して反応するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株の具体例としては、ハイブ
リドーマ細胞株ＫＭ１１７８等をあげることができる。
ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２１、ＫＭ１０９９およ
びＫＭ１１７８は平成７年３月１６日付で工業技術院生
命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５０
３７、ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３６、ＦＥＲＭ ＢＰ−５
０３８として寄託されている。
【００１７】（４）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（３）で得られた抗ＮＤＰＫαアイ
ソフォームモノクローナル抗体、抗ＮＤＰＫβアイソフ
ォームモノクローナル抗体または抗ＮＤＰＫモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０6〜２×１０7
細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去
後、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプ
リル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテ
インＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムに通塔し、Ｉｇ
ＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体
とする。
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（３）で得られた抗ＮＤＰＫαアイ
ソフォームモノクローナル抗体、抗ＮＤＰＫβアイソフ
ォームモノクローナル抗体または抗ＮＤＰＫモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０6〜２×１０7
細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去
後、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプ
リル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテ
インＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムに通塔し、Ｉｇ
ＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体
とする。
【００１８】抗体のサブクラスの決定は、免疫の用いた
動物に対する抗体のタイピングキット、例えばマウスモ
ノクローナル抗体タイピングキット等を用いて酵素免疫
測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および
２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
動物に対する抗体のタイピングキット、例えばマウスモ
ノクローナル抗体タイピングキット等を用いて酵素免疫
測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および
２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【００１９】（５）ドットブロッティングを利用したモ
ノクローナル抗体の特異性の確認 （３）で選択されたモノクローナル抗体の反応特異性の
確認をドットブロッティングにより行う。大腸菌で発現
したラットＮＤＰＫαアイソフォームおよびラットＮＤ
ＰＫβアイソフォーム〔Biochim. Biophys. Acta., 120
5, 113-122(1994)〕をニトロセルロース膜へ吸着させ、
スキムミルクやＢＳＡ溶液などでブロッキング後、上記
（１）で取得したハイブリドーマ細胞培養上清または
（３）で取得した精製抗体を希釈し０．１〜１０μｇ／
ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、室温で１〜２時間ま
たは４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ緩衝液またはＴｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した後、上記
（１）で免疫に用いた動物種と同じ動物のイムノグロブ
リンに対する抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あ
るいは放射線化合物等で標識し調製した第二抗体０．１
〜５０μｇ／ｍｌを添加し、室温で１〜２時間反応させ
る。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に相応した反
応を行ない、モノクローナル抗体がラットＮＤＰＫの各
アイソフォームと反応することを確認する。
ノクローナル抗体の特異性の確認 （３）で選択されたモノクローナル抗体の反応特異性の
確認をドットブロッティングにより行う。大腸菌で発現
したラットＮＤＰＫαアイソフォームおよびラットＮＤ
ＰＫβアイソフォーム〔Biochim. Biophys. Acta., 120
5, 113-122(1994)〕をニトロセルロース膜へ吸着させ、
スキムミルクやＢＳＡ溶液などでブロッキング後、上記
（１）で取得したハイブリドーマ細胞培養上清または
（３）で取得した精製抗体を希釈し０．１〜１０μｇ／
ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、室温で１〜２時間ま
たは４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ緩衝液またはＴｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した後、上記
（１）で免疫に用いた動物種と同じ動物のイムノグロブ
リンに対する抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あ
るいは放射線化合物等で標識し調製した第二抗体０．１
〜５０μｇ／ｍｌを添加し、室温で１〜２時間反応させ
る。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に相応した反
応を行ない、モノクローナル抗体がラットＮＤＰＫの各
アイソフォームと反応することを確認する。
【００２０】（６）ウエスタンブロッティングを利用し
たＮＤＰＫとの反応性の検討 （３）で選択されたモノクローナル抗体のラットＮＤＰ
ＫまたはヒトＮＤＰＫとの反応性の確認をウェスタンブ
ロッティングにより行なう。ラット癌細胞またはヒト癌
細胞〔ATCC Catalogue of cell lines & Hybridomas, 7
th edition (1992)〕を界面活性剤を含む可溶化緩衝液
により可溶化し、遠心して核や細胞小器官を除いた細胞
抽出液を得る。次いで、得られた細胞抽出液に含まれる
蛋白質１〜１０μｇをドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと
略す。）により分離する。分離された蛋白質をＰＶＤＦ
膜にブロッティングし、スキムミルクやＢＳＡ溶液など
でブロッキング後、上記（１）で取得したハイブリドー
マ細胞培養上清または（３）で取得した精製抗体を希釈
し０．１〜１０μｇ／ｍｌに調製した抗体溶液を添加
し、室温で１〜２時間または４℃で一晩反応させる。
たＮＤＰＫとの反応性の検討 （３）で選択されたモノクローナル抗体のラットＮＤＰ
ＫまたはヒトＮＤＰＫとの反応性の確認をウェスタンブ
ロッティングにより行なう。ラット癌細胞またはヒト癌
細胞〔ATCC Catalogue of cell lines & Hybridomas, 7
th edition (1992)〕を界面活性剤を含む可溶化緩衝液
により可溶化し、遠心して核や細胞小器官を除いた細胞
抽出液を得る。次いで、得られた細胞抽出液に含まれる
蛋白質１〜１０μｇをドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと
略す。）により分離する。分離された蛋白質をＰＶＤＦ
膜にブロッティングし、スキムミルクやＢＳＡ溶液など
でブロッキング後、上記（１）で取得したハイブリドー
マ細胞培養上清または（３）で取得した精製抗体を希釈
し０．１〜１０μｇ／ｍｌに調製した抗体溶液を添加
し、室温で１〜２時間または４℃で一晩反応させる。
【００２１】ＰＢＳ緩衝液またはＴｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した後、上記（１）で免疫に用
いた動物種と同じ動物のイムノグロブリンに対する抗体
を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合
物等で標識し調製した第二抗体０．１〜５０μｇ／ｍｌ
を添加し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した
後、第二抗体の標識物質に相応した反応を行ない、モノ
クローナル抗体がラットＮＤＰＫまたはヒトＮＤＰＫと
反応することを確認する。
ＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した後、上記（１）で免疫に用
いた動物種と同じ動物のイムノグロブリンに対する抗体
を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合
物等で標識し調製した第二抗体０．１〜５０μｇ／ｍｌ
を添加し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した
後、第二抗体の標識物質に相応した反応を行ない、モノ
クローナル抗体がラットＮＤＰＫまたはヒトＮＤＰＫと
反応することを確認する。
【００２２】（７）抗ＮＤＰＫモノクローナル抗体を用
いた免疫組織染色 ラット癌組織またはヒト癌組織を、１０％中性緩衝ホル
ムアルデヒド液（ナカライテスク社製）で３日〜１週間
固定、パラフィン包埋後、ミクロトームを用いて薄切標
本を作製する。一方、新鮮組織を用いる場合は、液体窒
素で急速凍結した組織をクリオスタットを用いて薄切
し、組織切片を作製する。該切片をスライドグラス上に
とり、冷却したアセトンを用いて１０分間、あるいは４
％パラホルムアルデヒド液を用いて１０〜３０分間固定
する。１０％第二抗体と同種動物の正常血清を用いて１
０〜３０分間ブロッキングする。ブロッキング後、
（３）で得られた精製モノクローナル抗体（１〜４０μ
ｇ／ｍｌ）と室温で１時間反応させる。反応後、該切片
をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、上記（１）で免疫に用いた動
物種と同じ動物のイムノグロブリンに対する抗体を、ビ
オチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で
標識し調製した第二抗体０．１〜５０μｇ／ｍｌを添加
し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第
二抗体の標識物質に相応した反応を行なう。反応後、該
切片を封入し、顕微鏡で観察する。
いた免疫組織染色 ラット癌組織またはヒト癌組織を、１０％中性緩衝ホル
ムアルデヒド液（ナカライテスク社製）で３日〜１週間
固定、パラフィン包埋後、ミクロトームを用いて薄切標
本を作製する。一方、新鮮組織を用いる場合は、液体窒
素で急速凍結した組織をクリオスタットを用いて薄切
し、組織切片を作製する。該切片をスライドグラス上に
とり、冷却したアセトンを用いて１０分間、あるいは４
％パラホルムアルデヒド液を用いて１０〜３０分間固定
する。１０％第二抗体と同種動物の正常血清を用いて１
０〜３０分間ブロッキングする。ブロッキング後、
（３）で得られた精製モノクローナル抗体（１〜４０μ
ｇ／ｍｌ）と室温で１時間反応させる。反応後、該切片
をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、上記（１）で免疫に用いた動
物種と同じ動物のイムノグロブリンに対する抗体を、ビ
オチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で
標識し調製した第二抗体０．１〜５０μｇ／ｍｌを添加
し、室温で１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第
二抗体の標識物質に相応した反応を行なう。反応後、該
切片を封入し、顕微鏡で観察する。
【００２３】
実施例１ （１）抗原ペプチドの合成 ラットＮＤＰＫαアイソフォームのＮ末アミノ酸から１
４１〜１５２番目に存在する、配列番号１で示されたア
ミノ酸配列と同じ配列を有するペプチドＰＥＰ１、ラッ
トＮＤＰＫβアイソフォームのＮ末アミノ酸から１４１
〜１５２番目に存在する、配列番号２で示されたアミノ
酸配列と同じ配列を有するペプチドＰＥＰ２、ラットＮ
ＤＰＫのＮ末アミノ酸から８６〜１０４番目に存在す
る、配列番号３で示されたアミノ酸配列のＣ末にシステ
インを結合させた配列を有するペプチドＰＥＰ３を、特
開平０６−００７１９２に記載された方法に準じて合成
および精製を行い、取得した。
４１〜１５２番目に存在する、配列番号１で示されたア
ミノ酸配列と同じ配列を有するペプチドＰＥＰ１、ラッ
トＮＤＰＫβアイソフォームのＮ末アミノ酸から１４１
〜１５２番目に存在する、配列番号２で示されたアミノ
酸配列と同じ配列を有するペプチドＰＥＰ２、ラットＮ
ＤＰＫのＮ末アミノ酸から８６〜１０４番目に存在す
る、配列番号３で示されたアミノ酸配列のＣ末にシステ
インを結合させた配列を有するペプチドＰＥＰ３を、特
開平０６−００７１９２に記載された方法に準じて合成
および精製を行い、取得した。
【００２４】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 実施例１（１）で作製した合成ペプチドＰＥＰ１〜ＰＥ
Ｐ３を、動物の免疫および抗体産生細胞のスクリーニン
グに用いた。各合成ペプチドは、免疫原性を高める目的
でＭＢＳを架橋剤としてＫＬＨ（CALBIOCHEM社製）と結
合させ、免疫原として利用した。
Ｐ３を、動物の免疫および抗体産生細胞のスクリーニン
グに用いた。各合成ペプチドは、免疫原性を高める目的
でＭＢＳを架橋剤としてＫＬＨ（CALBIOCHEM社製）と結
合させ、免疫原として利用した。
【００２５】以下に免疫原作製方法を示す。ＫＬＨをＰ
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして１０ｍｇ／ｍｌに
調製し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ ＭＢＳを滴下
し、室温で３０分間攪拌する。攪拌後、あらかじめＰＢ
Ｓ緩衝液で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カ
ラムに通塔し、未反応のＭＢＳを除く。得られたＫＬＨ
−ＭＢＳ複合体２．５ｍｇとＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解したＰＥＰ１、ＰＥＰ２またはＰＥＰ３合成
ペプチド１ｍｇとを混合し、室温で３時間攪拌した。攪
拌後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液で透
析し、これを免疫原として用いた。
ＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして１０ｍｇ／ｍｌに
調製し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ ＭＢＳを滴下
し、室温で３０分間攪拌する。攪拌後、あらかじめＰＢ
Ｓ緩衝液で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カ
ラムに通塔し、未反応のＭＢＳを除く。得られたＫＬＨ
−ＭＢＳ複合体２．５ｍｇとＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解したＰＥＰ１、ＰＥＰ２またはＰＥＰ３合成
ペプチド１ｍｇとを混合し、室温で３時間攪拌した。攪
拌後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液で透
析し、これを免疫原として用いた。
【００２６】該各免疫原１００μｇを、初回のみアルミ
ニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研
究所製）１×１０9細胞とともに５週令雌マウス（Ｓ
Ｄ）に投与し、２週間後から、該各免疫原１００μｇを
１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血
し、その血清抗体価を、後述の実施例１（３）に示す酵
素免疫測定法で調べ、充分な抗体価を示したマウスから
最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
ニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研
究所製）１×１０9細胞とともに５週令雌マウス（Ｓ
Ｄ）に投与し、２週間後から、該各免疫原１００μｇを
１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血
し、その血清抗体価を、後述の実施例１（３）に示す酵
素免疫測定法で調べ、充分な抗体価を示したマウスから
最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
【００２７】脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐ
ｍ、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球
を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用い
た。
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐ
ｍ、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球
を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用い
た。
【００２８】（３）酵素免疫測定法 実施例１（１）で作成し免疫に用いた合成ペプチド１ｍ
ｇを０．１Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶かし、同じ組成の緩衝液に溶かしておいたＴＨＹ５
ｍｇを加え、１ｍｌにする。攪拌下、０．０２Ｍ グル
タールアルデヒド５４０μｌを滴下し、室温で５時間攪
拌反応させる。反応後、ＰＢＳ緩衝液で一晩透析し、各
ＴＨＹ−合成ペプチド複合体を作成した。測定対象の抗
体に対応するＴＨＹ−合成ペプチド複合体をポジティブ
抗原とし、他のＴＨＹ−合成ペプチド複合体をネガティ
ブ抗原として酵素免疫測定法に用いた。
ｇを０．１Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶かし、同じ組成の緩衝液に溶かしておいたＴＨＹ５
ｍｇを加え、１ｍｌにする。攪拌下、０．０２Ｍ グル
タールアルデヒド５４０μｌを滴下し、室温で５時間攪
拌反応させる。反応後、ＰＢＳ緩衝液で一晩透析し、各
ＴＨＹ−合成ペプチド複合体を作成した。測定対象の抗
体に対応するＴＨＹ−合成ペプチド複合体をポジティブ
抗原とし、他のＴＨＹ−合成ペプチド複合体をネガティ
ブ抗原として酵素免疫測定法に用いた。
【００２９】９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー
社）に、上述で作製した１０〜１００μｇ／ｍｌのＴＨ
Ｙ−合成ペプチド複合体（ポジティブ抗原）または別の
ＴＨＹ−合成ペプチド複合体（ネガティブ抗原）を５０
μｌ／穴で分注し、４℃で一晩放置した。洗浄後、１％
ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと略
す。）を１００〜２００μｌ／穴分注し、室温１〜２時
間または、４℃で１〜２晩放置した。放置後、ＢＳＡ−
ＰＢＳを捨て、ＰＢＳ緩衝液でよく洗浄し、マウス眼底
静脈叢より採血し取得した血清をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈
し調製した第一抗体を２０〜１００μｌ／穴で分注し、
室温で２時間または、４℃で一晩放置した。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ−0.
05Ｔｗｅｅｎと略す。）で洗浄後、第二抗体としてペル
オキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（Ｄ
ＡＫＯ社製）を５０〜１００μｌ／穴分注し、室温で１
〜２時間放置した。ＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
ＡＢＴＳ基質液〔２，２’−アジノビス（３−エチルベ
ンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム５５０
ｍｇを０．１Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リッ
トルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／
ｍｌを加えた溶液〕を用いて発色させ、ＯＤ41 5nmの吸
光度を測定した（ＮＪ２００１；日本インターメッド
社）。
社）に、上述で作製した１０〜１００μｇ／ｍｌのＴＨ
Ｙ−合成ペプチド複合体（ポジティブ抗原）または別の
ＴＨＹ−合成ペプチド複合体（ネガティブ抗原）を５０
μｌ／穴で分注し、４℃で一晩放置した。洗浄後、１％
ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと略
す。）を１００〜２００μｌ／穴分注し、室温１〜２時
間または、４℃で１〜２晩放置した。放置後、ＢＳＡ−
ＰＢＳを捨て、ＰＢＳ緩衝液でよく洗浄し、マウス眼底
静脈叢より採血し取得した血清をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈
し調製した第一抗体を２０〜１００μｌ／穴で分注し、
室温で２時間または、４℃で一晩放置した。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ−0.
05Ｔｗｅｅｎと略す。）で洗浄後、第二抗体としてペル
オキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（Ｄ
ＡＫＯ社製）を５０〜１００μｌ／穴分注し、室温で１
〜２時間放置した。ＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎで洗浄後、
ＡＢＴＳ基質液〔２，２’−アジノビス（３−エチルベ
ンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム５５０
ｍｇを０．１Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リッ
トルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／
ｍｌを加えた溶液〕を用いて発色させ、ＯＤ41 5nmの吸
光度を測定した（ＮＪ２００１；日本インターメッド
社）。
【００３０】（４）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。
【００３１】（５）ハイブリドーマの作製 実施例１（２）で得られたマウス脾細胞と実施例１
（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混
合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）した後、上
清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しな
がら、３７℃で、２ｇのＰＥＧ−１，０００、ＭＥＭ培
地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌを混合
した混液に０．２〜１ｍｌ／１０8マウス脾細胞を加
え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた
後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌとなるように調
製した。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨
て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる
吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍ
ｌ中に懸濁した。
（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混
合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）した後、上
清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しな
がら、３７℃で、２ｇのＰＥＧ−１，０００、ＭＥＭ培
地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌを混合
した混液に０．２〜１ｍｌ／１０8マウス脾細胞を加
え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた
後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌとなるように調
製した。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨
て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる
吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍ
ｌ中に懸濁した。
【００３２】この懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2、３７℃のインキュ
ベーター中で１０〜１４日間培養した。得られたハイブ
リドーマ培養上清のＢＳＡ−ＰＢＳ希釈液を第一抗体と
して用い、実施例１（３）に記載した方法に準じ、酵素
免疫測定を実施し、免疫に用いた抗原ペプチドに特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選び、さらにＨＴ培地を正常培地に換え、限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して、抗ラットＮＤ
ＰＫモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を
確立した。
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2、３７℃のインキュ
ベーター中で１０〜１４日間培養した。得られたハイブ
リドーマ培養上清のＢＳＡ−ＰＢＳ希釈液を第一抗体と
して用い、実施例１（３）に記載した方法に準じ、酵素
免疫測定を実施し、免疫に用いた抗原ペプチドに特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選び、さらにＨＴ培地を正常培地に換え、限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して、抗ラットＮＤ
ＰＫモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を
確立した。
【００３３】その結果αアイソフォーム特異的モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２
０およびＫＭ１１２１、βアイソフォーム特異的モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０
９９およびＫＭ１１０３、α、βアイソフォームに共通
して反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞株ＫＭ１１７８を取得した。産生された抗体の
サブクラスをマウスモノクローナル抗体タイピングキッ
トを用いた酵素免疫測定法により決定した結果、すべて
ＩｇＧ１に属していた。
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２
０およびＫＭ１１２１、βアイソフォーム特異的モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＫＭ１０
９９およびＫＭ１１０３、α、βアイソフォームに共通
して反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞株ＫＭ１１７８を取得した。産生された抗体の
サブクラスをマウスモノクローナル抗体タイピングキッ
トを用いた酵素免疫測定法により決定した結果、すべて
ＩｇＧ１に属していた。
【００３４】（６）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／
ｃ）に実施例１（３）で得られたハイブリドーマ株を５
〜２０×１０6細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０
〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水の
たまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）
し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を
除去した後、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）
により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
ｃ）に実施例１（３）で得られたハイブリドーマ株を５
〜２０×１０6細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０
〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水の
たまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）
し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を
除去した後、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）
により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
【００３５】（７）ドットブロッティングを利用したモ
ノクローナル抗体の特異性の確認 実施例１（５）で選択されたモノクローナル抗体の反応
特異性の確認をドットブロッティングにより行った。大
腸菌で発現したラットＮＤＰＫαアイソフォームおよび
ラットＮＤＰＫβアイソフォーム〔Biochim. Biophys.
Acta., 1205, 113-122(1994)〕をニトロセルロース膜へ
吸着させ、１０％スキムミルク溶液でブロッキング後、
実施例１（６）で取得した精製抗体を希釈し０．１μｇ
／ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、室温で１時間反応
させた。該ニトロセルロース膜を０．０８％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ−0.08Ｔｗｅｅ
ｎと略す。）でよく洗浄した後、第二抗体としてペルオ
キシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemic
on社）０．２μｇ／ｍｌを添加し、室温で１時間反応さ
せた。該ニトロセルロース膜をＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎ
でよく洗浄後、洗浄液を除去し、ＥＣＬ試薬（Amersham
社製のウエスタンブロッティング検出キット）を添加し
た。
ノクローナル抗体の特異性の確認 実施例１（５）で選択されたモノクローナル抗体の反応
特異性の確認をドットブロッティングにより行った。大
腸菌で発現したラットＮＤＰＫαアイソフォームおよび
ラットＮＤＰＫβアイソフォーム〔Biochim. Biophys.
Acta., 1205, 113-122(1994)〕をニトロセルロース膜へ
吸着させ、１０％スキムミルク溶液でブロッキング後、
実施例１（６）で取得した精製抗体を希釈し０．１μｇ
／ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、室温で１時間反応
させた。該ニトロセルロース膜を０．０８％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ−0.08Ｔｗｅｅ
ｎと略す。）でよく洗浄した後、第二抗体としてペルオ
キシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemic
on社）０．２μｇ／ｍｌを添加し、室温で１時間反応さ
せた。該ニトロセルロース膜をＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎ
でよく洗浄後、洗浄液を除去し、ＥＣＬ試薬（Amersham
社製のウエスタンブロッティング検出キット）を添加し
た。
【００３６】１分後余分な試薬を除去し、フィルムを感
光（１０秒〜２分程度）させ検出した。第１表に示すよ
うに、モノクローナル抗体ＫＭ１１７８はラットＮＤＰ
Ｋのαおよびβアイソフォームを認識し、モノクローナ
ル抗体ＫＭ１１２１およびＫＭ１１２０はラットＮＤＰ
Ｋのαアイソフォームのみ認識し、βアイソフォームは
認識せず、モノクローナル抗体ＫＭ１１０３およびＫＭ
１０９９はラットＮＤＰＫのβアイソフォームのみ認識
し、αアイソフォームは認識しなかった。従来のポリク
ローナル抗体ＮＫ−２はラットＮＤＰＫのαおよびβア
イソフォームを認識した。
光（１０秒〜２分程度）させ検出した。第１表に示すよ
うに、モノクローナル抗体ＫＭ１１７８はラットＮＤＰ
Ｋのαおよびβアイソフォームを認識し、モノクローナ
ル抗体ＫＭ１１２１およびＫＭ１１２０はラットＮＤＰ
Ｋのαアイソフォームのみ認識し、βアイソフォームは
認識せず、モノクローナル抗体ＫＭ１１０３およびＫＭ
１０９９はラットＮＤＰＫのβアイソフォームのみ認識
し、αアイソフォームは認識しなかった。従来のポリク
ローナル抗体ＮＫ−２はラットＮＤＰＫのαおよびβア
イソフォームを認識した。
【００３７】
【表１】
【００３８】実施例２ ウエスタンブロッティングを利
用したヒトＮＤＰＫとの反応性の検討 実施例１（５）で選択されたモノクローナル抗体のヒト
ＮＤＰＫとの反応性の確認をウェスタンブロッティング
で行なった。ヒト癌細胞（U937：ヒト白血病細胞、THP-
１：ヒト白血病細胞、WiDr：ヒト大腸癌、QG90：ヒト肺
小細胞癌、HL60：ヒト白血病細胞、KATOIII：ヒト胃癌
細胞）106個に界面活性剤を含む可溶化緩衝液（０．５
％シュクロースモノラウリン酸、０．２５Ｍ シュクロ
ース、１０ｍＭ トリス塩酸、２ｍＭ 塩化マグネシュウ
ム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４）を
添加し、０℃で３０分間攪拌後、遠心分離（１５，００
０ｒｐｍ、２０分間）し、核や細胞小器官を除いた細胞
抽出液を取得した。得られた該細胞抽出液中の蛋白質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１４％ ポリアクリルアミドゲル）
により分離後、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）にブロッテ
ィングした。該ＰＶＤＦ膜を１０％スキムミルク溶液で
ブロッキング後、実施例１（６）で取得した精製抗体を
希釈し０．１μｇ／ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、
室温で１時間反応させた。
用したヒトＮＤＰＫとの反応性の検討 実施例１（５）で選択されたモノクローナル抗体のヒト
ＮＤＰＫとの反応性の確認をウェスタンブロッティング
で行なった。ヒト癌細胞（U937：ヒト白血病細胞、THP-
１：ヒト白血病細胞、WiDr：ヒト大腸癌、QG90：ヒト肺
小細胞癌、HL60：ヒト白血病細胞、KATOIII：ヒト胃癌
細胞）106個に界面活性剤を含む可溶化緩衝液（０．５
％シュクロースモノラウリン酸、０．２５Ｍ シュクロ
ース、１０ｍＭ トリス塩酸、２ｍＭ 塩化マグネシュウ
ム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４）を
添加し、０℃で３０分間攪拌後、遠心分離（１５，００
０ｒｐｍ、２０分間）し、核や細胞小器官を除いた細胞
抽出液を取得した。得られた該細胞抽出液中の蛋白質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１４％ ポリアクリルアミドゲル）
により分離後、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）にブロッテ
ィングした。該ＰＶＤＦ膜を１０％スキムミルク溶液で
ブロッキング後、実施例１（６）で取得した精製抗体を
希釈し０．１μｇ／ｍｌに調製した抗体溶液を添加し、
室温で１時間反応させた。
【００３９】該ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−0.08Ｔｗｅｅｎで
よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識
抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemicon社製）０．２
μｇ／ｍｌを添加し、室温で１時間反応させた。該ＰＶ
ＤＦ膜をＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎ緩衝液でよく洗浄後、
洗浄液を除き、ＥＣＬ試薬を添加した。１分後余分な試
薬を除去し、フィルムを感光（１０秒〜２分程度）させ
検出した。図１に示すように、ラットＮＤＰＫのαおよ
びβアイソフォームを認識するモノクローナル抗体ＫＭ
１１７８はヒトＮＤＰＫのＡおよびＢアイソフォームを
認識し、ラットＮＤＰＫのαアイソフォームのみ認識
し、βアイソフォームは認識しないモノクローナル抗体
ＫＭ１１２１およびＫＭ１１２０はヒトＮＤＰＫのＢア
イソフォームのみ認識し、ラットＮＤＰＫのβアイソフ
ォームのみ認識し、αアイソフォームは認識しないモノ
クローナル抗体ＫＭ１１０３およびＫＭ１０９９はヒト
ＮＤＰＫのＡアイソフォームのみを認識し、ヒトＮＤＰ
Ｋアイソフォームの検出に応用可能であることが示唆さ
れた。
よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識
抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemicon社製）０．２
μｇ／ｍｌを添加し、室温で１時間反応させた。該ＰＶ
ＤＦ膜をＰＢＳ−0.05Ｔｗｅｅｎ緩衝液でよく洗浄後、
洗浄液を除き、ＥＣＬ試薬を添加した。１分後余分な試
薬を除去し、フィルムを感光（１０秒〜２分程度）させ
検出した。図１に示すように、ラットＮＤＰＫのαおよ
びβアイソフォームを認識するモノクローナル抗体ＫＭ
１１７８はヒトＮＤＰＫのＡおよびＢアイソフォームを
認識し、ラットＮＤＰＫのαアイソフォームのみ認識
し、βアイソフォームは認識しないモノクローナル抗体
ＫＭ１１２１およびＫＭ１１２０はヒトＮＤＰＫのＢア
イソフォームのみ認識し、ラットＮＤＰＫのβアイソフ
ォームのみ認識し、αアイソフォームは認識しないモノ
クローナル抗体ＫＭ１１０３およびＫＭ１０９９はヒト
ＮＤＰＫのＡアイソフォームのみを認識し、ヒトＮＤＰ
Ｋアイソフォームの検出に応用可能であることが示唆さ
れた。
【００４０】実施例３ 抗ＮＤＰＫモノクローナル抗体
を用いた免疫組織染色 ３ｇのヒト乳癌組織を、１０％中性緩衝ホルムアルデヒ
ド液（ナカライテスク社製）と３日〜１週間固定、パラ
フィン包埋後、ミクロトームを用いて薄切標本を作製し
た。該切片をスライドグラス上にとり、冷却したアセト
ンを用いて１０分間、４％パラホルムアルデヒド液を用
いて１０〜３０分間固定した。１０％ウサギ血清を用い
て１５分間ブロッキングした。ブロッキング後、実施例
１（６）で得られた精製モノクローナル抗体（１μｇ／
ｍｌ）と室温で１時間反応させた。反応後、該切片をＰ
ＢＳ緩衝液で洗浄し、二次抗体（ビオチン標識マウス抗
体、ベクターラボラトリ社製）と１時間室温で反応させ
た。反応後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ベクターラボラトリ社製）と３０分間室温で反応さ
せ、ジアミノベンジディン溶液を用いて発色させた。発
色後、顕微鏡で観察した。結果を第２表に示した。
を用いた免疫組織染色 ３ｇのヒト乳癌組織を、１０％中性緩衝ホルムアルデヒ
ド液（ナカライテスク社製）と３日〜１週間固定、パラ
フィン包埋後、ミクロトームを用いて薄切標本を作製し
た。該切片をスライドグラス上にとり、冷却したアセト
ンを用いて１０分間、４％パラホルムアルデヒド液を用
いて１０〜３０分間固定した。１０％ウサギ血清を用い
て１５分間ブロッキングした。ブロッキング後、実施例
１（６）で得られた精製モノクローナル抗体（１μｇ／
ｍｌ）と室温で１時間反応させた。反応後、該切片をＰ
ＢＳ緩衝液で洗浄し、二次抗体（ビオチン標識マウス抗
体、ベクターラボラトリ社製）と１時間室温で反応させ
た。反応後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ベクターラボラトリ社製）と３０分間室温で反応さ
せ、ジアミノベンジディン溶液を用いて発色させた。発
色後、顕微鏡で観察した。結果を第２表に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、ラットＮＤＰＫαアイ
ソフォームおよびβアイソフォームの機能解明、および
癌の転移、心筋梗塞等のヒトの疾患の診断に有用なラッ
トＮＤＰＫαアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−Ｂア
イソフォームに特異的なモノクローナル抗体、ラットＮ
ＤＰＫβアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−Ａアイソ
フォームに特異的なモノクローナル抗体、またはラット
ＮＤＰＫα、βアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−
Ａ、Ｂアイソフォームを共通に認識するモノクローナル
抗体が提供される。
ソフォームおよびβアイソフォームの機能解明、および
癌の転移、心筋梗塞等のヒトの疾患の診断に有用なラッ
トＮＤＰＫαアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−Ｂア
イソフォームに特異的なモノクローナル抗体、ラットＮ
ＤＰＫβアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−Ａアイソ
フォームに特異的なモノクローナル抗体、またはラット
ＮＤＰＫα、βアイソフォームおよびヒトＮＤＰＫ−
Ａ、Ｂアイソフォームを共通に認識するモノクローナル
抗体が提供される。
【００４３】
【００４４】配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ラット
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ラット
【００４６】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ラット 配列 Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro 1 5 10 15 Gly Thr Ile
【図１】ラットＮＤＰＫαアイソフォーム特異的モノク
ローナル抗体ＫＭ１１２０、ＫＭ１１２１、βアイソフ
ォーム特異的モノクローナル抗体ＫＭ１０９９、ＫＭ１
１０３、およびα、βアイソフォーム共通に反応するモ
ノクローナル抗体ＫＭ１１７８のヒトＮＤＰＫに対する
反応性をヒト癌細胞（U937：ヒト白血病細胞、THP-１：
ヒト白血病細胞、WiDr：ヒト大腸癌、QG90：ヒト肺小細
胞癌、HL60：ヒト白血病細胞、KATOIII：ヒト胃癌細
胞）を用いてウエスタンブロッティングで確認した電気
泳動の写真である。
ローナル抗体ＫＭ１１２０、ＫＭ１１２１、βアイソフ
ォーム特異的モノクローナル抗体ＫＭ１０９９、ＫＭ１
１０３、およびα、βアイソフォーム共通に反応するモ
ノクローナル抗体ＫＭ１１７８のヒトＮＤＰＫに対する
反応性をヒト癌細胞（U937：ヒト白血病細胞、THP-１：
ヒト白血病細胞、WiDr：ヒト大腸癌、QG90：ヒト肺小細
胞癌、HL60：ヒト白血病細胞、KATOIII：ヒト胃癌細
胞）を用いてウエスタンブロッティングで確認した電気
泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (14)
- 【請求項１】 ラットヌクレオシド二燐酸キナーゼαア
イソフォーム（以下、ヌクレオシド二燐酸キナーゼをＮ
ＤＰＫと略記する。）およびラットＮＤＰＫβアイソフ
ォームに共通するエピトープ部位を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項２】 エピトープ部位がラットＮＤＰＫαアイ
ソフォームおよびラットＮＤＰＫβアイソフォームのＮ
末アミノ酸から８６〜１０４番目に存在するアミノ酸配
列部位である請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ラットＮＤＰＫαアイソフォームのＮ末
アミノ酸から１４１〜１５２番目に存在するエピトープ
を認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ラットＮＤＰＫβアイソフォームを特異
的に認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 ラットＮＤＰＫβアイソフォームのＮ末
アミノ酸から１４１〜１５２番目に存在するエピトープ
を認識する請求項４記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 ウエスタンブロッティング、免疫細胞／
組織染色によりラットＮＤＰＫまたはヒトＮＤＰＫを検
出できる請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 ウエスタンブロッティング、免疫細胞／
組織染色によりラットＮＤＰＫαアイソフォームまたは
ヒトＮＤＰＫ−Ｂアイソフォームを検出できる請求項３
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】 ウエスタンブロッティング、免疫細胞／
組織染色によりラットＮＤＰＫβアイソフォームまたは
ヒトＮＤＰＫ−Ａアイソフォームを検出できる請求項４
または５記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 モノクローナル抗体がＫＭ１１７８であ
る請求項１、２または６記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１０】 モノクローナル抗体がＫＭ１１２０お
よびＫＭ１１２１から選ばれる請求項３または７記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 モノクローナル抗体がＫＭ１１０３お
よびＫＭ１０９９から選ばれる請求項４、５または８記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１２】 請求項１、２、６または９記載のモノ
クローナル抗体を用いるウエスタンブロッティング法ま
たは免疫細胞／組織染色法によるラットＮＤＰＫまたは
ヒトＮＤＰＫの検出法。 - 【請求項１３】 請求項３、７または１０記載のモノク
ローナル抗体を用いるウエスタンブロッティング法また
は免疫細胞／組織染色法によるラットＮＤＰＫαアイソ
フォームまたはヒトＮＤＰＫ−Ｂアイソフォームの検出
法。 - 【請求項１４】 請求項４、５、８または１１記載のモ
ノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティング法
または免疫細胞／組織染色法によるラットＮＤＰＫβア
イソフォームまたはヒトＮＤＰＫ−Ａアイソフォームの
検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14158595A JPH08333399A (ja) | 1995-06-08 | 1995-06-08 | ヌクレオシド二燐酸キナーゼに対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14158595A JPH08333399A (ja) | 1995-06-08 | 1995-06-08 | ヌクレオシド二燐酸キナーゼに対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08333399A true JPH08333399A (ja) | 1996-12-17 |
Family
ID=15295431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14158595A Withdrawn JPH08333399A (ja) | 1995-06-08 | 1995-06-08 | ヌクレオシド二燐酸キナーゼに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08333399A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001048005A1 (fr) * | 1999-12-27 | 2001-07-05 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | Nouveau polypeptide, phytochrome 10, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
| JP2006349658A (ja) * | 2005-02-21 | 2006-12-28 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | 神経系癌幹細胞の検出試薬、神経系癌幹細胞を分離する方法、神経系癌幹細胞、及び神経芽腫の予後診断薬。 |
-
1995
- 1995-06-08 JP JP14158595A patent/JPH08333399A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001048005A1 (fr) * | 1999-12-27 | 2001-07-05 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | Nouveau polypeptide, phytochrome 10, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
| JP2006349658A (ja) * | 2005-02-21 | 2006-12-28 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | 神経系癌幹細胞の検出試薬、神経系癌幹細胞を分離する方法、神経系癌幹細胞、及び神経芽腫の予後診断薬。 |
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