JPS60199830A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、 ［１］　ヒト肺扁平上皮癌に含まれる分子量２２万の抗
原及び分子量９．５万の抗原と抗原抗体反応をし、（１
）ヒト肺扁平上皮癌と反応し、■ヒト肺腺癌と反応しな
い、■腺癌型のヒトの大腸癌、胃癌。

直腸癌、甲状腺癌、乳癌、胆管癌、唾液ｌ１ｇ１癌と反
応しない及び（４）ヒトの肺胞、気管支粘膜、、甲状腺
。

腎１１ＦＦＩ膵、直腸、大腸、胃、牌、脳、末梢血リン
パ球の正常組織と反応しない性質を有するＩｇＧ１亜群
に属するモノクローナル抗体１−ｕＣａ３、［２］　ヒ
ト肺扁平上皮癌に含まれる分子ω１５万の抗原と抗原抗
体反応をし、（１）ヒト肺扁平上皮癌と反応し、■ヒト
肺腺癌と反応しない、（３）腺癌型のヒトの大腸癌、胃
癌、直腸癌、甲状腺癌、乳癌。

胆管癌、唾液腺癌と反応しない及び（Ｉｔ）ヒトの肺胞
。

気管支粘膜、甲状腺、腎、肝、膵、直腸、大腸。

胃、ｎ、脳、末梢血リンパ球の正常４ｆ７ｍと反応しな
い性質を有するＩＣＩＧ、亜群に属するモノクローナル
抗体１−ｕＣａ４、 ［３］　ヒト肺腺癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし
、（１）ヒト肺扁平上皮癌、ヒト肺腺癌、ヒト肺小細胞
癌と反応し、■腺癌型のヒトの大腸癌。

胃癌、直腸癌、乳癌、胆管癌、ｎｉｕ液腺癌及び扁平上
皮癌型の舌癌と反応し及び■ヒトの肺胞、気管支粘膜、
甲状腺、腎、肝、胃、脳の正常組織と反応しない性質を
有するＩｔｌ１Ｍ亜群に属するモノクローナル抗体１ｕ
Ｃａ６、 ［４］　ヒト肺腺癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし
、（１）ヒト肺扁平上皮癌と反応しない、■ヒト肺腺癌
と反応し及び（３）ヒトの肺胞、気管支粘膜。

甲状腺、腎、皮崩、肝、膵、直腸、大腸、胃、脳。

牌、子宮頚部の正常組織と反応しない性質を有するＩ（
ＩＧ、亜群に属するモノクローナル抗体ＬＵＣａ７、 に関−４るものである。

肺癌は近年増加傾向にあるにもかかわらず、確たる早期
診断法は確立され′Ｃいない。本発明者等は客観的でし
かも確瓜の高い組織及び細胞診の開発と早期診断への応
用を意図し、肺癌関連抗原に対するモノクローナル抗体
について種々検討を行なった結果、本発明を完成した。

なお、以下の説明において述べる細胞９組織等は特にこ
とわりのない限り全てヒ１−の細胞９組織等である。

肺癌の特徴の１つはそれが多様な細胞型１組織型からな
ることである。現在肺癌の組織型は大きく４つに分類さ
れている。即ち扁平上皮癌、腺癌。

小細胞癌及び大細胞癌である。肺癌の多様な組織型は臨
床的に極めて重要な意味を持つ。即ち肺癌の進行、転移
及び化学療法、放射線療法などの治療効果はその組織型
に依存するのである。このため肺癌組織型の正確な決定
はその治療計画を考える上で大きな比重を占めている。

しかしながら、１ｉｌｉ癌組織型の決定は病理学者の主
観的、形態学的判断に頼っているのが現状であり、客観
的な診断法２診断薬の開発が望まれている。

本発明において、本発明者等は客観的な組織型決定のた
めの診断薬としてのモノクローナル抗体を新しく開発し
た。

本発明のモノクローナル抗体１−ｕＣａ３及び１ｕＣａ
４は、後述する実施例に示すように、肺扁平上皮癌とは
反応するが肺腺癌とは反応せず、又腺癌型の大腸癌、胃
癌、直腸癌、甲状腺癌、乳癌、胆管癌、唾液腺癌とも反
応せず、更に肺（肺胞、気管支粘膜）、甲状腺、腎、肝
、膵、直腸、大腸。

胃、牌、脳、末梢血リンパ球の正常組織とも反応しない
。又、１−ｕＣａ３抗体は、扁平上皮癌組織である食道
癌及び舌癌とわずかに反応する。更に、１ｕＣａ３と１
−ｕＣａ４抗体は正常皮唐２食道、子宮頚部の扁平上皮
組織とも弱く反応する。

１、ｕＣａ３に反応する抗原は分子量２２万と９．５万
の２つのタンパク分子であり、一方１ｕＣａ４に反応す
る抗原は１５万のタンパク分子である。

１−ｕｃａ３及び１ｕＣａ４に反応する抗原はタンパク
質であり、１−ｕＣａ３及び１−ｕＱａ４が認識する抗
原決定基はシアル酸を含んでいない。

１−ｕＣａ３及び１ｕＣａ４はいずれもＪＯＧ、亜群に
属するものである。

これらの抗体１ｕ　Ｃａ３．　ｌｕ　Ｃａ４を利用づれ
ば、得られた肺癌組織が扁平上皮癌か否かをほぼ１００
％の確率で決定できる。また肺癌はしばしば真水により
細胞診断を行なうが、真水中の癌細胞は遊離細胞のため
、一定の形態をとらず、その［１ｍ型の決定は困難を極
める。しかしながら、本抗体１−ｕＣａ３及び１−ｕＣ
ａ４を用いれば、真水中の癌細胞の組織型が扁平上皮癌
か否かを客観的に決定可能であり、真水の細胞診に画期
的な進歩をもたらした。

本発明の１−ｕＣａ６抗体はヒト肺扁平上皮癌、ヒト帥
腺癌、ヒト肺小細胞癌と反応づるが正常組織とは反応し
ない。又、１ｕＣａ７抗体は一部の肺腺癌と反応するが
他の組織型の肺癌及び正常肺組織とは反応しない。

ＬｕＣａｅ抗体を用いれば、得られた肺組織に癌細胞が
存在するか否かを判定でき、ＬｕＣａ７抗体により腺癌
の存在を判定できる。更【５ｌｕｃａ６を用いれば真水
中の癌細胞の有無を判定でき、１−ｕＣａ７を用いれば
真水中の腺癌細胞の存在を！ｌ’ｌ定できる。１−ｕＣ
ａ６に反応する抗原はト１ノブシン及びプロナーゼに非
感受性で、しかも１−ｕＣａ６の認識する抗原決定基に
はシアル酸が含まれて（Ｘな０゜１ｕＣａ７に反応づる
抗原はタンパク質で１−ｕＣａ７の認識する抗原決定基
にシアル酸【よ含まれて（Ｘない。また、ＬＩＪＣａ６
抗体はＩＯＭ亜群に属し、ＬｕＣａ７抗体は［１ｌＩＧ
、亜群に属する。

本発明のモノクローナル抗体は例え（５次のようにして
製造することができる。即ち、ヒトＩｈ１ｉ癌細胞等で
マウス又はラット等の動物を免疫し、免疫された動物か
ら抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得ら
れた融合細胞を９１−」−ン化し、ヒト肺癌に対する抗
体を産生ずる融合細胞を選択し、これを培養し抗体を回
収づる。免疫法、融合法、融合細胞の選択等は公知の通
常の方法によって行なうことができる。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することができる。

先ず、マウスを肺癌細胞で免疫する。免疫する動物はマ
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスを用いるのが好
ましい。又、肺癌細胞の代りにその小モジネート又はそ
れから採取された抗原を用いてもよい。例えばＢＡＬ、
Ｂ／ｃマウスに肺癌細胞又はそのホモジネート又はそれ
から採取された抗原を数日〜数週間おきに数回接種する
。

接種量は１１！！！当り１回につき１０　〜１０　個の
細胞を使うのが好ましい。その後マウスより稗臓を摘出
し、遠心分離により抗体産生細胞を得る。この細胞は増
殖していく能力を持たないのぐ、自己増殖能力を有づる
細胞と融合さゼる。自己増殖能力を有する細胞としては
骨髄腫細胞が特に好ましい。

骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用いるのが好
ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産生じないも
のを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞
をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と混合し、細
胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割合
は、細胞数比で２：１〜１０：１とするのが好ましい。

得られた融合細胞は限界希釈法により分離し、分離した
融合細胞は増殖させたのら、各穴（ウェル）において産
生される。抗体は公知の方法、例えば螢光抗体法又は酵
素抗体法等により、各種細胞組織等と反応さけ、その結
果から所望の抗体を産生Ｊるハイブリドーマを選択する
。選択したハイブリドーマをｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養法又
（よ　ｉｎ　ｖｉｖｏ移植法により増殖させ抗体を得る
。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法としＣは、例えば次のように
行なうことができる。即ち、ハイブリドーマを適当な培
養液（例えば完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで
培養し、その培養上清を回収する。上清中に分泌された
七ツクＬｌ−ノ・ル抗体は一般には精製しないで用いら
れるが、例えば以下の方法によりＩ（ＩＧ分画、１（Ｉ
Ｍ分画等にしても使用できる。即ち、培養上清を４０％
飽和硫安で沈澱させた後、ｐＨ７，８の２０ｍＭリン酸
！！Ｊ衝液で平衡化したジエチルアミノエヂルセルロー
ス力ラム又はセファデックス０２００ノコラムを通過さ
せ不純物を除去して用いる。

又、　目＋　ｖｉｖｏ移植法としては、例えば次のにう
に行なうことができる。即ち、生体内、例えばヌードマ
ウス腹腔内にハイブリドーマを注入し、ヌードマウス体
内で腫瘍として生育させ、メートマウス血清あるいは腹
水から抗体を回収する。更に詳しくは、ハイブリドーマ
を移植するＢＡＬＢ／Ｃマウスにあらかじめ（５〜１０
日前）　２，６，１０．１４−１トラメヂルペンタデカ
ンを腹腔内に０．５７注射しく゛おき、次にハイブリド
ーマ５×１０　〜１０７個を腹腔内に移植する。移植さ
れたマウスを適当な時間飼育づると、腹腔内にハイブリ
ドーマの腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結
果′、腹水及び血清中に高濃度のモノクローナル抗体が
生成され、それらを採取する。この腹水及び血清中には
目的のモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由来す
る多クローン性抗体が含まれているが、それらはヒトの
組織とは反応しないために、１：Ｊに分離しないＣ゛用
いられる。又、ｉｎ　ｖｔｔｒｏｊ６養法の場合と同様
に、ｉｎ　ｖｉｖｏ移植法においてもｌＸ１０分画、＋
＜ＪＭ分画等にして使用リ−ることもできる。

本発明のモノクローナル抗体を作るために免疫原として
使用する細胞としては、１ＩＩｂ扁平上皮癌等の肺癌細
胞が使用できるが、肺癌＃ｌ胞は特定の株のものに限定
されす”、ｌｌ＋癌１１抱であればいずれも使用可能で
ある。なお、七ツク〔１−ナル抗体しＵＣａ３及びＬｕ
Ｃａ４を作る場合は、肺扁平上皮癌細胞株が使用ぎれる
。

本発明のモノクローナル抗体を作るために用いる抗体産
生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが牌臓
等に蓄積するので婢臓を摘出して使用するのが好ましい
が、必ずしも碑臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。

本発明のモノクローナル抗体は、肺癌の診断薬として使
用することができ、又、本発明の七ツクローナル抗体と
抗癌剤を組合Ｕてミリノイル療法に用いることができる
。

Ｘ１（ＭＪ　１ １）免疫 ８週令のＩＩ　Ｂへ１Ｂ／ｃマウスを９×１０　個の肺
扁平」−皮癌山来の細胞株（以下ＳＫ−ＭＥＳ　１とい
う）で皮下に免疫し、その後２週間の間隔で２回腹腔内
に　１．４Ｘ　１０　個の細胞を注入した。

２）細胞融合 最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通ずことにより細胞懸濁液を作製した。この２，
６ｘ　１０　個の牌細胞とｇ、ｏｘ　ｉｏ　個の８アザ
グアニン耐性骨髄腫細胞Ｐ３−ＮＳｒ−Ａ（１４／１　
（ＮＳＩ）を混合し、遠沈後沈渣に　１−の４５％ポリ
エチレングリコール（平均分子ｆｆ１６０００）を加え
、２分間ゆるやかに撹拌した。洗浄後、細胞混合液を１
０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩｊａ地（完全ＲＰＭＩ培
地）に懸濁し、９６穴マイクロ培養プレートに１穴当り
１０　個の割合でｏ、ｉ＃！ｉ！ずつまいた。２４時間
後、ヒボキサンチン　１００μＭ、アミノプテリン０．
４μＭ、チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（１
」Ａ　Ｔ培地）を０．１ｄ加えた。

ＪＲ養開始後２０目、　３日目、５し１目、　７日日、
　１０日口に培養上清０．１／ｄ、を捨Ｃ１＋１　Ａ　
Ｔ　Ｊ１’ｉ地０．１蔵を加えた。１２日後に全Ｃの穴
にハイブリドーマを増殖するのが観察された。

３）ハイブリドーマの選択 ＳＫ−ＭＥＳＩ細胞に対して抗体を産生じているハイブ
リドーマを酵素抗体法により選択した。

酵素抗体法は以下の如く行なった。

ＳＫ−ＭＥＳＩ細胞を９６穴マイクロ培養プレートに増
殖限界に達するまで培養し、０．２５％グルタルアルデ
ヒドで５〜７分間固定し、５回洗浄した。

ハイブリドーマの培養上清０．１−を加え、室温で１時
間反応さゼた。５回洗浄した後、第２抗体どし”Ｕ３０
ｄの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ａ７ギ抗マウス免
疫グロブリンを加え、１時間反応さけた。６〜７回洗っ
た後、１．１％過酸化水素水と１５０埒／ｍのアジノー
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−６−スルフォ
ン酸）（八〇ＴＳ）を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液を１
００鱈加え、１０分間室温で発色させた。停止液とし−
Ｕ１０％シュウ酸を５０成加え、４０５ｎＩｌｌの吸光
度をマイクロプレート用の分光光度晶１により測定し、
０．０２以上吸光度のあるハイブリドーマを選択した。

選択されたハイブリドーマはあらかじめＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胸腺細胞（フィーダー細胞）をまかれた２４穴培
養プレートに移され、１００μＭヒボキザンチンと１６
μＭチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（］」Ｔ培地）で
培養した。増殖限界に達した後、再び酵素抗体法により
ＳＫ−ＭＥＳ１１１１胞に対して抗体産生を行なってい
るハイブリドーマを選んだ。

次に、選択されたハイブリトーンを限界希釈法によりク
ローニングした。即Ｉ〕、細胞を５０個／ｍｆｌあるい
は１０個／ｄに希釈し、あらかじめフィーダー細胞をま
かれた９Ｇ穴マイク１」Ｊ８養プレー１−に０．１ｄず
つ分注し、］−１１−培地により　２週間培養した。１
穴に　１個のハイブリトーマコ１ニに一が形成された場
合をクローンとしで取り出した。酵素抗体法によりＳＫ
−ＭＥＳ１細胞に対し゛（反応し、正常ヒト線紐刀細胞
に対して反応しない１ｉＬ（Ａを分泌しているハイブリ
ドーマクローンを選択した。

更に、これらのクローンのうら、ヒト肺扁平上皮癌組織
にのみ反応づるクローンを凍結切片の免疫パーＡキシタ
ーゼ染色により選択した。つまり、ヒトの肺・癌、その
他の臓器癌及び正常組織を手術材れによりｉ＆、その４
ＪＪＭ凍結切片を作製した。アセトン固定後、ハイブリ
ドーマクローンの培養上清を加え、室温３０分反応させ
た。よく洗った後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（
γ鎖、λ鎖。

に鎖と反応する）と室温３０分反応させた。更に洗浄後
、アビジンとビオチン標識西洋ワザビバーオ手シダーゼ
を加え室温１時間反応させ、よく洗ったｔｍ質として０
．５ＩＩＩｇ／ＩＲ１のジアミノベンチジン（！：　０
　、０１　％　ｌ−１２０，ヲ含む５０１１１Ｍ　トリ
ス−塩酸緩衝液（ｌ１ｌ−３７，０）を加え発色させた
。

このようにして、ヒト肺扁平上皮癌とは反応するが、肺
腺癌とは反応せず、又、腺癌型の大腸癌胃癌、直腸癌、
甲状腺癌、乳癌、胆管癌、唾液腺癌及び肺（帥胞、気管
支粘膜）、甲状腺、腎、肝。

膵、直腸、大腸、胃、牌、脳、末梢血リンパ球の正常組
織と反応しないモノクローナル抗体を産生りるハイブリ
ドーマクローン２つが（りられ、これを１−ｕＣａ３’
及び１−ｕＣａ４’と名句けた。そして、これらハイブ
リドーマ１−ｕＣａ３’及び１ｕＣａ４が産生りるモノ
クローナル抗体をそれぞれＬｕＱａ３及び１ｕＣａ４と
命名した。後述づるように、１ｕｃａ３は分子８２２万
と９．５万の２つの抗原と反応するが、１ｕＣａ４は分
子量１５万の抗原と反応するものである。

３ンモノクロー）“ル抗体の作製 （ａ）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法 １０　個／ｄのハイブリドーマを培養液（完全ＲＰＭＩ
培地）で増殖限界（２Ｘ１０６個／Ｉｒｄｌ）になるま
で培養し、その培養上清を回収した。上清中に分泌され
たモノクローナル抗体は精製しないで用いた。（但し、
以下の方法によりＥｇＧ分画にして使用することもでき
る。即ち、培養上清を４０％飽和硫安で沈澱させた後、
ｐＨ７，８の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したジエチ
ルアミノエチルセルロースカラムを通過させ不純物を除
去して用いる。ン （ｂ）　ｉｎ　ｖｉｖｏ移植法 ハイノリドーマを移植するＢＡＬＢ／ｃマウスにあらか
じめ（５〜１０日前）　２，６，１０゜１４−テトラメ
チルペンタデカンを腹腔中に０．５ｍ注射しておく。次
にハイブリドーマ５×１０　個を腹腔内に移植づる。移
植されたマウスを３週間餌育すると、腹腔内にハイブリ
ドーマの腫瘍が形成され、腹部が肥大しでくる。この結
果、腹水及び血清中に＾濃庶のモノクローナル抗体が生
成され、それらを採取した。この腹水及び血清中には目
的モノクロ−プル抗体以外に、マウス自身に由来覆る多
クローン性抗体が含まれＣいるが、それらはヒトの組織
とは反応しないために、特に分離しないで用いた。

（また、４）の（ａ）に示した方法により１（ＩＧ分画
にして使用できる。） ５）モノクローナル抗体ＬｕＣａ３及び１ｕＣａ４の特
性 （ａ）肺癌組織との反応性 肺癌手術により得られた癌組織の凍結切片１８例との反
応性を免疫パーΔ４−シダーゼ染色により調べた。第１
表に示ずように、ＬｕＣａ３抗体は肺扁平上皮１￥Ｊ８
例中７例と１ｕＣａ４抗体は８例中６例と反応した。し
かし、これらの抗体は肺腺癌や小細胞癌とは全く反応し
なかっに０また、扁平上皮癌と腺癌の混合型である腺扁
平上皮癌では扁平上皮癌の部分とのみ反応した。

（ｂ）他の癌組織との反応性 １ｕＣａ３及びＬｕＣａ４と線以外の種々の臓器の癌組
織（１０例）との反応性を凍結切片の免疫パーオキシダ
ー１染色により調べた。ｍ２表に示すように１−ｕｃａ
３抗体は扁平上皮癌組織である食道癌及び苦痛とわずか
に反応するのみで、他の癌とは全く反応しなかった。Ｌ
ｕＣａ４抗体は調べた全ての癌と反応しなかった。

（ｃ）正常組織との反応性 １−ｕＣａ３及び１−ｕＣａ４抗体と様々の正常組織（
１５例）の凍結切片との反応性を免疫パーＡキシダーゼ
染色により調べた。第３表に示すように、ＬｕＣａ３及
び１ｕＣａ４抗体は正常肺や多くの正常組織とは反応し
ないが、正常皮膚２食道、子富頚部の扁平上皮組織に対
して、弱陽性を示すことが判つＩこ　。

（ｄ）モノクローナル抗体ＬｕＣａ３及び１−ｕＣａ４
と反応する可溶化抗原 １−ｕＣａ３及びＬｕＣａ４に反応する抗原を’９４６
　Ｓ−メヂオニン或いは＋＊ｇ　Ｉにより細胞表面タン
パク質を標識して調べた。　Ｓ−メチオニンによる標識
はＳＫ−ＭＩＳＩ細胞をａｈ　ｓ−メチオニン０．５１
１１キユリーとともにメチオニン不含イーグル培地（１
０％牛脂児血清を含む）で２０時間培養した。０．０２
％ＥＤＴＡで細胞をはがし、よく洗った。　■による標
識はＥ　Ｄ　Ｔ　ＡではがしたＳＫ−ＭＥＳ１細胞をよ
く洗った後、０．５ｍキュリー（７）”５１　ト−ｙ’
ｙ　トム−１ｒ＊シ’Ｊ−セ０．１＋１１（ｌ及び０．
００３％Ｈ２Ｏ２を加え、３０℃４分間、更に室温１０
分間反応させ、よく洗つｌ〔。

細胞沈渣に０．５ｍの０．５％ノニデートＰ−４０を加
え、氷上で１０分間放置することにより細胞膜を可溶化
した。この混合液を２７．０ＯＯＧ、　２０分間遠心し
、上清を集めた。

酉Ｓ或いは１２５Ｉで標識された可溶化タンパク質にＬ
ｕＣａ３或いは１ｕＣａ４の腹水を加え氷上で１時間反
応させ、その後ヤギ抗マウスＩｏＧ抗体を加え、更に１
時間反応させた。対照群としてｌｕ　Ｃａ３．　Ｌｕ　
Ｃａ４の代わりに正常マウス血清より得られたＩｇＧ１
を用いた。この混合液にスタフィロコッカスアウレウス
の死菌を加え、３０分間反応後よく洗い、菌に結合した
抗原をソデイウムードデシルースルフオネートーポリア
クリルアミドゲル電気泳動で還元条件下で分析した。

１ｕＣａ３に反応する抗原は　Ｉで標識されず、　Ｓ−
メチオニンにより標識され、分子団２２万と９．５万の
２つのタンパク分子である。ＬＬＩＣａ４に反応づる抗
原は　Ｉにより標識され１５万のタンパク分子であるこ
とがわかった。このことは１−ｕＣａ３と１−ｕＣａ４
がＳＫ−ＭＥＳ１細胞上の異なるタンパク抗原と反応す
ることを示している。

６）モノクローナル抗体による肺癌組織型の診断法 ５）で示したように１ｕＣａ３及びＬＵＣａ４抗体は肺
扁平上皮癌と強く反応づるモノクローナル抗体である。

このことは肺癌の組織型の診断にこれら２つのモノクロ
ーナル抗体が応用できることを示している。

正常の扁平上皮組織にわずかに交叉反応を示１が、肺癌
の組織診断にはほとんど障害とならない。具体的な診断
法としては凍結切片の免疫パーＡキシダーＬ染色と真水
中の癌細胞の免疫螢光染色の２つがある。

（ａ）凍結切片による診断法 肺癌或いはリンパ節転移組織が外科的手術により切除さ
れると、それをできるだけ早く凍結する。凍結は組織を
包埋剤に入れ、ドライアイスで冷７ｉｌ＋されたイソペ
ンクンの中で瞬時に行なう。こうしＣ凍結された組織は
一８０℃で少なくとも１年は保存可能である。組織は凍
結切片（４岬）にされ、アセトンで一２０℃、１０分間
固定する。順１乾の後、非特異的染色を防ぐためにウマ
血清で２０分室温処理する。５埒／ｄの１−ｕＣａ３或
いは［ｕＣａ４抗体を加え、室温３０分反応さける。よ
く洗った後、３）で述べた免疫パー７１キシダーゼ法で
染色する。第１表に承りように、肺扁平十皮癌は９０％
以上の確率で１ｕＣａ３或いは１−ｕＣａ４のどちらか
に反応７る。一方、他の組織型の肺癌で１ｕＣａ３或い
は１ｕＣａ４のどちらかに染色される確率は０％である
。従つで、９０％以上のＭＣ率で扁平上皮癌を判定でき
る。

（ｂ）真水による診断法 忠当より真水を採取し、抗凝固剤を加える。マクロファ
ージは非特異的に免役グロブリンを結合するために除去
づることが望ましい。真水にシリカを加え、３７℃で・
１時間反応させる。この混合液の下にフィー１−ルーハ
イバーク（比重１．０７７ｉ：　０．００１）を重層し
、４００Ｇで３０分速心りる。中間細胞層を集め、よく
洗った後、間接免疫螢光法で染色する。即ち真水細胞５
×１０　個に０．５Ｉｎｆｌの１ｕＣａ３或いは１ｕＣ
ａ４抗体（５巧／ｄ）を加え、氷上で１時間反応さける
。

よく洗った後、ノルＡレッセインイソヂＡシアネート標
識ｉアギ抗マウスＩｇＧを加え、更に氷上で３０分間反
応させる。よく洗った後、螢光顕微鏡で観察する。診断
例を第４表に示す。細胞診クラスＶの腺癌及び小細胞癌
とはＬＵ　Ｃａ３．　ＬＬＩ　Ｃａ４とも一例も反応し
Ｃいない。一方、細胞診クラスＶの扁平上皮癌−例と反
応し、クラス１の扁平上皮癌とは反応し−Ｃいない。こ
のようにＬＬＩＣａ３及び１−ｕＣａ４は真水において
も肝癌組織と全く同様の特異性を示し、真水による組織
型の診断に有効であることが証明されｌこ。

真水の螢光染色を定量化Ｊるためにセルソーターによる
測定が試みられた。セルソーターはＦＡＣ８４２０（ベ
タ１−ンデツキンソン社）が用いられた。第１図は細胞
診クラス■の扁平上皮癌を１−ｕＣａ３及びＬＩＪＣａ
４で染色したものである。対照群（非免疫マウスｆｉｌ
ｌ　Ｇ）に比してイｊ意に高い螢光強度が観察された。

即ち、第１図はヒルソーターを用いた １ｕＣａ３及びｌ−ｕ　Ｃａ４ニＪ、る１性胸水（扁平
上皮癌）の診断結果を示したものであり、ｃｏｎｔｒｏ
ｌとし′では正常マウスＩｇＧを用いた。真水は思考番
号ＵＰＬ７（第４表）、扁平上皮癌、クラスＶを用いた
。第１図（ａ）は１ｕＣａ３による螢光染色、第１図（
ｂ）は１ｕＣａ４による螢光染色結果である。

友１」［と １）免疫 ８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに４×１０　個のヒト肺
腺癌由来の細胞株（以下Ｆ　ｅｒｒｉａｎｓという）を
皮下に注入し、２週間後２×１０　個、更に　１り月後
１，５Ｘ　１０　個の細胞が腹腔内に注入された。

２）細胞融合 実施例１において、ＳＫ−ＭＥＳｌで免疫された２、６
Ｘ　１０”個の牌細胞の代わりＬＬ　Ｆ　ｅｒｒｌａｎ
ｓ　テ免疫された１、５ｘ　ｉｏ　個の牌細胞を用い、
８．０×７ １０　個のＮＳＩの代わりに５×１０　個のＮＳＩを用
いた以外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行なっ
た。実施例１の場合と同様に１２日後に全ての穴にハイ
ブリドーマが増殖するのが観察されＩこ　。

３）ハイブリドーマの選択 「ｅｒｒｉａｌｌｓ細胞に対して抗体を産生じているハ
イブリドーマの選択を実施例１の場合と全く同様にして
行なった。

次に実施例１と全く同様にして、選択されたハイブリド
ーマを限界希釈法によりクローニングした。そして、酵
素抗体法によりＦ　ｅｒｒｉａｎｓ細胞に対して反応し
、正常ヒトフィブロブラストに対して反応しない抗体を
分泌しているハイブリドーマクローンを選択した。

更に、これらのクローンのうちヒト肺癌組織及び他のヒ
ト癌組織と反応し、正常組織とはと／υど反応しないク
ローンを実施例１と同様にして選択した。

このようにして、ヒト肺扁平上皮癌、ヒト肺腺癌、ヒト
肺小細胞癌、腺癌型の大胆癌、胃癌、直賜癌、乳癌、胆
管癌、唾液腺癌及び扁平上皮癌型の苦痛と反応し、肺胞
、気管支粘膜、甲状腺、腎。

肝、胃、脳の正常組織と反応しないモノクローナル抗体
を産生ずるバイブリド−マク［］−ンＬ０ＣａＭ＜得ら
れた。このハイブリドーマ１−ｕＣａ６が産生するモノ
クロ−プル抗体を１−ｕＣａ６と命名した。

又、ヒト肺扁平上皮癌どは反応せず、ヒ１−肺腺癌と反
応し、肺胞、気管支粘膜、甲状腺、腎、皮膚、肝、膵、
直腸、大腸、胃、脳、牌、子宮頚部の正常組織と反応し
ないモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマクロ
ーン１−ｕＣａ７が得られ、このハイブリドーマが産生
Ｊるモノクローナル抗体をＬｕＣａ７と名付【プた。

４）モノクローナル抗体の作製 ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養及び　ｉｎ　ｖｉｖｏ移植ににる
増殖と抗体産生を実施例１と同様にして行なった。（尚
、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養において、１ｕＣａ６抗体（１
（ＪＭ）の場合は、培養上清を４０％飽和硫安で沈澱さ
Ｕた後セファデックス０２００カラムを通過さｕ１最初
に流出りる分画を回収して用いることもできる。）こう
し゛（得られたモノクローナル抗体１−ｕＣａ６はＩｕ
ＭｄｋＪ！Ｙに、１−ｕＣａ７はＩ（ＩＧ、亜群に属り
る。

５）モノクローナル抗体の特性 （ａ）肺癌組織との反応性 １ｕＣａ６抗体は肺癌組織１８例中１６例と反応し、組
織型に対す−る特異性は見出せなかった。ＬｕＣａ７は
肺腺癌８例中４例と反応したが、肺扁平Ｊ−皮癌及び小
細胞癌とは反応しなかった。

（ｂ）伯の癌組織との反応性 ＬｕＣａ６抗体は甲状腺癌を除く調べた全ての癌と反応
している。又、ＬＵＣａ７抗体は腺癌である胃癌、乳癌
、唾液腺癌と反応しているが他の癌とは反応していない
。

（Ｃ）正常組織との反応性 １ｕＣａ６抗体は、直腸及び大腸の粘膜上皮に対して微
陽性、子宮頚部及び食道の扁平上皮組織に対して陽性を
示した。更に、ＬＬＩＣａ７抗体は食道の扁平上皮に対
してのみ弱陽性を示した。

６）モノクローナル抗体による肺癌の組織診断法５）で
示しＩＣように１ｕＣａ６はほとんどの肺癌組織と、１
ｕＣａ７は一部の腺癌と反応するモノクローナル抗体Ｃ
゛ある。−プｊ、これらの抗体は正常肺組織と反応しな
い。

このことは肺癌の組織診断にこれらの抗体が応用できる
ことを示している。これらの抗体は、他の正常組織とわ
ずかに反応するが、肺癌の組織診断にはほと／ｖど障害
にならない。具体的な診断法としては、肺癌組織凍結切
片の免疫パーオキシダーゼ染色と真水中の癌細胞の免疫
螢光染色の２つである。

（ａ）凍結切片による診断法 肺癌或いはリンパ節転移組織が外科的に切除されると、
それを速かに凍結する。凍結は組織を包埋剤に入れ、ド
ライアイスで冷Ｍｌされたイソペンタンの中で瞬時に行
なう。こうして凍結込れた組織は一８０℃で少なくとも
１年は使用可能である。組織は凍結切片（４〜６岬）に
され、アセトンで一２０℃、　１０分間固定する。風乾
の後、非特異的染色を防ぐために　１％ウマ血清で２０
分間室温処理する。５Ｎ　／　ｍｌｌの１ｕＣａ６或い
はＬｕＣａ７抗体を加え、室温３０分反応さける。よく
洗った後、３）で述べた免疫パーオキシダーゼ法で染色
する。第１表に示すように、肺癌は約９０％の確率でｌ
ｔ＋Ｃａ６抗体に染色されるので、得られた肺組織が癌
か否かを決定できる。更に、１ｕＣａ７は約５０％の肺
腺癌と反応するが、他の組織型で１ｕＣａ７によって染
色された組織は１例もない。従って、１ｑられた肺癌組
織が１ｕＣａ７に反応すれば腺鶴と決定でさる。しかし
、逆に１ｕＣａ７に染色されない場合には、その組織が
腺癌ではないと結論Ｊることはできない。

（ｂ）真水による診断法 患者より真水を採取し、抗凝固剤（３％り上ン酸ソーダ
）を加える。肺マクロファージは非特異的に免疫グロブ
リンを結合するために除去する。真水にシリカ粒子を加
え、３７℃で１時間反応さぼる。この混合液の下層にフ
ィコール−ハイバーク（比重１．０７７±０．００１）
を重層し、４００Ｇで３０分遠心する。上清を集め、よ
く洗った後、間接免疫螢光法で染色する。即ち真水細胞
５×１０５個にしｕＣａ６及びＬｕＣａ７（５Ｎ／ｄ）
をそれぞれ０．５ｒｄの加え、氷上で１時間反応させる
。よく洗った後、フルオレン［インイソチオシアネート
標識ヤギ抗マウスＩＵＧを加え、更に氷上で３０分間反
応させる。よく洗った後、螢光顕微鏡で観察ジーる。現
在までの診断例を第４表に示す。

１−ｕＣａ６は細胞診クラスｖ７例中４例と反応してい
るが、クラスＩとは１例も反応していない。また、Ｌｕ
Ｃａ７抗体はクラスＶの腺癌５例中３例と反応している
が、クラスＶの扁平上皮癌及び小細胞癌とは反応してい
ない。興味深いのは（ＪＰＬ５　（クラス■）の例であ
る。この患者は真水の形態学的な細胞診によって癌と確
定できなかったにもかかわらず、１ｕＣａ６及び１ｕＣ
ａ７により染色された。４ケ月後試験切除により肺腺癌
であることが判明した。

このようにｔツクａ−ナル抗体しｕＣａ６゜１ｕＣａ７
は真水中の癌細胞においても腫瘍組織と同様の特異性を
示し、真水による肺癌の細胞診及び組織型の診断に有効
であることが証明された。特にｔＪＰＬ５の例は従来の
形態学的診断で見逃されるような場合でもこれらのモノ
クローナル抗体により癌細胞が発見できることを意味し
ている。

真水細胞の螢光染色を定量化するためにセルソーターに
よる測定が試みられた。セルソーターはＦＡＣ８４２０
（ベクトンデツキンソン社）が用いられた。第２図は、
細胞診クラス■の腺癌（第４表ＵＰＬ５）をＬＬＩＣａ
６で染色したものである。非常に強い螢光強度が観察さ
れた。

第１表 免疫パーオキシダーゼ染色法による七ツクロープル抗体
の肺癌組織に対りる反応竹Ｓ４　＋　十　→　− 扁平上皮癌　Ｃ３−＋　→−− ０７十千十十− ８５Ｗ　−−−− ８９＋−−−１−１−−− ８１２＋＋　→−−１−十− ８２　−　−−　−＋、　− ＬＩ３２　−−　−　−− 腺　癌　ＩＪ２６　−’　−十− １Ｊ６４　−　〜　→−」− ０１４−−−（−十− Ｕ１２　−　−〜　ト　Ｗ （注）　ａ）扁平上皮癌の部分を染色している。

第２表 免役パーＡキシター１染色法による［ツクＵ−ナル抗体
の種々の１１；Ｕ械【こ対する反１芯１ｊ［−−１−＋
　− 大腸癌　腺　癌　− 胃癌一一一トＷ １１ＩＩｌ瀞θ　−’　−＋−１−− 甲状腺癌　− 乳癌　−＋＋（ 口１］’７てｒ、＃ｉ；　→−− −＋−＋−Ｗ 唾１１ｋｌｌＩＪｌ癌　− ３癌　扁平−Ｌ皮癌　ｌ−−十十− 子宮頚部癌　−−Ｗ− 」単Ｗ　Ｔ−−−−一一色−−二−− ト＋°強陽性　１−；陽性　Ｗ：弱陽性　Ｔ；微陽性　
−：陰性第３表 免疫パーＡキシダーＬ染色払にＪ、るＬツク１．ｌ−ノ
ル抗体の止常絹械に対づる反応性 気風支粘膜　−−−一一一 甲状腺　−−−−一 肝　−−一−−− 膵　−−ｍ＝ 直腸　］　− 大腸　−−−’ｌ’　− 胃　−−−一−− 脳　−−−＝− （注）ａ）扁平上皮組織が陽性 第４表 免疫螢光染Ｌ２仏にＪ、るしツクローノル抗体の真水細
胞に対Ｕ反応性ＵＩ）１２　ｎ”）　ｙ　− −十　Ｗ （）ｌ）ｔＪ　、、６１　■　− −＋＋　Ｗ Ｕ））ｌｆｔ　、／’ン　Ｖ　− １ＪＰＬＩ２　ｌ＋”ｌ　ｙ　− ＬＪＰＬｉ３　ｌＩ　■　− （注）ａ）ＩＩｌｌＩ癌絹織型は組織後のリンパ節生検
・剖検・手術料オ′ＭにＪ二り決定されｌこ１゜ｂ　）
真水細胞診断により決定された。

Ｃ）真水中の細胞について Ｖ：確実に悪性 ｍ：疑陽性１．たたし悪性の確徴はない。

１：陰性；全く異形性を認めず。

ｄ）癌細胞が非１ｔに少ない。

友１」しＬ ＩＬＩ（：：ａ３及び１ｕＣａ４に反応Ｊる抗原の性状
抗原としＣ用いｌ：ｓ　Ｓ　Ｋ　−Ｍ　Ｅ　Ｓ　１　ｍ
＋胞を１〜リブシン或いはブＵノーＵで処理づるど１−
ｕｃａ３及びＬｕＣａ４抗体はＳＫ−ＭＥＳＩＭＩＪ胞
とは結合しなくなることが間接螢光抗体法により証明さ
れた。

即ち、１０　個のＳＫ−ＭＥＳ１細胞を１ｎ＋ｇ／＋ｉ
の１〜リプシン又はブロナーげで３７℃、　３０分間処
理した。よく洗った後、ＬｕＣａ３或いは１−ｕＣａ４
抗体を加え、氷上で３０分間反応した。洗浄後、フルΔ
レッセインイソチＡシアネート標識Ａ７ギ抗マウス１０
Ｇを加え、更に氷上３０分間反応させ、洗浄後螢光顕微
鏡で観察した。１〜リブシン或いはプロナーゼ非処理群
は強い螢光染色が観察されたが、トリプシン或いはプロ
ナーゼ処理すると全く螢光染色されないことが判った。

更ニ、１０　（ｒｊＪ（ＤＳＫ−ＭＥＳＩ細ｍＧ　ｏ、
２：Ｌ二ツ］へのノイラミニダーゼで処理しても、ｌ−
１１Ｃａ３゜１Ｕｃａ４に対づ−る反応性は全く減弱し
ないことが間接螢光抗体法により証明された。

以上のことは、１−ｕＣａ３或いは１ｕＣａ４に反応７
る抗原がタンパク質であり、その抗原決定基にシアル酸
がａまれていないことを示し−Ｃいる。

実施例４ １ｕＣａ６及び１ｕＣａ７に反応する抗原の性状抗原と
して用いたＦｅｒｒｉａｎｓ細胞をトリプシン或いはプ
ロナーゼでＬｕ　Ｃａ３．　Ｌｕ　Ｃａ４の項で述へた
方法（実施例３）と同様の方法で処理すると、しｕＣａ
６に対４°る反応性は全く減少しないが、しｕＣａ７に
対する反応性は消失リ−ることか間接螢光抗体法により
証明された。

Ｆ　ｅｒｒｉａｎｓ細胞をノイラミニダーゼ処理しても
、Ｌｕ　Ｃａ６．　ｌ、−ｕ　Ｃａ７に対りる反応性は
全く減少しなかった。

以上の事実は、１Ｕｃａ７抗体【、二及応りる抗原はタ
ンパク質Ｃ，イの抗原決定基にシアル酸は含まれでいな
いごとを示しくいる。、　ｉ　／、二１１Ｃａ６に反応
Ｊる抗原は１−リゾシン及び１１１ノーげに非感受性で
その抗原決定基にはシ）フル酸が含Ｊ：れていないこと
を示し−Ｃいる。

実施例５ ＬｕＣａ３及び１Ｕｃａ４抗体のイムノグロブリン亜群
の決定： １−ｕＣａ３及び１−ＵＣａ４抗体ど＼７ギ抗マウスＩ
（ＩＧ、亜群、Ｉ（ＩＧ、、ＩＩＬ亜群、ＩｇＧ、、亜
ｆ！Ｔ、ＩｇＭ亜群との反応１１をアガロースゲル内免
疫）ん陪反応により調べた。１−ｕＣａ３及びしｕｃａ
４抗体はいずれも抗マウスＩｇＧイ亜群抗体と反応し沈
降線をつくったが、他の抗体とは全く沈降線を作らなか
った。

１ｕｃａ６及び１−ｕＣａ７抗体のイムノグロブリン亜
群の決定： １ｕＣａ６及び１−ｕＣａγ抗体とヤギ抗マウス１ｇＧ
、！Ｉｎ群、１（ＩＯ２，亜群、ＩｔｌＧ２ｂ亜群、［
（ＩＭ亜ＢＹとの反応性をアカロースグル内免疫沈降反
応により調べた。１−ｕＣａ６抗体は抗マウス［Ｍ亜群
抗体と、１ｕＣａ７抗体は抗マウスＩ（ＩＧ１亜群抗体
と反応し沈ｌｌ？線をつくったが、他の抗体とは全く沈
降線を作らなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、レルソーターを用いた１−ｕＱａ３及び１−
ｕＣａ４による癌性真水（扁平上皮癌）の診断結果を示
したしので、＜　ａ＞は１ｕＣａ３による螢光染色結末
を、（ｂ）は１ｕＣａ４による螢光染色結末を示したも
のぐある。 第２図は、レルソーターを用いた１ｕＣａ６による癌ｖ
１胸水（腺癌）の診断結果を示したものである２゜ 第１図 螢ｆｆ１５１屓→

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト肺扁平上皮癌に含まれる分子量２２万の抗
   原及び分子量９．５万の抗原と抗原抗体反応をし、次の
   性質を有するＮＧ、亜群に属するモノクローナル抗体し
   １Ｉｃａ３゜ （１）ヒト肺扁平上皮癌と反応する。 ■ヒト肺腺癌と反応しない。 （３）腺癌型のヒトの大腸癌、胃癌、直腸癌、甲状腺癌
   、乳癌、胆管癌、唾液腺癌と反応しない（４）ヒトの肺
   胞、気管支粘膜、甲状腺、腎、肝。 膵、直腸、大腸、胃、牌、脳、末梢血リンパ球の正常組
   織と反応しない。 （２）　ヒト肺扁平上皮癌に含まれる分７子量１５万の
   抗原と抗原抗体反応をし、次の性質を有づるＩｇＧ、亜
   群に属するモノクローナル抗体［ｕＣａ４゜（１）ヒト
   肺扁平上皮癌と反応する。 ■ヒト肺腺癌と反応しない。 （３）腺癌型のヒトの大腸癌、胃癌、直腸癌、甲状腺癌
   、乳癌、胆管癌、唾液腺癌と反応しない。 （４）ヒトの肺胞、気管支粘膜、甲状腺、腎、肝。 膵、直腸、大腸、胃、牌、脳、末梢血リンパ球の正常組
   織と反応しない。 （３）　ヒト肺腺癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし
   、次の性質を有する［ＱＭ亜群に属するモノクローナル
   抗体ＬｕＣａ６ゎ （１）ヒト肺扁平上皮癌、ヒト肺腺癌、ヒｌ−肺小細胞
   癌と茨応づる。 ■腺癌型のヒ１への大腸癌、胃癌、直腸癌、乳癌。 胆管癌、唾液Ｊｌ＊癌及び扁平上皮癌型の舌癌と反応す
   る。 ■ヒトのＩＩｒａ胞、気管支粘膜、甲状腺、腎、肝、゛
   胃、脳の正常組織と反応しない。 （４）　ヒト肺腺癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし
   、次の性質を有するＩｇＧ、亜群に属するモノクローナ
   ル抗体しｕＣａ７゜ （１）ヒト肺扁平上皮癌と反応しない。 ■ヒト肺腺癌と反応する。 （３）ヒトの肺胞、気管支粘膜、甲状腺、腎、皮膚。 肝、膵、直賜、大腸、胃、脳、牌、子宮頚部の正常組織
   と反応しない。