JPS6143200A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトの癌の診断等に有用なモノクローナル抗
体に関するものである。

（従来の技術） 肺癌の腫瘍マーカーとして、ＣＢＡ、ＴＰＡ等が知られ
ているが、これらは必らずしも腫瘍特異的ではな（、悪
性疾患のみならず種々の良性疾患、健康者でもみられる
。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びに；ｈｌｅｒの発明以来、癌に対
するモノクローナル抗体について研究が行なわれている
が、肺癌に対するモノクローナル抗体で臨床的に有用な
ものはまだない。

近年、種々の固型癌組織特に腺癌中に、Ａ型類似の抗原
が出現していることが分って来た。

これは血液型Ａ型患者以外にもみられ、腺癌の腫瘍マー
カーとして有望である。ｌｌｉ’ｏｒｓｓｍａｎ抗原は
この人型類似の抗原の一つである。又、腫瘍細胞膜から
抽出された糖脂質中に、Ｆｏｒｓｓｍａｎ抗原以外のＡ
型類似の抗原がみられたとも報告されている。今迄にＦ
ｏｒｓｓｍａｎ抗原以外のＡ型類似の抗原に対するモノ
クローナル抗体の作製の報告はない。

（発明が解決しようとする問題点） 現在のところ、肺癌の組織診断及び血清診断に臨床的に
有用なモノクローナル抗体はまだない。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、癌特に肺癌の組織診断及び血清診断に有
効な実用化しうるモノクローナル抗体について鋭意研究
を行なった結果本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、 「１．　　分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白
質抗原と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセ
チルガラクトサミンをもっ糖鎖である、次の性質を有す
るＩｇＭのクラスに属するモノクローナル抗体３５−Ｌ
ｕ６５゜（１）　　ヒト肺非小細胞癌と反応する。

（２）　　ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分に
のみ反応する。

（３）　　ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する
。

（４）正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの
気管支腺、唾液腺、腎尿細管、膵外分泌腺、直腸を除く
消化管上皮、移行上皮、扁平上皮表層、赤血球膜、血管
内皮と反応する。

（５）　　ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。

（６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
い。

２、分子量１００万以上（ゲルを適法）の糖蛋白質抗原
と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセチルガ
ラクトサミンをもっ糖鎖である。次の性質を有するＩｇ
Ｍのクラスに属するモノクローナル抗体８１−Ｌｕ６５
゜（１）　　ヒト肺゛非小細胞癌と反応する。

（２）　　ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分に
のみ反応する。

（３）　　ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する
。

（４）正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの
気管支腺、唾液腺と反応し、正常のヒトの腎尿細管、膵
外分泌腺、直腸を除く消化管上皮、赤血球膜、血管内皮
と反応しない。

（５）　　ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。

（６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
い。

３、分子量１００万以上（ゲルｆ適法）の糖蛋白質抗原
と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセチルガ
ラクトサミンをもつ糖鎖である、次の性質を有するＩｇ
Ｍのクラスに属するモノクローナル抗体１６５−Ｌｕ６
５゜（１）　　ヒト肺非小細胞癌と反応する。

（２）　　ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分に
のみ反応する。

（３）　　ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する
。

（４）　　正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒ
トの気管支腺、唾液腺、膵外分泌腺、直腸を除く消化管
上皮、移行上皮、腎尿細管、扁平上皮表層と反応し、正
常のヒトの赤血球膜、血管内皮と反応しない。

（５）　　ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。

（６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
い。」 に関するものである。

なお、以下の説明において述べる細胞、組織等は特にこ
とわりのない限り全てヒトの細胞、組織等である。

本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５＋ｉＡ型赤
血球膜と交叉反応し、Ａ型類似の抗原を認識し、又、本
発明のモノクローナル抗体８１−Ｌｕ６５及び１６５−
Ｌｕ６５もＡ型光血球とは反応しないがＡ型類似の抗原
を認識する。

本発明のモノクローナル抗体は、いずれもＡ型類似のＦ
ｏｒｓｓｍａｎ抗原とは異なる糖鎖を認識する。

本発明のモノクローナル抗体はいずれも後述する実施例
に示す様に、肺非小細胞癌、特に腺癌と高率に反応し、
肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分にのみ反応する。

又、胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌にも反応する。

本発明のモノクローナル抗体はいずれも腸上皮化生胃粘
膜と反応する。

本発明のモノクローナル抗体はいずれも正常の白血球、
精巣、膵ラ氏島、心筋、横紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞
上皮、神経組織と反応しな（）。

又、本発明の３種のモノクローナル抗体は次のような異
なる反応性を示す。

（１）モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５は、正常のヒ
トの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの気管支腺、唾液
腺、腎尿細管、膵外分泌腺、直腸を除く消化管上皮、移
行上皮、扁平上皮表層、赤血球膜、血管内皮と反応する
。

（２）モノクローナル抗体８１−Ｌｕ６５は、正常のヒ
トの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの気管支腺、唾液
腺と反応し、正常のヒトの腎尿細管、膵外分泌腺、直腸
を除く消化管上皮、赤血球膜、血管内皮と反応しない。

（３）モノクローナル抗体１６５−Ｌｕ６５は、正常の
ヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの気管支腺、唾
液腺、膵外分泌腺、直腸を除く消化管上皮、移行上皮、
腎尿細管、扁平上皮表層と反応し、正常のヒトの赤血球
膜、血管内皮と反応しない。

本発明の３種のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８
１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５が反応する肺巨細胞
癌組織パラフィン切片を０．５％過ヨウ素酸で処理した
ところ、これらの抗体の反応性が消失した。

又、モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６
５．１６５−ＬＬ＋６５が反応する肺巨細胞癌ヌードマ
ウス移植腫瘍のリン酸緩衝食塩水抽出液−ゼ、ヌラミニ
ダーゼ、アクチナーゼ等の酵素で処理したところ、グリ
コシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼやアク
チナーゼで処理した場合はこれらの抗体の反応性が低下
し、フコシダーゼやヌラミニダーゼで処理した場合はこ
れらの抗体の反応性に変化がなかった。

これらのことから、モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５
．８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５の反応する抗原
は糖蛋白質であり、これらの抗体の認識する抗原決定基
は末端にＮ−アセチルガラクトサミンをもつ糖鎖である
ことが分った。

本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌ
ｕ６５及び１６５−ＬＬＩ６５の認識する抗原決定基は
、末端にフコース及びシアル酸を持たない。

本発明のモノクローナル抗体が認識する抗原の分子量は
１００万以上（ゲル濾過法）である。

本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌ
ｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５は１ｇＭクラスに属し、モ
ノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５
のＬ鎖はＫである。

モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６５及
び１６５−Ｌｕ６５の認識する抗原の癌細胞内での分布
を酵素抗体法を用いて電顕、電顕で検索したところ、細
胞膜の表面のみならず、多くの癌では細胞質内にも存在
することが分った。

モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６５及
び１６５−Ｌｕ６５と反応する抗原は、肺腺癌組織中に
正常肺組織に比べ多量に存在する他、肺巨細胞癌無血清
培地上清中、肺巨細胞癌又は腺癌の担癌ヌードマウスの
血清中及び肺癌患者の血清中にも存在する。

本発明のモノクローナル抗体は例えば次のようにして製
造することが出来る。本発明のモノクローナル抗体が認
識する抗原でマウス又はラット等の動物を免疫する。（
この場合通常抗原を含む癌細胞が用いられるが、本発明
者らはその他に分化、増殖、転移等の癌細胞の生物学的
特性に重要な癌細胞の細胞膜成分を分離してこれを用い
て動物を免疫する方法及び癌関連抗原が分泌されている
担癌ヌードマウスの血清を用いて動物を免疫する方法も
採用した。）免疫された動物から抗体産生細胞を得、こ
れと骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン
化し、本発明のモノクローナル抗体を産生ずる融合細胞
を選択し、これを培養し抗体を回収する。

免疫法、融合法、融合細胞の選択等は通常の方法によっ
て行なうことが出来る。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。

先ず、マウスを肺癌細胞（又はその細胞膜成分又は肺癌
担癌動物の血清）で免疫する。免疫する動物はマウスに
限らずラット等のネズミ科の動物又はその他の動物を使
用してもよいが、通常はマウスを用いるのが好ましい。

例えばＢＡＬＢ／Ｃマウスに肺癌細胞（又はその細胞膜
成分又は肺癌担癌動物の血清）を数日〜数週間おきに数
回接種する。その後マウスより牌臓を摘出し遠心分離に
より抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖する能力を持
たないので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる。

自己増殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に好
ましい。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用い
るのが好ましく、又、抗体を産生じないものを選択する
のが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレ
ングリコール等の細胞融合剤と混合し細胞融合を行なう
。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数比で
２：１〜１０：１とするのが好ましい。得られた融合細
胞は限界希釈法により分離し、分離した融合細胞は増殖
させたのち、各穴（ウェル）において産生される抗体は
公知の方法例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、
各種細胞組織等と反応させ、その結果から所望の抗体を
産生ずるハイプリドーマを選択する。選択したハイプリ
ドーマを培養器中で培養し上清液から抗体を得ることも
出来るが、生体内例えばヌードマウス腹腔内にハイブリ
ドーマを注入し、マウスの腹腔内でハイブリドーマを増
殖させ、マウスの血清又は腹水から抗体を回収する方法
によることも出来る。

本発明の化ツクローナル抗体を作るために免疫原として
使用する癌細胞は特定の株のものに限定されな℃・。

（実施例） 実施例１ （１）モノクローナル抗体の製造 ３つの独立した細胞融合法により３種のモノクローナル
抗体を作製した。

免疫はり下のとおり３種類の方法で行なった。

八　癌細胞膜粗分画を用いる方法 男性の肺巨細胞癌患者の鎖骨上席リン パ節転移巣から腫瘍組織を摘出し、組織病理検索に用い
た残りの組織を２〜３爺大に細切し、胸腺欠損ヌードマ
ウス（ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕ）の皮下１（移植した。

腫瘍は局所で増殖し固型腫瘍を形成しマウスからマウス
への継代移植が可能な移植株として確立された。

この腫瘍（移植株）を摘出し、■ｅｌｔｒｉらの方法に
従って細胞膜粗分画を採取した。即ち、前記腫瘍（セ植
株）Ｉｇを、５　ｍｌのＨａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅ
ｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ（ｐｉ−（６，６）中
で゛細切しポリトロンにて３０秒ホモジェナイズした後
４°ｃ、８０００ｇで１５分間遠沈した。この沈渣を５
培量の５　ｍＭｔｒｉｓ−２ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆ
ｅｒ（ｐＨ７，２）に浮遊し、再度ポリトロンでホモジ
ェナイズした後遠沈（４℃、８０００ｇ、１５分間）し
た。その上清を超遠心 （１ｏｏｏ０ｇ）して得られた沈渣を癌細胞膜粗分画と
した。免疫には１回あたりこの３００Ｉ１ｇを、初回に
ばＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐ　−１ｅｔｅ　ａｄｊｕ
ｖａｎｔ　Ｏ，２ｍｌと、２，３回目にはＦｒｅｕｎｄ
’ｓ　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｑ、
２　ｍｌと混和し、マウス（Ｂ　Ａ、　Ｔ、　Ｔ３　／
　Ｃｎｕ／十）（７）腹腔内に２週間隔で投与した。最
終免疫には３０μｇを静注した。

（Ｂ）　　担活：マウス血清を用いる方法。

前記（Ａ＋における胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／
Ｃｎｕ／ｎｕ）の腫瘍か２〜３［有］犬に増殖した所で
、このヌードマウスをエーテル麻酔し、全採血を行なっ
た。これを５０００ｒｐｍ、５分間遠沈し、その上清と
して血清を得た。血清は使用まで −７０’Ｃで凍結保存された。免疫には１回０２ｍ１の
血清に同量の初回にはＦ　ｒｃｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅ
ｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｌを、２，３回目にはＦｒｅｕｎ
ｄ’ｓ　　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　　ａｄｊｕｖａｎｔ
を混合してマウス（ＢＡ、ＬＢ／Ｃｎｕ／＋）の腹腔内
に２週間隔で投与した。最終免疫には０．１ｍｌの血清
を静注した。

（ｑ　癌細胞を用いる方法 前記穴における腫瘍（移植株）から １０％ＦＣ８を加えたＲＰＭ１１６４０培地、３７°Ｃ
１５％ＣＯ□の環境下で増殖する培養細胞株を樹立した
。

この細胞を１回につき１０７個を０．２ｍ１Ｆ）　ａｄ
ｊｕｖａｎｉと共に？ウス（ＢＡ、ＬＢ／Ｃｎ　ｕ／−
１−）の腹腔内に２週間隔で゛３回投力した。最終免疫
には１０６個の細胞を静注した。

上記三種類の方法で免疫した各マウスは、それぞれ癌に
対する抗体価の上昇を確かめた後、各マウスからそれぞ
れ牌臓を摘出した。

この摘出した３つの牌臓を用い、それぞれについて独立
した細胞融合を行なった。

細胞融合の方法は、いずれの場合も渡辺等の方法（免疫
実験操作法ＶＩＩ、２９６３〜２９６７．１９７８）に
準じて行なった。

即ち、摘出した牌臓を細切したのち、ステンレスメツシ
ュを通し７．１５００　ｒｐｍ、　２００　ｇで遠沈し
て得た沈渣に５０ｍ１の０７％Ｎｌ−１４Ｃ１を加え赤
血球を除き、ＲＰＭＩ　１６４０で２回洗浄して得た牌
細胞ｘｉｏ’個に、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｘ　６３
−Ａｇ　８−Ｕ　１．　）　（以下Ｆ’３Ｕ１という）
をＲ，１）ＭＩ　１　Ｇ　／Ｉ　Ｏで２回洗浄して得た
Ｐ３Ｕ１　２Ｘ１０７個（５：１）を混合し、２００Ｏ
ｒｐｍ、２００ｇで１０分間遠沈した。沈殿細胞をよく
ときほぐした後、４５％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリ
コール４０００　（メルク社）を含有した３７℃、ｐＨ
７，４ノＲＰＭＩ　１．６４０、ｌ　ｍｌを加え８分間
処理した。

反応１分後からＲＰＭ１１６４０を徐々に加え総量４０
　ｍｌとして細胞融合を終了した。１０００叩１η、１
００ｇで遠沈後１０％牛脂児血清を含んだＲＰＭ１１６
４０を４０　ｍｌ加えて細胞浮遊液を作ノプテリン、チ
ミジン１０％牛脂児血清）に入れ換え、Ｃｏ５ｔａｒ　
ｍ１ｃｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅに、１ウエル
あたり０２ｍ１ずつ分注培養した。１０日目に上清を取
り出し、肺癌組織のホルマリン固定、パラフィン切片を
酵素抗体法で染色することにより癌と反応する抗体産生
の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中のノ
・イブリドーマを１ウエルあたり０３〜０．６個となる
よう限界希釈法によりクローニングを行なった。培地ハ
最初ｆ■Ｔ　（ヒボキサンチン、チミジン、１０％牛脂
児血清）を用い、ｆｅｅｄｅ　ｒ　　ｌ　ａｙｅｒとし
てＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋マウスの胸腺細胞５×１０５／
ウエルを加えた。次に］Ｏ％牛脂児血清を加えたＲ、Ｐ
Ｍ１１６４０培地に置換した。

限界希釈法によるクローニングは２回行なった。

又、大量培養には１ウエルのノ・イブリドーマを５ウエ
ル、２４つｘル（Ｆａｌｃｏｎ　３００８）と増量しな
がら、最終的には２５（支）２．４０　ｍｌ　、Ｎｕｎ
ｃｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌａｓｋ　　を用
いた。ｆｌａｓｋ培養で得た上清にＮａＮ３を０１％加
え４℃にて保存した。

（２）本発明のモノクローナル抗体の選定及びモノクロ
ーナル抗体による各種組織の染色本発明のモノクローナ
ル抗体選定のための各種組織の染色及び本発明のモノク
ローナル抗体による各種組織の染色は、ｌ−ｌ５ｕ　、
　Ｓ０Ｍ等の方法（Ｊ、　）ｌｉｓｔｏｃｈｅｍ９、Ｃ
ｙｔｏｃｈｅｍ、　、　２９．５７７〜５８０．１９８
１）に準じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複
合体法（Ａ　Ｂ　Ｃ法）によるホルマリン固定、パラフ
ィン切片の染色により行なった。即ち、広く一般的に用
いらオｔている１０％ホルマリン固定後パラフィン包埋
、薄切されたヒト肺癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正
常組織を脱パラフイン後、０３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノ
ールにて２０分間処理した。その後リン酸緩衝食塩水（
１）　Ｂ　Ｓ　）で洗った後、１０％正常豚血清を含む
ｌ）　Ｂ　Ｓにて３０分間処理した。次（・で、抗体を
含む溶液と室温で２時間反応させ、更に４°Ｃで一夜反
応さぜた。そしてＰＢＳで１５分間洗った後、ビオチン
化抗マウス免疫グロブリン（７５μｇ／ｍ１）にて３０
分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗った後、アビ
ジンＤＨ−ビオチ／化ベルオキンダーゼ複合体と室温で
３０分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗った後ジ
アミノベンチジン溶液（５０ｍｇジアミノベンチジン、
０００６％Ｈ２０□、トリスバッファーｐＨ７，６）に
て５〜１０分間反応させた。細胞核をヘマトキシリンに
て染色後、通常の方法で封入し検鏡した。

（３）結　果 １）　前記（１）の囚の方法により免疫し、たマウスの
胸臆を用いて細胞融合を行なった実験においては、３８
４ウエル中３４９ウエルについて産生抗体の反応性を調
べ、その中から前記モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５
の反応性を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマ１株を選択した。この選択したハイブリドーマ
の産生ずるモノクローナル抗体を３５−Ｌｕ６５と名付
げた。

１１）前記（１）の（Ｉ３）の方法により免疫したマウ
スの胸臆を用いて細胞融合を行なった実験においては、
４８０ウエル中１８０ウエルについて産性抗体の反応性
を調べ、その中から前記モノクローナル抗体１６５−Ｌ
ｕ６５の反応性を有するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマ１株を選択した。この選択したハイブリ
ドーマの産生ずるモノクローナル抗体を１６５−Ｌｕ６
５と名付けた。

：ｉり　　前記（１）の（ｑの方法により免疫したマウ
スの胸腺を用いて細胞融合を行なった実験においては、
４８０ウエル中３８０ウエルにつ℃・て産生抗体の反応
性を調べ、その中から前記モノクレーナル抗体８１−Ｌ
ｕ６５の反応性を有するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマ１株を選択した。この選択したハイブリ
ドーマの産生ずるモノクローナル抗体を８１．−Ｌｕ６
５と名付けた。

上記三種のハイブリドーマが産生ずる三種のモノクロー
ナル抗体を用℃・て、各種肺癌組織、その他の癌組織及
び正常組織との反応試験を上記（２）の方法に従って行
った。三種のモノクローナル抗体の各種肺癌組織、その
他の癌組織及び正常組織に対する反応性試験結果をそれ
ぞれ表−１、表−２及び表−３に示し５た。

表−１各種肺癌組織に対する各モノクレーナル抗体の反
応性 ※上皮様分化を示す部分にのみ反応 表中、（）内は陽性例数／症例数を示し、係はその百分
率を示す。

このように、三種のモノクローナル抗体はいずれも肺非
小細胞癌特に肺腺癌と高率に反応したか、肺小細胞癌で
は上皮様分化を示す部分にのみ反応した。このうち、高
分化型腺癌では細胞膜に強く染色され、中等度ないし低
分化腺癌、扁平上皮癌、太細胞癌では細胞膜及び細胞質
内に染色された。

このことは、本発明のモノクローナル抗体は肺癌の小細
胞５１モリと非小細胞癌との鑑別に有用であることを示
している。

表−２その他の各種癌組織に対する各モノクローナル抗
体の反応性 表中、（）内は陽性例数／症例数を示し、％はその百分
率を示す。

正常組織では、本発明のモノクローナル抗体　　　１３
５ＴＪＬＩ６５はＡ型の赤血球膜、血管内皮と反応する
か、この反応は抗Ａモノクローナル抗体（１）　Ａ、］
（Ｏ社製、Ｉ）ｅｎｍａｒｋ　）と比べ弱く、腫瘍組織
に極めて強く反応し、又、ヒツジ赤血球と本発明のモノ
クローナル抗体３５−Ｌｕ６５の認識する抗原ばｉ＋”
　Ｏｒ　ｓ　ｓ　ｍ　ａ　ｎ抗原以外のＡ型類似抗原と
考えられる。

本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンのクラ
スを知るため、本発明のモノクローナル抗体を寒天ゲル
内で、マウス１ｇの各クラス（１，ｇＡ、、　］−、ｇ
Ｍ、、　ＩｇＣｒ＋、１ｇＧ２ａ、Ｉｇ　Ｇ２ｂ　、　
Ｉｇ　Ｇ３ｆｇＤ、ＩｇＥ、に鎖、ヌ鎖）に対するウサ
ギ抗血清に対１〜で沈降反応を行なった。

その結果、本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５
．８１．−Ｌｕ６５及び＋　６５−Ｌｕ　６５はいずれ
も１ｇＭと判明しブー。　　　　　　　　　　　　　　
　　（一実施例３ （１）本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．８
１−Ｌｕ　６５及び１６５−：［、ｕ　６５を産生ずる
ハイブリドーマを、それぞれ、プリスタン処理後のＢＡ
ＬＢ／Ｃｎｕ／＋マウス三匹の腹腔内に別々に１０７個
投与した。１週間後、約５ｍｌの腹水を各マウスから採
取し、それぞれ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂによ
る濾過を行なった。

各分画から実施例２と同様にオフタロニー法で抗ＩｇＭ
血清と反応する分画をそれぞれについて得、これを鈍化
された抗体３５−Ｌｕ６５．８１−ＬＬ＋　６５及び１
６５−Ｌｕ　６５とした。

上記鈍化された各抗体は、Ｑｕｅｓｄｏｎ　等の方法（
＋Ｌ　ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｅｍ、　２７．１
１３１〜１１３９．１９７９）Ｋ従ってそれぞれヒオチ
ン化した。

２）　一方、肺巨細胞癌ヌードマウス移植株の腫瘍組織
１ｇを５　ｍｌの生理的食塩水中で、ポリトｏンを用い
てホモジェナイズした。

これを１００　Ｏｒｐｍ、１ｏ分間遠沈後、上清を５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂカラムによりゲル濾過し、
各分画をそれぞれ９６ウエルマイクロタイタープレート
にｏ、ｉｍｉずつ分注、２４時間後、各ウェルを５％牛
血清アルブミン化１）　Ｂ　Ｓにてブロッキング後、（
１）の項で作製したビオチン化抗体５μｇ／ｍｌを加え
、それぞれについてアビジンーヒオチンーペルオキシダ
ーゼ複合体法を行なった。反応は、１■／ｍ１のオルノ
フェニルジアミンを含む０１Ｍクエン酸バッファー（Ｉ
）Ｈ４，５）に００１５％ｌＩ２０□を加えて行ない、
その反応結果を０、Ｄ、　４５０でＤｙｎａｔｅｃｈ　
Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ　（ＭＲ。

５８０）を用心・て測定した。本発明の三種のモノクロ
ーナル抗体の認識する抗原はいずれの場合も■。付近に
検出され、その分子量は１０６ダルトン以上であった。

実施例４ （１）　　本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５
．８１−Ｌｕ　６５及び１６５−Ｌｕ６５のいずれもが
反応することが分っている肺巨細胞癌組織のパラフィン
切片を脱バラ後、０．２Ｕ／ｍｌのヌラミニダーゼで３
７℃、２時間処理した。

又、一方、０５％の過ヨウ素酸で３７°Ｃ，１時間処理
した後、実施例１の（２）に示したアビジン−ビオチン
−ペルオキシダーゼ複合体法による酵素抗体法で染色し
た所、本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ　６５．
８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ　６５は０５％過ヨウ
素酸で処理したものではいずれの場合も反応性が消失し
た。一方、ヌラミニダーゼで処理したものでは、いずれ
の場合も反応性に変化はなかった。

（２）　　実施例３の（２）で得られた■。分画を抗原
の粗分側としてその１　ｍｌを２０倍にＰＢＳで希釈し
、９６ウエルマイクロタイタープレートに１００μｍ／
ウェル分注した。２４時間後各ウェルなヌラミニダーゼ
、ミックストグリコシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−
Ｎ−アセチルガ２クトサミニダーゼ、アクチナーセの各
酵素で３７°Ｃ，２時間処理した。

即ち、ヌラミニダーゼは０．２Ｕ／ｍｌ及び０．０４　
Ｕ／ｍｌ　Ｋなるよう［０，２ｍＭのＰＭＳＴを含むリ
ン酸緩衝液（ＰＢ　）　（ｐＨ６，４）　　で希釈し、
グリコ／ダーゼは１ｒｔｖ、／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍ
１になるように０．２　ｍＭ　ＰＭＳ　Ｆを含むＰＢ（
ｐｉ−Ｉ　６．４　）で希釈し、アクチナーゼは２．５
　＋１１ｇ／ｍｌ及び０．２５　ｍｇ　／　ｍｌになる
ようにＰＢ（ｐＩ−１６，４）−ｃ−希釈Ｌ　、α−フ
コシダーゼとα−Ｎ−アセチルガラクトザミニダーゼは
０．２ｍＭＰＭＳＦを含むＰＩ３　（ｐＨ６，４）で５
０ｍＵ／ｍｌ及び１０＋ｎＵ７’ｍｌに希釈し、それぞ
れ１ｏｏμｌ／ウェル加えた。

２時間後、Ｐ］３Ｓ　（ｐＩ−Ｉ７．５　）　テ数回洗
浄Ｌ５％ＮＳＳでブロッキングした後、ビチオン化した
モノクローナル抗体３５−Ｌｕ　６５．８　ｊ−Ｌｕ　
６５及び１６５−Ｌｕ　６５を５　ｉｔｇ／ｍｌに５％
ＮＳＳで希釈したものを、各ウェルに５０μｍ／ｍ１加
えた。

実施例３の（２）と同様にしてＡＢＣ法を行ない１ｍｇ
／ｍＪのＯＰＤを反応させ、Ｏ，Ｄ、　４５０の吸光度
をＤｙｎａｔｅｃｈ　Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ　ＭＲ５８
０で測定した。

その結果、フコシダーゼ、ヌラミニダーゼで処理したも
のでは、本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５．
８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ　６５のいずれも反応
性に変化がなかったが、Ｎ−アセチルガラクトサミニダ
ーゼ、アクチナーゼ、ミクストグリコシダーゼにて処理
した場合は、（・ずれの抗体も反応性が低下した。

以上の結果より、本発明のモノクローナル抗体３５−Ｌ
ｕ　６５．８１−Ｌｕ　６５及び１６５−Ｌｕ　６５の
認識する抗原は糖蛋白で、その抗原決定基は本発明のい
ずれのモノクローナル抗体の場合も末端にＮ−アセチル
ガラクトサミンを持っ糖錯であることがわかる。

本発明の三つのモノクローナル抗体が認識する抗原決定
基はシアル酸及びフコースを持たないこともわかる。

実施例５ （１）実施例３の（２）で得られた腫瘍組織ホモジエネ
ートの上清５ｍｌに２ＭＰＣＡ　（過塩素酸）を５　ｍ
ｌ加え、よく混和し、２時間後遠沈（２０００ｒｐｍ、
２０分）し、上清をセルロース透析膜で水道水に対し２
日間、０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）
に対し１日間透析を行なった。

寒天ゲル内にて、こうして得られた腫瘍組織ホモジエネ
ート上清とそのＰＣＡ抽出液に対し、本発明のモノクロ
ーナル抗体３５−Ｌｕ　６５．８１−Ｌｕ　６５及び１
６５−Ｌｕ６５で沈降反応を行なった。

その結果、３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ　６５及び１６
５−Ｌｕ６５の３抗体は、ホモジエネート上清に対して
も、ＰＣＡ抽出液に対しても、互いに部分的に融合する
沈降線を作った。

（２）　　ビオチン化した３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ
６５及び１６５−Ｌｕ６５の３抗体５μｇ／ｍ１ｌｃ、
ビオチン化されていな〜・３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ
６５或いは１６５−Ｌｕ６５を０．５ｍｇ／ｍｌ、０．
０５ｍｇ／ｍｌ及び５　μｇ　／ｍｌ加え、実施例３の
（２）で得られた■。分割に対し、ＥＩＡを行ったとこ
ろ、ビオチン化抗体３５−Ｌｕ　６５は抗体３５−ＬＬ
＋　６５のみによって、ビオチン化抗体８１−Ｌｕ　６
５は抗体３５−４ｕ　６５及び８１−Ｌｕ６５によって
、又、ビオチン化抗体１６５−Ｌｕ６５は抗体３５−Ｌ
ｕ　６５．８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５によっ
て抗原との結合が阻害された。

（３１９６ウエルマイクロタイタープレートにビオチン
化してない３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６５及び１６５
−Ｌｕ　６５の各抗体を５μｇ／ｍ１の濃度で、１００
μｌ／ウェル分注し、２４時間後５％ＮＳＳで３０分間
ブロック後、腫瘍組織ホモジエネート上清を１００μｍ
／ウェル加え２時間反応させ、更にプレートに固着した
抗体とは異なるビオチン化抗体５μｇ／ｍ１を５０μｌ
／ウェル加えＡＢＣ法にてｏＰＤ（０−フエニレンジア
ミンニ塩酸塩）全反応させた。その結果、３５−ＬＬ＋
６５．８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌ＋４６５の３抗体
間では固着した抗体とビオチン化抗体をどのように組み
変えても陽性であった。

上記（１）〜（３）の結果より、本発明のモノクローナ
ル抗体３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌ
ｕ６５が認識する抗原決定基は同−分子上に存在し、か
つ、それらの間には共通部分があることがわかる。

実施例６ ９６ウエルマイクロタイタープレートに固相化したモノ
クローナル抗体と、ビオチン化抗体で、二抗体サンドイ
ッチＥＬＩＳＡで、様々のサンプルの抗原活性を測定し
た。

（１）肺癌手術材料から肺癌の腫瘍組織と、同一患者の
正常肺組織を得、−２０’ににて保存した。解凍後、５
倍量の生食水を加えポリトロンでホモジェナイズし、遠
沈（２０００ｒｐｍ、１０ｍ１ｎ　）　（ｆｌその上清
の抗原活性を測定した。

すると肺腺癌では９例中５例で正常肺に比し２倍以上の
高い抗原活性がみられたが、肺扁平上皮癌組織では５例
中５例とも抗原活性は正常肺と差がなかった。

との二抗体法サンドイッチＥＬＩＳＡの実施において、
プレートに固着する無標織抗体に８１−Ｌｕ６５抗体を
用いビオチン化抗体に３５−Ｌｕ６５を用いた場合は、
３５−Ｌｕ６５．８１−Ｌｕ６５及び１６５−Ｌｕ６５
の抗体を組み合わせた９種の内地の８種の組み合わせて
比べ、感度、腫瘍特異性とも高く、以下のＥＬＩＳＡで
はもっばらこの組合わせを用いた。

（２）二種類の肺巨細胞癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌及び
二種類の肺小細胞癌のヌードマウス移植肺癌の担癌マウ
ス血清中の抗原活性を測定したところ、一種類の肺巨細
胞癌及び肺腺癌につ℃・ては、担癌マウス血清中に正常
マウスに比べ著しく高い抗原活性がみられた。、しかし
、扁平上皮癌、小細胞癌で養した後の培養」二清中にも
、対照の無血清培地に比べ高い抗原活性がみられた。ま
た、１０％ＦＣ８を加えた培地でも同様な結果を得た。

（４）肺腺癌患者の血清中にも１４例中６例で高い抗原
活性かみら７ｔた。一方、肺扁平上皮癌患者の血清中に
は、４例中４例とも抗原活性が検出できなかった。又、
Ａ型血液型を含む健康人の血清中には、１０例中１０例
とも抗原活性を検出できなかった。

実施例７ ポリビニールクロライド９６ウエルマルチタイタープレ
ートに１ｍｇ／ｍｌのポリ−ｌ−リジンを５０１ｔｌ／
Ａ−注し３０分後人１、Ａ２．０、■３各型赤血球及び
ヒツジ赤血球（Ｓ　Ｒ，Ｂ　Ｃ）、肺巨細胞癌細胞をそ
れぞれＰＢＳ　（ｐＨ７，４）に浮遊したものを４×１
０５個１５０μｌ／ウェルとなるように分注した。０５
％カグルタールアルデヒドで固定し、これらに対し３５
−Ｌｕ６５．８１−ＬＬ＋６５及び１６５−Ｌ１１６５
の各抗体と抗Ａモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）、抗Ｆ
ｏｒｓｓｍａｎ抗血清（ＤＩＦＣＯ）で実施例３の（２
）と同様なＥＩＡを行なった。

その結果、モノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５はＡ、血
球、５ＲＢＣと弱く反応し、肺巨細胞癌細胞と強く反応
した。モノクローナル抗体８１−Ｌｕ６５及び１６５−
Ｌｕ　６５は肺巨細胞癌細胞のみと強く反応した。抗Ａ
モノクローナル抗体はＡ。

血球と強く反応し、Ａ２血球、５ＲＢＣ１肺巨細胞癌細
胞と弱く反応した。又、抗Ｆｏｒｓｓｍａｎ血清は、Ｓ
ＩＲ，ＢＣと強く反応したがＡ１血球、肺巨細胞癌細胞
とも弱く反応した。

以上のとおり、本発明のモノクローナル抗体３５−Ｉ、
ｕ６５．８１−Ｌｕ　６５及び１６５−Ｌｔ１６５はＦ
ｏｒｓｓｍａｎとは異なるＡ型類似の抗原を認識してい
る。

８１、−Ｌｕ６５．１６５−Ｌｕ６５は実施例５で示さ
れる様に３５−Ｌｕ６５と部分的に共通の抗原決定基を
認識しておりＡ型の正常組織の一部と反応するが、抗フ
ォルスマン血清、抗Ａモノクローナル抗体と各種赤血球
に対する反応性が異なり、同様にフォルスマン抗原とは
異なるＡ型類似の抗原を認識している。

（発明の効果）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原
   と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセチルガ
   ラクトサミンをもつ糖鎖である、次の性質を有するＩｇ
   Ｍのクラスに属するモノクローナル抗体３５−Ｌｕ６５
   。 （１）ヒト肺非小細胞癌と反応する。 （２）ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分にのみ
   反応する。 （３）ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する。 （４）正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの
   気管支腺、唾液腺、腎尿細管、膵 外分泌腺、直腸を除く消化管上皮、移行上 皮、扁平上皮表層、赤血球膜、血管内皮と 反応する。 （５）ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。 （６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
   紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
   い。 ２、分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原
   と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセチルガ
   ラクトサミンをもつ糖鎖である、次の性質を有するＩｇ
   Ｍのクラスに属するモノクローナル抗体８１−Ｌｕ６５
   。 （１）ヒト肺非小細胞癌と反応する。 （２）ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分にのみ
   反応する。 （３）ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する。 （４）正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの
   気管支腺、唾液腺と反応し、正常 のヒトの腎尿細管、膵外分泌腺、直腸を除 く消化管上皮、赤血球膜、血管内皮と反応 しない。 （５）ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。 （６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
   紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
   い。 ３、分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原
   と反応し、認識する抗原決定基は末端にＮ−アセチルガ
   ラクトサミンをもつ糖鎖である、次の性質を有するＩｇ
   Ｍのクラスに属するモノクローナル抗体１６５−Ｌｕ６
   ５。 （１）ヒト肺非小細胞癌と反応する。 （２）ヒト肺小細胞癌では上皮様分化を示す部分にのみ
   反応する。 （３）ヒトの胃癌、膵癌、結腸癌、乳癌と反応する。 （４）正常のヒトの気管支上皮及び血液型Ａ型のヒトの
   気管支腺、唾液腺、膵外分泌腺、 直腸を除く消化管上皮、移行上皮、腎尿細 管、扁平上皮表層と反応し、正常のヒトの 赤血球膜、血管内皮と反応しない。 （５）ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。 （６）正常のヒトの白血球、精巣、膵ラ氏島、心筋、横
   紋筋、平滑筋、肝、脾、肺胞上皮、神経組織と反応しな
   い。