JPH0145359B2 - - Google Patents
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- JPH0145359B2 JPH0145359B2 JP59101769A JP10176984A JPH0145359B2 JP H0145359 B2 JPH0145359 B2 JP H0145359B2 JP 59101769 A JP59101769 A JP 59101769A JP 10176984 A JP10176984 A JP 10176984A JP H0145359 B2 JPH0145359 B2 JP H0145359B2
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
現在、細胞融合法を用いたモノクローナル抗体
の作製が確立されつつあり、多くの研究者の手に
よつて、癌の診断、治療に役立つ癌関連抗原を認
識する新しいモノクローナル抗体の作製が試みら
れている。 従来、癌関連抗原を認識するモノクローナル抗
体の作製は、胸腺を有する（即ちＢ細胞及びＴ細
胞のいずれをも有する）マウス又はラツト等の動
物に癌細胞を投与して、動物を癌細胞で免疫し、
該動物から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞
を融合し、得られた融合細胞をクローン化し、所
望の抗体を産生する融合細胞を選択し、これを増
殖させることにより行つておりこれ以外の方法は
全く行われておらず、又、提案もされていない。 本発明者らは、モノクローナル抗体の作製を前
記の方法とは異なつた方法で行うことが出来るこ
とを見出し本発明を完成した。 即ち、本発明は、胸腺を有さない動物に癌細胞
又は癌組織を投与又は移植し、これを該動物内で
増殖させ、次に該動物にリンパ球Ｔ細胞又はリン
パ球Ｔ細胞及びＢ細胞を投与し、次いで該動物か
ら抗体産生Ｂ細胞を得、これを骨髄腫細胞と融合
させ、得られた融合細胞をクローン化し、癌細胞
又は癌組織に対する抗体を産生する融合細胞を選
択しこれを増殖させることを特徴とするモノクロ
ーナル抗体の製造法に関するものである。 胸腺を有さない動物としては、具体的にはヌー
ドマウスnu／nu、ヌードラツトrnu／rnu等があ
るが、胸腺を持たずＴ細胞を有さない動物（但し
ヒトを除く）ならいずれも使用可能である。通常
は胸腺を持たないマウスを使用するのが便利であ
る。 胸腺を持たない動物は、体内にリンパ球Ｔ細胞
が生成されない為、異種移植に際しリンパ球Ｂ細
胞が体内に存在していても抗体を産生することが
出来ない。この胸腺を有さない動物に癌細胞又は
癌組織を投与又は移植すると癌細胞又は癌組織は
増殖する。癌細胞又は癌組織としてはヒト又はヒ
ト以外の動物の癌細胞又は癌組織が使用できる。
又、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、子宮癌、
食道癌、腎癌、直腸癌、胆管癌、甲状腺癌等種々
のものが使用出来、特に限定されない。癌細胞又
は癌組織の投与又は移植量は特に限定されない
が、通常は癌組織を１mm〜４mm角位の大きさに細
切しこれをマウス等の動物に１個〜数個移植する
のが好ましい。移植する癌組織の数は多くしても
かまわない。移植する場所は動物の皮下、腹腔内
等が好ましい。又、癌細胞の投与の場合、投与量
は103〜108個の細胞を投与するのが望ましい。 癌細胞又は癌組織を投与又は移植した後該動物
を飼育すると、癌細胞又は癌組織は増殖し腫瘍の
かたまりが成長してくる。例えば１〜４mm角の癌
組織を胸腺を持たないマウスの皮下に移植した場
合、１ケ月〜数ケ月後に腫瘍最大径が１cm位に成
長する。腫瘍が成長した時点で、例えば腫瘍最大
径が５mm〜５cm位に成長した時点でこの腫瘍を持
つた胸腺欠損動物にリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球
Ｔ細胞及びＢ細胞を投与する。投与するリンパ球
Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞としては、
同種の動物のものを使用する。 投与するリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及
びＢ細胞の投与量は、胸腺を持ち抗体産生能力を
有する同種の動物一頭分の脾臓に含まれるＴ細胞
又はＴ細胞及びＢ細胞の0.1〜５倍程度とするの
が好ましい。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞の投与は１回行え
ばよく、数回に分けて投与する必要は全くない。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与すると、投
与したＴ細胞の指示によつて、抗体産生能力に欠
陥のあつた動物の体内において、該動物に存在し
ていた又は新たに投与したＢ細胞により腫瘍
（癌）に対する抗体が産生される。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与後しばらく
すると、腫瘍のかたまりは縮小又は消失する。腫
瘍のかたまりが縮小又は消失した時点で、例えば
腫瘍のかたまりの大きさが1/2以下となるか、又
は腫瘍のかたまりが消失した所で該動物から脾臓
（抗体産生細胞を含む）を摘出し、これを骨髄腫
細胞と融合する。抗体産生細胞はＢ細胞であり、
Ｂ細胞は体内を循環するが、脾臓等に蓄積するの
で脾臓を摘出して使用するのが好ましいが、必ら
ずしも脾臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。 細胞融合は通常の方法によつて行うことが出来
る。即ち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチ
レングリコール等の細胞融合剤と混合し細胞融合
を行う。骨髄腫細胞としては同種の動物のものを
用いるのが好ましく、又、抗体を産生しないもの
を選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫
細胞の使用割合は、細胞数比で２：１〜10：１と
するのが好ましい。得られた融合細胞は限界希釈
法により分離し、分離した融合細胞は増殖させた
のち、各穴（ウエル）において産生される抗体は
公知の方法例えば螢光抗体法又は細胞抗体法等に
より、各種細胞組織等と反応させ、その結果から
所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択す
る。選択したハイブリドーマを培養器中で培養し
上清液から抗体を得ることも出来るが、生体内例
えばヌードマウス腹腔内にハイブリドーマを注入
し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌ
ードマウス血清あるいは腹水から抗体を回収する
方法によることも出来る。 従来の方法によれば、癌細胞を動物体内に何回
も投与する必要があり面倒であつたが、本発明で
はそのような必要がなく簡単である。更に本発明
によれば癌細胞又は癌組織が体内で増殖した動物
を用いるので、動物体内に常に癌細胞が多量に存
在しており、従つて癌関連抗原を認識する抗体を
産生するＢ細胞が大量に生産されると考えられ、
細胞融合による目的とするハイブリドーマの選択
も効率良く行えるものと思われる。 実施例 １ (1) モノクローナル抗体の製造 ヒト胃低分化型腺癌のヌードマウス移植株
（St−４）を２〜３mmに細切しBALB／Ｃ
nu／nu（胸線欠損ヌードマウス）（リンパ球Ｔ
細胞を持たない）の皮下に移植し、約１ケ月半
後、腫瘍最大径が10mmとなつた。一方、
BALB／Ｃ nu／＋ヌードマウスの一匹の脾
臓を細切後、ステンレスメツシユを通し生理食
塩水0.5mlを用いリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞浮
遊液としこれを前述のBALB／Ｃ nu／nu担
癌マウス（約10mmの腫瘍を持つたBALB／Ｃ
nu／nu）の腹腔内に投与した。 投与後１ケ月で腫瘍は消失した。そこでSt−
４のホモジエネート0.2mlをBALB／Ｃ nu／
nuの腹腔に投与した。（この投与は行わなくて
もかまわない。）その３日後にマウスから脾臓
を摘出した。 細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験
操作法、2963〜2967、1978）に準じて行つ
た。 即ち、摘出した脾臓を細切したのち、ステン
レスメツシユを通し、1500rpm、200Gで遠沈
して得た沈渣に50mlの0.7％NH4Clを加え赤血
球を除き、RPMI−1640で２回洗浄して得た脾
臓胞１×108個に、マウス骨髄腫細胞（P3−
X63−Ag8−U1）（以下P3U1という）をRPMI
−1640で２回洗浄して得たP3U1 ２×107（５：
１）を混合し、2000rpm、200Gで10分間遠沈
した。沈殿細胞をよくときほぐした後、45％
（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール4000（メル
ク社）を含有した37℃、PH7.4のRPMI−1640、
１mlを加え８分間処理した。 反応１分後からRPMI−1640を徐々に加え総
量40mlとして細胞融合を終了した。1000rpm、
100Gで遠沈後10％牛胎児血清を含んだRPMI
−1640 40mlを加えて細胞浮遊液を作り37℃、
５％CO2充填培養液中で培養した。24時間後、
HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン10％牛胎児血清）に入れ換え、
Costar micro culture plateに、１ウエルあた
り0.2mlずつ分注培養した。10日目に上清を取
り出し、胃癌組織のホルマリン固定、パラフイ
ン切片を酵素抗体法で染色することにより抗体
産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示した
ウエル中のハイブリドーマを１ウエルあたり
0.6個となるよう限界希釈法によりクローニン
グを行つた。培地は最初HT（ヒポキサンチン、
チミジン、10％牛胎児血清）を用い、feeder
layerとしてBALB／Ｃ nu／＋マウスの胸腺
細胞５×105／ウエルを加えた。次に10％牛胎
児血清を加えたRPMI−1640培地に置換した。 限界希釈法よるクローニングは２回行つた。 又、大量培養には１ウエルのハイブリドーマ
を５ウエル、24ウエル（Falcon3008）と増量
しながら、最終的にはFalcon tissue culture
flaskを用いた。flask培養で得た上清にNaN3
を0.1％加え４℃にて保存した。 (2) モノクローナル抗体の選定及びモノクローナ
ル抗体による各種組織の染色 モノクローナル抗体選定のための各種組織の
染色及び該モノクローナル抗体による各種組織
の染色はHsu、S.M.等の方法（J.Histochem.
Cytochem.、29、577〜580、1981）に準じてア
ビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法
によるホルマリン固定、パラフイン切片の染色
により行つた。即ち広く一般的に用いられてい
る10％ホルマリン固定後、パラフイン包埋、薄
切されたヒト胃癌組織、他のヒト癌組織及びヒ
ト正常組織を脱パラフイン後、0.3％H2O2を含
むメタノールにて20分間処理した。その後リン
酸緩衝食塩水（PBS）で洗つた後、10％正常
豚血清を含むPBSにて30分間処理した。次い
で、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、
更に４℃で一夜反応させた。そしてPBSで15
分間洗つた後、ビチオン化抗マウス免疫グロブ
リン（7.5μｇ／ml）にて30分間処理した。これ
をPBSで15分間洗つた後アビジンDH−ビオチ
ン化ペルオキシダーゼ複合体と室温で30分間処
理した。これをPBSで15分間洗つた後、ジア
ミノベンチジン溶液（50mgジアミノベンチジ
ン、0.006％H2O2、トリスバツフアーPH7.6）に
て５〜10分間反応させた。細胞核をヘマトキシ
リンにて染色後通常の方法で封入し検鏡した。 (3) 結果 400ウエル中78ウエルについて産生抗体の反
応性を調べ、その中から、ヒトの胃癌、大腸
癌、膵癌、乳癌、肺癌、胆管癌、子宮癌、食道
癌と反応し、又、正常の顎下腺、近位尿細管上
皮、気管支腺、扁平上皮角化層、膵ラ氏島、肝
細胞膜、十二指腸腺と反応し、腸上皮化生胃粘
膜とも反応するが、正常の前立腺、胆管上皮、
膵管上皮とは反応しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ１株を選択した。 選択したハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル抗体St−４−39を用いて、ヒトの各種癌
組織又は正常組織との反応試験を上記(2)の方法
に従つて行つた。 (A) 表−１にモノクローナル抗体St−４−39の
各種癌組織に対する反応性試験結果を示し
た。
の作製が確立されつつあり、多くの研究者の手に
よつて、癌の診断、治療に役立つ癌関連抗原を認
識する新しいモノクローナル抗体の作製が試みら
れている。 従来、癌関連抗原を認識するモノクローナル抗
体の作製は、胸腺を有する（即ちＢ細胞及びＴ細
胞のいずれをも有する）マウス又はラツト等の動
物に癌細胞を投与して、動物を癌細胞で免疫し、
該動物から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞
を融合し、得られた融合細胞をクローン化し、所
望の抗体を産生する融合細胞を選択し、これを増
殖させることにより行つておりこれ以外の方法は
全く行われておらず、又、提案もされていない。 本発明者らは、モノクローナル抗体の作製を前
記の方法とは異なつた方法で行うことが出来るこ
とを見出し本発明を完成した。 即ち、本発明は、胸腺を有さない動物に癌細胞
又は癌組織を投与又は移植し、これを該動物内で
増殖させ、次に該動物にリンパ球Ｔ細胞又はリン
パ球Ｔ細胞及びＢ細胞を投与し、次いで該動物か
ら抗体産生Ｂ細胞を得、これを骨髄腫細胞と融合
させ、得られた融合細胞をクローン化し、癌細胞
又は癌組織に対する抗体を産生する融合細胞を選
択しこれを増殖させることを特徴とするモノクロ
ーナル抗体の製造法に関するものである。 胸腺を有さない動物としては、具体的にはヌー
ドマウスnu／nu、ヌードラツトrnu／rnu等があ
るが、胸腺を持たずＴ細胞を有さない動物（但し
ヒトを除く）ならいずれも使用可能である。通常
は胸腺を持たないマウスを使用するのが便利であ
る。 胸腺を持たない動物は、体内にリンパ球Ｔ細胞
が生成されない為、異種移植に際しリンパ球Ｂ細
胞が体内に存在していても抗体を産生することが
出来ない。この胸腺を有さない動物に癌細胞又は
癌組織を投与又は移植すると癌細胞又は癌組織は
増殖する。癌細胞又は癌組織としてはヒト又はヒ
ト以外の動物の癌細胞又は癌組織が使用できる。
又、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、子宮癌、
食道癌、腎癌、直腸癌、胆管癌、甲状腺癌等種々
のものが使用出来、特に限定されない。癌細胞又
は癌組織の投与又は移植量は特に限定されない
が、通常は癌組織を１mm〜４mm角位の大きさに細
切しこれをマウス等の動物に１個〜数個移植する
のが好ましい。移植する癌組織の数は多くしても
かまわない。移植する場所は動物の皮下、腹腔内
等が好ましい。又、癌細胞の投与の場合、投与量
は103〜108個の細胞を投与するのが望ましい。 癌細胞又は癌組織を投与又は移植した後該動物
を飼育すると、癌細胞又は癌組織は増殖し腫瘍の
かたまりが成長してくる。例えば１〜４mm角の癌
組織を胸腺を持たないマウスの皮下に移植した場
合、１ケ月〜数ケ月後に腫瘍最大径が１cm位に成
長する。腫瘍が成長した時点で、例えば腫瘍最大
径が５mm〜５cm位に成長した時点でこの腫瘍を持
つた胸腺欠損動物にリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球
Ｔ細胞及びＢ細胞を投与する。投与するリンパ球
Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞としては、
同種の動物のものを使用する。 投与するリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及
びＢ細胞の投与量は、胸腺を持ち抗体産生能力を
有する同種の動物一頭分の脾臓に含まれるＴ細胞
又はＴ細胞及びＢ細胞の0.1〜５倍程度とするの
が好ましい。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞の投与は１回行え
ばよく、数回に分けて投与する必要は全くない。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与すると、投
与したＴ細胞の指示によつて、抗体産生能力に欠
陥のあつた動物の体内において、該動物に存在し
ていた又は新たに投与したＢ細胞により腫瘍
（癌）に対する抗体が産生される。 Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与後しばらく
すると、腫瘍のかたまりは縮小又は消失する。腫
瘍のかたまりが縮小又は消失した時点で、例えば
腫瘍のかたまりの大きさが1/2以下となるか、又
は腫瘍のかたまりが消失した所で該動物から脾臓
（抗体産生細胞を含む）を摘出し、これを骨髄腫
細胞と融合する。抗体産生細胞はＢ細胞であり、
Ｂ細胞は体内を循環するが、脾臓等に蓄積するの
で脾臓を摘出して使用するのが好ましいが、必ら
ずしも脾臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。 細胞融合は通常の方法によつて行うことが出来
る。即ち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチ
レングリコール等の細胞融合剤と混合し細胞融合
を行う。骨髄腫細胞としては同種の動物のものを
用いるのが好ましく、又、抗体を産生しないもの
を選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫
細胞の使用割合は、細胞数比で２：１〜10：１と
するのが好ましい。得られた融合細胞は限界希釈
法により分離し、分離した融合細胞は増殖させた
のち、各穴（ウエル）において産生される抗体は
公知の方法例えば螢光抗体法又は細胞抗体法等に
より、各種細胞組織等と反応させ、その結果から
所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択す
る。選択したハイブリドーマを培養器中で培養し
上清液から抗体を得ることも出来るが、生体内例
えばヌードマウス腹腔内にハイブリドーマを注入
し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌ
ードマウス血清あるいは腹水から抗体を回収する
方法によることも出来る。 従来の方法によれば、癌細胞を動物体内に何回
も投与する必要があり面倒であつたが、本発明で
はそのような必要がなく簡単である。更に本発明
によれば癌細胞又は癌組織が体内で増殖した動物
を用いるので、動物体内に常に癌細胞が多量に存
在しており、従つて癌関連抗原を認識する抗体を
産生するＢ細胞が大量に生産されると考えられ、
細胞融合による目的とするハイブリドーマの選択
も効率良く行えるものと思われる。 実施例 １ (1) モノクローナル抗体の製造 ヒト胃低分化型腺癌のヌードマウス移植株
（St−４）を２〜３mmに細切しBALB／Ｃ
nu／nu（胸線欠損ヌードマウス）（リンパ球Ｔ
細胞を持たない）の皮下に移植し、約１ケ月半
後、腫瘍最大径が10mmとなつた。一方、
BALB／Ｃ nu／＋ヌードマウスの一匹の脾
臓を細切後、ステンレスメツシユを通し生理食
塩水0.5mlを用いリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞浮
遊液としこれを前述のBALB／Ｃ nu／nu担
癌マウス（約10mmの腫瘍を持つたBALB／Ｃ
nu／nu）の腹腔内に投与した。 投与後１ケ月で腫瘍は消失した。そこでSt−
４のホモジエネート0.2mlをBALB／Ｃ nu／
nuの腹腔に投与した。（この投与は行わなくて
もかまわない。）その３日後にマウスから脾臓
を摘出した。 細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験
操作法、2963〜2967、1978）に準じて行つ
た。 即ち、摘出した脾臓を細切したのち、ステン
レスメツシユを通し、1500rpm、200Gで遠沈
して得た沈渣に50mlの0.7％NH4Clを加え赤血
球を除き、RPMI−1640で２回洗浄して得た脾
臓胞１×108個に、マウス骨髄腫細胞（P3−
X63−Ag8−U1）（以下P3U1という）をRPMI
−1640で２回洗浄して得たP3U1 ２×107（５：
１）を混合し、2000rpm、200Gで10分間遠沈
した。沈殿細胞をよくときほぐした後、45％
（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール4000（メル
ク社）を含有した37℃、PH7.4のRPMI−1640、
１mlを加え８分間処理した。 反応１分後からRPMI−1640を徐々に加え総
量40mlとして細胞融合を終了した。1000rpm、
100Gで遠沈後10％牛胎児血清を含んだRPMI
−1640 40mlを加えて細胞浮遊液を作り37℃、
５％CO2充填培養液中で培養した。24時間後、
HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン10％牛胎児血清）に入れ換え、
Costar micro culture plateに、１ウエルあた
り0.2mlずつ分注培養した。10日目に上清を取
り出し、胃癌組織のホルマリン固定、パラフイ
ン切片を酵素抗体法で染色することにより抗体
産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示した
ウエル中のハイブリドーマを１ウエルあたり
0.6個となるよう限界希釈法によりクローニン
グを行つた。培地は最初HT（ヒポキサンチン、
チミジン、10％牛胎児血清）を用い、feeder
layerとしてBALB／Ｃ nu／＋マウスの胸腺
細胞５×105／ウエルを加えた。次に10％牛胎
児血清を加えたRPMI−1640培地に置換した。 限界希釈法よるクローニングは２回行つた。 又、大量培養には１ウエルのハイブリドーマ
を５ウエル、24ウエル（Falcon3008）と増量
しながら、最終的にはFalcon tissue culture
flaskを用いた。flask培養で得た上清にNaN3
を0.1％加え４℃にて保存した。 (2) モノクローナル抗体の選定及びモノクローナ
ル抗体による各種組織の染色 モノクローナル抗体選定のための各種組織の
染色及び該モノクローナル抗体による各種組織
の染色はHsu、S.M.等の方法（J.Histochem.
Cytochem.、29、577〜580、1981）に準じてア
ビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法
によるホルマリン固定、パラフイン切片の染色
により行つた。即ち広く一般的に用いられてい
る10％ホルマリン固定後、パラフイン包埋、薄
切されたヒト胃癌組織、他のヒト癌組織及びヒ
ト正常組織を脱パラフイン後、0.3％H2O2を含
むメタノールにて20分間処理した。その後リン
酸緩衝食塩水（PBS）で洗つた後、10％正常
豚血清を含むPBSにて30分間処理した。次い
で、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、
更に４℃で一夜反応させた。そしてPBSで15
分間洗つた後、ビチオン化抗マウス免疫グロブ
リン（7.5μｇ／ml）にて30分間処理した。これ
をPBSで15分間洗つた後アビジンDH−ビオチ
ン化ペルオキシダーゼ複合体と室温で30分間処
理した。これをPBSで15分間洗つた後、ジア
ミノベンチジン溶液（50mgジアミノベンチジ
ン、0.006％H2O2、トリスバツフアーPH7.6）に
て５〜10分間反応させた。細胞核をヘマトキシ
リンにて染色後通常の方法で封入し検鏡した。 (3) 結果 400ウエル中78ウエルについて産生抗体の反
応性を調べ、その中から、ヒトの胃癌、大腸
癌、膵癌、乳癌、肺癌、胆管癌、子宮癌、食道
癌と反応し、又、正常の顎下腺、近位尿細管上
皮、気管支腺、扁平上皮角化層、膵ラ氏島、肝
細胞膜、十二指腸腺と反応し、腸上皮化生胃粘
膜とも反応するが、正常の前立腺、胆管上皮、
膵管上皮とは反応しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ１株を選択した。 選択したハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル抗体St−４−39を用いて、ヒトの各種癌
組織又は正常組織との反応試験を上記(2)の方法
に従つて行つた。 (A) 表−１にモノクローナル抗体St−４−39の
各種癌組織に対する反応性試験結果を示し
た。
【表】
上記のとおり、大腸癌、膵癌では100％、
胃癌60.7％、乳癌81.5％、肺癌では特に腺癌
で94.1％がモノクローナル抗体St−４−39と
反応した。腺癌の陽性例では、しばしば粘
液、細胞膜で強くモノクローナル抗体St−４
−39と反応した。又、扁平上皮癌の陽性例
は、角質層のみに強く反応を示した。その
他、胆管癌１例中１例、子宮癌３例中２例、
食道癌１例中１例、腎癌２例中１例に反応陽
性であつた。 (B) 表−２に、モノクローナル抗体St−４−39
の各種正常組織に対する反応性試験結果を示
した。 表−2.正常組織との反応性 正常組織 陽性例数／サンプル例数 顎下腺 ５／５ 近位尿細管上皮 ５／５ 気管支腺 10／10 扁平上皮角化層 10／10 膵ラ氏島 10／10 肝細胞膜 10／10 十二指腸腺 ５／５ 前立腺 ０／５ 胆管上皮 ０／15 膵管上皮 ０／10 膵腺房 ０／10 脳 ０／５ 神経組織 ０／10 平滑筋 ０／10 横紋筋 ０／10 脂肪組織 ０／10 結合組織 ０／10 血管 ０／10 リンパ節 ０／10 胃正常粘膜 ０／10 大腸粘膜 ０／10 小腸粘膜 ０／10 脾臓 ０／５ 甲状腺 ０／５ 乳腺 ０／10 睾丸 ０／３ 膀胱粘膜 ０／５ 骨 ０／５ 骨髄 ０／５ 軟骨 ０／５ 又、モノクローナル抗体St−４−39はヒト
の腸上皮化生胃粘膜と25例中11例に反応し
た。 実施例 ２ 実施例１の(2)において、アビジン−ビオチン−
ペルオキシダーゼ複合体法による染色をほどこす
前に、胃癌組織サンプルをニユーラミニダーゼ
0.2U／mlにより37℃２時間処理した。一方、別
の胃癌組織サンプルを同様に0.5過沃素酸にて37
℃１時間処理した。かくして得られた胃癌組織二
例に対するモノクローナル抗体St−４−39の反応
試験を実施例１と同様にして行つた所、両者共に
染色は消失した。 以上のことにより、モノクローナル抗体St−４
−39の認識する部位（抗原決定基）は末端にシア
ル酸が存在する糖鎖であることがわかる。 実施例 ３ モノクローナル抗体St−４−39のイムノグロブ
リンクラスを知るため、モノクローナル抗体St−
４−39と抗マウス各種Ig血清と寒天ゲル内沈降反
応による試験を実施した。 モノクローナル抗体St−４−39は、抗マウス
IgM血清及び抗マウスＫ鎖血清と明らかな沈降線
を示したが、IgG、IgA、IgD、IgE及びλ鎖に対
するどの血清とも反応せず、このモノクローナル
抗体がIgMK型イムノグロブリンであることが判
明した。 実施例 ４ (1) 実施例１で得られたモノクローナル抗体St−
４−39を産生するハイブリドーマをプリスタン
処理後のBALB／３ nu／＋マウスの腹腔内
に１×107個投与した。１週間後、約５mlの腹
水を採取し、Sepharose CL−6Bによるゲル
過を行つた。各分画から実施例３と同様にして
オクタロニー法によりIgMと反応する分画を
得、これを純化された抗体とした。 純化された抗体は、Guesdon等の方法（J.
Histochem.Cytochem.27、1131〜1139、1979）
に従つてビオチン化した。 (2) 一方、脾癌患者血清５mlをSepharose CL−
6Bカラムによりゲル過し、各分画をそれぞ
れ96ウエルマイクロタイタープレートに0.1ml
ずつ分注、24時間後、各ウエルを５％牛血清ア
ルブミン化PBSにてブロツキング後、(1)の項
で作製したビオチン化抗体5μｇ／mlを加え、
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体
法を行つた。反応は、１mg／mlのオルフエニル
ジアミンを含む0.1Mクエン酸バツフアー（PH
4.5）に0.015％H2O2を加えて行い、その反応結
果をO.D.450でDynatech Autoreader（MR580）
を用いて測定した。モノクローナル抗体St−４
−39の認識する抗原はVo付近に検出され、そ
の分子量は106ダルトン以上であつた。 実施例 ５ カトウ（胃印環癌）の培養培地にH3−グル
コースアミンを15μCi／mlの濃度に添加し、３日
間培養し、その培養上清をとり、透折により遊離
のH3−グルコースアミンを排除した。 この上清液をモノクローナル抗体St−４−39に
よるアフイニテイカラムを通すと、H3の放射活
性を有する抗原が得られた。 このことは、モノクローナル抗体St−４−39が
反応する抗原は糖蛋白質であることを示してい
る。 実施例 ６ 正常人及び胃癌患者、膵癌患者、大腸癌患者の
血清を、モノクローナル抗体St−４−39を用いて
エンザイムイムノアツセイの固相サンドイツチ法
により測定した所、正常人の血清では５例中１例
において弱陽性（残りの４例は陰性）であつたの
に対し、胃癌患者血清の場合７例中３例、膵癌患
者血清の場合８例中４例、大腸癌患者血清の場合
８例中３例が強陽性であつた。
胃癌60.7％、乳癌81.5％、肺癌では特に腺癌
で94.1％がモノクローナル抗体St−４−39と
反応した。腺癌の陽性例では、しばしば粘
液、細胞膜で強くモノクローナル抗体St−４
−39と反応した。又、扁平上皮癌の陽性例
は、角質層のみに強く反応を示した。その
他、胆管癌１例中１例、子宮癌３例中２例、
食道癌１例中１例、腎癌２例中１例に反応陽
性であつた。 (B) 表−２に、モノクローナル抗体St−４−39
の各種正常組織に対する反応性試験結果を示
した。 表−2.正常組織との反応性 正常組織 陽性例数／サンプル例数 顎下腺 ５／５ 近位尿細管上皮 ５／５ 気管支腺 10／10 扁平上皮角化層 10／10 膵ラ氏島 10／10 肝細胞膜 10／10 十二指腸腺 ５／５ 前立腺 ０／５ 胆管上皮 ０／15 膵管上皮 ０／10 膵腺房 ０／10 脳 ０／５ 神経組織 ０／10 平滑筋 ０／10 横紋筋 ０／10 脂肪組織 ０／10 結合組織 ０／10 血管 ０／10 リンパ節 ０／10 胃正常粘膜 ０／10 大腸粘膜 ０／10 小腸粘膜 ０／10 脾臓 ０／５ 甲状腺 ０／５ 乳腺 ０／10 睾丸 ０／３ 膀胱粘膜 ０／５ 骨 ０／５ 骨髄 ０／５ 軟骨 ０／５ 又、モノクローナル抗体St−４−39はヒト
の腸上皮化生胃粘膜と25例中11例に反応し
た。 実施例 ２ 実施例１の(2)において、アビジン−ビオチン−
ペルオキシダーゼ複合体法による染色をほどこす
前に、胃癌組織サンプルをニユーラミニダーゼ
0.2U／mlにより37℃２時間処理した。一方、別
の胃癌組織サンプルを同様に0.5過沃素酸にて37
℃１時間処理した。かくして得られた胃癌組織二
例に対するモノクローナル抗体St−４−39の反応
試験を実施例１と同様にして行つた所、両者共に
染色は消失した。 以上のことにより、モノクローナル抗体St−４
−39の認識する部位（抗原決定基）は末端にシア
ル酸が存在する糖鎖であることがわかる。 実施例 ３ モノクローナル抗体St−４−39のイムノグロブ
リンクラスを知るため、モノクローナル抗体St−
４−39と抗マウス各種Ig血清と寒天ゲル内沈降反
応による試験を実施した。 モノクローナル抗体St−４−39は、抗マウス
IgM血清及び抗マウスＫ鎖血清と明らかな沈降線
を示したが、IgG、IgA、IgD、IgE及びλ鎖に対
するどの血清とも反応せず、このモノクローナル
抗体がIgMK型イムノグロブリンであることが判
明した。 実施例 ４ (1) 実施例１で得られたモノクローナル抗体St−
４−39を産生するハイブリドーマをプリスタン
処理後のBALB／３ nu／＋マウスの腹腔内
に１×107個投与した。１週間後、約５mlの腹
水を採取し、Sepharose CL−6Bによるゲル
過を行つた。各分画から実施例３と同様にして
オクタロニー法によりIgMと反応する分画を
得、これを純化された抗体とした。 純化された抗体は、Guesdon等の方法（J.
Histochem.Cytochem.27、1131〜1139、1979）
に従つてビオチン化した。 (2) 一方、脾癌患者血清５mlをSepharose CL−
6Bカラムによりゲル過し、各分画をそれぞ
れ96ウエルマイクロタイタープレートに0.1ml
ずつ分注、24時間後、各ウエルを５％牛血清ア
ルブミン化PBSにてブロツキング後、(1)の項
で作製したビオチン化抗体5μｇ／mlを加え、
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体
法を行つた。反応は、１mg／mlのオルフエニル
ジアミンを含む0.1Mクエン酸バツフアー（PH
4.5）に0.015％H2O2を加えて行い、その反応結
果をO.D.450でDynatech Autoreader（MR580）
を用いて測定した。モノクローナル抗体St−４
−39の認識する抗原はVo付近に検出され、そ
の分子量は106ダルトン以上であつた。 実施例 ５ カトウ（胃印環癌）の培養培地にH3−グル
コースアミンを15μCi／mlの濃度に添加し、３日
間培養し、その培養上清をとり、透折により遊離
のH3−グルコースアミンを排除した。 この上清液をモノクローナル抗体St−４−39に
よるアフイニテイカラムを通すと、H3の放射活
性を有する抗原が得られた。 このことは、モノクローナル抗体St−４−39が
反応する抗原は糖蛋白質であることを示してい
る。 実施例 ６ 正常人及び胃癌患者、膵癌患者、大腸癌患者の
血清を、モノクローナル抗体St−４−39を用いて
エンザイムイムノアツセイの固相サンドイツチ法
により測定した所、正常人の血清では５例中１例
において弱陽性（残りの４例は陰性）であつたの
に対し、胃癌患者血清の場合７例中３例、膵癌患
者血清の場合８例中４例、大腸癌患者血清の場合
８例中３例が強陽性であつた。
Claims (1)
- １ 胸腺を有さない動物に癌細胞又は癌組織を投
与又は移植し、これを該動物内で増殖させ次に該
動物にリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ
細胞を投与し、次いで該動物から抗体産生Ｂ細胞
を得、これを骨髄腫細胞と融合させ、得られた融
合細胞をクローン化し、癌細胞又は癌組織に対す
る抗体を産生する融合細胞を選択しこれを増殖さ
せることを特徴とするモノクローナル抗体の製造
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59101769A JPS60246324A (ja) | 1984-05-22 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
| US06/732,406 US4683200A (en) | 1984-05-17 | 1985-05-09 | Monoclonal antibody to human cancer antigen and method for producing same |
| KR1019850003312A KR930003912B1 (ko) | 1984-05-17 | 1985-05-15 | 모노클로날 항체 및 제조방법 |
| DE8585303481T DE3586440T2 (de) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Zur diagnose von menschlichem magen- oder brustkrebs zu verwendender monoklonaler antikoerper. |
| EP85303481A EP0161941B1 (en) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Monoclonal antibody useful in the diagnosis of human stomach or breast cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59101769A JPS60246324A (ja) | 1984-05-22 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60246324A JPS60246324A (ja) | 1985-12-06 |
| JPH0145359B2 true JPH0145359B2 (ja) | 1989-10-03 |
Family
ID=14309424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59101769A Granted JPS60246324A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60246324A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0347089A (ja) * | 1989-03-09 | 1991-02-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 膵癌細胞に対するモノクローナル抗体及び該抗産生ハイブリドーマ |
-
1984
- 1984-05-22 JP JP59101769A patent/JPS60246324A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60246324A (ja) | 1985-12-06 |
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