KR930003912B1 - 모노클로날 항체 및 제조방법 - Google Patents

모노클로날 항체 및 제조방법 Download PDF

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세쓰오 히로하시
유끼오 시모사또
마사히꼬 와다나베
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Description

모노클로날 항체 및 제조방법
본 발명은 모노클로날항체, 더 상세히는 특정암에 대해 특이성인 모노클로날항체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 모노클로날항체의 효과적인 생산에 이용될 수 있는 새로운 방법에 관한 것이다.
현재, 세포융합법에 의한 모노클로날항체의 제법이 확립되었으며 암관련항원을 인식하는 암의 진단 및/또는 치료에 이용되는 새로운 모노클로날항체를 생산하기를 많은 연구자들이 시도하였고 여전히 시도하고 있다.
지금까지 보고된 다수의 모노클로날항체 가운데 코프로브스키(H.Koprowski) 등에 의해 개발된 모노클로날 항체인 CA19-9(1116NS 19-9)가 현재 췌장암의 혈청진단에 실제적인 사용이 기대되고 있다. 그러나, 이것은 위암을 포함하는 다른 암의 진단에 충분히 효과적이지 못하다.
일반적으로, 암관련항원을 인식하는 모노클로날항체의 제조는 이제까지 동물에, 예를들면, 흉선을 갖는, 달리말하면 B세포와 T세포를 갖는 생쥐 또는 쥐에 암세포를 투여하여 암세포로 동물을 면역시키고 면역된 동물로부터 얻은 항체 생성세포를 골수종 세포와 융합시키며, 원하는 항체를 생성하는 융합 세포를 선택하고 융합세포를 클로우닝시키며 클로우닝된 융합세포를 배양함으로써 수행하여 왔다.
다른 방법은 유용하지 않으며 보고되어 있지도 않다.
본 발명자는 모노클로날 항체와 그를 제조하는 새로운 방법을 연구하였다. 현재, 위암을 포함하는 각종암과 크게 효율적으로 반응하는 모노클로날항체, 그리고 종래의 방법과는 아주 다른 모노클로날항체의 신규한 제조방법을 발견하였다.
본 발명을 요약하면 다음과 같다.
본 발명은 1,000,000 또는 그 이상의 겔투과 분자량을 갖는 당단백질과 반응하는 IgM 부류의 모노클로날 항체를 제공한다. 항체에 의해 인식되는 항원결정인자는 그의 말단에 시알산 잔기를 갖는 설탕사슬이다.
발명 모노클로날 항체는 다음의 특성을 갖는다 :
(1) 이것은 사람의 위, 대장, 췌장, 유방, 폐, 담즙관, 자궁 및 식도의 암과 반응하며
(2) 정상인 턱밀샘, 기부신소낭, 기관지선, 비늘상피 피부각질층, 췌장란게란섬(Pancreatic Iangerhans'islands), 간세포막 및 십이지장선과 반응하고
(3) 인장 화생 위점막과 반응하며, 그리고
(4) 정상인 전립선, 담즙관 및 대췌관과 반응하지 않는다.
또한, 본 발명에 따라 모노클로날 항체의 제조에 대한 신규한 방법을 제공한다. 방법은 암세포 또는 조직을 흉선이 없는 동물에 투여 또는 이식시키는 단계, 세포 또는 조직을 동물내에 번식시키는 단계, T세포 또는 T세포와 B세포를 동물에 투여하는 단계, 동물로부터 항체 생성 B세포를 채취하는 단계, B세포를 골수종세포와 융합시키는 단계, 암세포 또는 조직에 대한 항체를 생성하는 융합세포를 선별하는 단계, 결과 융합세포를 클로우닝시키는 단계, 그리고 클로우닝된 융합세포를 배양하는 단계로 이루어진다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
여기에 사용된 용어 "세포", "조직" 등은 달리 지시되어 있지 않으면 "인(人)세포", "인조직" 등을 말한다.
상기한 모노클로날항체, CA 19-9에 의해 인식된 항원 결정인자는 시알산화-루이스a(sialylated-Lewisa)이다.
발명 모노클로날 항체는 또한 그의 말단에 시알산잔기를 갖는 설탕사슬인 항원 결정인자를 인식한다.
그러나, 같은 기원의 시험표본들에 대한 두 모노클로날 항체와의 비교면역 염색법 시험으로 몇 시험표본들은 발명항체와는 쉽게 반응하나 CA 19-9와는 반응하지 않았으며, 반면에 다른 시험표본들은 그 반대로 반응함을 나타내었다.
또한, 발명 모노클로날 항체는 정상인 조직에 대한 두항체의 반응성의 비교시험에서 간세포막, 신장의 기부신소낭, 췌장란게란 세포 및 비늘 상치 피부 각질층과 반응했으나, 반면에 CA19-9는 반응하지 않았음을 발견하였다. 게다가, CA19-9는 전립선, 담즙관 및 대췌관과 반응했으나 반면에 발명모노클로날 항체는 반응하지 않았다. 이와 같이 각 항체는 다른 결정인자를 인식한다.
이후에 기재된 실시예에서 보는 바와 같이, 발명 모노클로날 항체는 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 폐암, 담관암, 자궁암 및 식도암과 반응한다.
본 모노클로날 항체는 또한 턱밑샘, 기부신소낭, 기관지선, 비늘상피 피부각질층, 췌장란게란섬, 간세포막 및 십이지장선의 정상조직과 반응한다.
또한, 모노클로날항체는 장의 화상위점막과 반응한다.
그러나, 발명 모노클로날 항체는 전립선, 담즙관 및 대췌관의 정상조직과 반응하지 않는다.
위암의 조직시험표본을 시알산 잔기를 분할하는 효소인 뉴라미니다제로 처리했을때, 발명 모노클로날 항체는 이러한 처리된 조직 시험표본에 대해 반응성을 나타내지 않았다. 이것은 모노클로날 항체에 의해 인식되는 항원부위(결정인자)에 존재하는 시알린산 잔기가 있음을 가리킨다.
한편, 발명 모노클로날 항체는 과요오드산으로 처리한 위암의 조직시험표본에 대해 반응하지 않았는데, 본항체에 의해 인식되는 결정인자는 설탕사슬임을 가리킨다.
발명 모노클로날 항체가 반응하는 항원은 겔투과에 의해 측정된 1,000,000 또는 그 이상의 분자량을 갖는다. 게다가, 항원은 거기에 글리코스아민을 결합하는 능력을 가지며, 따라서 이것은 당단백질이다.
이와 같이, 발명 모노클로날 항체가 반응하는 항원은 1,000,000 또는 그 이상의 겔투과 분자량을 갖는 당단백질이며, 모노클로날 항체에 의해 인식되는 결정인자는 그의 말단에 시알산 잔기를 갖는 설탕사슬이다.
본 발명 모노클로날항체는 L-사슬로서 K사슬을 갖는 면역글로부린 류 IgM에 속한다.
본 모노클로날 항체가 반응하는 항원은 암조직에서 뿐만 아니라 위암, 유방암, 결장암, 췌장암등에 걸린 환자의 혈청중에서 종종 다량으로 발견된다.
따라서, 발명 모노클로날항체는 위암과 유방암의 크게 효율적인 혈청진단법에 특히 유용하게 된다.
발명 모노클로날항체는 세포생성항체, 예를들면, 항-인 위암항체의 골수종세포와 세포융합에 의해 형성된 융합세포(히브리도마)로부터 생성될 수 있다.
예를들면, 모노클로날항체에 의해 인식되는 항원으로 생쥐 또는 쥐와 같은 동물을 면역시키는 단계, 이때의 항원은 분리된 항원 또는 달리는 이러한 항원으로 이루어지는 암세포 또는 그의 균등질 일 수도 있으며, 골수종세포로 면역된 동물로부터 얻은 항체-생성세포를 융합(교잡)시키는 단계, 발명 모노클로날항체의 생성을 위한 히브리도마를 선별하는 단계, 결과 융합세포(히브리도마)를 클로우닝시키는 단계, 클로우닝된 히브리도마를 배양하고 생성된 항체를 수집하는 단계에 의하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 면역, 융합, 선별등은 종래의 방법으로 수행할 수 있다.
발명 모노클로날항체의 생산에 대해 이하에 더 충분히 기술하기로 한다.
위암 세포와 같은 암세포로 생쥐를 면역시킨다. 생쥐외에 쥐와 같은 다른 쥐과의 동물을 면역시키는 동물로서 이용할 수 있다. 암세포의 균등질 또는 암세포로부터 분리 또는 정제된 항원을 암세포 자체대신에 면역에 이용할 수도 있다.
BALB/c 쥐는, 예를들면, 매 2-3일 내지 2-3주 마다 수회, 암세포 또는 그의 균등질 또는 정제된 항원의 접종에 의하여 면역시킨다.
접종하는 양은 바람직하게는 매 접종에 대하여 생쥐 한마리당 105내지 108개의 세포이다.
비장을 쥐로부터 제거하여 원심분리에 의해 항체 생성세포를 수집한다. 이들 세포는 자기 번식력을 갖지 않는다. 다음에 세포들을 골수종 세포들에서 바람직하게 선별된 자기번식력을 갖는 세포와 교잡시킨다. 면역에 이용한 같은 종류의 골수종세포가 가장 바람직하다. 바람직하게는, 골수종세포는 항체를 생성하지 않는 것들로부터 선별한다.
이러한 골수종 양세포주는, 예를들면, P3-NSI-1-Ag4-1(용이 입수처 : 연세대학교 의과대학 미생물학교실), P3-X63-Ag8, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8-653, SP2/0-Ag14(용이입수처 : 연세대학교 의과대학 미생물학교실) 등을 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다.
다른 각종 골수종세포도 또한 방법에 사용할 수 있다.
항체생성세포의 골수종세포와의 교잡은 그들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 세포융합제와 혼합함으로써 수행한다. 항체생성세포수의 사용한 골수종 세포수에 대한 비율은 바람직하게는 2 : 1 내지 10 : 1이다.
결과 히브리도마는 조직배양판에서 번식시킨다. 각 웰에서 생성되는 항체는 종래의 방법, 예를들면, 형광항체법 또는 효소표지 항체법에 의하여 가공 세포조직과 그의 반응을 토대로 검출한다.
이와 같이 원하는 항체를 생성하는 히브리도마를 선별한다. 다음에, 한계희석법 또는 다른방법을 사용하여 히브리도마를 클로우닝시킨다.
항체 생성 히브리도마는 상징액으로부터 항체를 회수하기 위하여 배지내에서 체외적으로 배양할 수 있으며 또는 다르게는 생쥐와 같은 생체내에서 체내적으로 배양할 수도 있다. 체내배양에 있어서, 히브리도마를 생쥐에 복강내에 주사하고 생쥐내에서 종양이 성장하도록 두며, 생쥐의 복수 또는 혈청으로부터 항체를 수집한다.
발명 모노클로날항체의 제조에 사용될 수 있는 면역원은 위암 또는 다른 암세포일 수도 있으나 특별히 제한할 수는 없다.
발명 모노클로날 항체의 생성에 사용될 수 있는 항체 생성세포는 B세포일 수도 있는데, 이것은 B세포가 생체내에서 순환하고 비장에 누적되기 때문에 바람직하게는 비장으로부터 획득한다.
그러나, 방법은 반드시 비장에 제한할 수 없으며 B세포가 다량으로 존재하는 어떠한 부위도 이용할 수 있다.
다르게는, 발명 모노클로날항체는 본 발명에 따라 제공된 새로운 방법에 의해 제조될 수 있는데 이것을 이후에 충분히 기술하기로 한다.
발명 모노클로날 항체가 반응하는 항원은 또한 암조직에서 뿐만 아니라 암에 걸린 환자의 혈청에서도 발견된다. 따라서, 모노클로날항체는 위암, 유방암등에 걸린 환자의 혈청진단법에 사용될 수 있다.
발명 모노클로날항체에 의해 인식된 항원이 환자의 혈청에 풍부히 나타날때 치료효과의 측정 또는 재발의 예측에 사용할 수 있다.
발명 모노클로날항체는 방사성 동위원소의 결합에 의해 암 부위측정진단에 사용할 수 있다.
또한, 모노클로날 항체의 항암제와의 조합은 미사일 요법에 이용할 수 있다.
발명 모노클로날 항체는 암을 조직학적으로 구별하기 어려운 몇 병변의 정확한 진단에 도움이 될 수 있다.
본 발명은 또한 암세포 또는 조직을 흉선이 없는 동물에 투여 또는 이식시키고, 동물내에서 세포 또는 조직을 번식시키며, T세포 또는 T세포와 B세포를 모두 동물에 투여하고, 동물로부터 항체-생성 B세포를 채취하며, B세포를 골수종 세포와 융합(교잡)시키고, 암세포 또는 조직에 대한 항체를 생성하는 히브리도마를 선별하며, 결과 융합세포(히브리도마)를 클로우닝시키고 히브리도마를 배양시키는 것으로 이루어지는 모노클로날 항체의 신규한 제조방법을 제공한다.
흉선이 없는 동물은 예를들면, 무모(無毛)생쥐 nu/nu, 무모쥐 rnu/rnu 등을 포함하나 사람을 제외하고는 흉선도 없고 실질적인 양의 T세포로 없는 어떠한 동물도 발명방법에 이용할 수 있다. 보통, 흉선이 없는 생쥐를 사용하는 것이 이용할 것이다.
흉선이 없는 이러한 동물은 체내에 B세포가 존재함에도 불구하고 실질적인 양의 T세포를 체내에서 생성하지 않기 때문에 외부이식에 대한 실질적인 어떠한 항체도 생산할 수 없다.
암세포 또는 조직을 흉선이 없는 이러한 동물에 투여 또는 이식할때 암세포 또는 조직은 동물내에서 번식(성장)할 수 있다.
방법에 사용될 수 있는 암세포 또는 조직은 사람 또는 어떤 다른 동물의 암세포 또는 조직을 포함한다. 암의 예로는 위암, 폐암, 유방암, 췌장암, 결장암, 자궁암, 식도암, 신장암, 직장암, 담관암, 갑상선암등인데 이들에 제한되지는 않는다.
투여되거나 이식된 암세포 또는 조직의 양은 특별히 제하되지 않는다. 보통, 약 1 내지 4평방mm 크기로 저민 하나 내지 여러 조각의 암조직을 이식하는 것이 바람직하다. 많은 시험표본들에 이식할 수 있다. 이식되는 부위는 바람직하게는 피하, 복강내 또는 기타일 수 있다.
암세포가 사용될때, 투여되는 양은 바람직하게는 105내지 108개의 암세포이다.
암세포 또는 조직을 투여 또는 이식한후에 암세포 또는 조직은 번식하고 동물이 자람에 따라 종양덩어리가 성장한다. 예를들면, 1 내지 4평방mm의 암조직을 흉선이 없는 쥐에 피하 이식시킬때, 최대직경 약 1cm의 종양덩어리가 1 내지 수개월내에 성장하게 된다.
예를들어서, 최대직경 약 5mm 내지 5cm로 종양이 성장할 시기에 T세포 또는 T와 B세포를 모두 종양이 있는 흉선 결핍생쥐에 투여한다. 투여된 림프구는 바람직하게는 흉선 결핍 동물과 같은 종류의 동물로부터 획득한다.
투여된 림프구의 양은 흉선을 갖고 따라서 항체를 생산할 수 있는 같은 종류의 한 동물의 비장내에 포함된 T세포 또는 T와 B세포의 양의 0.1 내지 5배인 것이 바람직하다. 림프구의 1회 투여가 본 발명의 목적에 충분하고 수회 투여의 필요성은 없다.
투여했을때, T세포는 어떠한 항체도 생산할 수 없는 동물내에 이미 존재하는 B세포나 아니면 투여된 B세포로 하여금 동물내에 종양(암)에 대한 항체를 생산하도록 가능하게 할 것이다.
림프구의 투여후, 종양 덩어리는 점차로 감소되거나 또는 사라지게 될 것이다. 덩어리가 반 또는 그 이하의 크기로 감소되거나 또는 사라졌을 시기에 항체 생성 세포를 포함하는 비장을 동물로부터 제거하고 비장세포를 골수종세포와 교잡시킨다.
이들 항체생성세포는 B세포인데 이것은 생체내에서 순환하고 비장 또는 다른 기관에 누적된다. B세포를 비장으로부터 획득하는 것이 바람직할지라도 B세포가 다량 존재하는 부위를 이용할 수 있다.
발명방법에서 교잡(Hybridization), 잇다른 히브리도마의 선별, 히드리도마의 배양 및 모노클로날 항체의 수집은 종래의 방법에 대해 상기한 바와 같은 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 신규한 방법에서는 종래의 방법에서 절대적으로 필요한 암세포를 동물에 수회 또는 많은 투여를 요구하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따라 더 간단한 방법이 제공된다. 발명방법은 암세포 도는 조직이 이미 성장한 동물을 이용하고 그러므로 많은양의 암세포가 존재한다.
따라서, 암 관련항원을 인식하는 항체를 생성하는 B세포는 다량으로 생산되는 것으로 생각된다.
또한, 원하는 히브리도마의 선별은 고효율로 수행되는 것으로 생각된다.
이제 본 발명을 다음의 무제한한 실시예를 참조하여 더욱 충분히 설명하기로 한다.
[실시예 1]
(1) 모노클로날 항체의 생성 : 암이 이식된(St-4) 무모생쥐로부터 사람의 불량하게 구별된 위(胃)의 선암(腺癌)을 2 내지 3mm 크기의 시험표본으로 저미었다.
시험표본을 거의 T세포를 갖지않는 흉선 결핍 무모 생쥐인 BALB/c nu/nu생쥐에 피하 이식시켰다. 약 1개월 반후에 종양은 최대직경 10mm의 덩어리로 성장하였다.
한편, BALB/c nu/+ 무모생쥐로부터 제거한 비장을 저미어서 스테인레스 메시를 통과시키고 생리식염수 0.5ml에 부유시켰다. T 및 B세포를 포함하는 결과 현탁액을 약 10mm 크기의 종양을 지닌 BALB/c nu/nu 생쥐에 복강내 투여하였다.
림프구의 투여 1개월후 종양이 사라졌다. 그때, St-4의 균등질 0.2ml를 각 BALB/c nu/nu 생쥐에 복강내 투여하였다.(이 투여는 본 발명방법에서 반드시 수행되지는 않을 수도 있다)
3일후, 비장을 쥐로부터 제거하였다.
세포융합은 와다나베(Watanabe) 등에 의해 면역사건 수사법 Ⅶ, 2963-2967(1978)에 기재된 방법에 따라 달성되었다.
제거한 비장을 저며서 스테인레스 메시를 통과시키고 1500rpm, 200G에서 원심분리하였다. 얻은 침전에 적세포(red cells)를 제거하기 위하여 0.7% NH4Cl 50ml를 가하고 침전을 HPMI-1640으로 2회 세척하였다.
이와 같이 얻은 1×108개의 비장세포에, RPMI-1640으로 2회 세척한 2×107개(5 : 1)의 생쥐 골수종세포, P3-X63-Ag8-U1 (이후부터 P3U1으로 일컬음)를 혼합하였고 혼합물을 2000rpm, 200G에서 10분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 잘 분할한후, 37℃, pH 7.4인 45% (W/V)의 폴리에틸렌글리콜 4,000(Merck ＆ Co., Inc,)을 포함하는 RPMI-1640 1ml를 가하고 37℃에서 8분간 배양시켰다.
1분간 반응후, 교잡의 끝무렵에 최종부피가 40ml가 되도록 RPMI-1640을 점차적으로 첨가하였고 총부피를 1,000rpm, 100G에서 원심분리하였다. 침전된 세포에 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI-1640 40ml를 가하고 결과 세포현탁액을 5% CO2로 채워진 배양용기내에서 37℃에서 배양하였다.
24시간후, 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 및 10% 소태아혈청을 포함한 HAT 매제로 매제를 치환하고 배양액을 각 웰당 0.2ml의 양으로 코스타르(Costar)미소 배양판에 분포시켰다.
10일째에, 상징액을 수집하고, 위암조직을 포르말린으로 고정시킨 파라핀 조각을 효소-표지 항체법에 의하여 염색시킴으로써 항체 생산에 대해 분석하였다.
암과 반응성인 항체의 생산에 양성인 웰내의 히브리도마를 각 웰당 0.6개의 세포로 희석액을 한정시킴으로써 클로우닝시켰다. 사용한 초기매제는 하이포크산틴, 티미딘 및 10% 소태아혈청을 포함하는 HT매제인데 BALB/c nu/+생쥐의 웰당 5×105개의 흉선세포를 공급장치층으로서 첨가하였다.
초기매제는 나중에 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640매제로 대치하였다.
한계 희석법에 의한 클로우닝을 다시한번 반복하였다.
덩어리 배양에 대하여, 한 웰의 히브리도마는 5개의 웰, 24개의 웰(Falcon 3008) 및 최종적으로 팥콘 조직 배양 플라스크로 증가되었다. 0.1% NaN3가 첨가된 얻은 상징액을 4℃에서 저장하였다.
(2) 모노클로날 항체의 선별과 모노클로날항체에 의한 각종 조직의 염색법 :
모노클로날 항체를 생성하는 히브리도마의 선별을 위한 여러 조직의 염색과 모노클로날항체의 분석을 위한 각종 조직의 염색은 조직을 포르말린으로 고정시킨 파라핀조각을 사용하는 쑤(S.M.Hsu et al. in J. Histochem.Cytochem, 29, 577-580(1981)) 등에 의해 기술된 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 착물법에 따라 달성되었다.
10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 함침시킨 저민 인 위암조직의 시험표본과 다른 인 암조직 및 정상 인 조직은 널리 구입가능한데, 이것을 파라핀을 제거한후 20분간 0.3% H2O2를 포함하는 메탄올로 처리하였다. 다음에 시험표본을 인산염 완충식염수(PBS)로 세척하고 10% 정상 돼지 혈청을 포함하는 PBS로 30분간 처리하였다.
시험표본을 항체를 포함하는 용액, 즉, 위의 (1)에서 얻어서 PBS 약 1μg/ml로 10배 희석시킨 상징액과 실온에서 2시간동안 반응시키고 4℃에서 하룻밤 더 반응시켰다. 반응혼합물을 PBS로 15분간 세척하고 비오틴 결합 항-생쥐 면역글로부린, 7.5μg/ml로 30분간 처리하였다.
단편들은 15분간 PBS로 세척한 다음 실온에서 30분간 아비딘 DH-비오틴-퍼옥시다제 착물로 처리하였다. 다음에 단편들은 PBS로 15분간 세척하고 50mg 디아미노벤지딘, 0.006% H2O2, pH 7.6인 트리스 완충액을 포함하는 디아미노벤지딘용액과 5 내지 10분간 반응시켰다.
셀모양 핵을 헤마톡실린으로 염색시키고 통상의 방법으로 올려놓아 현미경으로 분석하였다.
(3) 결과 :
400웰 가운데 78웰내의 생성된 항체의 반응성을 분석하고 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 폐암, 담관암, 자궁암 및 식도암 그리고 정상 목밑샘, 기부신소낭, 기관지선, 비늘상피피부각질층, 췌장란계란섬, 간세포막 및 십이지장선과 반응할 뿐만 아니라 장화생 위점막과 반응하나, 정상전립선, 답즙관 및 대췌관과는 반응하지 않는 모노클로날항체를 생성한 한 히브리도마를 선별하였다.
선별한 히브리도마, NCC-St-4 39에 의해 생성된 발명 모노클로날 항체의 각종 암 또는 정상조직과의 반응성을 위의 (2)에 기술한 방법에 따라 분석하였다.
(A) 표 1은 각종 암조직에 대한 모노클로날항체의 반응성시험의 결과를 나타낸다.
[표 1]
암조직과의 반응성
Figure kpo00001
a)++: 3분지 1 또는 그 이상의 암세포가 양성임
b)+: 3분지 1 이하의 암세포가 양성임.
표 1에 나타낸 바와 같이, 결장암과 췌장암의 100%, 위암의 60.7%, 유방암과 폐암의 81.5%, 특히, 선암의 94.1%가 발명 모노클로날 항체와 반응하였다.
모노클로날 항체의 반응은 종종 선암의 양성 시험표본의 점액 및 세포막과의 반응이 강하다.
비늘세포암에서는 단지 각질면이 강하게 반응하였다. 또한, 반응은 하나의 시험표본중 하나의 담관암 시험표본, 셋중 두개의 자궁암 시험표본, 하나의 시험표본중 하나의 식도암 시험표본, 그리고 둘중 하나의 신장암 시험표본과 양성이었다.
(B) 표 2는 각종 정상조직에 대한 모노클로날항체의 반응성시험의 결과를 나타낸다.
[표 2]
정상조직과의 반응성
Figure kpo00002
Figure kpo00003
또한, 발명 모노클로날항체는 25개의 시험 표본중 11개의 장화생 위점막 시험표본과 반응하였다.
[실시예 2]
위암시험표본을 실시예 1(2)의 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 착물법에 의한 염색에 앞서 37℃에서 2시간 동안 뉴라미니다제 0.2U/ml로 처리하였다.
한편, 또다른 위암시험표본을 37℃에서 1시간 동안 0.5% 과요오드산으로 처리하였다.
처리한 두 시험표본을 실시예 1에서와 같은 방법으로 반응성을 시험하였다. 염색이 관찰되지 않았다.
이들 결과는 발명 모노클로날항체에 의해 인식되는 부위(결정인자)가 그의 말단에 시알산 잔기를 갖는 설탕사슬임을 증명한다.
[실시예 3]
발명 모노클로날항체의 면역글로부린 부류를 측정하기 위하여 모노클로날항체의 각종 Ig의 항-생쥐혈청과의 침전반응을 한천겔에서 달성하였다.
모노클로날항체의 항-생쥐 IgM혈청과의 반응 그리고 항-생쥐 K사슬 혈청과의 반응에서는 명확한 침전곡선이 형성되었으나 항체의 IgG, IgA, IgD, IgE 및 λ사슬의 혈청과의 반응에서는 반응이 일어나지 않았다.
따라서, 발명 모노클로날항체는 면역글로부린 IgM, K이다.
[실시예 4]
(1) 실시예 1에서 얻은 히브리도마(1×107개의 세포)를 프리스탄으로 처리한 BALB/c nu/+생쥐에 복강내 투여하였다. 1주일 뒤에 복수 약 5ml를 수집하고 세파로우스 CL-6B에 의한 겔투과를 받게하였다.
IgM과 반응하는 분율을 오우체르로니(Ouchterlony)법에 의해 실시예 3과 같은 방법으로 선별하였다.
정제된 항체를 게스돈등(Guesdon et al.in J.Histochem. Cytochem., 27, 1131-1139(1979))에 의해 기재된 방법에 따라 비오틴으로 표지시켰다.
(2) 췌장암에 걸린 환자로부터의 혈청 5ml의 세파로우스 CL-6B 컬럼에서의 겔투과후, 각 분율을 96개의 웰 미소 타이터판내에 웰당 0.1ml의 양으로 분포시켰다. 24시간후, 각 웰을 5% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS로 차단시켰다.
위의 (1)에서 얻은 비오틴-표지 항체(5μg/ml)를 판에 첨가하고 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 착물법을 수행하였다. 오르토-페닐렌디아민 1mg/ml를 포함하는 pH 4.5인 0.1M 시트르산염 완충액에 0.015% H2O2를 첨가함으로써 반응을 수행하였다.
측정은 다니나텍 자동독해기(Dynatech Autoreader), MR580을 이용하여 O.D.450으로 행하였다.
발명 모노클로날항체로 인식되는 항원은 106달톤 또는 그이상의 분자량으로 공부피 V0근처에서 검출되었다.
[실시예 5]
KATOⅢ 배지에 위의 단일 고리세포암, H3-글루코스아민을 15μCi/ml의 농도에 첨가하였다. 3일 배양후, 상징액을 회수하고 유리 H3-글루코스아민을 제거하기 위하여 투석하였다.
발명 모노클로날항체와 짝지음시킨 어피니티 컬럼에 상징액을 통과시켰다. H3방사능을 갖는 항원이 컬럼에 흡착되었다.
이들 결과는 발명 모노클로날항체가 반응하는 항원이 당 단백질임을 나타낸다.
[실시예 6]
발명 모노클로날 항체의 정상인, 무해성질병을 가진 환자 및 각종 암환자의 혈청과의 반응을 측정하기 위하여, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, Vol.81, pp.5242-5246 1984년 8월, "선암을 가진 환자의 혈청 및 복수중의 췌장암 관련항원(DU-PAN-2항원)의 검출"에 기재된 방법에 따라 효소면역측정(억제 EIA)을 수행하였다. 50개의 정상인 시험표본을 측정하고 그의 평균치와 표준편차보다 2배 더큰값을 더하여 차단값으로 택하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
각종혈청에 대한 반응성
Figure kpo00004

Claims (3)

  1. 암세포 또는 조직을 흉선이 없는 동물에 투여 또는 이식시키는 단계, 세포 또는 조직을 동물내에서 번식시키는 단계, T세포 또는 T세포와 B세포를 동물에 투여하는 단계, 동물로부터 항체생성 B세포를 채취하는 단계, B세포를 골수종세포와 융합시키는 단계, 암세포 또는 조직에 대한 항체를 생성하는 융합세포를 선별하는 단계, 융합세포를 클로우닝시키는 단계, 그리고 클로우닝된 융합세포를 배양시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 흉선이 없는 동물이 생쥐이며 골수종세포를 생쥐로부터 획득하는 것을 특징으로 하는 모노클로날항체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 암세포 또는 조직을 사람에게서 획득하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체의 제조방법.
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