JPS60246324A - モノクロ−ナル抗体の製造法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体の製造法Info
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- JPS60246324A JPS60246324A JP59101769A JP10176984A JPS60246324A JP S60246324 A JPS60246324 A JP S60246324A JP 59101769 A JP59101769 A JP 59101769A JP 10176984 A JP10176984 A JP 10176984A JP S60246324 A JPS60246324 A JP S60246324A
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- cancer
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
現在、細胞融合法を用いたモノクローナル抗体の炸裂が
確立されつつあり、多くの研究者の手によって、癌の診
断、治療に役立つ癌関連抗原を認識する新しいモノクロ
ーナル抗体の作製が試みられている。
確立されつつあり、多くの研究者の手によって、癌の診
断、治療に役立つ癌関連抗原を認識する新しいモノクロ
ーナル抗体の作製が試みられている。
従来、癌関連抗原を認識するモノクローナル抗体の作製
は、胸腺を有する（即ちＢ細胞及びＴ細胞のいずれをも
有する）マウス又はラット等の動物に癌細胞を投与して
、動物を癌細胞で免疫し、該動物から抗体産生細胞を得
、これと骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクロ
ーン化し、所望の抗体を産生ずる融合細胞を選択し、こ
れを増殖させることにより行っておりこれ以外の方法は
全く行われておらず、又、提案もされていない。
は、胸腺を有する（即ちＢ細胞及びＴ細胞のいずれをも
有する）マウス又はラット等の動物に癌細胞を投与して
、動物を癌細胞で免疫し、該動物から抗体産生細胞を得
、これと骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクロ
ーン化し、所望の抗体を産生ずる融合細胞を選択し、こ
れを増殖させることにより行っておりこれ以外の方法は
全く行われておらず、又、提案もされていない。
本発明者らは、モノクローナル抗体の作表を前記の方法
とは異なった方法で行うことが出来ることを見出し本発
明を完成した。
とは異なった方法で行うことが出来ることを見出し本発
明を完成した。
即ち、本発明は、胸腺を有さない動物に癌細胞又は癌組
織を投与又は移植し、これを該動物内で増殖させ、次に
該動物にリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞
を投与し、次いで該動物から抗体産生Ｂ細胞を得、これ
を骨髄腫細胞と融合させ、得られた融合細胞をクローン
化し、癌細胞又は癌組織に対する抗体を産生する融合細
胞を選択しこれを増殖させることを特徴とするモノクロ
ーナル抗体の製造法に関するものである。
織を投与又は移植し、これを該動物内で増殖させ、次に
該動物にリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞
を投与し、次いで該動物から抗体産生Ｂ細胞を得、これ
を骨髄腫細胞と融合させ、得られた融合細胞をクローン
化し、癌細胞又は癌組織に対する抗体を産生する融合細
胞を選択しこれを増殖させることを特徴とするモノクロ
ーナル抗体の製造法に関するものである。
胸腺を有さな（・動物としては、具体的にはヌードマウ
スｎｕ ／ ｎｕ 、ヌードラットｒｎｕ ／ ｒｎｕ
等があるが、胸腺を持たすＴ細胞を有さない動物（但し
ヒトを除く）ならいずれも使用可能である。通常は胸腺
を持だな℃・マウスを使用するのが便利である。
スｎｕ ／ ｎｕ 、ヌードラットｒｎｕ ／ ｒｎｕ
等があるが、胸腺を持たすＴ細胞を有さない動物（但し
ヒトを除く）ならいずれも使用可能である。通常は胸腺
を持だな℃・マウスを使用するのが便利である。
胸腺を持だな（・動物は、体内にリンパ球Ｔ細胞が生成
されない為、異種移植に際しリンパ球Ｂ細胞が体内（て
存在していても抗体を産生することが出来ない。この胸
腺を有さない動物に癌細胞又は癌組織を投与又は移植す
ると癌細胞又は癌組織は増殖する。癌細胞又は癌組織と
してはヒト又はヒト以外の動物の癌細胞又は癌組織が使
用できる。又、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、子宮
癌、食道癌、腎癌、直腸癌、胆管病、甲状腺癌等種々の
ものが使用出来、特に限定されない。癌細胞又は癌組織
の投与又は移植量は特に限定されないが、］、１！１
％は癌組織を１ｍ〜４期角位の大きさに細切しこれをマ
ウス等の動物に１個〜数個移植するのがｔ）ｆましく・
６、移植する癌組織の数は多くしてもかまわない。移イ
」する場所は動物の皮下、腹腔内等が好才しい。
されない為、異種移植に際しリンパ球Ｂ細胞が体内（て
存在していても抗体を産生することが出来ない。この胸
腺を有さない動物に癌細胞又は癌組織を投与又は移植す
ると癌細胞又は癌組織は増殖する。癌細胞又は癌組織と
してはヒト又はヒト以外の動物の癌細胞又は癌組織が使
用できる。又、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、子宮
癌、食道癌、腎癌、直腸癌、胆管病、甲状腺癌等種々の
ものが使用出来、特に限定されない。癌細胞又は癌組織
の投与又は移植量は特に限定されないが、］、１！１
％は癌組織を１ｍ〜４期角位の大きさに細切しこれをマ
ウス等の動物に１個〜数個移植するのがｔ）ｆましく・
６、移植する癌組織の数は多くしてもかまわない。移イ
」する場所は動物の皮下、腹腔内等が好才しい。
又、癌細胞の投与の場合、投与量は１０３〜１（）８個
の細胞を投与するのが望ましい。
の細胞を投与するのが望ましい。
癌細胞又は癌組織を投り又は移植した後該動物を飼育す
ると、癌細胞又は癌組織は増殖し腫瘍のかたまりが成長
してくる。例えば１〜４１１１１１角の癌組織を胸腺を
持たないマウスの皮下に移植した場合、１ケ月〜数ケ月
後に腫瘍最大径が１σ位に成長する。腫瘍が成長した時
点で、例えば腫瘍最大径が５＋ｏ＋〜５σ位に成長した
時点でこの腫瘍を持った胸腺欠損動物にリンパ球゛■゛
細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞を投与する。
ると、癌細胞又は癌組織は増殖し腫瘍のかたまりが成長
してくる。例えば１〜４１１１１１角の癌組織を胸腺を
持たないマウスの皮下に移植した場合、１ケ月〜数ケ月
後に腫瘍最大径が１σ位に成長する。腫瘍が成長した時
点で、例えば腫瘍最大径が５＋ｏ＋〜５σ位に成長した
時点でこの腫瘍を持った胸腺欠損動物にリンパ球゛■゛
細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞を投与する。
投与するリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞
としては、同種の動物のものを使用する。
としては、同種の動物のものを使用する。
投与するリンパ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及び１３細
胞の投与量は、胸腺を持ち抗体産生能力を有する同種の
動物−頭分の肺臓に含まれるＴ細胞又は゛Ｉ゛細胞及び
Ｂ細胞の０１〜５倍程度とするのが好ましい。
胞の投与量は、胸腺を持ち抗体産生能力を有する同種の
動物−頭分の肺臓に含まれるＴ細胞又は゛Ｉ゛細胞及び
Ｂ細胞の０１〜５倍程度とするのが好ましい。
Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞の投与は１回行えばよく、
数回に分けて投与する必要は全くな（・。
数回に分けて投与する必要は全くな（・。
Ｔ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与すると、投与したＴ
細胞の指示によって、抗体産生能力に欠陥のあった動物
の体内において、該動物に存在していた又は新たに投与
したＢ細胞により腫瘍（癌）に対する抗体が産生される
。
細胞の指示によって、抗体産生能力に欠陥のあった動物
の体内において、該動物に存在していた又は新たに投与
したＢ細胞により腫瘍（癌）に対する抗体が産生される
。
′ｒ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞を投与後しばらくすると
、腫瘍のかたまりは縮小又は消失する。
、腫瘍のかたまりは縮小又は消失する。
腫瘍のかたまりが縮小又は消失した時点で、例えば腫瘍
のか１こまりの大きさが１／２以下となるか、又は腫瘍
のかたまりが消失した所で該動物から肺臓（抗体産生細
胞を含む）を摘出し、これを骨髄肺細胞と融合する。抗
体産生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが
、肺臓等に蓄積するので肺臓を摘出して使用−するのが
好ましいが、必らずしも肺臓でなくてもよく、Ｂ細胞が
多く存在する部分を使用すればよい。
のか１こまりの大きさが１／２以下となるか、又は腫瘍
のかたまりが消失した所で該動物から肺臓（抗体産生細
胞を含む）を摘出し、これを骨髄肺細胞と融合する。抗
体産生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが
、肺臓等に蓄積するので肺臓を摘出して使用−するのが
好ましいが、必らずしも肺臓でなくてもよく、Ｂ細胞が
多く存在する部分を使用すればよい。
細胞融合は通常の方法によって行うことが出来る。即ち
、抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリコール
等の細胞融合剤と混合し細胞融合を行う。骨髄腫細胞と
しては同種の動物のものを用いるのが好ましく、又、抗
体を産生じないものを選択するのが好ましい。抗体産生
細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数比で２＝１〜１
０１とするのが好まし−・。得られた融合細胞は限界希
釈法により分離し、分離した融合細胞は増殖させたのち
、各穴（ウェル）において産生される抗体は公知の方法
例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、各種細胞組
織等と反応させ、その結果から所望の抗体を産生ずるハ
イプリドーマを選択する。選択したハイプリドーマを培
養器中で培養し上清液から抗体を得ることも出来るが、
生体内例えばヌードマウス腹腔内にハイプリドーマを注
入し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌード
マウス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法による
ことも出来る。
、抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリコール
等の細胞融合剤と混合し細胞融合を行う。骨髄腫細胞と
しては同種の動物のものを用いるのが好ましく、又、抗
体を産生じないものを選択するのが好ましい。抗体産生
細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数比で２＝１〜１
０１とするのが好まし−・。得られた融合細胞は限界希
釈法により分離し、分離した融合細胞は増殖させたのち
、各穴（ウェル）において産生される抗体は公知の方法
例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、各種細胞組
織等と反応させ、その結果から所望の抗体を産生ずるハ
イプリドーマを選択する。選択したハイプリドーマを培
養器中で培養し上清液から抗体を得ることも出来るが、
生体内例えばヌードマウス腹腔内にハイプリドーマを注
入し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌード
マウス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法による
ことも出来る。
従来の方法によれば、癌細胞を動物体内罠何回も投与す
る必要があり面倒であったが、本発明ではそのような必
要がなく簡単である。更に本発明によれば癌細胞又は癌
組織が体内で増殖した動物を用いるので、動物体内に常
に癌細胞が多量に存在しており、従って癌関連抗原を認
識する抗体を産生ずるＢ細胞が大量に生産されると考え
られ、細胞融合による目的とするノ＼イプリドーマの選
択も効率良く行えるものと思われる。
る必要があり面倒であったが、本発明ではそのような必
要がなく簡単である。更に本発明によれば癌細胞又は癌
組織が体内で増殖した動物を用いるので、動物体内に常
に癌細胞が多量に存在しており、従って癌関連抗原を認
識する抗体を産生ずるＢ細胞が大量に生産されると考え
られ、細胞融合による目的とするノ＼イプリドーマの選
択も効率良く行えるものと思われる。
実施例１
（１）モノクローナル抗体の製造
ヒト胃低分化型腺癌のヌードマウス移植株（８１−４）
を２〜３鵡に細切しＢＡＬＢ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ（胸腺
欠損ヌードマウス）（リンノく球Ｔ細胞を持たない）の
皮下に移植し、約１ケ月半後、腫瘍最大径が１０１１１
１となった。一方、ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ヌードマウス
の一匹の肺臓を細切後、ステンレスメツシュを通し生理
食塩水０．５ ｍｌを用いリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞浮
遊液としこれを前述のＢＡ、ＬＢ／Ｃｎｕ ／ ｎｕ担
癌マウス（約１０鴎の腫瘍を持ったＢＡ、ＬＢ／Ｃｎｕ
／ ｎｕ ）の腹腔内に投与した。
を２〜３鵡に細切しＢＡＬＢ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ（胸腺
欠損ヌードマウス）（リンノく球Ｔ細胞を持たない）の
皮下に移植し、約１ケ月半後、腫瘍最大径が１０１１１
１となった。一方、ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ヌードマウス
の一匹の肺臓を細切後、ステンレスメツシュを通し生理
食塩水０．５ ｍｌを用いリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞浮
遊液としこれを前述のＢＡ、ＬＢ／Ｃｎｕ ／ ｎｕ担
癌マウス（約１０鴎の腫瘍を持ったＢＡ、ＬＢ／Ｃｎｕ
／ ｎｕ ）の腹腔内に投与した。
投与後１ｔ月で腫瘍は消失した。そこで５ｔ−４のホモ
ジェネート９２ｍ１をＢＡ Ｌ Ｂ／ Ｃｎｕ ／ ｎ
ｕの腹腔に投与した。（この投与は行わなくてもかまわ
ない。）その３日後にマウスから肺臓を摘出した。
ジェネート９２ｍ１をＢＡ Ｌ Ｂ／ Ｃｎｕ ／ ｎ
ｕの腹腔に投与した。（この投与は行わなくてもかまわ
ない。）その３日後にマウスから肺臓を摘出した。
細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験操作法■、
２９６３〜２９６７．１９７８）に準じて行った。
２９６３〜２９６７．１９７８）に準じて行った。
即ち、摘出した肺臓を細切したのち、ステンレスメツシ
ュを通し、１５００ ｒｐｍ、２００ Ｇで遠沈して得
た沈漬に５０ｍ１の０７％Ｎｕ（４ＣＩを加え赤血球を
除き、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄して得た肺臓胞Ｉ
Ｘ １０’個Ｋ、マウス骨髄腫細胞（Ｐ ３−Ｘ ６
３−Ａｇ ８−Ｕ １ ） （以下Ｐ３Ｕ］とい５）を
旧）Ｍ Ｉ −１６４０で２回洗浄して得たＰ３Ｕｌ
２Ｘ１０個（５：１）を混合し、２０００ ｒ１Ｍ１１
＋ ２００ Ｇで１０分間遠沈した。沈殿細胞をよくと
きほぐし１こ後、４５％（ｗ／ｖ ）のポリエチレング
リコール４０００（メルク社〕を含有し１こ３７℃、
ｐｌ−１７，４０ＲＰＭＩ−１６４０゜ｌ ｍｌを加え
８分間処理した。
ュを通し、１５００ ｒｐｍ、２００ Ｇで遠沈して得
た沈漬に５０ｍ１の０７％Ｎｕ（４ＣＩを加え赤血球を
除き、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄して得た肺臓胞Ｉ
Ｘ １０’個Ｋ、マウス骨髄腫細胞（Ｐ ３−Ｘ ６
３−Ａｇ ８−Ｕ １ ） （以下Ｐ３Ｕ］とい５）を
旧）Ｍ Ｉ −１６４０で２回洗浄して得たＰ３Ｕｌ
２Ｘ１０個（５：１）を混合し、２０００ ｒ１Ｍ１１
＋ ２００ Ｇで１０分間遠沈した。沈殿細胞をよくと
きほぐし１こ後、４５％（ｗ／ｖ ）のポリエチレング
リコール４０００（メルク社〕を含有し１こ３７℃、
ｐｌ−１７，４０ＲＰＭＩ−１６４０゜ｌ ｍｌを加え
８分間処理した。
反応１分後からＲＰＭＩ−１６４０を徐々に加え総量４
０ｍ１として細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、
１００ Ｇで遠沈後１０％牛脂児血清を含んだＲＰＭＩ
−１６４０４０ｍ１を加えて細胞浮遊液を作り３７℃、
５％Ｃ０２充填培養器中で培養し１こ。２４時間後、Ｉ
ＩＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、デミ９
フ１０％牛脂児血清）に入れ換え、Ｃｏ５ｔａｒ ｒｎ
ｉｃｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに、１ウエルあ
たり０．２ ｍｌずつ分注培養した。１０日目に上清を
取り出し、胃癌組織のホルマリン固定、パラフィン切片
を酵素抗体法で染色することにより抗体産生の有無を確
かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中のハイプリドー
マを１ウエルあたり０６個となるよう限界希釈法により
クロー二／グを行った。培地は最初１１Ｔ（ヒボキサン
チン、チミジン、１０％牛脂児血清）を用い、ｆｅｅｄ
ｅｒ １ａｙｅｒとしてＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ マウス
の胸腺細胞５ Ｘ １０５／ウエルを加えた。次に１０
％牛脂児血清を加えたＲ、Ｉ）Ｍｌ −１６４０培地罠
置換した。
０ｍ１として細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、
１００ Ｇで遠沈後１０％牛脂児血清を含んだＲＰＭＩ
−１６４０４０ｍ１を加えて細胞浮遊液を作り３７℃、
５％Ｃ０２充填培養器中で培養し１こ。２４時間後、Ｉ
ＩＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、デミ９
フ１０％牛脂児血清）に入れ換え、Ｃｏ５ｔａｒ ｒｎ
ｉｃｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに、１ウエルあ
たり０．２ ｍｌずつ分注培養した。１０日目に上清を
取り出し、胃癌組織のホルマリン固定、パラフィン切片
を酵素抗体法で染色することにより抗体産生の有無を確
かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中のハイプリドー
マを１ウエルあたり０６個となるよう限界希釈法により
クロー二／グを行った。培地は最初１１Ｔ（ヒボキサン
チン、チミジン、１０％牛脂児血清）を用い、ｆｅｅｄ
ｅｒ １ａｙｅｒとしてＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ マウス
の胸腺細胞５ Ｘ １０５／ウエルを加えた。次に１０
％牛脂児血清を加えたＲ、Ｉ）Ｍｌ −１６４０培地罠
置換した。
限界希釈法によるクローニングは２回行った。
又、大量培養には１ウエルのハイブリドーマを５ウエル
、２４ウエル（Ｆａｌｃｏｎ ３００８ ）と増量しな
がら、最終的にはＦａｌｃｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌ
ｔｕｒｅｆｌａｓｋを用（・た。ｆｌａｓｋ培養で得た
上清にＮａＮ３を０１％加え４℃にて保存した。
、２４ウエル（Ｆａｌｃｏｎ ３００８ ）と増量しな
がら、最終的にはＦａｌｃｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌ
ｔｕｒｅｆｌａｓｋを用（・た。ｆｌａｓｋ培養で得た
上清にＮａＮ３を０１％加え４℃にて保存した。
（２）モノクローナル抗体の選定及びモノクローナル抗
体による各種組織の染色 モノクローナル抗体選定のための各種組織の染色及び該
モノクローナル抗体による各種組織の染色は）（ｓｕ、
Ｓ１Ｍ−等の方法（Ｊ、 Ｈｉｓｔｏｃｈｃｍ。
体による各種組織の染色 モノクローナル抗体選定のための各種組織の染色及び該
モノクローナル抗体による各種組織の染色は）（ｓｕ、
Ｓ１Ｍ−等の方法（Ｊ、 Ｈｉｓｔｏｃｈｃｍ。
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２９ 、５７７〜５８０ 、１
９８１ ）に準じてアビジン−ビオチン−ベルオキシダ
ーゼ複合体法によるホルマリン固定、パラフィン切片の
染色により行った。即ち、広く一般的に用いられている
１０係ホルマリン固定後、パラフィン包埋、薄切された
ヒト胃癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パ
ラフイン後、０．３％ＩｈＯ２を含むメタノールにて２
０分間処理した。
９８１ ）に準じてアビジン−ビオチン−ベルオキシダ
ーゼ複合体法によるホルマリン固定、パラフィン切片の
染色により行った。即ち、広く一般的に用いられている
１０係ホルマリン固定後、パラフィン包埋、薄切された
ヒト胃癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パ
ラフイン後、０．３％ＩｈＯ２を含むメタノールにて２
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その後リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗った後、】０％
正常豚血清を含むＰＢＳにて３０分間処理した。次いで
、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、更に４℃で
一夜反応させた。そしてＰ ＢＳで１５分間洗った後、
ピオチン化抗マウス免疫グロブリン（７，５μｇ／ｍｌ
）にて３０分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗っ
た後アビジンＤｌｌ−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合
体と室温で３０分間処理した。これをＰＢＳで１５分間
洗った後、ジアミノベンチジン溶液（５０〜ジアミノベ
ンチジン、０００６％Ｈ２０２。
正常豚血清を含むＰＢＳにて３０分間処理した。次いで
、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、更に４℃で
一夜反応させた。そしてＰ ＢＳで１５分間洗った後、
ピオチン化抗マウス免疫グロブリン（７，５μｇ／ｍｌ
）にて３０分間処理した。これをＰＢＳで１５分間洗っ
た後アビジンＤｌｌ−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合
体と室温で３０分間処理した。これをＰＢＳで１５分間
洗った後、ジアミノベンチジン溶液（５０〜ジアミノベ
ンチジン、０００６％Ｈ２０２。
トリスパフファーｐＨ７，６）にて５〜１０分間反応サ
セタす細胞核をヘマトキシリンにて染色後通常の方法で
封入し検鏡した。
セタす細胞核をヘマトキシリンにて染色後通常の方法で
封入し検鏡した。
（３） 結 果
４０′０ウエル中７８ウエルについて産生抗体の反応性
を調べ、その中から、ヒトの胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌
、肺癌、胆管病、子宮癌、食道癌と反応し、又、正常の
顎下腺、近位尿細管上皮、気管支線、扁平上皮角化層、
膵う代品、肝細胞膜、十二指腸線と反応し、腸に皮化生
胃粘膜とも反応するが、正常の前立腺、胆管上皮、膵管
上皮とは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ１株を選択した。
を調べ、その中から、ヒトの胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌
、肺癌、胆管病、子宮癌、食道癌と反応し、又、正常の
顎下腺、近位尿細管上皮、気管支線、扁平上皮角化層、
膵う代品、肝細胞膜、十二指腸線と反応し、腸に皮化生
胃粘膜とも反応するが、正常の前立腺、胆管上皮、膵管
上皮とは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ１株を選択した。
選択したハイブリドーマの産生ずるモノクローナル抗体
５ｔ−４−３９を用℃・て、ヒトの各種癌組織又は正常
組織との反応試験を上記（２）の方法に従って行った。
５ｔ−４−３９を用℃・て、ヒトの各種癌組織又は正常
組織との反応試験を上記（２）の方法に従って行った。
囚 表−１にモノクローナル抗体５Ｌ−４−３９の各種
癌組織に対する反応性試験結果を乃くした。
癌組織に対する反応性試験結果を乃くした。
表−１ヒトの癌組織との反応性
胃 癌 ３３ ２９ ６２／１０２ ６０．７大腸癌１
７ ９ ２６／２６ １００ 膵 癌 ２１ ７ ２８／２８ １００肺腺癌１１ ５
１．６／１７ ９４．１肺扁平上皮癌 ６ ８ １４
／１９ ７３．７肺大細胞癌 ７ ３ １０／１８ ５
５．６肺小細胞癌 ０ ４ ４／１９ ２１．１乳 癌
１５ ７ ２２／２７ ８１．５ａ）４斗癌細胞の１
／３以上が陽性 り十 癌細胞の１７３未満が陽性 上記のとおり、大腸癌、膵癌では１００％、胃癌６０．
７％、乳癌８１５％、肺癌では特に腺癌で９４１％がモ
ノクローナル抗体ｓ＋−４−３ｇと反応した。腺癌の陽
性例では、しばしば粘液、細胞膜で強くモノクローナＡ
［体５ｔ−４−３９色反応した。又、扁平上皮癌の陽性
例は、角質層のみに強く反応を示した。その他、胆管癌
１例中１例、子宮癌３例中２例、食道癌１例中１例、胃
癌２例中］例に反応陽性であった。
７ ９ ２６／２６ １００ 膵 癌 ２１ ７ ２８／２８ １００肺腺癌１１ ５
１．６／１７ ９４．１肺扁平上皮癌 ６ ８ １４
／１９ ７３．７肺大細胞癌 ７ ３ １０／１８ ５
５．６肺小細胞癌 ０ ４ ４／１９ ２１．１乳 癌
１５ ７ ２２／２７ ８１．５ａ）４斗癌細胞の１
／３以上が陽性 り十 癌細胞の１７３未満が陽性 上記のとおり、大腸癌、膵癌では１００％、胃癌６０．
７％、乳癌８１５％、肺癌では特に腺癌で９４１％がモ
ノクローナル抗体ｓ＋−４−３ｇと反応した。腺癌の陽
性例では、しばしば粘液、細胞膜で強くモノクローナＡ
［体５ｔ−４−３９色反応した。又、扁平上皮癌の陽性
例は、角質層のみに強く反応を示した。その他、胆管癌
１例中１例、子宮癌３例中２例、食道癌１例中１例、胃
癌２例中］例に反応陽性であった。
ＦＢＩ 表−２に、モ／りｏ−ｆ、ｎ、抗体Ｓｔ−／１
−３９の各種正常組織に対する反応性試験結果を示した
。
−３９の各種正常組織に対する反応性試験結果を示した
。
表−２正常組織との反応性
正 常 組 織 陽性例数／サンプル例数類 下 腺
５１５ 近位尿細管上皮 ５１５ 気 管 支 腺 １０／１０ 扁平上皮角化層 １０／Ｉ Ｏ 膵 ラ 氏 島 １０／１０ 肝細胞膜 １０／１０ 十二指腸線 ５１５ 前 立 腺 ０１５ 胆 管 上、皮 ０１５ 膵 管 上 皮 ０／１０゜ 膵 腺 房 ０／１０ 脳 ０１５ 神 経 組 織 ０ ／１０ モ 滑 筋 ０ ／１０ 横 紋 筋 Ｏ／１０ 脂肪組織 Ｏ／１０ 結 合 組 織 Ｏ／１０ 血 管 ０ ／１０ リ ン パ 節 ０／１０ 胃正常粘膜 ０７１０ 大腸粘膜 Ｏ／１０ 小 腸 粘 膜 ０ ／１０ 牌 臓 ０１５ 甲 状 腺 ０１５ 乳 腺 ０ ／１０ 寧 丸 ０／３ 膀胱粘膜 ０１５ 骨 ０１５ 骨 髄 ０１５ 軟 骨 ０１５ 又、モノクローナル抗体８１−４−３９はヒトの腸上皮
化生胃粘膜と２５例ウニ１例に反応した。
５１５ 近位尿細管上皮 ５１５ 気 管 支 腺 １０／１０ 扁平上皮角化層 １０／Ｉ Ｏ 膵 ラ 氏 島 １０／１０ 肝細胞膜 １０／１０ 十二指腸線 ５１５ 前 立 腺 ０１５ 胆 管 上、皮 ０１５ 膵 管 上 皮 ０／１０゜ 膵 腺 房 ０／１０ 脳 ０１５ 神 経 組 織 ０ ／１０ モ 滑 筋 ０ ／１０ 横 紋 筋 Ｏ／１０ 脂肪組織 Ｏ／１０ 結 合 組 織 Ｏ／１０ 血 管 ０ ／１０ リ ン パ 節 ０／１０ 胃正常粘膜 ０７１０ 大腸粘膜 Ｏ／１０ 小 腸 粘 膜 ０ ／１０ 牌 臓 ０１５ 甲 状 腺 ０１５ 乳 腺 ０ ／１０ 寧 丸 ０／３ 膀胱粘膜 ０１５ 骨 ０１５ 骨 髄 ０１５ 軟 骨 ０１５ 又、モノクローナル抗体８１−４−３９はヒトの腸上皮
化生胃粘膜と２５例ウニ１例に反応した。
実施例２
実施例１の（２１において、アビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼ複合体法による染色を（１どこイ前Ｋ、胃
癌組織サンプルを二一一うミニダーゼ０、２ Ｕ ／
ｍｌにより３７℃２時間処理した。−力、別の胃癌組織
サンプルを同様に０．５％過沃素酸にて３７℃１時間処
理した。かくして得られた胃癌組織二側に対するモノク
ローナル抗体５ｔ−４−３９の反応試験を実施例１と同
様にして行った所、両者共に染色性は消失した。
オキシダーゼ複合体法による染色を（１どこイ前Ｋ、胃
癌組織サンプルを二一一うミニダーゼ０、２ Ｕ ／
ｍｌにより３７℃２時間処理した。−力、別の胃癌組織
サンプルを同様に０．５％過沃素酸にて３７℃１時間処
理した。かくして得られた胃癌組織二側に対するモノク
ローナル抗体５ｔ−４−３９の反応試験を実施例１と同
様にして行った所、両者共に染色性は消失した。
以上のことにより、モノクローナル抗体５Ｌ−４−３９
の認識する部位（抗原決定基〕は末端にシアル酸が存在
する糖鎖であることがわかる。
の認識する部位（抗原決定基〕は末端にシアル酸が存在
する糖鎖であることがわかる。
実施例３
モノクローナル抗体５ｔ−４−３９のイムノグロブリン
クラスを知るため、モノクローナル抗体Ｓｔ −４−３
９と抗マウス各種Ｉｇ血清と寒天ゲル内沈降反応による
試験を実施した。
クラスを知るため、モノクローナル抗体Ｓｔ −４−３
９と抗マウス各種Ｉｇ血清と寒天ゲル内沈降反応による
試験を実施した。
モノクローナル抗体５Ｌ−４−３９は、抗マウスＩｇＭ
血清及び抗マウスに鎖血清と明らかな沈降線をパしたが
、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 ＩｇＤ、 Ｉｇ Ｅ及びλ鎖に
対するどの血清とも反応せず、このモノクローナル抗体
がＩｇＭＫ型イムノグロブリンであることが判明した。
血清及び抗マウスに鎖血清と明らかな沈降線をパしたが
、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 ＩｇＤ、 Ｉｇ Ｅ及びλ鎖に
対するどの血清とも反応せず、このモノクローナル抗体
がＩｇＭＫ型イムノグロブリンであることが判明した。
実施例４
（１）実施例１で得られたモノクローナル抗体Ｓｔ −
４−３９を産生ずるハイブリドーマをプリスタン処理後
の＋ＪＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋マウスの腹腔内にｌＸｌ０’
個投与した。１週間後、約５ ｍｌの腹水を採取し、８
ｃｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ −６Ｂ ＩＩＣよるゲル濾過
を行った。各分画から実施例３と同様にしてオフタロニ
ー法によりＩｇＭと反応する分画を得、これを純化され
た抗体とした。
４−３９を産生ずるハイブリドーマをプリスタン処理後
の＋ＪＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋マウスの腹腔内にｌＸｌ０’
個投与した。１週間後、約５ ｍｌの腹水を採取し、８
ｃｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ −６Ｂ ＩＩＣよるゲル濾過
を行った。各分画から実施例３と同様にしてオフタロニ
ー法によりＩｇＭと反応する分画を得、これを純化され
た抗体とした。
純化された抗体は、Ｇｕｅｓｄｏｎ等の方法（Ｊ、Ｈｉ
−ｓｊｏｃｈｃｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ−２７、１１３
１〜１１３９ 、１９７９ ）に従ってビオチン化した
。
−ｓｊｏｃｈｃｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ−２７、１１３
１〜１１３９ 、１９７９ ）に従ってビオチン化した
。
（２）一方、膵癌患者血清５ ｍｌを５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＣＬ−６Ｂカラムによりゲル濾過し、各分画なそれ
ぞれ９６ウエルマイクロタイタープレートに０．１ ｍ
ｌずつ分注、２４時間後、各ウェルを５％牛血ｔ１１ｒ
アルブミン化Ｐ Ｂ Ｓにてブロッキング後、（１）の
項で作製したビオチン化抗体５μｇ／ｍｅを加え、アビ
ジンービオチンーベルオキシダーゼ複合体法を行った。
ｅ ＣＬ−６Ｂカラムによりゲル濾過し、各分画なそれ
ぞれ９６ウエルマイクロタイタープレートに０．１ ｍ
ｌずつ分注、２４時間後、各ウェルを５％牛血ｔ１１ｒ
アルブミン化Ｐ Ｂ Ｓにてブロッキング後、（１）の
項で作製したビオチン化抗体５μｇ／ｍｅを加え、アビ
ジンービオチンーベルオキシダーゼ複合体法を行った。
反応は、１〜／ｍｅのオルラフＳニルジアミンを含む０
．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４，５）に０．０１５
％１１□０□を加えて行い、その反応結果を０．１）、
４５０でＤｙｎａｔｅｃｈ Ａｕｔｏｒｃａｄｅｒ（
ＭＲ５８０）を用いて測定した。モノクローナつた〇 実施例５ カトウ１…（胃印環癌）の培養培地に１１３−グルコー
スアミンを１５μＣｉ／ｍ／の濃度に添加し、３日間培
養し、その培養上清をとり、透析により遊離のＨ３−グ
ルコースアミンを排除した。
．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４，５）に０．０１５
％１１□０□を加えて行い、その反応結果を０．１）、
４５０でＤｙｎａｔｅｃｈ Ａｕｔｏｒｃａｄｅｒ（
ＭＲ５８０）を用いて測定した。モノクローナつた〇 実施例５ カトウ１…（胃印環癌）の培養培地に１１３−グルコー
スアミンを１５μＣｉ／ｍ／の濃度に添加し、３日間培
養し、その培養上清をとり、透析により遊離のＨ３−グ
ルコースアミンを排除した。
この上清液をモノクローナル抗体５ｔ−４−３ＩＣよる
アフィニティ力ラムを通すと、Ｈ３の放射活性を有する
抗原が得られた。
アフィニティ力ラムを通すと、Ｈ３の放射活性を有する
抗原が得られた。
このことは、モノクローナル抗体５ｔ−４−３９が反応
″（る抗原は糖蛋白質であることを示している。
″（る抗原は糖蛋白質であることを示している。
実施例６
正常人及び胃癌患者、膵癌患者、大腸癌患者の血清を、
モノクローナル抗体５ｔ−４−３９を用いてエンザイム
イムノアノセイの固相サンドイツチ法により測定した所
、正常人の血清では５例中１例にお（・て弱陽性（残り
の４例は陰性）であったのに対し、胃癌患者血清の場合
７例中３例、膵癌患者血清の場合８例中４例、大腸癌患
者血清の場合８例中３例が強陽性であった。
モノクローナル抗体５ｔ−４−３９を用いてエンザイム
イムノアノセイの固相サンドイツチ法により測定した所
、正常人の血清では５例中１例にお（・て弱陽性（残り
の４例は陰性）であったのに対し、胃癌患者血清の場合
７例中３例、膵癌患者血清の場合８例中４例、大腸癌患
者血清の場合８例中３例が強陽性であった。
特、ｖ［出願人 廣 橋 説 雄
特許出願人 下 里 幸 雄
特許出願人 渡 辺 昌 彦
特許出願人 日本化薬株式会社
Claims (1)
- （１）胸腺を有さない動物に癌細胞又は癌組織を投与又
は移植し、これを該動物内で増殖させ次に該動物にリン
パ球Ｔ細胞又はリンパ球Ｔ細胞及びＢ細胞を投与し、次
いで該動物から抗体産生Ｂ細胞を得、これを骨髄腫細胞
と融合させ、得られた融合細胞をクローン化し、癌細胞
又は癌組織に対する抗体を産生ずる融合細胞を選択しこ
れを増殖させることを特徴とするモノクローナル抗体の
製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59101769A JPS60246324A (ja) | 1984-05-22 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
| US06/732,406 US4683200A (en) | 1984-05-17 | 1985-05-09 | Monoclonal antibody to human cancer antigen and method for producing same |
| KR1019850003312A KR930003912B1 (ko) | 1984-05-17 | 1985-05-15 | 모노클로날 항체 및 제조방법 |
| EP85303481A EP0161941B1 (en) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Monoclonal antibody useful in the diagnosis of human stomach or breast cancer |
| DE8585303481T DE3586440T2 (de) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Zur diagnose von menschlichem magen- oder brustkrebs zu verwendender monoklonaler antikoerper. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59101769A JPS60246324A (ja) | 1984-05-22 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60246324A true JPS60246324A (ja) | 1985-12-06 |
| JPH0145359B2 JPH0145359B2 (ja) | 1989-10-03 |
Family
ID=14309424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59101769A Granted JPS60246324A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-22 | モノクロ−ナル抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60246324A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0347089A (ja) * | 1989-03-09 | 1991-02-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 膵癌細胞に対するモノクローナル抗体及び該抗産生ハイブリドーマ |
-
1984
- 1984-05-22 JP JP59101769A patent/JPS60246324A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0347089A (ja) * | 1989-03-09 | 1991-02-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 膵癌細胞に対するモノクローナル抗体及び該抗産生ハイブリドーマ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0145359B2 (ja) | 1989-10-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |