JPS5982317A - モノクロ−ナル抗メラノ−マ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はメラノーマ細胞に対するモノクローナル抗体に
関する。

メラノーマは皮膚に発生する極めて移転しやすい悪性腫
瘍の一つであるが、ヒトに限らず他の哺乳動物にも存在
するため、マウスなどの実験動物を体制化することは、
ヒトノラノーマの診断・治療の基礎を与えることになる
。一方、単一抗原決定基だけを認識する純粋な抗体を得
たという免疫学分野の要望は、１９７５年、Ｋ　石ｈ　
Ｉ　ｅ　ｒとＭ　ｉ　Ｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｉ　ｎによりヒ
ツジ赤血球で免疫したマウスの牌細胞とマウスミエロー
マ細胞とを細胞融合させることで実現した。（ＩＮａ　
ｔ　ｕ、　ｒ　ｃ　２並４９５〜４９７　（１９７５）
　）。性質を異にした２種類の細胞を融合した細胞株は
、インビ１−口で自立的に分裂増殖するとともに、特異
性をもった均一の１１１体を産生じ続けた。したがって
、細胞融合法を用いてモノクローナル抗体を作製するこ
とは、■目的とする抗原決定基に対する均一・な抗体か
得られること、■抗原の精製の必要かなく、比較的容易
に融合細胞株が作られること、■非常に高い抗体価の抗
体が多量に作製できること、■同一・の抗体を用いて実
験ができるため、データの比較検削ができるなど多くの
利点を持つことになる。このように細胞融合法により特
定な抗原決定基、とくに癌特異抗原に対するモノクロー
ナル抗体の作製が可能にな−ったことは、腫瘍免疫学の
基礎的研究のみならず、実際的な診断治療法という制癌
−・のアプローチが確立していない臨床面において大き
な期待が集められている。これまでに悪性黒色腫、大腸
癌、白血病細胞など多くの細胞に列するモノクローナル
抗体か相ついで作製され報告されている。　（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ。

７５、３４０５　３４０９．　　（１９Ｎ）　　；Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａ　ｃ　ａ　ｄ、　　Ｓ　ｃ　ｉ、　７６、２９２７−
２９３１．　　（１９７９）　　；Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ
　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、７７゜６］１４−６１１８
．　　（１９８０）　　；　Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ、　Ｎａ　
Ｌ　ｌ、。

Ａ　ｃ　ａ　ｄ、　　Ｓ　ｃ　ｉ、　７６、１４３８−
１４４２．　　（１９７９）　　；Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕ　ｎ　ｏ　１．８１．　１６４−１６９．　　
（１９７８）　、　）しかし、これらモノクローナル抗
体の多くは、ヒト癌細胞をマウスに免疫する絹み合わせ
（異種免疫）によって作製されているのが現状である。

しかし、異種免疫は、すべての遺伝的なちがい、すなわ
ち癌特異抗原ばかりでなく組ｍ、適合性抗原をはじめと
するあらゆる種９ｎの正常細胞抗原に則して抗体を作る
。このため、抗体の特異性を決定するには弗素な困難が
伴う。しがも、最終的にｔｌられた抗体により認識され
る抗原決定基が、ある種の正常細胞抗原である可能性を
決して否定することはできない。さらにその抗原決定基
は、正常細胞より腫瘍細胞に比較的多量に存在している
という量的な差によるものか、または正常細胞のごく限
られた細胞群にのめ存在しているため、あたかも腫瘍特
異抗原のごとく印象を与えるのかもしれないという疑問
は常に残されてしまう。

したがって、腫瘍特異抗原の検索を明確に行うためには
、腫瘍が発生し宿主とまったく遺伝的背景の等しい同系
動物に腫瘍を免疫する組め合わせ（同系免疫）によって
、モノクローナル抗体を作製することが最も理想的と占
えられる。つまり免疫する腫瘍と、される側の宿主が同
系である組の合わせにおいては、腫瘍抗原以外の正常細
胞抗原を考慮する必要性は、異種免疫に比べるとはとん
ど無に等しい程であろう。同系免疫でモノクローナル抗
体を作製し、それを用いて腫瘍抗原を解析することが望
まれる。

・モノクローナル抗メラノーマ特異抗体の製造Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウス由来のメラノーマであるＢ１６細胞株をマ
イトマイシンＣ（ＭＭＣ）で不活化し・これを同系のＣ
７５ＢＬ／６マウスに１〜２週間隔で頻回免疫しておく
。この組み合わせにおいては、免疫する腫瘍細胞と免疫
されるマウスが同系であるため、腫瘍特異抗原に対して
のみ抗体が作られるはずである。このようにして免疫さ
れたＣ７５ＢＬ／６の肺細胞をＢＡＬＩ３／ｃ７ウス由
来のミエローマ細胞（Ｐ３Ｕｌ）とポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）の存在下で細胞融合する。融合の時期は
、最終免疫後３〜４日後の肺細胞を用いるのが最も効率
がよい。また、この時融合に用いるミエローマ細胞数と
牌細胞数との比は、１：１〜１：１０の間のいずれでも
可能である。融合の媒体として用いられるＰＥＧは、そ
の分子量が１０００〜４０００のものが融合効率がよい
。−・般にＰＥＧは分子量が大きくなるにつれて細胞毒
性は減少するが、粘性が増加するために扱いにくくなる
。

また、ＰＥＧは細胞凝望能が低いため、融合さＵるには
細胞が密に接触するようにしなげればならない。そのた
めには、一度遠沈して細胞どうしを十分に密着させた後
、細胞ベレットにＰ　Ｆ、Ｇをゆっくり加えながら混ぜ
てゆき、数分かりて膜の融合をはかる。その後、徐々に
血ｌＲを含まない培養液でＰＥＧを希釈し、遠沈してＰ
Ｐ、Ｇを含む上ｌＲを吸収除去する。細胞ペレ７＋〜に
１０％牛脂児＋ｍ　１ｐｔ（Ｆｅ２）添加ＲＰＭＩ＋６
４０倍溶液を加え、ｊ）１１胞浮Ｍ液としたのち、９６
穴平底プレートに５〜ｌ０Ｘ１０５（固／ウェル（ｗｅ
ｌｌ）となるように０．１ｍｌ！ずつ分注し、３７°Ｃ
で培養する。翌日／）・ら培庁液の半量をＩ−Ｉ　Ａ　
Ｔ培地で置換してゆく。融合しなかったミエローマは、
ＨＡ　Ｔ培地中では生育できない。一方、肺細胞単独で
は自立的増り１ムはしない。

ミエローマと肺細胞とが融合できたものだりカ月ＩＡＴ
培地中で増殖を開始し、１〜２週間後にはコロニーを形
成するまでに成長する。

つぎに増殖のあったウェルの中から目的とする抗体産生
細胞株だけを選別する。そのスクリーニングの方法とし
ては、細胞傷害試験、ラジオイムノ　アッセイ　　　（
Ｒａｄ　ｉ　ｏ　ｉｒｎｍｕｎ。

ａｓｓａｙ）法（ＲＩＡ）またはエンザイムリンクト　
　イムノンルベント　　アノセ・ｒ（Ｅｎｚｙｍｌ　ｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ）法（Ｅ　
１．　Ｉ　Ｓ　Ａ　）など種々の方法が用いられるが、
本発明者らは主としてＲＩＡ法にょるセル　ハインディ
イング　アッセイ　　（ｃｅｌｌ　　ｂｉｎｄｉｎｇａ
　ｓ　ｓ　ａ　ｙ）を用いてスクリーニングを行った。

このアッセイ法はＩｌｉ！瘍特異抗原のような精製困難
な細胞膜抗原を対象としたモノクローナル抗体作製には
便利な方法であり、また多数の検体を同時に処理するこ
とができる。ＨＡＴ培地で細胞増殖のあったウェルから
培地上清を取り出し標的細胞と反応させる。標的細胞は
Ｂ１６メラ、ノーマと、対照として同系マウス由来のＥ
Ｌ−４リンフオーマを用いた。培養上清と反応させた標
的細胞はよく洗ったのち、アイソトープ標識した抗マウ
ス免疫グロブリン、またはプロティン八を反応させて放
射能の強さをガンマカウンターで測定することにより、
特異抗体産生細胞を含むウェルを検出した。

この場合、放射能の強さは結合する抗体の最および抗原
との結合の親和性、細胞膜表面の抗原密度に依存するこ
とになる。以上の方法で目的とするモノクローナル抗体
を産生ずる融合細胞株が得られたならば、できるだけ早
期にクローニングを行う必要がある。方法としては、限
界希釈法、シングル　セル　マニピユレーション（ｓｉ
ｎｇｊｅｃｅｌｌ　　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）法が
用いられる。いずれの場合にもＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸
腺細胞をフィーダー　レイヤー（ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅ
ｒ）として加え、融合３■抱の増殖を助ける。クローニ
ングした細胞が十分に増殖してきたならば再度スクリー
ニングを行い、特異性を検定するとともに、抗体分子を
大量に産生じてい乙クローン（ｈｉｇｈ　　ｐｒｏｄｕ
ｃｅｒ）を選別する。クローンが確立した後にも何らか
の理由でクロモシームの脱落などを起こし、抗体を作ら
ない融合細胞株が出現してその割合が増えてくることが
あるので、細胞株維持のためにはクローニングを繰り返
すとともに、一部は凍結保存しておくことが大切である
。クローン化した細胞融合株は、ＩＩ　Ａ　’ｒ培地よ
り徐々に通當の培地に戻してゆきながら、インビトロお
よびインビボで増殖させ、大量のモノクローナル抗体を
採取する。

さて、作製されたモノクローナル抗体の特異性をさらに
詳しく検討するために、マウスおよびヒ１−由来のさま
ざまな腫瘍細胞や正常組織、ハムスターのメラノーマ細
胞などを標的細胞としてセルバインディング　アッセイ
　（ｃｅｌｌｂ　ｉ　ｎ　ｄ　ｉ　ｎ　ｇ　　ａ　ｓ　
ｓ　ａ　ｙ　）を行った。

・モノクローナル抗メラノーマ特異抗体の性質下記表１
に示すように、大別して２種類の抗原特異性をもつ抗体
を得ることができた。第１のグループはＭ５６−２に代
表される抗体で、免疫に用いたＢ］６マウスメラノーマ
にのみ特異的に反応するが、それ以外の細胞にはまった
く反応しないものである。すなわち、マウスの脳、眼、
皮＋１肝臓などの正常細胞、マウス由来のリンフメーマ
、あるいはメラノーマと同じ外胚葉系細胞由来の線維肉
腫、神経芽細胞腫とも反応しない。もちろん、ハムスタ
ーやヒトノいかなる腫瘍とも反応しない。

しかし、第２のグループであるＭ２５９〜０に代表され
る抗体はＭ５６−２と同様にメラノーマに特異性を示す
が、メラノーマならばマウス、ヒ１−、ハムスター由来
のものと種属を超えて反応する。しかし、それ以外のい
かなる種属の腫瘍細胞や止木組織ともまったく反応しな
い。したがって、この抗体は種属間共通に存在するメラ
ノーマ特異抗原をＬ’Ｑ　ＡＭしているものと考えるこ
とができる。この抗体の特異性は、補体依存性細胞傷害
試験によ、っても確かめられた。第１図は同試験の結果
を示ず。

図中・−ｅはＢ１６マウスメラノーマ、△−へはＥＬマ
ウスリンフオーマ、〇−〇はハムスターノラノーマ、ム
ームはＨｅ　ｌ　ｎヒト力ルチノーマ、×−×はＰ−３
９ヒトメラノーマを示す。第１図に示すようにＭ２５９
−０抗体（腹水）を用いてその化抗メラノーマ抗体の臨
床応用 癌治療の一つとして最近、免疫療法が注目を簗めるよう
になってきたが、その多くば免疫学的特異性を持たない
免疫賦活療法が主流をなしている。

腫瘍に対する特異抗体を用いての腫瘍免疫療法も古くか
ら行われているが、抗腫瘍効果は著明でな（、その有用
性は疑問視されてきた。その大きな原因の一つは作製さ
れた抗血清の特異性が明確でなく、力価の高い抗体が得
られなかったことに起因すると思われる。しかし、細胞
融合法の開発により単一抗原決定基に対する力価の高い
抗体が試験管内で大量に作ることが可能になった現在、
モノクローナル抗体を用いた癌の診断、治療への臨床応
用は大いに注目されている。われわれが作製し）こ抗メ
ラノーマ抗体ありラスはＩｇＭ抗体に属するため、抗体
それ自身で補体依存性傷害活性を示し、すでに述べたよ
うに、インビトロでの細胞傷害試験でメラノーマ細胞を
特異的に傷害する（第１図）。そこで、これらモノクロ
ーナル抗体を用いて、生体内における抗腫瘍効果を検討
した。

すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に同系マウ
ス由来のＢｌ（ｉメラノーマを移植し、肉眼的に計測可
能になった時点で、尾静脈より抗体を注射しＩＩｆ瘍の
増殖に及ぼす影響をみることで、その抗腫瘍効果を調べ
た結果を第２図に示す。第２図は担癌動物における抗メ
ラノーマ抗体の特異的活性を示すもので、Ｃ５７ＢＬ／
６マウス背部皮下に１≦ ×１０　　個の腫瘍細胞を移植し、腫瘍増殖後抗メラノ
ーマ抗体を１■／１回（↓）投与した。ａはＢ１６メラ
ノーマに及ぼす影響、ｂはＥＬ−４リンフオーマに及ぼ
ず影響を示す。図中○−Ｏは抗体非投与群、・−・は抗
体投与群を示す。

以上の結果より、ＢＩＧメラノーマにター　シＨｊｉ著
な増殖抑制効果がみられたが、対照の同系マウス由来の
ＥＬ−４リンフオーマに影響を及はさなかった。このこ
とは、抗体単独投与によるｌＩ！瘍特異的な抗腫瘍効果
を観察できた点において、モノクローナル抗体による腫
瘍治療の可能性を示したものといえる。

・メラノーマ特異抗原の解析 癌化に伴う細胞膜変化の分子レベルでの解析は、１９６
０年代後半から現在に至るまで広範に行われてきた。一
つは細胞膜表面の糖脂質の変化に由来するものて、アシ
アロＧＭ＋　、ＧＭ２などの糖質不全に付随すると考え
られる前駆体Ｍ積に由来するマーカーの出現、あるいは
ポルスマン （Ｆｏｒｓｓｍａｎ）抗原のような新しい合成系の誘導
現象により、新しい糖脂質マーカーが出現することが解
明されてきた。もう一つの膜変化は糖蛋白質の変化に由
来するもので、線維芽細胞の悪性化に伴い消退するフィ
ブロネクチンのような蛋白質の変化と、癌化に伴い糖蛋
白糖鎖そのものが変化する現象に分けて考えることがで
きる。この糖ペプチドの変化は、ＷａｒｒｅｎとＣ１１
ｃｋによりはじめて記載されて以来、最も広範に研究さ
れており、一般の上皮癌も含めて種々の悪性化細胞に共
通してみられる変化のようである。しかし、これらの報
告はいずれも癌細胞と正常細胞を比較した場合の膜変化
であり、これらの変化が生体にとって１ｌｆｆｉ瘍特異
的な抗原性を獲得しているか否かは別の問題である。こ
の点に関して本発明者らの発明したモノクローナル抗体
は腫瘍粕異抗原決定基の解析に需要な手段を提供する。

すなわち、メラノーマの細胞表面上にあり、これら二つ
の特異性の異なる抗体により認識される抗原決定基の性
状にｙＭ鎮の関与があるか否かについて検耐した。

すなわち、標的細胞であるノラノーマをグルコンダーゼ
で処理し、細胞表面の糖鎖を切断したのち、Ｍ２Ｓ−２
あるいはＭ　２５９−０の特異性の異なる抗体を反応さ
せて抗原性の変化について検ｄ・１シた。

その結果を表２に示す。Ｍ２Ｓ−２の標的細胞への結合
は、グルコシダーゼ処理によってはまったく影響されな
かったが、種族間共通抗原を認識するＭ２Ｓ９−０はグ
ルコシダーゼ処理によって８１６メラノーマに結合でき
なくなった。また、ヒ）−、ハムスター、のメラノーマ
をグルコシダーゼ処理したのち、標的細胞にした場合も
Ｍ２Ｓ９−０ばもはや反応しなくなった。このことば、
種属間共通のメラノーマ抗原の決定に糖鎖が関与してい
ることを強く示唆するものである。さらに、Ｂ１６メラ
ノーマはノイラミニダーゼ単独で反応させ、糖鎖末端よ
りシアル酸だけを取り除くだけでその抗原性を失ってし
まう。したがって、動物種属間に共通して存在するメラ
ノーマ特異抗原は末端にシアル酸をもつ糖鎖によって構
成された抗原決定基であり、一方Ｍ５６−２抗体が認識
するマウス特異的メラノーマ抗原は、糖鎖以外の蛋白部
分にあるものと名えられた。

さて、Ｍ２Ｓ−２抗体が反応するメラノーマ特異抗原は
蛋白質部分を認識するが、それを物理化学的に検索して
種族間共通抗原決定基との相関性を検耐した。すなわち
、Ｂ１６メラノーマを３Ｈ−ロイシンで内部標識し、４
０時間後の細胞上ｔｎ中に放出されたノラノーマ抗原を
Ｍ２Ｓ９−０およびＭ２Ｓ−２の２種類の抗体で反応さ
せ、抗゛７ウス免疫グロブリンを結合させたＳ、オウレ
ウス（ａｕｒｅｕｓを用いて沈降させた。沈降物を９％
ポリアクリルアミド勾配をもつ５ＤＳ−ＰＡＧＥを用い
て解析した結果、特異性の異なる２種類の抗体は共に分
子１３１０００の抗原分子を認識していることがわかっ
た。第３図はモノクローナル抗メラノーマ抗体によるＳ
ＤＳポリアクリルアミ１．ゲル電気泳動を示す。Ｂ１６
はメラノーマを３　Ｈ−ロイシンで内部標識し、４０時
間後の培養上清中のノラノーマ抗原をＩｇＭ抗メラノー
マ抗体（Ｍ２Ｓ　　２．　　Ｍ　２５９−０）、ＩｇＭ
ミラノーマ蛋白（ＣＢＰＣ−１１２）を用いて解析した
。そこで、これら二つの抗原決定基が同−分子上にある
か否かを調べるために、セフエンティアル　プレシピテ
ーション　（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　　ｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｔｉｏｎ）の方法を用いて検索した。すなわち、３
１１−ロイシンで標識した抗原を一方の抗メラノーマ抗
体で完全に吸収し、すでに反応しなくなった培養上清を
今度は特異性の異なる別の抗体で反応させて別の蛋白分
子が沈澱するか否かを調べた。その結）果いずれの抗体
を用いた場合でも、初回の沈澱物中には分子量３１００
０の蛋白が証明されたにもかかわらず、その上清と初回
とは異なる抗体で反応させても、再び沈澱してくる蛋白
は見られなか−、た。

一方、対照として初回に抗体活性のないミエローマ蛋白
で吸収させ１．その後抗メラノーマ抗体と反応させるこ
とにより、３１０００の蛋白を検出することができた。

このことは特異性の異なる二つの抗体が同−分子上の二
つの抗原決定基を認識していることを示すものである。

したがって、二つの抗原決定基は３］０００の分子量を
もつ糖蛋白質上に表現されており、マウス特異的メラノ
ーマ抗原は蛋白質部分によって構成されているのに対し
、動物種属間に共通して存在するメラノーマ抗原は、シ
アル酸が末端についた糖鎖部分で構成されていることを
示唆するものである。

実施例 実施例１゜ （１，１マウスへの抗原の感作 培養液ＲＰ’Ｍ　ｌ１６４０　（４％生胎児血清を含む
。

）中でｌＸｌ０　　／ｒｒ＋１！マウスメラノーマ細胞
に１００μｇ／ｍβのマイトマイシンＣを４５分間３７
°Ｃの条件下で反応させる。このマイトマイシンＣ処理
した１×１０　個の８１６−メラノーマ細胞をＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスの腹腔内に週１回の割合で投与、１０週に
亘ってこの免疫をくり返す。さらに細胞融合３日前に再
び１×１０　個のマイ］・マインンＣ処理Ｂ１６−メラ
ノーマ細胞を静注する。さらに、３〜４日後に、マウス
より肺臓を取り出し、細胞をばらばらにし、ＲＰＭ１１
６４０細胞浮遊液を得る。

（２）ハイブリダイゼーション ミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１　　（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　１．Ｉｍｍｕｎｏ　Ｉ、１３ｉ、ｌ
　−７、１９７８）　　ｌＸｌ０　　ｌ囚のＲＰ　Ｍ　
Ｉ　１６４０浮遊ン夜と前記（１）により調製された肺
細胞ｌＸ１０９個の浮遊液（場合によっては両者ともに
１ｘ１０８ｉＢを用ｐｓでもよい。すなわち、ミエロー
マ細胞と肺細胞の混合比は１：１０〜１；１のいずれて
もよい）を５０「ｎｐの遠心管に入れ、室温で４００ｘ
ｇ、１０分間遠心する。上清を完全に除去し、３ド恒’
／Ｌ　１Ｗ内に入れる。ピペットの先端で細胞をゆ−９
くりかき混ぜながら、加温した５０％ポリエチレングリ
コーノ１ノ（ＰＥＧ）溶液の１ｍｊ！を、１分間かりて
ゆっくりと加えていく。さらに１分間、同しビー（／ｌ
−でかき混ぜる。次に、加温したＲ　Ｐ　ｌｖｌ　Ｉ　
１６４０の２　ｒｎ　ｐ。

を、２分間かりてゆっくりとかきｌ昆ぜながら加える。

さらに、ＲＰＭｌ］６４０の７ｍ７２を２〜３分間かげ
て加える。室温で４００ｘｇ、１０分間遠心す伝上清を
除去して、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０　＋　１０％Ｆ　Ｃ
Ｓ　ＩＯｍｐを加え、軽くかき混ぜる。９Ｇ穴平底マイ
ク１コテストプレー１−に０．１ｍβずつ細胞浮遊液を
分注し、炭酸ガスふらん器内で培養する。

（３）スクリーニング 培養開始翌日に０．１ｍ７！の■（Δ′１゛培ｆｉ　；
＋′１．を加える。２．３，５．８．１１０後に、各穴
の士ｌｈを半分吸引し、新鮮なＩ−Ｉ　Ａ　Ｔ培養液を
Ｑ、１ｍ７！加える。

その後は、３〜４日ごとに、ＨＴ培養液で培地交換を行
う。

標的イ、ｌＩＩ胞には■ＢＩ６マウスメラノーマ細胞　
■ヒ１−メラノーマ細胞　■Ｃ５７ＢＬ／６山来ＥＬ−
４リンフオーマ細胞の３種を用いる。標的細胞５×１０
５個と５０μｌのハイブリ１−マ培養上清（抗体を含む
）とを０°Ｃ１５０分間反応させる。この反応は９６六
マイクロクイターブレー１−’（ダイ＋チック社製）上
で行なう。細胞を遠心によって洗藤後、５０ｐ（！の１
２’；、でラヘルした抗マウス１ｇ抗体（５００００ｃ
　ｐ　ｍ　／穴）を０”ｃ１時間反応さ−Ｕる。よく洗
ｉｌｌしたのち、乾燥させ、ガンマ−カウンター（ダイ
ナボッＩ・社製）にて放射活性を測定する。

判定ば■に反応し、■、■の標的細胞に反応しなかった
抗体を一応マウスメラノーマ特異的抗体としくＭ５６２
抗体）、次のステップ−へ進む。■および■と反応する
が■と反応しないものは種属共通メラノーマ抗原を認識
する抗体（Ｍ２５９−０抗体）としてあつかう。■、■
、■いずれとも反応しないもの、およびいずれとも反応
したものは非特異抗体として除外した。

目的抗体産生細胞のクローニング 限界希釈法（ｌ　ｉ　ｍ　ｉ　Ｌ　ｉ　ｎ　ｇ　　ｄ　
ｉ　Ｉ　ｕ　ｔ　ｉ　ｏ　ｎ）が使われる。スクリーニ
ングで特異抗体産生ノ＼イブリトーマ細胞が存在するウ
ェル（ｗｅｌｌ）が判明したら限界希釈法によってクロ
ーン化を行なう。そのト祭には、３０（固／　２０　ｍ
　ｅの’ＩＩＮ度になるように細胞を調整し、その０．
２ｒｒ＋７！づつを９６穴平底マイクロタイタープレー
トに播く。クローニング５０後に０．］ｒｎＡのＨ△培
養液を加え、１２０後に半分の培地の交換をｉｊう。そ
の後は３〜４０ごとに培地交換を行なう。

Ｍ５６　２抗体産生細胞の識別名をＤ２とし、Ｍ２５９
−０抗体産生細胞の識別名をＤ＋ｏとした。

・抗体の精製 それぞれのハイフ′す１−−マｉｘ＋ｏｅ＋固・を（１
３ＡＬＢ／ＣｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ＋　マウス腹腔内に
投与し、抗体を含む腹水を採取した。この腹水１Ｏｒｎ
　Ｒを遠心分！ｉｌｌ後、透析チューブに入れ、０．０
０１Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で４８時間透析
した。この操作でモノクローナル抗体はすべて沈澱させ
ることができる。沈澱したモノクローナル抗体は少量の
３％Ｎａα熔液に熔溶液せ、０．１　Ｍ　ＩＪン酸食塩
緩衝液−７，２で透析することによって可ｌ容性の抗体
として取扱うことができる。この操作を２〜３度くり返
すことによって、９５％以上の純度の・モノクローナル
抗体を得ることができる。Ｍ２５９−０及びＭ　５６−
２抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＭであり、しかも
ニーグロブリン （ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ）であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗メラノーマ抗体（Ｍ２５９−
０）による細胞傷害試験結果を示す。 第２図は担癌動物における抗メラノーマ抗体の特異的活
性を示す。 第３図はモノクローナル抗メラノーマ抗体によるＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。 特許出願人　　　谷　口　　　克 代理人　新井　力（ほか２名） １１９ 第　　１　　図 （％） 第２図 月ｔＡｙＮ１イｔ、ｎａｈ 第　３　図 ４ＴＪＬ参巧

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　１３１６メラノーマに対する抗体を産生ずる細胞
   とミエローマ細胞とのハイブリドーマに産生さ一已た、
   哺乳類共通のメラノーマ抗原を認識するモノクローナル
   抗体。 ２、　モノクローナル抗体がＭ２５９−０である特許請
   求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３、　８１６メラノーマに対する抗体を産生する細胞と
   ミエローマ細胞とのハイブリドーマに産生さ一ロた、８
   １Ｇメラノーマ細胞に対して特異的に反応するモノクロ
   ーナル抗体。 ４、モノクローナル抗体がＭ５６−２である特許請求の
   範囲第３項記載のモノクローナル抗体。