JPS61194100A

JPS61194100A - モノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS61194100A
Application number: JP3501385A
Authority: JP
Inventors: Haruhiko Nakamura; 治彦中村; Tatsuo Suzuta; 鈴田　達男; Masayuki Niitsuma; 新妻　雅行; Yoshihiro Hayata; 早田　義博
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1985-02-23
Filing date: 1985-02-23
Publication date: 1986-08-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒトの特に肺癌の診断に有用なモノクローナ
ル抗体に関するものである。

（従来の技術）肺癌の腫瘍マーカーとしてＣＫＡ、ＴＰＡ等が知られて
いるが、これらは悪性疾患以外にも良性疾患や健康者に
もみられるという欠点を有する。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びに；ｈｌｅｒの発明以来、癌に対
するモノクローナル抗体について研究が行なわれている
。

（発明が解決しようとする問題点）現在のところ、肺癌等の診断に有効な実用化されたモノ
クローナル抗体はまだない。

（問題を解決するための手段）本発明者らは、特に肺癌の診断に有効な実用化可能なモ
ノクローナル抗体について鋭意検討の結果本発明を完成
した。

即ち、本発明は「分子量３４キロダルトンのポリペプチド抗原と反応し
１次の性質を有する１２Ｍにに属するモノクローナル抗
体ＭＡ−１Ｄ５゜（１）ヒト肺扁平上皮癌と反応する。

（２）ヒト肺腺癌と反応する。

（３）ヒト肺悪性胸膜中皮腫と反応する。

（４）ヒト肺小細胞癌とは反応しない。

（５）ヒトの胃癌及び乳癌と反応する。

（６）正常のヒトの皮膚表皮と反応する。

（７）正常のヒトの肺胞上皮及び気管支線とは反応しな
い。

（８）正常のヒトの気管支繊毛上皮の繊毛と反応する。

（９）ヒトのＴ、Ｂ　　ＩＪンバ球系培養細胞株ＲＰＭ
Ｉ１７８Ｂ、ＪＭ、ＲＰＭＩ　６４１Ｑ、Ｌ工ＣＲ−１
，ＯＮ−ＨＭＹ２及びに５６２　と反応しない。

（１０）本発明のモノクローナル抗体ＭＡ−１Ｄ５が反
応する癌細胞を有する患者の末梢リンノく球とは反応し
ない。」に関するものである。

なお、以下の説明において述べる細胞１組織等は特にこ
とわりのない限り全て人の細胞１組織である。

又１本発明において各細胞１組織との反応性は。

本発明のモノクローナル抗体ＭＡ−ＩＩ）ｓを産生ずる
ハイプリドーマを人工培地（ＲＰＭＩ　１６４０に１５
％ＦＣ８を添加したもの）で培養し細胞が飽和状態に達
した際に得られる本発明のモノクローナル抗体ＭＡ−１
Ｄ５を含む上清をそのまま用いて得られた反応性である
。

本発明のモノクローナル抗体ＭＡ−ＩＤ５（以下ＭＡ−
１Ｄ５という）は後記実施例に示すとおり、前記の反応
性を有する。

ＭＡ−１Ｄ５は肺扁平上皮癌と特に高率で反応する。Ｍ
　Ａ　−１１）　５の認識する抗原は、肺扁平上皮癌、
肺腺癌及び肺悪性胸膜中皮腫の細胞膜及び細胞質の両方
に存在する。

又、ＭＡ−１Ｄ５に関する性質等は実施例に詳しく述べ
た。

本発明のモノクローナル抗体は例えば次のようにして製
造することが出来る。本発明のモノクローナル抗体が認
識する抗原でマウス又はラット等の動物を免疫する。（
この場合通常抗原を含む癌細胞又はその細胞膜成分が用
いられる）免疫された動物から抗体産生細胞を得、これ
と骨髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン化
し１本発明のモノクローナル抗体を産生する融合細胞を
選択し、これを培養し抗体を回収する。免疫法。

融合法、融合細胞の選択等は通常の方法によって行なう
ことが出来る。

更に詳しくは１例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。

先ず、マウスを肺癌紙＠（又はその細胞膜成分）で免疫
する。免疫する動物はマウスに限らずラット等のネズミ
科の動物又はその他の動物を使用してもよいが１通常は
マウスを用いるのが好ましい。

例えばＢＡＬＢ／Ｃマウスに肺癌細胞（又はその細胞膜
成分）を数日〜数週間おきに数回接種する。

その後マウスより牌１虞を摘出し遠心分離により抗体産
生細胞を得る。この細胞は増殖する能力を持たないので
、自己増殖能力を有する細胞と融合させる。自己増殖能
力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に好ましい。骨
髄腫細胞としては、同種の動物のものを用いるのが好ま
しく、又、抗体を産生しないものを選択するのが好まし
い。抗体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリコー
ル等の細胞融合剤と混合し細胞融合を行なう。抗体産生
細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数比で２：１〜１
０：１とするのが好ましい。得られた融合細胞は限界希
釈法により分離し１分離した融合細胞は増殖させたのち
、各穴（ウェル）において産生される抗体は公知の方法
例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、各種細胞組
織等と反応させ、その結果から所望の抗体を産生するー
イプリドーマを選択する。選択した・−イプリドーマを
培養器中で培養し上清液から抗体を得ることも出来るが
、生体内例えばヌードマウス腹腔内に−・イブリドーマ
を注入し、マウスの腹腔内で・・イブリドーマを増殖さ
せ、マウスの血清又は腹水から抗体を回収する方法によ
ることも出来る。

本発明のモノクローナル抗体を作るために免疫原として
使用する癌細胞は特定の株のものに限定されない。

（実施例）実施例１（１）モノクローナル抗体の製造ヒト肺腺癌株ＰＣ７（東京医科大学外科学教室で辻らに
より樹立され人工培地（ＲＰＭＩ　１６４０゜１５％Ｆ
Ｃ８）で継代維持されているもの〕の細胞１ｘ１０７個
を０．５　ＩＬｅのＰＢＳに浮遊させて１週間隔でＥＡ
ＬＢ／Ｃマウス腹腔内に２口腔内し。

最終免疫より５日後に牌臓を摘出した。

摘出した牌臓を細切したのち、ステンレスメツンユを通
し、１５００ｒｐｍ、２００ｐで遠沈して得た沈渣に５
０ｍ１の０．７％ＮＨ４Ｃ４を加え赤血球を除き、ＲＰ
ＭＩ　１６４０で２回洗浄して得だ牌細胞２Ｘ１０８個
に、ＢＡＬＢ／Ｃ由来骨髄腫細胞Ｓ　ｉ　９４　／　５
　ＸＸ０−ＢＵ　１（Ｉｌｉ’非生産、ＨＡＴ感受性）
をＲＰＭＩ　１６４０　　で２回洗浄して得た骨髄腫細
胞４Ｘ１０　個を混合し、２０００ｒｐｍ。

２００２で１０分間遠沈した。沈澱細胞をよくときほぐ
した後、４５％（Ｗ／Ｖ　）のポリエチレングリコール
１５００を含有した５７℃、ｐＨ７゜４のＲＰＭＩ　１
６４０，１ｍ／を加え８分間処理した。

反応１分後からＲＰＭＩ　１６４０　を徐々に加え総量
４０ゴとして細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、１
００ｆで遠沈後１０チ牛脂児血清を含んだＲＰＭＩ　１
６４０　を４０ｄ加えて細胞浮遊液を作り、５７℃、５
　％　ＣＯ２充填培養器中で培養した。２４時間後、Ｈ
ＡＴ人工培地ポキサンチン。

アミノプテリン、チミジン１０チ牛脂児血清）に入れ換
え、　ＣＯ［］ｔａｒ　ｍ１ｃｒｏ　ｃｕｌ七ｕｒｅ　
ｐｌａｔｅに、１ウエルあたり０．２ｄずつ分注培養し
た。

播種した７６８ウエルの内、２１５ウエル（２８，０％
）で融合細胞の増殖を認めた。Ｑｕｃｈ　ｅ−ｅ　ｒｌ
ｏｎｙ　法で工２陽性は１０２ウエル（ｔｓ−２％）。

このうち間接螢光抗体法でＰＯ２と反応したのは７ウエ
ル（０，９％）であった。

免疫原以外の培養細胞との交差反応を指標として特異性
が最も高い１株を限界希釈法を３回行うことにより単ク
ローン化し最も特異性が高く、リンパ球系培養細胞株に
５６２と反応せずｐｃ７と最も強く反応する１株をＩＤ
５株と命名した。

得られたＩＤ５株は培地（、ＲＰＭＩ　１６４０゜１５
％ＦＣ９）中で細胞が飽和状態になるまで培養した。こ
の培養上清に含まれる本発明のモノクローナル抗体をＭ
　Ａ　−１Ｄ　５と命名した。

（２）　Ｍ　Ａ　−１Ｄ　５による各種組織及び細胞の
染色（２−１）各種組織の染色ＭＡ−１Ｄ５による各種組織の染色は、ＨＢｕ。

Ｓ、Ｍ、等の方法（Ｊ、Ｈｉｓしｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｅ
ｏｃｈｅｍ、、　２９　。

５７７〜５８０．１９８１）に準じてアビゾンービオチ
ンーベルオキンダーゼ複合体法（ＡＢＣ法）によるホル
マリン固定、パラフィン切片の染色により行なった。即
ち、広く一般的に用いられている１０チホルマリン固定
後パラフイン包埋、薄切されたヒト肺癌組織、他のヒト
癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイン後、０．３％Ｈ
２Ｏ２を含むメタノールにて２０分間処理した。その後
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗った後、１０％正常豚
血清を含むＰＢＳにて３０分間処理した。次いで。

ＭＡ−ＩＤ５を含む溶液（上記実施例１の（１）の項で
得られた飽和状態の培養上清）と室温で３０分反応させ
た。そしてＰＢＳで１５分間洗った後、ビオチン化抗マ
ウスＩＢＭ　（ベクステイン社製）にて３０分間処理し
た。これをＰＢＳで１５分間洗っり後、アビジンＤＨ−
ビオチン化ベルオキシグーゼ複合体と室温で５０分間処
理した。これをＰＢＳで１５分間洗った後ジアミノペン
テジン溶液（５０ηジアミノヘンチジ７，０．００６％
Ｈ２ｏ２゜トリスバッファーｐＨ７，６）にて５〜１０
分間反応させた。

細胞核をヘマトキンリンにて染色後１通常の方法で封入
し検鏡した。

（２−２）各種単個浮遊細胞の染色標的細胞５×１０　個に上記実施例１の（１）の項で得
られた飽和状態の培養上清２００μｔを加えて３７℃、
３０分反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ５０
μｔに浮遊させ、それにＦ工ＴＣ結合抗マウスイムノグ
ロブリン５μｔを加え３７℃。

３０分反応させ、ＰＢＳで５回洗浄後螢光顕微鏡で螢光
を観察した。

（３）結果上記実施例１の（１）の項で得られたＭＡ−１Ｄ５を用
いて、上記（２）の項に記載した方法に従って各種組織
及び単個細胞の染色を行った。

各種培養細胞株、新鮮摘出腫瘍細胞、パネル赤血球、患
者末梢リンパ球に対しては間接螢光抗体法〔上記（２−
２）の方法〕を用い、パラフィン包埋組織切片に対して
はアビジンービオチンーベルオキンダーゼ複合体法（Ａ
ＢＣ法）〔上記（２−１）の′方法〕を用いて特異性を
検索した。結果は以下のとおりであった。

（３−１）各種癌組織及び癌細胞に対するＭＡ−１Ｄ５
の反応性表−１なお、肺扁平上皮癌、肺腺癌及び肺悪性胸膜中皮腫の組
織染色においては、細胞膜及び細胞質の両方に抗原の存
在が認められた。

（Ｓ−２）　Ｔ、Ｂ−リンパ球系培養細胞株ＲＰＭＩ１
７Ｂ８．ＪＭ、ＲＰＭＩ　６４１０．ＩＪ工ＣＲ−ＬＯ
Ｎ−ＨＭＹ２及びに５６２とはＭＡ−ＩＩ）ｓは反応し
なかった。（間接螢光抗体法）（３−Ｓ）上記（Ｓ−ｔ
）の項で癌細胞又は癌組織との反応が陽性になった８例
について、当該癌細胞又は癌組織を摘出した各患者の末
梢リンパ球をとり。

この末梢リンパ球とＭＡ−ＩＤ５との反応性を間接螢光
抗体法により調べたが、ＭＡ−ＩＤ５は８例の末梢リン
パ球のいずれとも反応しなかった。

（５−ａ）各種の赤血球型とのＭＡ−ＩＩ）５の反応性
（正常赤血球）ＡＢＯ，Ｒｈ−ｈ「（Ｃ，Ｄ、　Ｅ、　ｃ、　ｅ、　ｆ
、　Ｃ”　）Ｋｅｌｌ（Ｋ、　ｋ）、　Ｄｕｆｆｙ（Ｆ
ｙａ、　Ｆｙｂ）Ｋｉｄｄ　（Ｊｋａ、　Ｊｋｂ）、　
Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ　（ｘｒ’　）Ｌｅｗｉｓ　（Ｌｅａ
、Ｌｅｂ）、ＭＮＳｓ（Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｎ）Ｐ（ＰＬ）、
　Ｌｕｔｈ（Ｌｕａ）、工の各赤血球型抗原とはＭＡ−
１Ｄ５は反応しなかった。（間接螢光抗体法）（３−ｓ）各種正常組織に対するＭＡ−１Ｄ５の反応性
（ＡＢＣ法）表−２実施例２（ＭＡ−１１）５の殺細胞性〕ＰＯ２株を標的細胞としてＴｅｒａｓａｋｉ　ｐｌａｔ
ｅを用いたｍ１ｃｒｏｃｙｔｏｔｎｘｉｃｉｔ；ｙ　ｔ
ｅｓｔを行った。

即ち％ＰＬＬ処理したＴｅｒａａａｋｉ　ｐｌａｔｅの
各穴に６×１０５個／Ｋｅに調製１．たＰＣ７浮遊液５
μｔ。

段階希釈したｉＤ５株培養上清５７ｔｔ、Ｐｅ７であら
かじめ充分に吸収したウサギ補体５μｔを加え。

３７℃で４５５分反応せた後、ふりすてて残った細胞に
０．１％トリバンプルー５μｔを加え室温で５分反応さ
せ、再びふりすてた後、培地１０μｔを加え、鏡検して
細胞２００個を数え１色素排除を指標として死細胞の割
合を算出した。

ＩＤ５培養上清は１：８の濃度まで有意な補体依存性殺
細胞能を示した。

実施例５〔抗原解析〕 ■抗原の性状Ｐｅ７株に対し、糖鎖合成阻害剤（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃ
ｉｎ）添加（５６ｈｒ培養）、各種分解酵素処理（３７
℃。

３０　ｍｉｎ　）　、熱処理を行った後１間接螢光抗体
法を用いて抗原性への影響を調べた。

Ｐｒｏｔｅａｓｅ、　Ｔｒｙｐｓｉｎ、　Ｐａｐａｉｎ
、　Ｂｒｏｍｅａｌｉｎ　に感受性あり。

Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ、　Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓ
ｅ、　Ｋｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａ８ｅ　Ｄ。

β−ｇａｌａｃｔｏｓｌａｓｅ、　ａ−Ｌ−ｆａｃｏｓ
：１ａｓｓ。

（ｘ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ、Ｑ−Ｎ−ａｃｅ　ｅｙ
ｌ−ｇａｌａｃむｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅに感受性なし
。

膜構造を破壊しない濃度のＬｉｐａｓｅに感受性なし。

５６℃ｘ　１ｏ　ｍｉｎの熱処理に感受性あり。

これらより抗原は易熱性のポリペプチドであることがわ
かる。

■抗原分子量Ｉ　Ｘ　１０７個のＰｅ７に対し５００μｔ１％ＳＤＳ
、１０ｍＭ　　トリス塩酸緩衝１（ｐＨ６，ａ）を加え
、　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ　Ｌ　、　　４℃１２ｈ「イ
ンキューベーション後、遠沈（５０００ｒｐｍｘ３０ｍ
ｉｎ）１．。

上清を試料とした。１０μｔｔｌ−８ＤＳ−ＰＡＧＥで
泳動後、　　ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂｌｏｔ　ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　テ５０　Ｖ。

１８ｈ「泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。

このセルロース膜に一次抗体としてＭＡ　　ＩＩ）５゜
二次抗体としてＰｅ　ｒｏｘｉｄａｓｅ結合抗マウスエ
２抗体を用いたｂｌｏ　ｅｔｉｎｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
を行い、３４ＫｄＫ相当して単一バンドを得た。

ＭＡ−１Ｄ５は、ポリペプチド性の分子量５４Ｋｄの上
皮系腫瘍関連抗原を認識することがわかる。

実施例４〔１Ｄ５株の染色体数〕コルヒチン処理により分裂中期に停止した細胞を集めギ
ムザ染色を行い、５０個の細胞につき染色体を計数した
。

Ｓ　１９４　／　５　Ｘ　Ｘ　Ｏ−Ｂｕｌ　ノモードが
４０本であるのに対し％　１Ｄ５株は７６本であった。

実施例５ ■〔マウス腹水の精製〕プリスタン処理したＢＡＩＩＪＢ／Ｃマウス腹腔内に１
Ｄ５株Ｉ　Ｘ　１０７個を移植し、貯留した腹水を１０
日後に採取した。この腹水１　ｍｌをセファクリルＳ−
５００ゲルカラムで濾過しＰｅ７に対する活性分画を採
取した。

■〔抗体の単クローン性〕腹水から純化した活性分画について０ｕｃｈｌ−ｅｒｌ
ｏｎｙ法で工２鎖の分析を行ったところ、　ａｎｔｉ−
μ、　ａｎｔｉ−Ｎとのみ反応し、　ａｎｔｉ−７，ａ
ｎｔｉ−α、　ａｎｔｉ−λとは反応せずＭＡ−ＩＤ５
が工ｆＭ＃に属することがわかった。

また腹水の等電点電気泳動を行ったところｐＩ　＝＝　
７・６５に相当して単一バンドを得、単クローン性が裏
付けられた。

（発明の効果）ＭＡ−ｊＤ５を用いた診断により、特に肺癌の診断を的
確に行うことが出来、又、肺癌の組織型の判別にも使用
することが出来る。

Claims

【特許請求の範囲】１、分子量３４キロダルトンのポリペプチド抗原と反応
し、次の性質を有するＩｇＭκに属するモノクローナル
抗体ＭＡ−１Ｄ５。（１）ヒト肺扁平上皮癌と反応する。（２）ヒト肺腺癌と反応する。（３）ヒト肺悪性胸膜中皮腫と反応する。（４）ヒト肺小細胞癌とは反応しない。（５）ヒトの胃癌及び乳癌と反応する。（６）正常のヒトの皮膚表皮と反応する。（７）正常のヒトの肺胞上皮及び気管支線とは反応しな
い。（８）正常のヒトの気管支繊毛上皮の繊毛と反応する。（９）ヒトのＴ，Ｂ−リンパ球系培養細胞株ＲＰＭＩ　
１７８８、ＪＭ、ＲＰＭＩ　６４１０、ＬＩＣＲ−ＬＯ
Ｎ−ＨＭＹ２及びＫ５６２と反応しない。（１０）本発明のモノクローナル抗体ＭＡ−１Ｄ５が反
応する癌細胞を有する患者の末梢リンパ球とは反応しない。