JPS62501189A - 腫瘍↓−胎児に特異的なモノクロナ−ル抗体の調製方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３７、マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞系の融合生成物である第３５項ま たは第３６項に記載の／％イブリドーマ細胞系。

３８、該抗体がＩｇＭである第３７項に記載の１１イブリドーマ細胞系。

３９、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８６６３、ＨＢ−８６６４、ＨＢ−８６６５、ＨＢ− ８６６６またはＨＢ−８６６７と同一の特性を有している第３５項に記載のハイ ブリドーマ細胞系。

明　細　書 腫瘍−胎児に特異的なモノクロナール抗体の調製方法および使用方法 本発明は一部、アメリカ合衆国政府基金を用いてなされた。アメリカ合衆国政府 は、本発明においである特定の権利を有している。

技術範囲 本発明は腫瘍−胎児抗原、それに対する免疫反応性を有するモノクロナール抗体 、そのモノクロナール抗体の調製方法および、それらの抗体の使用方法（例えは 、癌の診断および腫瘍のタイプの分類などに使用する方法）に関するものである 。

背景 癌は、最も人間が挫折感を抱き、恐れている疾病のひとつである。文明人の寿命 がのびたために、明らかに、個人が癌にかかる可能性が、非常に高くなったので ある。癌が臨床的に認められると、癌制御に用いられる治療のほとんどは、大部 分の致死的な癌に対しては、せいぜい緩和するのが精一杯であるので、癌生物学 者のフラストレーションが増大している。新しい癌制御方法を発達させるために 、数十億ドルの研究費および数百万の労働時間が費やされたにもかかわらず、人 かかかる主な癌の生存率は、一般に改善していない。

それ故、腫瘍学者およびｌ」癌生物学者が癌生物学をよりよく理解することによ り、癌診断および癌治療のためのよりよい手段を必死に探求しているのは当然の ことである。

他の方法では治療不可能である腫瘍が、自然に軽減するという事例が、数少ない が有意に起こっているので、人体が本来持っている防御機構が、腫瘍出現に対す る抵抗を改善するために用いられているのではないかと生物学者は期待している 。いつの日か、二度と癌にかからないようにヒトを免疫することが、少なくとも 理論的には、できるようになるであろうという延入な計画へと、この希望的観察 は拡張してきた。

ヒトの癌、および動物の実験用の癌の多くに関して、癌宿主の免疫機構は、広範 な種類の自然発生癌および人工的に誘導した癌に存在している抗原決定群を確か に記憶しているらしいという事に、この２０年間に、生物学者は気がついた。あ るいはまた、免疫応答に対する妨害を発見した（例えば、抑制）。宿主の抗原性 腫瘍増殖に対する感受性にこの免疫的記憶が役目を果たす手段についての正確な 実体は、ごく最近に解明されてきたに過きない。

何年もの間、癌生物学者は、腫瘍細胞の内部に、または、その表面に現われる新 しい抗原を検出し、その特性を調べることＩこたずされってきた。このような抗 原決定基の多くは、ウィルス性の動物の腫瘍、および化学的に誘引した動物の腫 瘍に出現する。５Ｖ４Ｑウイルスのような発癌性ＤＮＡ含有ウィルスを不完全に 感染させるか、ＲＮＡ含有レテしウイルスを感染させた結果、形質転換した細胞 の内部に、または、その細胞表面に出現する抗原のタイプは、これらのウィルス の各々を用いて形質転換した異なる種の細胞にも存在することを一般に示すこと ができる。しかし、各々のウィルス種は、異なった腫瘍ウィルスにより誘導され たものに対して特異的な抗原を誘導する。化学的に誘導した腫瘍はその宿主中で 抗原性を有することが多いが、ウィルス性移植抗原を欠くこともある。

イン・ビトロ条件またはイン・ビボ条件のいずれかの条件下での細胞の、ウィル ス性形質転換の過程中、またはその後に出現する腫瘍関連抗原の内で最もよく知 られているものは（１）腫瘍関連細胞表面抗原、（２）膜関連腫瘍特異的または 腫瘍関連移植抗原、（３）主に核内に局在する細胞内抗原で、腫瘍抗原またはＴ 抗原と名づけられており、腫瘍が大きくなり、壊死が生じる場合にのみ免疫原と して機能するもの、（４）ウィルス粒子上に、または細胞膜内の成熟ウィルス自 体の上に存在するウィルス関連抗原、＋５１　Ｓ　Ｖ　４０形質転換細胞をイン ・ビトロで培養した場合に、細胞表面上でおよび、また、細胞外液中で再発現さ れた胚または胎児性抗原。

この胚または胎児性抗原は、抗体を用いて、および移植拒絶試験によっても検出 することができる（この序文は本質的にコギン（Ｃｏｇｇｉｎ）　、Ｊｒ、およ びアムブローゼ（Ａｍｂｒｏｓｅ　）　、メリーズ・イン・キャンサー・リサー チ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）、１８巻、１ ０章、３７１−３８９ページから抜粋したものである）。

診断薬および治療薬を調製することを目的として、腫瘍抗原に対する抗体（ポリ クローナルまたはモノクローナル抗体）を開発するための多くの試みがなされて きた。この希望を持って、以前に、２種類の免疫方法、すなわち異種免疫および 同種異系免疫が行なわれた。異種免疫は、マウスまたはラットなどの動物を、異 種の動物（例えば、ヒト）由来の動物組織（例えば、腫瘍組織）を用いて免疫す る方法である。同種異系免疫は、ある特定の種の動物を、同種であるが異なる系 （株）の動物由来の組織を用いて免疫することにより得る。ヒト神経芽細胞腫に 対するモノクロナール抗体を提供するマウスの異種免疫の例は、ケネット（Ｋｅ ｎｎｅｔｔ）、Ｒ，Ｈ，、モノクロナール抗体、ハイブリドーマ：ＡＮｅＷＤｉ ｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　、ｌ　Ｑ章 、１１５−１６８ページ、に記載されている。マウス牌細胞由来のヒト白血病細 胞に対して異種的に惹起させたモノクロナール抗体については例えば、サトウ（ Ｓａｔｏ）、らの「発育、増殖および分化」、２５：３３３−３４４（１９８３ ）に記載されている。異種免疫で調製する抗体（ポリクロナールであろうとモノ クロナールであろうと）には、いくつかの問題点がある。おそらく、その最も重 要な問題点は、このような抗体の腫瘍に対する完全な特異性を常に確立すること が明らかに困難であるということである。マウスまたはラットを、特定のヒト腫 瘍組織で異種免疫することにより得たモノクロナール抗体は、その特定の腫瘍ク ラスに対して完全な特異性を示すものはほとんどなく、その多（は正常な成人ヒ ト組織のあるものと反応する（例えば、ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　 ）　、Ｓ、Ａ、、ローゼンベルク編集、「ヒト癌抗原の血清学的分析」、ニュー ヨーク、アカデミツク・プレス、１９８０参照）。これらの問題点は、ヒト腫瘍 細胞を、組織不適合性宿主に注射した場合、ヒト１１瘍細胞は、腫瘍に特異的な 抗原を有するのみならず、他の多くの正常な非腫瘍関連抗原をも有しているとい う事実に起因する。それ故、異種の、または異系の腫瘍細胞に対して惹起せしめ たポリクロナール血清は必然的に、腫瘍に特異な抗原および腫瘍に非特異的な抗 原の両方に対して免疫反応性を有している。特定の抗原決定基に対するモノクロ ナール（ＭＣ）抗体を得ることができる様になったので、ハイブリドーマ上清か ら無作為に選択して得たモノクロナール抗体の内には、真実の腫瘍特異性を有し ているものがあるかもしれないという期待が生れてきた。しかし、これは単調で たいくつで、面倒な作業であり、結果が再現性を有している保証も乏しいのであ る。その結果は「のるかそるか」であり、抗体を「惹起」させるための古典的免 疫学のアプローチが基礎となっている。

この１０−１５年間にわたり、癌研究とは異なる系列の研究と共に、ヒトおよび 、げつ歯頚の悪性腫瘍の大部分は、同系宿主に於いて免疫原性を持つことができ 、細胞原形質膜に関連している共通の胚（胎児性）抗原決定基（ＥＡ）を有して いるという可能性がわかって来た（例えば、コギン（Ｃｏｇｇｉｎ　’）　、Ｊ ｒ、、「胎児性抗原と癌」、ピット？　７　（Ｐｉｔｔｍａｎ　）、ロンドア（ ＣＩＢＡ基金シンポジウム９６）、２８−５４ページ（１９８３）参照）。本明 細書で用いる定義によると、真のＥＡは胚芽の、（ｇｅｒｍｉｎａｌ　）、胚の （ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　）　、およびある胎児の細胞膜上で、特異的に発現され 、正常な成熟組織および再生組織においては（免疫原性的に）発現されない。子 宮内での、胎児の発達における胚の抗原の免疫学的役割はまだ明らかではない。

子宮内で発現されたＥＡに反応して、母体抗体が生成することが知られている。

悪性細胞クローンの出現時にＥＡを再発現させる発癌性プロセスの生物学的産物 が宿主において、腫瘍保護免疫応答の促進に親密な関係があるらしい。

これらの応答は、ＥＡ”（７）胎児を妊婦の免疫攻撃から保護するように働く妊 娠時の免疫応答と類似している。

実際に、胚の抗原は、げつ歯頚およびヒトのあらゆる種類の腫瘍によって発現さ れる。ヒト腫瘍（例えばメラノーマ）において発現される胎児性抗原（腫瘍−胎 児性抗原またはＯＦＡ抗原と同意義）は、共通のＥＡも報告されてはいるが、組 織学上区別されるクラスに分類すべきであると考えられる。アムブローゼ（Ａｍ ｂｒｏｓｅ　）、Ｋ、　Ｒ，ら、ネーチャー２３３　：　１９４（１９７１）； コギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ）　、Ｊ、ら、「癌研究の発達Ｊ　１９：１０５（１９ ７４）および、コギン、ＣＩＢＡシンポジウム、（前述）は、共通する免疫原性 抗原決定群を持ち、種の進化において保存されたげつ歯頚とヒトの胚の抗原は、 げつ歯頚の腫瘍におけると同様に、ヒトの腫瘍においても、ＯＦＡ抗原として再 発現されるということを報告している。この考えは、初めは、放射線照射を受け たヒトの胎児の腎臓細胞および放射線照射を受けた同系のハムスターの胎児細膓 は共に、ハムスターにおける５Ｖ４Ｑによる発癌を妨害するという発見から生じ た。成人ヒトの組織は同じように保護的ではなかった。

このことは、げつ歯頚の胚の抗原は、げつ歯頚の腫瘍−胎児性抗原と関連があり 、げつ歯頚の胚の抗原は、ヒトの胚の抗原のあるものとは同一であることを意味 している。ヒト胎児の腎臓細胞上に存在する胚抗原は、５Ｖ４Ｑにより活性化さ れたハムスターの胚の抗原に対して保護するので、少なくとも、ヒトの胚抗原の 内には、けつ歯頂の腫瘍−恰児抗原と同じものが存在しているのである。

最近まで、Ｅ　Ａの特徴を免疫化学的に特徴すけるのに使用できる試薬がなかっ たので、ＥＡ抗原の性質は明らかではなかった。しかし、多くの研究者が、モノ クロナール抗体を用いて精製を行なってはいないけれども、種々の胎児性抗原と いわれているものを発見したことを報告しティる。プライス（Ｐｒ１ｃｅ　）　 、　Ｍ、Ｒ，、Ｓｏｃ。

Ｔｒａｎｓ、、２　：　６５０（１９７４）は、ラット肝癌において、推定分子 量（１００ＫＤ）を有する大きな特性の示されていない胎児に関連した抗原を発 見した。エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、キー？７ｆ−・リサーチ（Ｃａｎ、　Ｒｅ ｓ、　）、３９：２００６（１９７９）は、ラットの肉腫が、３，５ＫＤ〜ＩＱ ＫＤの範囲に入ると推定される２つの腫瘍−胎児性抗原を示すＢｒ、　Ｊ、　Ｃ ａｎｃｅｒ、２９　：４２５（１９７４）は、胸、子宮頚、膣および網膜のヒト 腫瘍の抽出物が、胎児性抗原に関連しているらしい、１６〜１８ＫＤの大きさを もつ、いくつかの小さな共通のたん白質を含んでいることを報告した。ジョルン バーノｖＡ　Ｊｏｒｎｖａｌｌ　’ｐ　ｅｔ　ａｔ　、）、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、Ｓ 。

ＵＳＡ　７９：２８７（１９８２）は、５３　Ｋ　Ｄの腫瘍−胎児性たん白質を 発見したと報告している。それは、配列決定され、ＤＮＡ結合能力を、ポリオー マ中型Ｔ抗原（５５ＫＤ）と共有しているものであった。この形Ｍ転換に関連し たたん白質は、評価されたヒトおよび成人の腫瘍タイプのいくつかにおけるのと 同様に、いくつかの種の妊娠中期の胎児性細胞にも存在していた。

ヒト腫瘍細胞に、げつ歯頚のおよび／またはヒトの胚抗原が存在するかどうかに ついて研究がなされる一方で、同系の免疫を行なう研究者もいた。同系免疫は、 免疫学的方法によって、検出できる組織不適合性抗原決定基を除かれた動物シス テムにおいて誘導されるものである。いいかえると、同系免疫は、特定の動物を 、発生学的に同一の、（即ち、同種の、同系の）動物から得コギン（Ｃｏｇｇｉ ｎ、ｌ；　Ｊｒ、、ｅｔａｌ、）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔｈｅ　 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　ｌ　Ｑ　５　：　５２４（ １９７０）およびコギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ　）ら、「癌研究の発達」（Ａｄｖ、 　Ｃａｎ、Ｒｅｓ、　）　１９：　１０５−１６５（１９７４）は、／’　ムス ターおよびマウスの胎児細胞が、ＳＶ４０により誘導された肉腫および、他のウ ィルスにより誘導された、および化学的に誘導された肉腫と交差反応する抗原を 有し、その場合に、この抗原は抗体生成を刺激することを報告した。１０日間放 射線を照射したハムスターの胎児細胞を、成熟した同系のハムスターに注射する と抗体が生成するが、１４日間照射を行なったハムスターの胎児細胞を用いる場 合には抗体は生成しない。

そして、その後、これらの動物は５Ｖ４Ｑ腫瘍細胞のチャレンジに対して免疫能 を示すことが発見された。

照射を受けなかった胎児細胞は移植免疫を引き起さなかった。

ハンテ（Ｈａｎ＋ｕ　）　、Ｊｒ　、、コギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ　）ら、科学国 際アカデミ−会報（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　）　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　６８　：１ ７４８　（１９７１）は、ＲＬＶビールスに感染した細胞の成育およびプラズマ 細胞癌に及はす、マウス胎児性抗原（ζよ、る免疫の抑制効果を研究した。若い Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雄性マウスを３週間の間隔で、Ｘ線照射した同系胚細胞 を用いてプライムした。

このマウスにおいて、腫瘍の発達は抑制された。新生児の、または正常の異種細 胞を用いてプライムしたマウスにおいては同様の現象は観察されなかった。

児に対する感作を使用するコギン、、（Ｃｏｇｇｉｎ＋、　Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ 、）（前述）により記載された研究に従い、ライング（Ｔｉｎｇ）　、イア　、 ヒトｏ　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）　１４：２０７　（１９７８）は、マウス胎児細 胞由来の胎児性抗原の発現を研究した。妊娠期間１−２週間のマウス胎児から得 た組織にＸ線照射（５，０ＯＯＲ）　ｔ、た組織を用いて同系免疫を行ない、抗 血清を製造した。胎児性抗原は、実際の胎児組織から得たイン・ビトロで形質転 換した細胞系において５年後でさえも維持されていることが発見された。

同系免疫を用いるこれらのすへての研究は、細胞上の胚抗原の存在を分析し、宿 主内の腫瘍に対する免疫性を誘導することを目的として行なわれた。同系の宿主 由来の胎児組織についての胎児性特異抗原決定基に対するＭｃ抗体およびハイブ リドーマの誘導については記載がない。既知の妊娠時の、ハムスターのまたはマ ウスの胎児細胞表面上の胚抗原決定基のいずれに対しても反応性のあるモノクロ ナール抗体を誘導することは、このような試みは同系システム内での免疫を含む であろうから、いくらよく見ても凝わしいと予想されていた。さらに複雑なこと は、モノクロナールにつぃての文献中で、一般に報告されている可溶性の、粗製 の、胚の抗原調製物を用いる通常の頻回免疫方法により、Ｔ−抑制リンパ球が活 性化し、量に依存して、腫瘍移植を妨げることが、すでに示されているというこ ンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　４０　：　１３８０ （１９８０））。

ＢＩＪンパ球の活性化に関して、同系の胎児による超免疫の効果もまた、本発明 以前には知られていなかった。

粉砕した胎児細胞を多（含んでいる放射線照射を行なった、同系の胎児細胞調製 物を用いて直接免疫を行なった場合、５Ｖ４Ｑ肉腫細胞と交差反応する胚抗原に 対する静細胞１ｇＧが発達することが、雌性のげつ歯頚で観察されたが、このよ うな条件下では、腫瘍抵抗性および、たぶん細胞毒性エフェクターＴ細胞は発達 しなかった（アムブロゼ（Ａｍｂｒｏｓｅ　）　、Ｋ、　Ｒｏ、（前述）；コギ ：／　（Ｃｏｇｇｉｎ）、Ｊ、Ｈ９、キャンサー・リサーチ３９：２９５２（１ ９７９）　）。

実際に、スエビンスキー（５ｈｅｖｉｎｓｋｙ　）ら、「細胞」（Ｃｅｌｌ）、 　３０：６９７−７０５（１９８２）　は、胚で感作したマウスまたはラットの 膵臓を用いてハイブリドーマを得ることは非常に困難であると報告した。ただひ とつの胚特異性モノクロナール抗体（１４の融合中、　２，０００のクローンの 内）を得、報告した。さらに、このことは、累種免疫でも得られた。

それ故、本発明以前には、診断および／または治療において有効なハイブリドー マ−およびモノクロナール抗体を製造するのに有用なリンパ球を生成するには、 同系免疫は効果がなく、免疫原性を示すことさえもないであろうと予想される理 由がいくつか、本分野において存在した。

ヒト腫瘍において保持されているＥＡまたはＯＦＡの検出に関して高い特異性を 有する免疫性試薬を得る必要性が大きかったために、本発明を導びいた最初の研 究を行なう際には、本分野の以前の先入観を無視した。

本発明は、非増殖性（例えば、致死量の放射線照射をうけた）妊娠中期の同系胎 １児細胞を用いて動物の同系免疫を行ない、リンパ球を、そして終局的にはげつ 歯頚およびヒトの胚の抗原に対して高度な特異性を有するモノクロナール抗体を 製造することが可能であるという予期しなかった発見から生じた。このようにし て感作したマウスから得た膵臓細胞を、ハイブリッド・ミエローマ（ハイブリド ーマ）を調製するための既知の条件下にて、適切な増殖し続ける細胞と融合する ことができ、選別、スクリーニングおよびクローニングの後、胚抗原に高い特異 性を有するモノクローナル抗体を産生ずることがわかった。これらのモノクロナ ール抗体は、げつ歯頭およびヒトのＥＡ抗原と同一、またはほとんど同一である らしいヒトの腫瘍−胎児性抗原の交差検出を行なうという特異的な特徴を有する 。

このようなプロセスで得られたモノクロナール抗体は、今までに発行された文献 中に記載のない特異な腫瘍胎児性ポリペプチド抗原決定基を特異的に検出するこ とができる。

それ故、本発明は、以下の工程（（ａ）〜（ｄ））により、ハイブリドーマおよ びモノクロナール抗体を調製する方法を提供するものである： （ａ）　適切な動物を、適量の、同系の非増殖性妊娠中期胎児細胞調製物で免疫 し、 （ｂｌ　該動物から感作したリンパ球を分離し、（Ｃ）　適切な融合条件下で、 該リンパ球を不死細胞系と融合し、その結果、ハイブリドーマを得、そしてｆｄ ｌ　該ハイブリドーマからモノクロナール抗体を得る。

本プロセスの重要な点のひとつは、非増殖性胎児細胞で動物を同系免疫すること である。細胞を含まない粗製の抗原調整物を用いて、長期の免疫スケジュールを 行なう場合、胚の抗原は、イン・ビボ、すなわちＢａ１ｂ／ｃマウス、ハムスタ ーにおいて、免疫原性がないか、または免疫原性に乏しく、免疫抑制的であり、 イン・ビトロでは胚の抗原は、厳密に、相に特異的に、その培養を妨げると一般 に、信じられていたので、胚の抗原を免疫原として使用することは難しいであろ うという従来の信念および先入観に、本発明の結果を得る能力は、対抗するもの である。さらに、本発明方法は、げつ歯頚およびヒト腫瘍において広（発現され る進化的に保存されて来た胚抗原に対するＭｃＩｇを発達させることのできるこ とを示すものである。

本発明は、また、本方法により得られたタイプのモノクロナール抗体に関するも のであり、特に、以下に示す特定の性質（（ａ）〜（ｄ））を有するモノクロナ ール抗体に関するものである： （ａ＋　げつ歯頚およびヒトの妊娠中期胚−胎児抗原に対する免疫反応性、 （ｉ））　ヒトｉ！！１！瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫反応性、ｆｃ）　けつ 歯頚妊娠後期胎児組織に対する、またはマウス、ハムスター、またはヒトの成熟 組織に対して、実質的に検出不能の免疫反応性、 （ｄ）　ヒト正常組織に対して実質的に検出不能の免疫反応性。

この抗体はアフイニテイクロマトグラフイーにより、腫瘍関連抗原を単離するた めに使用することができ、原発性の腫瘍、腫瘍の転移または腫瘍の分類の診断と 検出により、ＯＦＡ抗原を発現する腫瘍を同定するために使用することができ、 試薬または結合性細胞毒性薬剤を腫瘍細胞へ特異的に輸送するのに使用すること かでき、そしてまた、腫瘍細胞を細胞毒性で殺傷することにより潜在的受動免疫 を提供するために使用することができる。

本発明は、また、腫瘍の診断のマーカーおよび／または腫瘍分類のマーカーとし て有用な、新規な腫瘍胎児性抗原に関するものであり、その抗原の内のひとつは 、分子量が約４４，０００−４８，０００であるポリペプチドであり、他のもう 一つの抗原は、分子量が約２００，０００であるポリペプチド（上記のポリペプ チドが共有結合した多重結合体であるらしい）である。

本発明は、ある挿類の、真に腫瘍−胎児抗原に特異的な試薬への道を開くもので ある。

図の説明 ハイブリドーマの１０−１２日培養土清中のいくつかのＭｃ　抗体の、固相（ｓ ｐ）ＥＬＩＳＡ検定におけるプラスチックマイクロウェルに固定した１　２　ｄ ｍｆｃ（マウス胎児細胞の妊娠日数）標的を用いる滴定を第１図に示す。Ｉ　ｇ 　Ｇ２□イソタイプであるＭ　ｃ　５８以外は、示されたすべての抗−ＥＡモノ クロナールは、ＩｇＭイソタイプであった。ＭＰＣｌｌは、（ＩＥ検定によると ）胎児に関連した抗原決定基ではない未知の抗原決定基に対するものであるので 、ＭＰＣＩＩは比較用に選択された対照のＩｇＧＭｃ抗体である。ＭＰＣ−１１ はすべての実験において、負の対照として用いられており、各々の実験において バックグラウンドのＥＬＩＳＡレベルを確立するものである。

他の抗−ＥＡＭｃ％ＩｇＭ　６９．１の胎児特異性を第２図に示す。成熟マウス の膵臓、肝臓、筋肉、肺、および皮膚細胞（）の、または１２−１３妊娠日で初 産のマウス胎児細胞（○）の、または２４日齢のマウス筋および膵臓細胞（）の 、濃度を上昇させてゆき　Ｍｃｌｇ（６５００Ｄユニツト）をそれらとの初期吸 着によって、１２時間４℃にて処理し、遠心分離して、細胞小球を除去し、固相 ＥＬＩＳＡ検定において再滴定した。

試験開始４または２４時間前に、イン・ビトロで培谷するか、あるいは収穫した １２−１３日妊娠日のマウス胎児細胞を用いて、無作為に選んだハイブリドーマ 上清の結合親和性の変化（最大の反応性を示すまでの時間）を比較する免疫濾過 ＥＬＩＳＡの結果を第３図に示す。細胞は、すべての場合において、同数に標準 化し、同じ生存能力（１０％）を有していた。

新たに得て、直ちに用いるか、あるいは液体窒素中に一週間、凍結させておき、 解凍して、免疫濾過ＥＬＩＳＡ　検定に用いるかのどちらかの方法で用いる１３ ｄｍｆｃｓとの第３図に示した上清の反応能力について比較した結果を図４に示 す。両方の検定は、同じ試験中においては同じ日に行なった。ＥＬＩＳＡ反応は 、クロモゲンを添加後の発色の早さによって示す（モモモモ−５分間以内に完全 に呈色、モモモー１０分間以内に完全に呈色、モモ−１５分間以内に呈色、モー ２０分間以内に少し呈色、０＝呈色せず）。

セファロース４Ｂ二表示したＭｃ抗体に負荷した１２ｄｍｆｃｓマウス組織の、 または成熟マウス組織のＮＰ４０抽出物（４ｕｇｓ　）中の、胎児特異性４４− ４８ＫＤおよび２００　ＫＤポリペプチドの検出を第５図に示す。ゲル複合体を 徹底的に洗浄し、溶離し、その溶離液を５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、コオ マジイ・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ　）を用いて染色した。モロニイ （Ｍｏｌｏｎγ）肉腫ウィルス・エンベロープ・グリコプロティン決定基（ＭＳ Ｖ）に対するマウスのＭｃｌｇＭを胎児細胞抽出物と共に対照ＭＣとして使用し た。ｆ＝胎児抽出物、１＝成熟組織抽出物。−香石のレーンは標準分子量マーカ ーを示している。１９−２０日マウス胎児細胞は、前記の成熟細胞の結果と同一 の結果を示した。

１２日マウス胎児細胞のＮＰ４０抽出物から得た胎児特異性の４５ＫＤのおよび ２００ＫＤの、増加量のポリペプチドを除去するＭｃｌ１５５ｈｌｌＩの能力を 第６図に示す。レーン１＝標準分子量、レーン２＝ＭＣ１１５ｓｈＩＩＩモ胎児 抽出物（１０μ召）、レーン３　＝Ｍｃｌ１５５ｈＩＩＩモ抽出物（２０μ召） 、レーン４　＝　Ｍｃ　１１５　ｓｈ　ＩＩＩ÷抽出物（３０μＣ）、レーン５ 　＝　Ｍｃｌ１５　ｓｈ　ＩＩＩモ１０×　成熱抽出物（１０μｅ）、レーン６ −抽出物（２０μｇ）、レーン７＝抽出物（３０μｅ）。

本発明を実施する最善の方法 本発明は、動物を、非増殖性、妊娠中期の胎児細胞調製物を用いて同系免疫を行 なうことを基本としている。適切な動物ならば、どのようなものでも用いてよく 、例えば、げつ歯頚（マウス、ラットまたはハムスターのような）、山羊、馬、 にわとりなどを用いてよい。マウスを用いるのが最も好ましい。実際に、多くの 実験を行なった結果、充分特徴が調べられている通交系マウスであり、本分野に おける熟練者に良く知られており、市販されている、（：５７ＢＬ１５ｎが、最 終的なハイブリドーマを得るために最も適していることが発見された。別の通交 系マウスであるＢａ１ｂ／ｃマウスは最初の実験に使用するのに容易ではないで あろう。

同系の胎児細胞が、選択された種の妊娠時の妊娠中期であるべきであり、初産の 雌から得るべきであるということは重要な点である。それ故、例えば、マウスの 妊娠中期は１２−１４日の間であり、一方、／１ムスターのそれは９−１０日の 間である。このことが必要とされる理由は、胚の抗原が相（期）特異性であるか らである。妊娠の初期に、抗原は陽性であるらしいが、胎児組織の量か非常に少 なく、これらの初期組織は有用ではない。正常な成熟細胞、満期胎児細ｊ泡（１ ９−２１日のマウスまたは１５日のハムスター）、腫瘍細胞、成熟マウス組織ま たは成熟ハムスター組織を用いた場合には、満足な結果を得ることはできない。

免疫を成功させる、もう一つの別の条件として、同系の免疫胎児細胞調製物にお いて分裂を阻止する必要がある。ＤＮＡ複製を停止させる多数の良く知られたプ ロセス（例えば、Ｘ線照射、紫外線またはセシウム照射またはヨウ化デオキシウ リジン処理など）のいずれかのプロセスにより、増殖を停止させることができる 。免疫を行なう前に、細胞全体にＸ線照射（約４，０００−６，０ＯＯＲ）を行 なうのが望ましい。免疫期間中に連続的な細胞の複製が起るようならば、胚の抗 原は、細胞表面から迅速に消失しく免疫抗原として）、所望のハイブリドーマを 得ることに失敗するだろう。

（免疫に先立って）胎児細胞を収穫し、分散する方法についてはコギン（Ｃｏｇ ｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，ら、「癌研究の発展Ｊ　（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）、１９　：１０５　（１９７４）に記載がある 。酵素分散を用いるのは好ましくない。

妊娠したドナーを用いる方法、すなわちＢａ１ｂ／ｃ　ドナーに胎児細胞を注射 し、高段用量で長期間感作を行なうという、通常のハイブリドーマ製造に用いる 方法で行なった初期の免疫の多くの試みが成功しなかったことは注目すべきこと である。最善の免疫を、最後のブースター（追加抗原刺激）を含む合計３回の注 射からなる短期のコースにおいて細胞により理想的に得る。

細胞はそれのみを注射してもよいし、マイコバクテリウム・スメガマテイテイス （、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇａｔｉｔｉｓ　）またはＭ、ラベル クロシス（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　）のいずれかヲ含む７０インドのア ジュバント中の細胞を注射してもよく、次に、胎児細胞およびフロイントの不完 全アジュバントを用いるブースター注射を行ない、最終のブースター注射は胎児 細胞のみで行う。注射は腹腔内に行なっても静脈内に行なってもよいが、前者が 最も適している。感作された膵臓細胞を、通常、最後の抗原注射から約２−３週 間後に行なう最終のブースター注射から約３日後に得ることができる。免疫に用 いる胎児細胞の量は、通常、１回の注射あたりだいたい１０６−１０８の間であ る。細胞全体、注意深く調製した細胞膜または、その他のＥＡを含む細胞抽出調 製物を用いてもよいが、いずれの場合も抑制細胞の発達が阻止されるように、免 疫計画を厳格に調節しなければならない（ウニブナ−とコギ７　（Ｗｅｐｐｎｅ ｒ　ｋ　Ｃｏｇｇｉｎ　）、セル−イム１０ジー（Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍ、）、５４ ：１９３．１９８０　）。

感作した膵臓細胞を得た後、適切な融合条件下で所望の不死細胞系と膵臓細胞を 融合し、／Ｘイブリドーマを得る。ハイブリドーマを調製し、これを選別するプ ロセスは、ケンネット（Ｋｅｎｎｅｔ　）、マツテ／Ｌ／　７　（Ｍｃｋｅａｒ ｎ　）およびベクトール（Ｂｅｃｈｔｏｌ　）　による「モノクロナール抗体、 バイブリド−７：生物学的分析における新しい単位」、プレナム出版、ニューヨ ークおよびロンドン（１９８２）に詳しく記載があり、特に、「モノクロナール 抗体の再生産および特徴づけ」という題名の補遺（ＰＰ、　３６３−４１７）に 詳しい。これらを本明細書に参考として記載した。増殖し続ける（不死）細胞系 で好ましいものの内のひとつはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３である。ポリエチレン グリコールの存在下、ネズミのミエローマ細胞と膵臓細胞との細胞比率を１：１ ０にして、融合を行うことかできる。選別は、普通、例えばＨＡＴのような選別 溶媒中にて行なう。ハイブリッド細胞はマクロファージ細胞系ＲＡ　Ｗ２６４， ７から得た上清を補足したＩ−Ｉ　Ｔ溶媒中に保存する。この溶媒は、活発に増 殖するＩｇＭ製造ハイブリドーマを得るために必須である。

このマクロファージ細胞系は、本出願の提出期限前にアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　）に寄託され、その番号はＣＲＬ　８６６８　である。多量の ハイブリドーマコロニーのクローニングは、例えば、末端希釈法やメチルセルロ ース内でのコロニー形成法などのような種々の方法の内のいずれを用いて行なっ てもよい。免疫グロブリンのクラスは、例えば、免疫拡散検定法により、および 、タイプを分類する抗体（抗−マウス免疫グロブリン）を用いることにより明ら かにしつる。本発明におけるすべての場合において、モノクロナール抗体は無傷 の胎児細胞を用いて誘導した場合にはＩｇＭクラスであり、溶解した胎児細胞を 用いて誘導した場合はＩｇＧイソタイプであることが発見された。しかし、この ことは限定的ではなく、その他のクラスも得ることができ、使用することができ る。

胚の抗原に関するモノクロナール抗体の特異性の厳密な試鹸は、新生児の、およ び成熟したマウスの組織（Ｃ５７ＢＬ／６ｎまたは新しく集めた全組織と共に） から調製したアセトン粉末を用いるコロニー上清の吸着スクリーニングにより行 なう。１パツクのアセトン粉末を同体積のハイブリドーマ上清と混合し、インキ ュベーションした。この混合物を、酵素を結合させた免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ ）に使用する前に遠心分離する。

吸着したバイブリド−７の上清か陽性の反応を与える場合は、真の決定基に対す るものであるとみなし、クローニングのために処理する。

生産物 前記のプロセスで得ることのできるモノクロナール抗体は、もとの動物の妊娠中 期の胚−胎児性抗原に対して実質上免疫反応性を有し、もとの動物由来の妊娠後 期の胎児性組織に対しては、実質上、検出しうる免疫反応性は有しておらず、ま たヒト正常細胞に対する実質上検出しつる免疫反応性は有していない。

免疫される動物がマウスである場合、本発明に係るモノクロナール抗体は、げつ 歯頚の妊娠中期の抗原に対して免疫反応性を有するが、げつ歯頚の妊娠後期の組 織に対しては、免疫反応性を有していない。

妊娠中期における胚の抗原は、ヒト癌細胞中の腫瘍−胎児性抗原として再現する が、ヒト正常成熟胎児細胞、新生児の胎児細胞、および妊娠完了期の胎児細胞中 においては、検出可能濃度において存在していないので、得られたモノクロナー ル抗体は胎児および癌に対して高度に特異的である。実際、妊娠中期の同系細胞 は、免疫した宿主の抗原と異なるいかなる抗原（胚の抗原以外のもの）も有して いないので、それに由来したモノクロナール抗体は、ＥＡおよびＯＦＡに真に特 異的である。

本発明に係るモノクロナール抗体の特異性に関して、１０日妊娠ハムスター胎児 細胞に対して誘導したポリクローナルインビボ吸着異種抗血清が、マウスの胎児 細胞（１２−１３日）またはハムスターの胎児細胞（１０日）の３　Ｍ　Ｋ（４ 抽出物、またはＮＰ−４０抽出物から得られる明らかな胎児特異的ポリペプチド を免疫沈降するという発見は興味深い。このような研究は、また、妊娠のこの時 期には、いくつかのポリペプチド（１０−１２）か存在し、新生児の組織および 成熟組織には存在しないことを示し、これらのポリペプチドには、より小さなポ リペプチドの重合体であるものも存在していることを示している。検出された胚 の抗原のほとんどは、両方のげつ歯頚（マウスおよびハムスター）において共通 である。胚抗原が１０日妊娠ハムスター胎児細胞と共通することが知られている 各種の腫瘍系もまた、このポリクロナール抗血清により殺傷される。一方、検出 できる腫瘍−胎児性抗原が、ハムスター胎児性細胞と共通しない腫瘍系は殺傷さ れない。両方とも成人ヒトの正常な線維芽細胞ではない。ポリクロナール血清中 に存在している抗−ＥＡＩｇＧ抗ＩｇＧいくつかの胚の抗原決定基を特異的に免 疫沈降させる。このことは、存在するＩｇＧ抗体により認識されるＥＡポリペプ チドはい（つかあるか、限定された数しかないということを示している。

ポリクロナール血清に関して得られたこれらの結果ハ、本発明に係るモノクロナ ールの特異性と一致している。本発明に係るモノクロナールは、せまい範囲の特 異性を有している。

すべての場合において、分子量が約４４，０００−４８，０００ダルトンである 特異的なポリペプチド（本明細書中では「４６　ＫＤポリペプチド」としても表 わす）が確認される。また、同じ胎児細胞から分子量約２００，０００ダルトン のポリペプチドも確認される。後者のペプチドは、４５ＫＤポリペプチドの多重 結合体であるか、または、４５ＫＤたん白質上に存在しているものと同じＥＡ抗 原決定基を有する第２のポリペプチドかもしれない。この４５ＫＤポリペプチド は、胚の妊娠中期に特異的な抗体であり、真の胚の抗原、すなわち、腫瘍胎児性 抗原であるらしい。

使用方法 本発明のモノクロナール抗体は広範囲にわたり利用することができる。診断の、 治療の、分析の計画および研究に適用することができる。

利用できる診断技術の内で、本発明の１つの側面は、ヒト腫瘍に関連する腫瘍胎 児性抗原を検出する方法であり、その方法は、 （ａ）　該腫瘍胎児性抗原を含むと考えられるヒトのサンプルを、本発明（こ係 るモノクロナール抗体とともにインキュベーションし、そして ［ｂ）　該抗原と該抗体とが、実質上、結合しているかどうかを決定することか らなる。

腫瘍胎児性抗原の検出は、免疫分析技術の分野における専門家に良く知られてい る方法で行なうことができる。例えば、競合分析または免疫定量分析を用いるこ とができる。競合分析の場合ｆこは、モノクロナール抗体を、検出可能なように ラベルした一定量の腫瘍胎児性抗原と共に、および腫瘍胎児性抗原を未知量含有 していると考えられる標本と共に、インキュベーションする。検出可能なように ラベルした抗原と標本中に存在する抗原との間で競合が起こり、比較的直接的な 方法で、標本中の抗原量を定量することができる。

免疫定量分析の場合には、本発明に係るモノクロナール抗体を（先にまたは後期 に）適切な面相上に固定し、ヒト腫瘍に関連しており、腫瘍胎児性抗原を含有し ていると考えられる標本と共にインキュベーションする。次に、溶解性の、検出 可能なようにラベルした、同じモノクロナール抗体または異なるモノクロナール 抗体を、サンプルと共にインキュベーションし、適切な方法で洗浄すると、複合 体が形成され、固相にラベルが結合する。ラベルした抗体の量とサンプル中に存 在する腫瘍胎児性抗原の量の間に直接的な比率関係を得ることができる。免疫定 量分析は、先の、逆の、または同時の方法で行うことができる。これらはすべて 本分野における専門家によく知られている。例えば、ディピッド（Ｄａｖｉｄ） らによる［モノクロナール抗体を用いる免疫定量分析」（米国特許４，３７６Ｊ １０　）を参照せよ。多価の抗原に対するＩｇＭ　モノクロナール抗体を特別に 用いる免疫定量分析については、例えばウエンズ（Ｗａｎｄｓ　）ら、ＰＣＴ／ ＵＳ８１１０１２７０　も参照せよ。

検出ラベルは、ラベルした抗原に関してか、または、ラベルした抗体に関しての どちらに利用してもよい。

これらのラベルには、放射能ラベル（例えば、Ｐ３２．１２５Ｉ、３Ｈ１３５Ｓ 、１４Ｃなど）がある。これらのラベルには、ＥＬＩＳＡ技術にて使用される酵 素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ 、ペニシリナーゼなど）、螢光化合物（フルオレセインなど）、バクテリオファ ージ、ＮＭＲ画像法に有用な金属、放射能画像法に有用な他の放射能ラベルなど が含まれる。放射能ラベルまたは酵素ラベルが、分析に適している。

適切な、良く知られている、免疫分析に有用な同相ならばどれでも用いてよい。

これらの固相には、ラテックス粒子、ポリスチレン・ビーズ、試験管、繊維、ウ ェル、他の天然の、および／または人工の重合体などがある。

ＭＣ（モノクロナール）１ｇで精製した抗原は、ＯＦＡに対する感作用の通常の 皮膚のテストに用いることができ、リンパ球幼若化現象分析における抗原として 用いることができる。この抗原は、また、腫瘍の発達または再発に対抗する宿主 の免疫系を感作するのに用いることもできる。

本発明にて発見した胚の抗原はまた、前記の標準的な免疫分析による腫瘍の検出 用および／または診断用のマーカーとして使用することもできる。これらの分析 には、本発明に係る方法を用いて調製した抗体、または他の方法で調製した、そ れに相当する他の類似抗体を使用してもよい。この分析は、先に記載のポリペプ チドを、検出可能な様にラベルして利用してもよいしく例えば、競合方法）、ま たは、不溶形にして利用してもよい（抗体用の凝集分析、または、抗体用の結合 分析）。それ故、例えば、本明細書中に記載した、胚の抗原−０ＦＡ特性を有す るポリペプチド（ＭＷ４４．０００−４８，０００　）を検出可能な様にラベル したもの、または、固定したものも、また、本発明の１部分である。

このポリペプチドを含む抗原とモノクロナール抗体との複合体も、また、本発明 の１部分である。例えば、イン・ビトロにおける診断用分析において、またはイ ン・ビボにおける診断の、画像作製の、または治療のプロセスにおいて、モノク ロナール抗体がそのポリペプチドと結合した場合に、このような複合体が生成す る。それ故、モノクロナール抗体が放射性同位体または金属原子（群）と結合す る放射能画像作製方法（例えば、放射能方法または、核磁気共鳴方法）において 有用な複合体も、また、本発明の１部分である。

腫瘍の成長または広がりを抑制、阻害、または遅延する能力のある化合物と、本 発明に係るモノクロナール抗体とを結合し、選択的な「魔法の弾丸」の治療薬と して、その結合物を利用することも、また、その使用方法に含まれる。この抗体 のその他の用途には、受身免疫療法がある。

抗原および／または抗体のその他の利用法は、妊娠か正常であることを確認する ためのヒト胎売上の胚抗原の検出、胎児生物学における分化のマーカーの分析、 胚抗原および腫瘍胎児性抗原の精製、ヒトの腫瘍および動物の腫瘍のタイプの分 類、腫瘍患者における循環している腫瘍胎児性抗原のスクリーニング、および、 腫瘍識別マーカーの分析がある。

腫瘍のタイプの分類は、特に重要である。腫瘍のクラスには４つの基本的なタイ プ（悪性１連瘍（癌）、悪性リンパ腫、白血病、肉腫）がある。その各々につい て、いくつかのサブクラスがある。ａ瘍胎児性抗原は種々の組織に出現する。例 えば、あるｍ瘍胎児性抗原が、大腸癌に出現し、それとは異なる腫瘍胎児性抗原 が乳癌に出現する。それ故、本発明に従って得られたモノクロナール抗体のパネ ルを作成し、成人標本中の特定の腫瘍胎児性抗原の存在のみならず、その抗原の 分類（悪性腫瘍、悪性リンパ腫、白血病または肉腫）、さらに、その組織源（大 腸、乳など）の分類を行なうことのできる迅速なスクリーニング方法を実施する ことができる。

それ故、本発明は、上記の適用法を行うためのキットの調製に向いている。この ようなキットは１またはそれ以上の容器を密着させて収容するための区切られた 保持体を有しており、その最初の容器は、例えば、本発明に係るモノクロナール 抗体を不溶の形で含んでいてもよく、また、第２番目の容器は、上記のモノクロ ナール抗体または異なるモノクロナール抗体を、検出可能なラベルを施された、 溶解し得る形で含んでいてもよい。従って、使用者は特定の腫瘍胎児性抗原のた めの免疫検定を行なうことができる。このキットは、検量線を作成することがで きるように、種々の濃度の腫瘍胎児性抗原を含む一連の容器を含んでいてもよい 。

さらに、腫瘍のタイプを分類するために、キットは予め各種のモノクロナール抗 体を、検出可能なラベル体で、または不溶形で、または、その両方の形で含む一 連の容器を含有してもよく、これにより、特定のヒト！瘍サンプル（例えば生検 など）について、迅速なスクリーニングおよび特異的な分析を行なうことができ る。

以上、本発明を概説したが、本発明は以下に示す特定の例を参照すればより良く 理解できるだろう。ただし、本明細書中に含まれるその例は、ただ、例示するの か目的であり、特にことわりがなければ、本発明を限定する目的のものではない 。

実施例１ 本実施例において記載したのは、マウスの胚（胎児）抗原に対する、いくつかの モノクロナール抗体の開発に成功した方法、無損傷マウス胎児細胞を用いてモノ クロナール抗体を迅速にスクリーニングする方法の確立、ＥＡを含む組織および 細胞に対するモノクロナール抗体のイソタイプの定義づけ、およびその特異性の 例示、および細胞表面関連ＥＡに対するモノクロナール抗体価を定量分析するた めの固相ＥＬＩＳＡ法の説明についてである。このエピトープは、ヒト、ハムス ター、およびマウスの胎児、および種々のゲツシ類の腫瘍で発現されることがわ かる。

用具および方法 化学試薬　バンカー（Ｈａｎｋｅｒ　）　／ヤーテス（Ｙａｔｅｓ　）、フェニ ルヒドラジンおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は市販品を購入した。

細胞　マウスのマクロファージ細胞系（ＲＡＷ　２６４・７）は、子ウシ胎児面 ａ（Ｃ５，１９％）、Ｌ−グルタミン（２ｍ　Ｍ　）、重炭酸ナトリウム（０， ０４５％）を含むダルベツコ溶媒中で培養した。これらの細胞の融合状態の培養 物から濾過した培養溶媒を、ハイブリドーマ増殖溶媒に追加するために用いた。

マウスＬ細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）お よび重炭酸ナトリウム（０，０４５％）を補足したエール塩（した。ＷＦ５−Ｉ 　ＳＶ４０誘導ハムスＪ）　−（Ｌ　ＶＧ　）　肉腫細胞およびｍ　Ｋ　Ｓ　Ａ 細胞、５Ｖ４Ｑ形質転換マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）肉腫は、ＦＢＳ（１０％）、グ ルタミン（２ｍＭ）および重炭酸ナトリウム（０，０４５％）を補足した１９９ 溶媒中で増殖した。（、Ｄ−３６，５Ｖ４Ｑ形質転換ハムスタ（Ｌ　Ｖ　Ｇ　） 　リフ　ハ腫細胞は、ＦＢＳ（１０％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および重炭 酸ナトリウム（０，０４５％）を含むＲＰＭＩ　１６４０中に保持した。

ハイブリッド細胞を得るための融合に使用するためのＣ５７ＢＬ／６ｎマウスの 免疫実験計画同系の雄性受容体において、胎児性抗原に対する体液性の反応を刺 激するために、最も生産的な免疫プロトコールを引き出す試みを行なった。即ち 種々の濃度の無傷の、同系の、１２日妊娠胎児細胞の３ＭＫＣ４抽出物を、注射 による種々の投与方法および／またはタイムコースで投与した７群に分けた動物 群を用いて行Ｃ’ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　１９　：　１０５　（１ ９７４）に記載がある。酵素の分散は決して使用しなかった。表１に示すように 、同系の、致死量の放射能（５０００Ｒ）照射を受けた妊娠中期（１０−１２日 ）のマウス胎児細胞を高濃度（１０７）または低濃度（１０６）　にて、マウス 群に投与した。

表１ 胎児性抗原決定基（ＥＡｓ）　に対する免疫性膵臓細胞（Ｃ５７Ｂβ／６ｎ）を 刺激するだめの免疫群１１、（ＳＨ）−短期間の、高投与量群。生存能力のある １３ｄ　Ｃ５７／ＢＬ／６ｎ胎児細胞（１０７）を、１週間、間隔を開けて腹腔 内に２回注射した。２回目の投与後の３週間後であり、融合に用いる膵臓細肥を 得る３日前に、同投与量のブースター注射を１回行なった。

２、（ＳＬ）＝短期間の、低投与量群。生存能力のある１３ｄ　Ｃ５７／ＢＬ／ ６ｎ胎児細胞を、１０６用いる以外は１に記載の方法と同じである。

３、（ＣＦＡ　Ｍｓ）＝マイコバクテリウム・スメグマテイテイス（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｔｉｓ　）を用いた７０インドの完全アジ ュバントを用いる群。フロイントの完全アジュバントおよび圧縮した胎児細胞の 混合物（１：１、ｖ　／　ｖ　）を、各々の後足に１回注射（０，０３ｍｆり　 Ｌ、、背中の中心に１回皮下注射（０，０４ｍＱ）　した。１週間後に、フロイ ントの不完全アジュバントを用いて接種を再び行なった。３週間後に、細胞だけ からなる最後のブースター注射を行なった。

４、（ＣＦＡ　ＭＥ　）　＝　Ｍ、ツヘ）１．ｔりｏ　’ｉ　ス（Ｍ、　ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を用いた７０インドの完全アジュバントを用いる群。

３に記載した方法と同じであるが、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　）のみが異なる。

５、（ＬＨ）＝長期間の、高投与量群。ＳＨ群と同じ方法であるが、最後のブー スター注射の前に１週間ごとに、５回投与した。

５、（ＬＬ）＝長期間の、低投与量群。ＳＬ群と同じ方法であるが、最後のブー スター注射の前に１週間ごとに、５回投与した。

７、（３Ｍ　ＫＧ／）＝胎児細胞を溶解した３Ｍ　ＫＯ２を用いる群。１３ｄ　 Ｃ５７ＢＬ／６ｎ　胎児細胞（７）　３　Ｍ　ＫＣ／Ｊ抽出物を２回、腹腔内投 与し、各々、たん白質７００μｙまたん白質４５０μｇを共に投与した。最後の ブースター注射（たん白質、１００μｇ）は静脈内投与した。

を１群とした。

ｆｂ）　免疫に用いた胎児細胞は、すべて、新しく調製した１３ｄ同系細胞であ り、注射前に、Ｘ線（５０００Ｒ）を照射した。

最後のブースター注射を含む計３回の注射を短期コースで行なう方法か、または 、計６回の注射を長期コースで行なう方法で、細胞を投与した。他の２つの群は 、マイコバクテリウム・スメグマテイス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｓｍ ｅｇｍａｔｉｓ　）またはＭ、７ベルクロシス（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）を用いた７０インドのアジュバント中の胎児細胞を注射し、その後、胎児細胞 および不完全フロインドアジュバントとを用いたブースター注射を行ない、最後 のブースター注射は胎児細胞のみを用いて行なった。アジュバントは、同容量の 圧縮した細胞と混合し、その抗原調製物（０，０３ｄ　）を、各々のマウスの両 方の後足に注射し、次いで各々のマウスの背中に抗原調製物（０，０４＋ｍＱ） を皮下注射した。マウスの１群は、３ＭＫＣ／に溶解した胎児細胞膜（１匹のマ ウス当り、たん白質０．５〜）を２回腹腔内注射し、次に、最後のブースター注 射０．１〜を静注して免疫した。最後のブースター注射は、すべての場合におい て、最後の抗原注射の後、２−３週間後に行なった。感作した膵臓細胞は、最後 のブースター注射の３日後に得た。

ハイブリドーマの培養 マウスのミエローマ（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と、致死量の放射能照射を受 けた妊娠中期の同系の胎児細胞を用いて免疫した成熟雄性Ｃ５７ＢＬ／６ｎ　マ ウスがら得た牌穐細胞吉を融合して、ハイプリドーマ細；泡を製造した。融合は 、マウスのミニローフ細胞と牌１臓細胞を１：１０の比率で、ポリエチレングリ コール４０００（５０％、ｖ／ｖ）　の存在下で用いて、コーラ−（Ｋｏｈｌｅ ｒ　）およびミルスティン（ｋｉｉｌｓｔｅｉｎ　）の方法（ネーチャー２５６ ：４９５（１９７５））に記載の方法の変法により行なった。ハイポキサンチン 、アミノプテリン、チミジン、ＦＢＳ（１５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、 重炭酸ナトリウム（０，０４５％）　およびゲンタマイシン（５０ｐｊｑ／ｒｎ Ｑ　）を含むＲＰＭＴ　１６４０溶媒（ＨＡＴ　溶媒）中にてハイブリッド細胞 を選別した。１つのウェル当たり細胞を３５Ｘ１０”個、９６個のウェルを持つ 平底リンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ　）プレート内に接種した。ハイブリッド細胞は、 ２４ウエルのリンプロプレートに移した後、ハイポキサンチン、チミジン、ＦＢ Ｓ（１５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（０，０４５％） 、およびゲンタマイシンで補ったＲＰＭＩ　１６４０溶ｐ（ＨＴ溶媒）中に保持 した。この移した溶媒は、また、マクロファージ細胞系（ＲＡＷ　２６４．７） からの濾過滅菌した７２時間培養上清１０容量％を追加した（ＨＴ４−Ｒ５溶媒 ）。

ハイブリッド培養物か十分Ｓこ適合し、イン・ビトロにて継代する準備ができた 時点で、培養上清中に存在する胎児性抗原決定基に対する抗体を測定した。

Ｍｃを生産するハイブリドーマを得るための、ハイブリドーマ培養集団のクロー ニング ハイブリドーマコロニー集団のクローニングを、ＲＡ〜Ｖ２６４．．７培養上清 （１０％）を補ったＨＴ溶媒中にて、末端希釈法を用いて行なった。培養集団か ら得たハイプリドーマ細胞（ｔｏｏ個および２００個）を、上記のクローニング 溶媒（１０ｍＱ）中に懸局し、ＨＡＴ−）Ｒ５溶媒（１００μ６）／ウェルを入 れた９６個のウェルプレートに分配した。次に、クローンを２４個のウェルプレ ートに移し、後に、成熟したコロニーを抗−ＥＡ活性について分析した。各々の ハイブリドーマに対して、１度またはそれ以上、再クローニングを行なった。

ＭＣイムノグロブリンのクラス モノクロナール抗体のイムノグロブリンのクラスを決定するために、二様の免疫 拡散分析を行なった。ポリエチレングリコール−４０００（２，５％）を含有す るアガロース（１，５％、５ｍｆｆ１）を沸騰したＨ２Ｏ中で融解し、次に、１ ５分間、５６℃に保った。次に、そのアガロース溶液を免疫拡散プレート（ミレ ス・ラボラトリ−（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ１）ｏｒａｔｏｒｙ　）、Ｉｎｃ、　）中 に注ぎ込み、３０分間、２５℃にて固化させた。アガロースを切り取り、５Ｈの ウェルを作成し、中心のウェルを６つのウェルが対称的に取り囲む様に配置した 。モノクロナールハイブリドーマ上清（２５Ｘｆｉ縮、１０μｅ）を中心のウェ ル中に分配し、それを取り囲むウェル中には、抗−１ｇｃｌ、抗−Ｉ　ｇ　Ｇｚ 、抗−１ｇ　Ｇ２　ａ、抗−１ｇ　Ｇ２ｂ、抗−Ｉ　ｇＧ３、および抗−ＩｇＭ （ミレス・ラボラトリ−１Ｉｎｃ、）を含む６種類の抗−マウスのイムノグロブ リン上清（１０μｅ）を分配した。プレートを２５℃にて、４８時間インキュベ ーションし、毎日、沈降線を観察した。正常なマウスの血清、およびＰ　３　ｘ 　６３　Ａｇ８．６５３培養上清を、それぞれ陽性の対照、および陰性の対照と して用いた。

免疫濾過ＥＬＩＳＡ用の装置 ■アンドＰサイエンティフィック（Ｖ　ａｒｘｉ　Ｐ　５ｃｉｅｎｔｉ　−ｆｉ ｃ）、Ｉｎｃ、、サン・ジエゴ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　）、カルフォルニア（Ｃ ａｌ　１ｆｏｒｎｉａ　）　）から得た再使用が可能なマイクロッＭ ７　／ｌ／　）　（Ｒｅｕｓａｂｌｅ　Ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ　）装置を、ＥＬＩ ＳＡの・操作を行なうために使用した。ＶＬ−Ｐサイエンティフィック（５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　）から得たガラス線維濾紙を、標的細胞を獲得し、固定するた めに用いた。細胞を適用する前に、熱湯（９０℃）を用いて、ウェルの下から融 解して取ったゼラチン（２％）を用いて、その濾過紙を予め処理した。

免疫濾過ＥＬＩＳＡ用の標的細胞 ＥＬＩＳＡの操作に使用する標的細胞は、新しく得た、初産の、１２−１３日の 妊娠期（７）Ｃ５７ＢＬ１５ｎ胎児細胞であった。子宮から、完全な、生きてい る胎児を、無菌条件で取り除き、新しいＩ（ＢＳＳ中に、３７℃にて、２０ゲー ジ針にて注入する前に、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、　ｐＨ７，０，５ ｘ）中で、徹底的にゆすいだ。

穏やかに、２．３回、ピペッティングした後、細胞を無菌綿ガーゼ（４Ｘ４）パ ッド（Ｐａｄ）を通してＥ過し、破片を除去した。低速度遠心分離により、ＨＢ ＳＳ中で細胞を洗浄し、次にカウントし、細胞（５Ｘ　１０６）をリン酸平衡生 理食塩水（ＰＢＳ、１０　ｍＭ、　ｐＨ７，４）中のフェニルヒドラジン溶液（ ０，０５％、１０ｍＱ）中に再ヒ！濁し、２５℃にて３０分間インキュベーショ ンし、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻害した。このように処理した細胞を、 直接、ＥＬＩＳＡに使用した。

ＥＬＩＳＡ濾過で用いた培養腫瘍細胞系をフラスコからけずりとり、ピペッティ ングにより分散することにより懸濁させた。次に、フェニルヒドラジン溶液中に 再ひ懸濁する前に、ＨＢＳＳを用いて２回、細胞を洗浄関連性免疫吸着分析 免疫濾過ＥＬＩＳＡ方法で用いたのは、間接的な免疫ペルオキシダーゼ反応であ った。フェニルヒドラジンで処理した胎児細胞を、１ウエル当たり５×１０４個 の細胞の割合で、９６ウ工ル再使用可能マイクロフアルトＴＭ内に入れた。装置 の中心と、その上のセクションとの間にサンドインチしたガラス線維のフィルタ ーに、真空により、細胞を固定した。フィルター紙は、ゼラチン（３％）を用い て前処理し、ウェル間の反応の交差混合を防いだ。使用前に、ゼラチンで処理し たフィルターを熱湯に通して、個々の濾過チャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ　）から 、ゼラチンをきれいに除いた。正常な山羊の血清（ＮＧＳ、５０μｌ）と共に、 ２５℃にて２０分間、細胞をインキュベーションし、ＮＧＳを真空にして、再使 用可能マイクロファルトＴＭ装置中の細胞から取去した。次に、ハイブリッド細 胞コロニーの上清（１００μｇ）を各々のウェルに加え、室温にて６０分間イン キュベーションした。次に、ペルオキシダーゼと抱合した山羊の抗−マウスＩｇ ＧおよびＩｇＭ血清（アフィニティーで精製し、ヒト血清に吸着したもの、ＫＰ Ｌインコーボレーテツド（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　）、ガイセルスブルグ（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）　、？リーランド（Ｍａｒｙｌ　ａｎｄ　）　） 　（１００μｌ）を加える前に、細１泡をバキュームし、装置中の同じ場所で、 ｃｓ（５嘔）を含むＰＢＳ（２５０μりを用いて６回洗浄した。ペルオキシダー ゼと抱合した抗血清は、ｃｓ（５％）を含むＰＢＳ中に１　＋　３００の比率で 希釈して用いた。２５℃にて３０分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ ＋−Ｃ３（３Ｘ）を用いて洗浄し、トリス平衡塩類緩衝液（ｌＱｍＭ　、　ｐＨ ７，４、ＴＢ　Ｓ。

３ｘ）　を用いて洗浄した。１００μｌ　のバンカー／ヤーテス（８”ｌｉ’／ １０ｄ、ＴＢＳ）およびＨ２Ｏ２ｃ　０．０３　％）をそのサンプルに加え、反 応を３０分間観察した。陽性の反応では、濃い黒茶色の沈殿が生成した。Ｈ２Ｓ ０４（４Ｎ、２５μｅ）を用いて反応を止め、濾過装置内にて、真空乾燥した。

並んだ陰性のウェルと陽性のウェルとをお互に、容易に区別することができるだ ろう。

また、そのＦ紙は永久の記録として保つことができ、新しくゼラチンで処理した フィルターを装置に備え付けて、直ちに再使用した。

固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡによるＭｃ抗−ＥＡ抗体の滴定を、以下の様に行なった。ＢＳＡ（１ ％）を含む緩衝グルタルアルデヒド（０，２％）中に固定した、新しく得た誇浄 （５ｘ）した、完全なＣ５７Ｂｎ／６ｎ胎児性細胞（１００μ６）を、平底の塩 化ポリビニルの微量滴定プレートの各々のウェルに加え、２５℃にて、２−３時 間インキュベーションした。細胞の懸濁溶液をさっと出し、１つのウェル当たり 、ＮＧＳ（５０％、１００μｇ）を加え、使用するまで４℃にてそのプレートを 保存した。ＥＬＩＳＡの操作を開始するために、ＮＧＳ（５０％）の混合物を除 去し、ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）中にて希釈（続けて２倍希釈）シたモノクロナー ルハイブリドーマ上清（１００μｎ）を各々のウェルに加え、そのプレートを室 温で一夜インキユベーションした。この時点から、ペルオキシダーゼ混合物（１ ：５００に希釈）を用いて２時間、インキュベーションして、標準間接ＥＬＩＳ Ａとしての操作を行なった。クロモゲンを加えた３０分後に、ＡＢＴＳおよびＨ ２０２を加えて、ペルオキシダーゼ反応を活性化シ、プレートを、マルチスキャ ンＥＬＩＳＡ分光計を用いて、４１４μｍの光波長において計測した。胎児細胞 は、コギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）　がキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ）　３９　：　２７５２　（１９７９）に記載した様にして調製す る。あるいはまた、コギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）がメリーズ・イン・キャンサー・ リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　ＸＶＩＩ ［、３７１−３８９（１９７９）に記載した方法を用いてもよい。

ＥＡｓに対する抗体に特異的なハイブリッドコロニーを得るためのスクリーニン グ 胎児細胞標的に対して陽性であるハイブリドーマコロニー上清を、新生児マウス の、または成熟マウスの組織（Ｃ５７ＢＬ１５ｎ）から調製した細胞懸濁液とハ イブリドーマ培養上清との吸着により、特異性に関してスクリーニングを行なっ た。成熟マウスの脳、筋肉、心臓、肝臓、および腎臓を集めて、ＨＢ　Ｓ　Ｓ　 （ｐＨ７，４）中へ入れた。これらの組織から得た細胞を細かい金網（４０メツ シユ）のスクリーンに圧縮して通し、分散し、ＨＢＳＳ中で、２回洗浄した。初 産の供給体から得た１３日妊娠期間の胎児細胞を、ＥＡ陽性の対照とじて用いた 。特定のＭＣ上清（２００μｅ）と共に、胎児細胞（ＩＸＩＯ〜３Ｘ１０８）を 用いて、胎児細胞用の標準吸着曲線を阜備した。各々の細）抱吸着サンプルのＣ Ｄ値を、同じＭｃ上清川用非吸着滴定曲線から得た対応するＣＤ値と比較した。

希釈回数の差を計算し、除去された活性比を、希釈当たり５０％除去して決定し た（すなわち、１回の希釈は５０％、２回の希釈は７５％、３回の希釈は８７． ５％など）。次に、除去された活性の比率対細胞数を用いて、標準吸着のグラフ を作成した。

胎児細胞に対するＭｃ抗体の特異性、および腫瘍細胞に対する交差反応性０ＦＡ ｓの検出に対するＭｃ抗体の特異性もまた、固相（ＳＰ）ＥＬＩＳＡを用いて、 調べた。標的細胞として、非酵素的に分散したげつ歯頚腫瘍細胞系を用いた。除 去された活性のパーセントを、それに対応する同じ数の胎児細胞で除去された活 性のパーセントと比較することによって、吸着した値に等しい胎児細胞値を決定 した。これらの細胞のタイプには、ハムスターの５Ｖ４Ｑ−形質転換ＷＦ５−１ およびＣＤ−３５系、およびマウスの５Ｖ４Ｑ−形質転換ｍＫｓＡ系が含まれて いた。

結果 以前の研究（コギンら（Ｃｏｇｇｉｎ　”ｙ：、Ｊ、　ｅｔ　ａＱ、チハ財団シ ンポジウム（版）での、「悪性腫瘍および妊娠における胚抗原」：「免疫調節に おける共通の特徴」、口７ドン：ピ７　ドア　７　（Ｐｉｔｍａｎ）ブツクス、 ２８−５４ページ）において、イン・ビボで吸着された１０日妊娠期間ハムスタ ー胎児細胞に対して誘導され、イン・ビボで吸着させたポリクローナル外因性抗 血清が、稔−１３ｄマウスのまたは１０ｄハムスターの胎児細胞の、ノニデット Ｐ−４０（０，５％）抽出物およびＫＣｄ（３Ｍ）　抽出物から得た胎児に特異 的なポリペプチドを免疫沈殿することが観察された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にお いて、いく本かの、明確な、胎児に特異的なポリペプチド帯が存在した。ハムス ターの、または、マウスの胎児細胞表面上にある、これらのＥＡ抗原決定基のい ずれに対するＭｃ抗体の誘導も、感作するには、同系の胎児細胞を用いて免疫し なければならないので、困難であろうと考えられていた。妊娠した、同系の雌性 マウスおよびハムスターは、ハイブリドーマ融合用のＥＡで感作したＢ細胞膵臓 細胞の良好な供給源として用いてもよいが、以前の研究では、これらの膵臓組織 中の抗−ＥＡ免疫反応に対抗する抑制の活性を検出し、その抑制の活性が、ハイ ブリドーマの発達を制限する可能性があるかもしれないと考えられていた。

同系で妊娠させた、Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウスを、融合用およびハイブリド ーマ製造用のＥ　ｋで感作した膵臓細胞の供給源として繰り返し使用されたが、 安定したハイブリドーマは得られなかった。さらに、ハムスター：マウスＰ３Ｘ ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と、同系の胎児組織に対して感作したハムス ターの膵臓細胞とのハイブリッドを誘導する目的で、無傷の放射能を照射した同 系の胎児細胞を、または、これらの細胞の可溶性抽出物を、ＬＳＨハムスターに 注射する試みも失敗した。

さらに、標的細胞として１２ｄｍｆｃｓを用いるＥＩ分析により、抗−ＥＡ十反 応性ハイブリドーマが少しは得られるけれども、Ｂａ１ｂ／ｃ　マウスもまた、 非常に応答が劣しいことが証明された。不幸なことには、これらのハイブリドー マはイン・ビトロで継代スることができなかった。

しかし、Ｃ５７Ｂ／Ｊ１５ｎマウスにおいては成功した。

放射能を照射した、１２ｄｍｆｃｓを用いて免疫したＣ５７Ｂβ／６ｎマウスは 、所望の抗−ＥＡイムノグロブリンを生産するハイブリドーマを産生ずるための 膵臓細胞の優秀な供給源であることが証明された。表２中に示す七 ように、ＥＩ分析において、ＥＡ　１２ｄｍｆｃｓに対抗する抗体を生産する多 量のハイブリッドのコロニーが、１２ｄｍｆｃｓに対して感作したＣ５７Ｒ１／ ６ｎ−ｙ　ウスから得た膵臓細胞の融合から誘導された。

種々の免疫計画について、得られるハイブリドーマの数で反映される効力に、大 きな差異かあることが示された。ｌ　２　ｄｍ［ｃの無傷の胎児細胞およびその ＫＣ／　（３Ｍ　）抽出物の両方を用いて、高容量、短期間の様式で免疫を行な うと、ＥＩスクリーニング分析におし１て、同系の１２ｄｍｆｃに対抗して陽性 のＥＬＩＳＡ応答を与える抗−ＥＡハイブリドーマの数が最も多かった。被験ハ イブリドーマ上清を加える前に、内因性の細胞ペルオキシダーゼを、山羊の血清 を用いて、適切に抑制することにより（詳しくは、方法のセクションを参照せよ ）、グラシイら（Ｇｌａｓｓｙ　）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　。

５８：１１９（１９８３）に記載の、ＥＬＩＳＡ免疫諷過（’ＥＩ）分析により 、１２日妊娠期間のマウスの胎児細胞で発現されるＥＡ抗原決定基に対する抗体 を検出し、迅速にスクリーニングすることができた。成熟マウス組織および、１ ９日のＥＡ７（ウニ゛ンプナー（Ｗｅｐｐｎｅｒ　）、Ｗ。

Ａ、およびコギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈｌ、ギャンサー・リサー−１−（ Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４０：１３８０（１９８０）妊娠期マウス細胞は、 いかなるハイブリドーマ上清とも反応しなかった。バックグラウンド・レベルを 高くしないために、正確なりロモゲン濃度を選択する注意が必要であった。胎児 細胞を用いたアジュバント免疫法も、長期間の、多数回の接種を行う方法も、適 切な抗−ＥＡハイブリドーマを生産することができなかった。

２次培養後、最初のハイブリドーマのコロニーの生き残りが、抗−ＥＡ抗体を示 すことも、また、表２中に示しである。生き残った総計２０１のコロニー（７０ ％）を、２４ウエルプラスチツクプレートへ２次培養し、ＲＡＷ２６４．７細胞 上清を補充したＨ　Ｔ溶媒中で増殖したけれども、ハイブリッド細胞が安定する につれて大多数のコロニーが、後に死滅した。次に、ＲＡＷ上清（１０％）を補 充しないで試験を行なうと、標準のリンパ球供給細胞が、ハイブリドーマの安定 化に有効でないことがわかった。初産の、同系ＥＡ＋１２−１３日マウス妊娠細 胞（１２ｄｍｆｃｓ　）との特異的結合について、ハイブリドーマのコロニーを 継代した組織培養を、Ｅ１分析によって、最初にスクリーニングした結果を表２ に示す。表２、コラム４で報告した抗−ＥＡ抗体を生産する陽性のハイブリドー マのコロニーは、すべて３回継代したクローン化していないハイブリドーマの２ 次培養を用いた最低３つの別個のＥＬＩＳＡ試験において、ＥＡ胎児細胞と反応 した。ｌ　２　ｄｍｆ標的細胞に関してＥＩ分析で試験する前に、新生児マウス の、または成熟マウスの細胞（１０８／Ｍりを抗体中に懸濁して吸着標的として 用いた場合（表２中、コラム５および６）、そのハイブリドーマは、−貫して、 これらの非胎児組織との反応性を示さず、抗体価は後の吸着の影響を受けなかっ た。しかし、ＥＩ分析にて検出された様に、１０６〜１０８の１２　ｄｍｆｃｓ を用いれば容易に抗体は完全に吸着された。

これらのもののハイブリドーマからクローン化されたハイブリドーマから誘導し たＭｃ抗体の特異性を次のセクションで証明する。短期間の、高投与量および３ 　Ｍ　ＫＣｊ免疫手順が他のすべての試験に比べてよりすぐれていると結論され た。ＲＡＷを補充した溶媒中の組織培養中で継代培養を行ない、ＥＡ胎児細胞標 的を用いるＥＩ分析において陽性の結果を示した最初の、クローン化していない ハイブリドーマ培養（３５個）を、さらに進んだ研究に用いるため、無作為に選 択した。これらを２次培養し、次に、ＥＡ−またはＥＡの１２ｄｍｆｃの新生児 マウス組織のアセトン粉末を用いて、ハイブリドーマ上清を吸着して、ＥＡ特異 性を分析した（表２）。新生児のＣ５７ＢｉＩ３　ｎマウス組織を用いて、繰り 返し吸着を行なった後、ＥＡ＋の１２　ｄｍｆｃ標的細胞を用いるとＥＬＩＳＡ 反応が、培養液上清３５個の内３２個においてまだ陽性で検出されたので、クロ ーン化されていない培養上清中に存在する抗−ＥＡ抗体か圧制的な特異性を有す ることが示された。ＥＡの１２ｄｍｆｃｓを用いて、希釈していない／’％イブ リドーマ上清を１回吸着させた後、抗−ＥＡ反応性イムノグロブリンの除去が、 イン・ビトロで継代培養したクローン化されていないハイブリドーマ３２個中の ３２個におい１２ｍｆｃｓ　を用いる短期の、高投与量の免疫手順で誘導した大 量のコロニーから、細胞をクローニングして、３つのモノクロナール抗体生産性 ハイブリドーマ系を最初に得た。これらの細胞のクローン化を行なう間、ＲＡＷ 上清を補充した。あるクローン化された／％イブリドーマを３ＭＫＣｌ群から得 、また、短期間の低投与量群からも得た。メチルセルロース中にてコロニーを形 成し、液体溶媒中で末端希釈を行なうことにより、各々をクローニングした。こ の研究課程では、付加末端希釈法および単一細胞分離法を用いて、クローニング を行なった。Ｍｃの内、４つはＩｇＭイソタイプであり、ひとつはＩｇＧイソタ イプてあった。この５つのＭ　（生産体は、すべて、多数の次に続いて行なう試 験における５ＰＥｌｉｓａ中にて、１２６ｍ［ｃの細胞に対しては特異的な反応 性を有するが、成熟細胞に対しては反応性がない抗体を産生じた。ＩｇＭを生産 する４つのＭＣの内でイソタイプが入れ替る（　ＩｇＭ、　ＩｇＧ　）ことは、 たとえ逆の培養ショック条件下であっても、観察されなかった。ゲル拡散法や、 ５ＰＥＬＩＳＡにおいては、たとえ２５倍に濃縮した場合でも、その抗体は胎児 子ウシ血清と、または通例の子ウシ血清と交差反応しなかった。

定量的な、ＰｖＣプレートで行なう５ＰＥＬＩＳＡ操作を用いると、５つのハイ ブリドーマから得た上清中のイムノグロブリンは、モノクローンの４つに対する 抗体価は＞１０２４であり、標的抗原として同系の１２ｄｍｆｃｓを用いた１　 ５５　（ｓｈ）ノＭｃに対する抗体価は〉２０４８であった（　Ｆｉｇｕｒｅ　 ｌ　）。前記の方法（レフエル（Ｌｅｆｆｅｌ　）、Ｍ、Ｓ、およびコギ７　（ Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ　、Ｈ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｏ、３７：４１１２（１９７ ２）およびシージエンスら（（５ｉｊｅｎｓ　＋Ｒ，Ｊ、ｅｔ　ａｌ、）ハイブ リドーマ、２　：２３１−２３４（１９８３））で調製グルタルアルデヒド固定 化胎児細胞に対して試験を行ない、ＳＰ　ＥＬＩＳＡ　において、標的抗原とし て使用したいくつかのＭｃを用いて、極めて類似した結果を得た。

抗−Ｅ　Ａ　：Ｍ　ｃ抗体の特異性 Ｃ５７Ｂｌ／６ｎマウス（７）　１３　ｄｍｆｓ、または完了期（１９ｄ）のマ ウス胎児細胞、または成熟細胞、のいずれかを用いて吸着を行なう方法で、前に 列挙した５つのＭｃにより生産された５つの抗体の特異性を試験した。Ｍｃ６９ ．１、すなわちＩｇＭ生産物に関して第４図に示すように、ＳＰ　ＥＬＩＳＡ分 析において、吸収された上滑を続けて、ＥＡ＋ｌ　２ｄｍｆｃ　に対して試験し た場合、１０７個の１３　ｄｍｆｃｓ　を用いて、１回吸着を行なうと、ＩｇＭ を、バックグラウンド・レベルにまで除去するが、同数の成熟Ｍｃを用いて行な っても除去しなかった。第２の試験においては、１２日妊娠期胎児細胞は、ただ １０６個の細胞を用いるだけで、Ｍｃ６９．１の活性をすべて除去したが、一方 、１０８個の成熟マウス細胞は有意に抗体を除去しなかった（データーには示さ れていない）。

上清のストック（抗体価＞１０２４　）を希釈して、ＩｇＭの、またはＩｇＧの ６００−８０００Ｄ単位（ＳＰ　ＥＬＩＳＡ）を得て、１度、胎児マウス細胞ま たは成熟マウス細胞を用いて（５Ｘ１０６または１０７）吸着を行なった場合に 、第２図中で示した結果と実質上同一の結果を他の４つのＭｃに対して得た。

ＥＡ＋細胞または組織を用いて得たＭｃＩｇに対する吸着の結果は、以前に、腫 瘍移植分析（コギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，およびアンダー７７　（Ａｎ ｄｅｒｓｏｎ　）、Ｎ、Ｇ、、Ａｄｖ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、１９：１０５（１９７４）およびコギン（Ｃｏｇｇｉ ｎ　）、Ｊ、Ｈｌおよびアムブローゼ（Ａｍｂｒｏｓｅ　）　、　Ｋ、Ｒ，、Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｘ■巻、３７１−３８９ページ（アカデミツ ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、ニューヨーク（１９７９）） で検出した、これらの種々の組織または腫瘍が、マウスの、またはハムスターの 胎児細胞と交差反応する能力と、正確に相関していた（表３）。

ａ１表示した吸着標的細胞を用いて、モノクロナール上７０の吸着を１回行ない 、ｌ　２ｄｍｆｃ細胞標的を用いた固相ＥＬＩＳＡにより特異性を測定した。

ｂ、非酵素的方法で細胞を懸澗し、ＰＢＳ中のＢＳＡ（１％）を用いて処理する ことにより、吸着標的細胞を調製した。（ＥＡ＋）−Ｔ−ＩＪンパ球介在腫瘍酎 性を耐性化することが知られている細胞系。（ＥＡ”−）＝腫瘍耐性を活性化す ることが証明されていない細胞。アセトンで抽出した胎児組織または成熟組織を 用いて、同一の結果を得ることができた。

ｃ、ＥＡ＋のｌ　２ｄｍｆｃｓに関する免疫諷過ＥＬＩＳＡに使用する前に、モ ノクロナール上清および圧縮した吸着標的細胞を同量ずつ混合し、３７℃にて１ 時間、インキュベーションし、４℃にて１８時間インキュベーションした。

６２士は、１回の吸着試験で４９　Ｑ　ｎｍにおいて、抗体の＞４０００Ｄ単位 の完全な吸着を示している。−は、ＥＬＩＳＡ反応で、１２６ｍｆｃ標的細胞を 用いると、抗体反応性が＞３５００Ｄユニツト残る１回の吸着試験において、４ ０００Ｄユニツトの抗体が吸着されないことを示している。ＮＴは試験を行なっ ていないことを示している。

Ｃ１試験せず。

上清を含んでいるＭｃ抗体は、異種の、ＬＶＧハムスターのｌＱｄ、ＥＡ　胎児 標的細胞と強く反応するが、これらげつ歯頚の成熟組織とは反応しなかった（表 ３）。

使用した最も初期の上清は、定量的ＳＰ　ＥＬＩＳＡ分析において、１：５１２ または、それ以上のＭｃ抗体価を有していた。新しい成熟げっ書類組織およびア セトンで抽出した成熟組織（組織とは、脳、肺、心臓、肺臓、または腎臓細胞で ある）は両方ともについて試験を行ない、種々のＭｃ上清から抗体を除去するこ とができなかった。５つの培養系の各々から得たＭＣ抗体もまた、Ｅ１分析によ り、ＥＡ＋ＳＶ４□−誘導または形質転換ＷＦ５−１細胞、ＣＤ−３５およびｍ ＫＳＡ細胞と反応した（表３）が、長期、イン・ビトロで培養したし一細胞（マ ウス）および接触阻害したＢＨＫ　（ハムスター）細胞とは反応しなかった。

抗体の各々が、第２の３力月間のヒト胎児を、新たにホモジネートしたものによ り吸着されるのは最も興味深い（表３）。新しい、培養していない包皮細胞また はヒト末梢血リンパ球の新しい、またはアセトン粉末はＭｃ抗体を吸着すること ができなかった（表３）。

ｌ　２ｄｍｆｃｓを用いて、短期間、高投与量の免疫手順で感作したマウスから 得たクローン化していないハイブリドーマの上清の最初にスクリーニングにおい て、新しく得た胎児細胞を、イン・ビトロにて増殖溶媒中で２４時間培養した２ つの胎児細胞と比較した場合、特定の上清の活性のパターンに著しい変化が検出 されるのに気づいた。具体的に述べると、１２ｄｍｆｓに対するクローン化して いないハイブリドーマからのＩｇＭを含んでいる反応上清の多くにおいて、ＥＬ ＩＳＡ反応活性の程度が有意に変化する（２．３　の数字の反応性のコロニーが Ｏまたは　１の数字の反応性のコロニーに変化する）ことが検出された。第４図 に示すように、１３　ｄｍｆｃｓを、−７０°Ｃにて１力月間凍結したものを急 速に解凍したものを用いる己、ＥＩ　ＥＬＩＳＡ分析において、クローン化して いないハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡ反応性は、新しく得て、洗浄した１３日 ｍｆ（６を用いて観察した場合と同じパターンおよび程度を保同系の胚細胞を用 いて３回以上注射したマウスがら、安定したハイブリドーマを得るのが難しいこ とはいくつかの理由で説明できよう。ＥＡを含む、可溶性胎児細胞抽出物は、粗 製ＥＡ＋細胞抽出物を多数回注射するか、または高濃度を注射するハムスターお よびマウスにおいて、抑制の活性を誘導した（コギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、 Ｈ，、千葉基金シンポジウム、前記、ウエツプナーら（Ｗｅｐｐｎｅｒ　）、Ｗ 、Ａ１、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、５４　：４４５（１９８０）、ウエップ ナ−（Ｗｅｐｐｎｅｒ　）、Ｗ、Ａ、およびコギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５０．４０：１３８０（１９８０）、およびコギ７−＋　 （Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，らＪ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、７ ２：８５３−８６２（１９８４））。肉腫細胞上のＥＡ抗原決定基に対する、腫 瘍に特異的な移植耐性に関係しているリンパ球および／またはマクロファージに 対して、この抑制活性が検出された。雌性げっ歯頚においては、放射能を照射し た同系の胎児細胞を用いて、直接免疫した場合、ＳＶ４　Ｑ肉腫細胞と交差反応 するＥＡｓに対する細胞増殖抑制性ＩｇＧが発達することが発見されたが、腫瘍 耐性は発達せず、たぶん、これらの条件下では、雌性げつ歯頚は細胞毒性エフェ クターＴ細胞も発達しなかった（アムブローゼら（Ａｍｂｒｏｓｅ楓に、　Ｒ。

ｅｔａｌ、）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、、１０５：５２４（１９７０）、コギ ンＪ、Ｈ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、３９：２９’５２（１９７９）、アリエら （Ｉｒ１ｅ＋、Ｒ，Ｆ、ｃｃ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ ５ｔ１．６３：３６７（１９７９））。放射線照射したｌ　２ｄｍｆｃｓを用い て免疫したＢａ１ｂ／ｃ雄匝マウスの場合の様に、妊娠Ｂａ１ｂ／ｃマウスは、 抗−ＥＡを産生ずるハイブリドーマを産生てきなかった。ハムスターの場合も、 また、放射線照射した胎児細胞を用いて免疫した場合、ハイブリドーマを産生で きなかった。ハムスターおよびマウスの胎児細胞表面上に存在するＥＡｓは、通 常、特徴付けるのが難しかった。これらの抗原決定基は、一定の胚または胎児の 発達段階に対して、相（期）−特異的であった。胎児細胞はイン・ビトロ培養に 対しては抗原を発現するのを停止した、（アリエら（Ｉｒ１ｅ＋λ。

Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、　Ｎａｔｌ、Ｃ：ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、６３　 ：　３６７（１９７９）：へルストロームら（Ｈｅｌ　ｌ　ｓ　【ｒｏｍ　＋、 １．ｅｔ　ａｌ　、）、Ｉｎｔｅｒ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、７　：　１　：　１０（１９７１）およびレツフエル（Ｌ ｅｆ４ｅｌｌ　）、Ｍ、Ｓ、およびコギン（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、３７：４１１２（１９７７）が、まれに例外はあった（ラ イング命（Ｔｉｎｇ　）、Ｃ，Ｃ０ら、ＩｎＶｉｔｒ□、１４：２０７　（１９ ７８））ｏ　ツイングー＊　（Ｔｉｎｇ　）　（前述）が５Ｖ４Ｑ形質転換標的 細胞を用いて示唆した様に、Ｂａ１ｂ／ｃマウスは同系の胎児感作に対して応答 性が乏しいことが証明された。

本明細書中に記載した様に、Ｃ５７Ｂｌ／６ｎマウスは、Ｘ線（５０００λ）で 不活性化した同系の胎児細胞を用いて免疫した場合、ＥＡに対する抗体を産生ず る安定したハイブリドーマを多く誘導するのに成功した。最も効果的な免疫方法 は、短期間の免疫計画にて、同系の宿主を胎児細胞に対して感作することであっ た。

無作為に抽出した最初の７つのハイブリドーマから、クローニングにより、５つ の安定なＭｃを産生じた。

無傷の胎児細胞に対して誘導したＭｃ抗体はすべて、ＩｇＭ生産生産高った。短 期間の、および長期間の両方の方法において、雄性マウスを、無傷の、放射線照 射した胎児細胞に対して感作して誘導したハイブリドーマは、すべて、ＩｇＭ産 生体のみを産することが、続いて観察された。ＩｇＧを産生ずるハイブリドーマ は、無傷のＥＡ＋胎児細胞ではなく、可溶化した（３ＭＫＣ／）胎児細胞抽出物 を受容しているマウスのみから誘導することができた。このことが、全胎児細胞 に対して産生されるすべてのハイブリドーマにとって完全な発見となるかどうか は不明であるが、数ダースの異なるハイブリドーマのコロニーを調べた今のとこ ろの結果では、ＩｇＭを生産するＭｃのみが産生じた。

最初の試験においては、無傷の胎児細胞に対して作成したハイブリドーマは、マ ウス肺臓細胞の培養層上の初期の２次培養段階において消滅することが多かった 。ＲＡＷ２６４．７細胞系などのマクロファージから得た上清を、移転溶媒に補 充することにより、すぐれたハイブリドーマの２次培養の生き残りを得て、Ｉｇ Ｍを生産するハイブリドーマを効果的にクローニングすることができた。培養マ ウス肺臓細胞は、そのままでは、他の抗原に対するハイブリドーマを得るのに有 用ではなかった。ＲＡＷ培養液を補充することは以前に報告がなく、培養細胞層 を用いるよりも、より容易に行うことができた。ＲＡＷ２６４．７細胞が、Ｉｇ Ｍ−ハイブリドーマ産生細胞に必要な成育因子（群）を提出しているのは明らか である。沖過したＲＡＷ細胞上清を使用することにより、正常のマウス肺臓細胞 をハイブリドーマ培養に加えることによる潜在的汚染物質源が除去された。

細胞表面上の本来のＥＡと反応する抗−胎児Ｍｃ抗体を産生ずるハイブリドーマ をスクリーニングするために、初産の母体から新しく得た無傷の妊娠中期の胎児 細胞を用いることができるのは、マイクロファルト装置の大きな利点であった； 標的細胞はグルタルアルデヒドを用いて固定する必要がなく、ポリＬ　ＩＪリジ ン前処理して、プレート上で遠心分離して付着しておく必要もなかった。新しく 組織から得た細胞をプロセスに用い、数分以内に再使用可能マイクロッアル）７ Ｍフィルターに適用し、ハ・イブリドーマ上清の大量のスクリーニングを、３時 間以内で完了した。他のタイプの細胞表面抗原に対するＩｇＧを産生ずるヒトの ハイブリドーマをスクリーニングする類似の方法が、最近、グラシイ（Ｇｌａｓ ｓｙ　）ら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５８　：１１９（１９ ８３））により報告された。

さらに、固定した胎児細胞または、胎児細胞膜のどちらかを分析するためのＳＰ 　ＥＬＩＳＡ　（第１図）が発達し、粗製の組織を用いて、ＥＡに対する抗体の 定量的吸着特異性分析を行なうことが可能になった。ＥＡまたはＯＦＡ発現に対 し、て評価された組織を、イン・ビトロ培養、すなわち、原発性腫瘍組織の、ま たは正常組織のスクリーニングにおける明らかな利点、を用いることなく分析す ることができるということは重要な点である。ＳＰ　ＥＬＩＳＡの手順は、鋭敏 であり、かつ、高度の再生産性も有していた。

ヒト胎児（表３）と同じく、妊娠中期のハムスターで発現される進化的に保存さ れて来た抗原決定期を、同系のマウス胎児中のＥＡに対して誘導したマウスＭ（ 抗体を用いて検出することは、腫瘍耐性を授与する場合における、これらの胎児 細胞のタイプの免疫原性に関連した以前の発現と並行している（前述）。吸着分 析によっても、また、成熟組織からの免疫沈殿法（ミュラーら（Ｍｕｌｌｅｒ　 Ｒ，）、ネーチャー、２９９：６４０　（１９８２））によっても、これらの種 の妊娠満期の胎児細胞または成人組織では、同様の交差反応性パターンは検出さ れなかった。このことは、真のＥＡ胚−胎児特異抗原に対してのＭｃ抗体の特異 性を示している。

げつ菌類の５Ｖ４Ｑ−誘導肉腫またはリンパ腫（ＥＡ＋であることが知られてい る）に対しては異なった結合反応性または吸着反応性があり、マウスＬ細胞とＢ ＨＫ−２１細胞に対しては結合反応性または吸着反応性がないという観察は、今 まで試験した５つのＭｃを用いて検出したＥＡの、腫瘍に特異的な抑制能力また は分散能力を示している。種々の研究の結果（コギンら（Ｃｏｇｇｉｎ　＋、Ｊ 、ｆ（、ｅｔ　ａｌ　、’）、、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｉｎ５ｔ 、、７２：８５３−８６２　：　ｏ−ゼンヘルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　）、Ｓ 、Ａ、　ヒト癌抗原の血清学的分析、Ｓ、Ａ、ローゼンベルグ（編者）（アカデ ミツク・プレス、ニューヨーク）：およびブラウンら（ＢｒＯＷｎ＋、Ｊ　、　 Ｐ　、ｅｔ　ａｌ　、）、Ｊ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、、１２７：５３９（１９８ １））は、特定のＥＡ（ＯＦＡ）は、特定の腫瘍の組織学上のクラスに制限され る可能性を支持しているが、ヒト腫瘍上の共通のＥＡについての報告が、サリナ ズ（５ａｌｉｎａｓ　）ら「ヒト癌抗原の血清学的分析」、Ｓ、Ａ、ｏ−ゼンヘ ルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　）　（編者）（アカデミツク・プレス、ニューヨー ク）５３９−５６４ページ、ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ　）、（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ　、、１２７：５３９）、ジ、ｔ　／Ｌ／　ンハ／Ｌ７４　（Ｊｏｒｎｖａ ｌｌ　）ら、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳ　）、７９：２８７−２９１（１９８１）および カラナテクら（Ｇｒａｎａｔｅｋ　）、（サイエンス、２２４：１１９８−１２ ０６（１９８４））　らによってなされている。

ヒト胎児は、大部分の報告によれば、外因性のポリクロナール、およびこれらの ＯＦＡに対するＭｃＩｇｓと反応し、また本発明のＭｃ抗体とも反応した。ポリ クロナールの抗−１２０マウス胎児細胞または１０日ハムスター胎児細胞によっ て免疫沈降した、いくつかのポリペプチドを含んでいるＥＡ種は、各々、選択的 （乙５Ｖ４Ｑ−誘導肉腫およびＡｄｖ、７−誘導肉腫の間に分布していた。これ らの肉腫は、５ｖ４０肉腫に対して交差した防衛免疫がないことを示している化 学的に誘導した肉腫の間では検出されない共通のＯＦＡを共有していることが知 られていた。１６０．４５−４８および２３ＫＤの種類を含んでいる３つのポリ ペプチドは、５Ｖ４ＱおよびＡｄｖ、７肉腫細胞に共通であることが発見されり （ヒルストロームら（Ｈ４ｌｌｓｔｒｏｍ　）、Ｉ、ｅｔａｌｏ、Ｉｎｔｅｒ９ ．Ｌ　Ｃａｎｃｅｒ、７：１　：１０およびウニブナ−ら（Ｗｅｐｐｎｅｒ　） 、Ｗ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ　、、Ｃｅｌ　Ｉ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、、５４−４ ４５（１９８０））。

得られた胎児中において、抗原活性と同様に免疫原性活性が消失することは、い くつかの胎児抗原決定基に対しては迅速で、完全であるらしい。イン・ビトロに てほんの数時間の培養後に、ＥＡ胎児細胞が、そのＥＡ＋腫瘍細胞に対する細胞 性免疫の活性化能力を、失うことが示され、培養前に致死帝の放射線照射を行な わない場合は、ＥＡ＋胎児細胞は完全に免疫原性がなかった（コギン（Ｃｏｇｇ ｉｎ　）、Ｊ　、Ｈ，およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　）、Ｎ、Ｇｏ、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４０　：　１５６８（１，９８０）ゝ　およびコギン （Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，およびアムブローゼ（Ａｍｂｒｏｓｅ　）、Ｋ、 Ｒ，、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（Ｗ、　Ｉ−１ ゜フイ７　シ：Ｌ　？　７　（Ｆｉｓｈｍａｎ　）およびＩ（、ブ７　’／　ユ （Ｂｕｓｃｈ　。

編者）、Ｘ４巻、３７１−３８９ページ（アカデミツク・プレス、ニューヨーク ））。ハイブリドーマ上清およびＥＩ分析を用いた本明細書中に示した結果（第 ３図）は、標的１２日妊娠マウス胎児細胞を、短期間（２４時間）培養した後に 行なった結果であるが、この以前の観察と一致した。

時間を一致させた同系のマウスを増殖する効力が悪いために、ルーチン分析用に 、特定の妊娠時期の胎児細胞の一定な供給を得ることは重要であり、困難である 。胎児細胞が、少数の、時間を一致させた妊娠供与体から、分析用として用いる ことができる場合、その胎児細胞は特定の日の実験に必要とされるよりも豊富で あることが多かった。将来使用するために、過剰の胎児細胞を凍結する能力は、 これらの得難い、高価な細胞の無駄をなくす。また、グルタルアルデヒドで固定 した胎児細胞は、固相分析における感受性を減することなしに、４℃にて、１週 間、保存することができることかわかった。

以下の実施例に報告した研究においては、抗−ＥＡモノクロナール抗体と反応す る胎児細胞中のポリペプチドが特徴付けられた。表３中に例示したＭｃ抗体の５ つすべてが、５ＤＳ−アクリルアミドゲル等電点電気泳動分析により明らかに同 じポリペプチドであることが示されたポリペプチドと反応することは注目に値用 具および方法 腫瘍細胞 （ペイ７　（Ｐａｙｎｅ　）、Ｗ、Ｊ、およびコギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ 、Ｈ，、Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　（１９８４）　）に記載 されている方法で、金網を通してふるいにかけることにより、５Ｖ４Ｑ誘導マウ ス肉腫細胞（ｍｋｓａ）またはハムスターのリンパ腫細胞（ＧＤ−３６）を同系 マウスまたはハムスターにおける小さな腫瘍移植から得た。

国際癌機関の援助を受けているアラバマ（Ａｌ　ａｂａｍａ　）（ヒルミングハ ｌａ　（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ　）、アラｔ＜　７　（Ａｌ　ａｂａｍａ　）　 ）癌銀行大学から、ヒト腫瘍を、新しく凍結した原発性腫瘍として得た。すべて の腫瘍は、病理学のパネルにより組織学的に分類し、保存溶媒中に凍結した。凍 結した腫瘍のフラグメントを、さっと融解し、酵素分離せずに金網を通して分散 して、粗製の細胞懸濁物を調製し、前記の様に洗浄し、前記の方法で吸着の実験 に使用した（ペイン（Ｐａｙｎｅ　）、Ｗ、　Ｊ　、およびコギン（Ｃｏｇｇｉ ｎ　）、Ｊ、Ｈ，、前述）。多くの場合、対照である正常組織は、腫瘍に近接し た組織、学的に正常な組織から、または、そうでなければ必須の外科手術を行な う目的で傷をつけた組織と共に除去した正常な患者の組織か既述した様に、同系 の受容者におけるＣ５６Ｂｚ／６ｎマウス胎児に対するＭｃＩｇ、６９．１．３ ８．７．８および１４を誘導した。ＭＣ６９，１，３８，７、および８はＩｇＭ であり、無傷の胎児細胞により刺激されたが、一方、Ｍｃ１４は胎児細胞のＫＣ ，抽出物を用いて誘導し、ＩｇＧのイソタイプであった。固相（ＳＰ）ＥＬＩＳ Ａの手順（前述）において、１２６ｍｆｃｓに対して試験を行なうと、すべてが ）１０２４の抗体価を有した。

ＥＡの分離および分子量の測定 抗−マウスのイムノグロブリンと組み合わせたセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓ ｅ　）　４　Ｂの親和性ゲルカラムを用いて、胎児性抗原（群）を分離した。各 々のＭｃの、２週間齢の、高密培養上清を、洗浄し平衡化した親和性ゲルと混合 し、４°Ｃにて、１２時間インキュベーションした。そのゲルを、トリス緩衝生 理食塩水（ＴＢ　Ｓ、１０　ｍＭＳｐＨ７，４）を１００×の体積を用いて洗浄 し、標準ＮＰ４０（４０μｍ　７０．１　ｄ、５−）を、または１２ｄｍｆｃｓ の細胞の、または成熟細胞のＫＣ，抽出物（１０μｍ７０、１　ｄ、５ｍりを、 そのゲルと混合した。

被験組織のまたは細胞の圧縮した細胞小球を、ＰＭＳ　Ｆ　（１ｍＭ　）を含む リン酸緩衝生理食塩水中のＮＰ４０（０，５％、容ｆｆ１ｌＯＸ）を用いて処理 して、細胞の抽出物を調製した。２５℃にて１時間後、細胞を１５００　ｒＰｍ ｓにおいて小球にし、その後、その上清を遠心分離（５０，０ＯＯＸＰ、３０分 間）した。抽出物および親和性ゲルを、４°Ｃにて１２−１５時間、インキュベ ーションし、次に、洗浄液中に、たん白質が検出されなくなるまで、抽出緩衝液 中で洗浄した。ＫＣｌ抽出物は、前記の如く作成した。

次に、基本８二と同じ容量の５　Ｍ　ＭｇＣｌ２を用いて、１時間、その抗体− 抗原−セファロース４Ｂ複合体を容量した。このステップを再び繰り返した。得 られた溶離液を、ＴＢＳ（容Ｗｋ　１００　Ｘ　）を用いて透析し、Ｓ　Ｄ　Ｓ 　−Ｐ　ＡＧ　Ｅに使用した。その溶離液を、トリス（１２、５ｎｌ　Ｍ　）中 に５ＤＳ（２，５％）、尿素（１，２ｓ　ｍＭ）、およびＢ−メルカプトエタノ ール（１％）を可溶化した緩衝液を用いて処理した。次に、このサンプルを、ラ エミ＋）　（Ｌａｅ＋ｎｍ１ｌｉ　）の不連続緩衝液システムを用いたアクリル アミド勾配スラブゲル（２０％から７％、底から頂上）において等電点電気泳動 を行なった。等電点電気泳動後、そのゲルを、酢酸：メタノール：水（７：４０ ：５３）中のコマシイ（ｃｏｍｍａｓｉｅ　）青Ｒ−２５０（パイオラドラブズ （Ｂｉｏ　ＲａｄＬａｂｓ　）、インコーポレーテイド（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ ｅｄ　）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　）、バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉ ａ　）　）を用いて染色し、後者の溶液中で脱色した。

リンパ球幼若化活性の評価 １２　ｄｍｆｃｓのＫＣｊ抽出物を与えた場合、ＥＡ陽性であり、刺激をうける ことが知られている、放射線照射を受けたｍＫｓａ細胞に対して感作した肺臓細 胞を用いて、リンパ球の形質転換の分析（ＬＴＡ）を行なった。

成熟マウス細胞のＫＣ１抽出物は、刺激を与える物質ではなかった。Ｌ　Ｔ　Ａ における分析の条件は、ウニブナ−（Ｗｃｐｐｎｅｒ　）、Ｗ、ｌ〜、およびコ ギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、５４：１ ９３（１９８０）に報告があった。

抽出物を０．０１〜０．０５ノ使用して、最大の刺激を達成し、その刺激インデ ックスの推定は記載した如くであった。

結果 Ｎｉｃに特異的なポリペプチドの分離 ３つのＩｇＭＭＣのＩｇ（６ｃ＋、ｔ、３８．７および８）およびＩｇＧ　Ｍｃ のＩｇは、すべてポリペプチド（４４−４８ＫＤ）とともに、より大きなポリペ プチドの重合体（２００ＫＤ）とも選択的に結合することが観察された。

そのたん白質（４５ＫＤ）は、胎児細胞の抽出物中にのみ検出され、成熟マウス の組織（筋肉、皮膚、肝臓、膵臓、心臓、腸、脳、を含んでいる）中、またはＣ ５７Ｂ　Ｌ　／　５　ｎマウスの１９−２１日胎児の動物全体のホモジネート中 には存在しなかった。１２−１３　ｄｍｆｃｓの胎児抽出物中に存在している濃 度の２５倍に濃縮した成熟抽出物を使用した場合でさえ、この結果は同じであつ た。

親和性ゲルから得た溶離液中に存在する他のバンドは、加えたモノクロナール抗 体からのＩｇＭの軽鎖＋Ｊ鎖（２０−２３ＫＤ）、サンドイッチ親和性ゲルにて 、マウスＭｃ１ｇＭと結合するために用いたＩｇＧからの重鎖（５７ＫＤ）、血 清アルブミン（７ＱＫＤ）、およびＩｇＭ重鎖（７５ＫＤ）であり、これらと共 に、たぶんＥＡたん白質モノマー（４５ＫＤ）の重合体である胎児に特異的なポ リペプチド（２００ＫＤ）があった。親和性ゲルから得た抗体のフラグメントは 、予期されたように、胎児の親和ゲルを表わすレーンと同じく、成熟親和ゲルを 表わすレーンの両方に存在していた。加えたＥＡ特異性ＭｃＩｇに対しての、ポ リペプチド（４６ＫＤおよび２００ＫＤ）が結合している親和性ゲルの特異性を 、モロネイ（Ｍｏ１ｏｎｅｙ　）肉腫ウィルス抗原決定基グリコプロティン（Ｍ Ｓ　Ｖ　）に対して特異的であることが知られている関連性のないマウスＭｃ　 ＩｇＭを用いて証明したことは重要であった。

この関連性のないＭｃｌｇは、前記のＭｃを用いて検出したポリペプチドを生産 する抗原決定基のいずれとも結合しなかった。

ＭＣ６９，１の濃縮物（２５Ｘ）を調製し、前記の親和性ゲルを用いて、１２　 ｄｍｆｃｓのＫＣ７抽出物（たん白質、５００μ２）を吸着するのに使用した。

ＭｃｌｇＭにより除去した結合ＥＡを用いて、その抽出物をゲルから回収し、そ れの元の体積にまで濃縮した。サンプルを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により再評価 し、元のＫＣ，抽出物と比較した。すべての検出可能なバンド（４５ＫＤおよび ２００ＫＤ）を除去したことをこの結果は示した。

次に、この親和性吸着した抽出−物を、ＬＴＡにて試験し、ポリペプチド（４５ ＫＤ、またはそれの重合体）を除去すると、ウエツプナー（Ｗｅｐｐｎｅｒ　） 、Ｗ、Ａ、およびコギ７　（Ｃｏｇｇｉｎ　）、Ｊ、Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍ＋ｎ ｕｎｏ１１．５４−１９３（１９８０）に記載の如く調製したＥＡで感作したマ ウス肺臓の刺激が妨害されるかどうかを調べた。その結果は表４に示したように 、実際に、ＩｇＭを吸着していないＫＣ，抽出物が刺激を行なうのにもかかわら ず、ＩｇＭを吸着した抽出物はＥＡで感作したリンパ球を刺激しえないことを示 した。

表４ ＼　セファロース４　Ｂ　：６　ｇ、Ｉ　Ｍｃ　ＩｇＭ抗体親和性ゲルを用いて 処理を行なう前と後のｌ　２　ｄｍｆｃｓのＫＣ４抽出物リンパ球の形質転換分 析 抽出物の処理 における刺激の指標 処理していない１２　ｄｍｆｃ溶離液 （４５ＫＤおよび２００ＫＤのポリ　２７±５ペプチドが存在） （４６ＫＤおよび２００ＫＤのポリ　６±３ペプチドは存在していない） 表５中に示す様に、肺の、乳の、大腸の、および直腸の肉腫からなるヒト腫瘍の スペクトルは、１２ｍｆｃｓに関してＳＰ　ＥＬＩＳＡ分析において続けて分析 した場合、選択的に、前記のＭｃのいくつかを吸着することが観察された。その 腫瘍が同様の腫瘍からなる数人の患者から得た、成人対照組織および正常組織は 、前記のＭｃを吸着しなかった。２つの肺の腺ガンのＫＣ，抽出物を親和性ゲル 分析すると、両方の腫瘍において、有、意に４６ＫＤのバンドが、および、２０ ０ＫＤのバンドの痕跡か示され、等しいたん白質１度の正常な成人組織中には、 これらのポリペプチドは存在しなかった。

１、例示した各々の型の環部化したＭｃｌｇを、表示された数の腫瘍二１Ｂ胞ま たは、正常対照組織の混合物（律３、心臓、筋肉、大腸、；庫、および肝臓）を 用いて、１２時時間前を行ない、ＥＡ＋１２日妊娠マウス胎児細胞を用いて、固 相ＥＬＩＳＡにて再び分析した。

０−Ｄ−（４１４ｎｍ　）吸着Ｉｇ ２、吸着比＝□： ０、Ｄ、（４１４ｎｍ）吸着しテイナイ工ｇＯ＝吸着なし、１．Ｏ＝完全に吸着 。

３、被験腫瘍の、または正常の標的細胞の吸着比（Ａ、Ｒ）を、例示した各々の 型の標準ＭｃＩｇに対する１２ｄｍｆｃｓのＡＲと比較することにより決定した 。

（すなわち、 １．８Ｘ１０４被験標的細胞＝　ｌ　Ｏ，Ｄ、単位３．３ｘ　ｌｏ’　１２　ｄ ｍ［ｃｓ＝　１０．Ｄ、　吸着単位（標ｅ吸着曲線から）＝０．５４ 討論 成熟マウス細胞の、または、マウスまたはヒトの妊娠完了期の細胞の抽出物中に おいては検出されないいくつかの抗−ＥＡ特異性ＭｃＩｇと反応性のあるマウス 胎児細胞中に、共通の４６および２００　ＫＤポリペプチドがこれらの結果によ り確認される。このたん白質は、また、ヒトの癌スペクトル中にて検出されるが 、大腸、肺臓、脳、皮膚および筋肉を含む、試験を行なった正常ヒト組織中には 検出されなかった。Ｍｃｌｇのすべてによるセファロース４Ｂ親和性ゲル中に結 合した２００ＫＤの胎児特異性ポリペプチドが存在することは、ＭｃＩｇの抗原 決定基が、胎児細胞および腫瘍細胞中に、本来の形で、４６ＫＤのたん白質の重 合体にて存在しているらしいことを示唆した。

マウスおよびヒトの胎児細胞および腫瘍細胞が、進化的に保存された４５ＫＤお よび２００　ＫＤのポリペプチドを共有しているという発見は大変意味深かった 。

ＭｃＩｇＭを用いて、親和性クロマトグラフィーを行ない、このポリペプチドを 選択的に除去すると、その抽出物は、ＥＡまたは腫瘍細胞および胎児細胞に対し て感作したリンパ球に対して非刺激物となるというもう１つの発見も、また、興 味深い。これらのペプチドは、同系マウスおよびハムスターにおける胎児細胞ま たはその抽出物により誘導される交差して保護的腫瘍移植耐性を誘導する原因と なるＥＡ決定基を少なくともひとつ含んでいることを、この発見は明らかに示唆 している。

本明細書中にて、無作為に、特定の追加研究を行なうために選択した５つの・・ イブリド−＝は、出願日前に、△ ＡＴＣＣ，ロックビレ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）、マリ−ランド（Ｍａｒｙｌａ ｎｄ　）に、３０年間、寄託した。その受諾番号は以下の通りである： ハイブリドーマ　８　（また、８ＫＣ１■で示される）ＨＡＴＣＣ番号ＨＢ−８ ６６３、 ハイブリドーマ６９．１　（また、６９．ｌ５ｈｌ［Ｉで示される）：　ＡＴ（ ：Ｃ番号ＨＢ−８６６４、ハイブリドーマ　３８．４６（また、３８．４６Ｓｈ ＩＩＩで示される）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８６６５、ハイブリドーマ３８．７（ また、３８．７ＳｈＩＩＩで示される）：　ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８６６６、およ び、ハイブリドーマ１１５（また、１１５ＳｈＵＩで示される）：　ＡＴＣＣ番 号ＨＢ−８６６７゜閂。　τｉＧ’１．１ｔｔｉｌい花、月３１賢糸田Ｒ乙もよ び）〜′蕉もβ月ととのり支着ＥＡ＋　月右（邑紳圧乙　との ＥＬＩＳＡ　Ｌｆ＞ミ嵩・ｌｊ生 図面の簡単な説明 ＦＩＧ、ｔ４ ＭｏＡｂ；９６９．（３８，７８（４ＭＳＶＦＥＦＩＧ、５ Ｍｃ工ｇ　１１５ 国際調査報告 ′°“−ａ＋ｌａ′ｍｌ　ＡｏＤｌｉ“″。”２°ＰＣＴ／ＬＩＳ８Ｓ／２２５ ８−

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍胎児ー特異的モノクロナール抗体を分泌するハィブリドーマの調製方法 であつて、（ａ）非増殖性の同系の妊娠中期胎児細胞の調製物の免疫量で動物を 免疫し、 （ｂ）該動物から免疫されたリンパ球を分離し、そして （ｃ）適切な融合条件下で、該リンパ球と不死細胞系とを融合して、該ハイブリ ドーマを得ること、からなる方法。
2. ２．該ハイブリドーマを、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロフアージ細胞系の存在 下で培養することからなる第１項に記載の方法。
3. ３．免疫される該動物が、げつ歯類である第１項に記載の方法。
4. ４．該細胞系によつて分泌された該モノクロナール抗体が、げつ歯類およびヒト の胚と胎児細胞、および、げつ歯類並びにヒトの腫瘍細胞に対して特異的である 第１項に記載の方法。
5. ５．第１項記載の方法により調製したハイブリドーマ。
6. ６．ある特定の動物の腫瘍に対して特異性を有するモノクロナール抗体の調製方 法であつて、第１項記載の方法により、該モノクロナール抗体を分泌する適当な ハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマから、該モノクロナール抗体を得る こと、 からなる方法。
7. ７．実質上、正常成熟動物組織に対する親和性のない抗体の内から、該モノクロ ナール抗体をスクリーニングすることを含む第６項に記載の方法。
8. ８．第６項または第７項のいずれかに記載の方法により調製したモノクロナール 抗体。
9. ９．以下に示す特性（ａ）〜（ｄ）を有しているモノクロナール抗体： （ａ）げつ歯類の妊娠中期の抗原に対する免疫応答能を有し、 （ｂ）ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫応答能を有し、 （ｃ）げつ歯類の、妊娠後期の胎児組織に対する免疫応答能が実質上なく、 （ｄ）ヒト正常組織に対する免疫応答能が実質上ない。
10. １０．分子量が、約４４，０００〜４８，０００である、腫瘍胎児性ポリペプチ ドに対する免疫応答能を有する第９項に記載のモノクロナール抗体。
11. １１．検出可能な様にラベルした形の第９項に記載の抗体。
12. １２．不溶性の形の第９項に記載の抗体。
13. １３．マウス起源の第９項に記載の抗体。
14. １４．ＩｇＭである第９項に記載の抗体。
15. １５．ヒト腫瘍に関連した腫瘍胎児性抗原を検出する方法であつて、 該腫瘍胎児性抗原を含むと考えられるヒト標本を、第９項記載の抗体と共にイン キユベートし、該抗原と該抗体間で、実質的な結合が起こるかどうかを測定する こと、からなる方法。
16. １６．免疫定量分析を含む第１５項に記載の方法。
17. １７．酵素関連分析を含む第１５項に記載の方法。
18. １８．放射能免疫分析を含む第１５項に記載の方法。
19. １９．競合的免疫分析を含む第１５項に記載の方法。
20. ２０．該抗原と該抗体との間の実質上の結合の測定を、検出可能な様にラベルし た腫瘍胎児性抗原の存在下で行なう第１５項に記載の方法。
21. ２１．該抗原が、分子量が約４４，０００〜４８，０００であるポリペプチドか らなる第１５項に記載の方法。
22. ２２．該抗原が、分子量が約２００，０００であるポリペプチドからなる第１５ 項に記載の方法。
23. ２３．抗原に結合したモノクロナール抗体を含んでいる分子複合体であつて、該 抗原が、分子量が４４，０００〜４８，０００であるポリペプチド、または、分 子量が２００，０００であるポリペプチドからなる複合体。
24. ２４．該抗原が、ヒト腫瘍細胞上に存在しているか、または、ヒト腫瘍細胞と関 連している第２３項に記載の複合体。
25. ２５．該抗原が、イン・ビポにおけるヒト腫瘍細胞の上に存在しているか、また は、関連している第２４項に記載の複合体。
26. ２６．該抗体が、検出可能な様にラベルされている第２３項に記載の抗体。
27. ２７．該ラベルが、酵素、放射性同位体、螢光ラベルおよび金属ラベルから成る 群から選択される第２６項に記載の複合体。
28. ２８．該モノクロナール抗体が、マウス起源である第２３項に記載の複合体。
29. ２９．イン・ビトロ系に存在している第２３項に記載の複合体。
30. ３０．該モノクロナール抗体が、実質的に異なる特異性を有する抗体を実質上含 んでいない第２３項に記載の複合体。
31. ３１．該抗体がＩｇＭである第２３項に記載の複合体。
32. ３２．動物の腫瘍を推察する方法であつて、該腫瘍と、第１１項に記載のモノク ロナール抗体とを接触させ、該腫瘍上の、または、該腫瘍に関連した該抗体の存 在を検出することからなる方法。
33. ３３．該抗体が放射能ラベルでラベルしてあるか、または、金属ラベルでラベル してある第３２項に記載の方法。
34. ３４．腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であつて、腫瘍増殖ー抑制物質に結合した 、第９項に記載のモノクロナール抗体の腫瘍増殖抑制量を該腫瘍細胞に投与する ことからなる方法。
35. ３５．以下に示す特性（（ａ）〜（ｄ））を有しているモノクロナール抗体を産 生するハイプリドーマ細胞系：（ａ）げつ歯類の妊娠中期抗原に対する免疫応答 能、があり、 （ｂ）ヒト腫瘍胎児性腫瘍抗原に対する免疫応答能があり、 （ｃ）げつ歯類の妊娠後期の組織に対して実質上免疫応答性がなく、 （ｄ）ヒト正常組織に対して実質上免疫応答性がない。
36. ３６．該モノクロナール抗体が、分子量が約４４，０００〜４８，０００である 腫瘍胎児性ポリペプチドに対して免疫応答性を有している第３５項に記載のハイ プリドーマ細胞系。
37. ３７．マウスリンパ球とマウスミエローマ細胞系の融合生成物である第３５項ま たは第３６項に記載のハイプリドーマ細胞系。
38. ３８．該抗体がＩｇＭである第３７項に記載のハイプリドーマ細胞系。
39. ３９．ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８６６３、ＨＢ−８６６４、ＨＢ−８６６５、ＨＢ− ８６６６またはＨＢ−８６６７と同一の特性を有している第３５項に記載のハイ ブリドーマ細胞系。