FI92222B - Onkofetaalisia spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö. - Google Patents

Description

92222

Onkofetaalisia spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö Tämä keksintö tehtiin osittain Yhdysvaltojen halli-5 tukselta saatua rahoitusta käyttäen. Hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Tekninen ala Tämä keksintö koskee onkofetaaliantigeeneja, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti 10 niiden kanssa, näiden vasta-aineiden valmistusmenetelmiä sekä käyttösovellutuksia, kuten esimerkiksi syövän diagnostisoinnissa ja kasvaintyypityksessä.

Tausta

Syöpä on yksi ihmiskunnan pelottavimpia ja turhaut-15 tavimpia tauteja. On selvää, että sivistyneen ihmisen eliniän piteneminen on suuresti lisännyt sitä mahdollisuutta, että yksilö tulee sairastumaan syöpään. Syöpäbio-logit ovat enenevässä määrin turhautuneita, sillä syövän kontrollointiin käytettävissä olevat hoidot silloin, kun 20 se on kliinisesti ilmennyt, parhaimmillaan lievittävät sen tärkeimpiä tappavia muotoja. Eloonjäämisindeksit eivät yleensä ole parantuneet tärkeimpien ihmistä kiusaavien syöpälajien kohdalla huolimatta miljardeista tutkimukseen käytetyistä dollareista ja miljooneista ihmistyötunneista, : 25 jotka on käytetty uusien syövänkontrollointimenetelmien kehittämiseen. Siten on luonnollista, että onkologit ja kasvainbiologit epätoivoisesti ovat etsineet parempia välineitä syövän toteamiseksi ja syövän biologian parempaan ymmärtämiseen perustuvaan hoidon parantamiseksi.

30 Pieni mutta merkittävä määrä spontaaneja remissioi- ta, joita tapahtuu muuten ei-hoidettavissa olevissa kasvaimissa, on rohkaissut biologeja toivomaan, että ruumiin luonnollisia puolustusmekanismeja voitaisiin käyttää olemassa olevien kasvainten vastustamiseksi paremmin. Tämä 35 optimismi on laajentunut pitkän tähtäimen suunnitelmaksi, 2 92222 jonka mukaan jonakin päivänä saattaa jopa olla mahdollista, ainakin teoriassa, immunisoida ihmiset niin, ettei syöpiä koskaan esiinny.

Viimeisten 20 vuoden aikana syöpäbiologit ovat tul-5 leet tietoisiksi siitä, että monissa ihmisen kasvaimissa ja eläinten kokeellisissa kasvaimissa syövän isännän immuunisysteemi näyttää muistavan antigeeniset determinantit, joita esiintyy laajassa joukossa luonnollisia ja keinotekoisesti aiheutettuja kasvaimia. Vaihtoehtoisesti ha-10 vaitaan sekaantumista immuunivasteisiin (esimerkiksi sup-pressiota). Täsmällinen kuvaus keinoista, joilla tämä immunologinen muisti tulee mukaan kuvaan isäntien alttiudessa antigeenisen kasvaimen kasvulle, on kuitenkin vasta äskettäin alkanut selventyä.

15 Monien vuosien ajan syöpäbiologit ovat keskittyneet toteamaan ja karakterisoimaan uusia antigeenejä, joita esiintyy kasvainsoluissa tai niiden pinnalla. Monet näistä determinanteista esiintyvät virusten avulla ja kemiallisesti aiheutetuissa eläinten kasvaimissa. Antigeenityyppe-20 jä, joita esiintyy transformoiduissa soluissa tai niiden pinnalla onkogeenisillä, DNA:ta sisältävillä viruksilla, kuten SV40 -viruksella, aiheutetun abortoivan infektion tai RNA:ta sisältävillä retroviruksilla aiheutetun infektion seurauksena, voidaan yleensä osoittaa esiintyvän eri 25 solulajeissa, jotka on transformoitu kullakin näistä viruksista; kukin viruslaji indusoi kuitenkin ainoalaatuisia antigeenejä verrattuna eri kasvainvirusten indusoimiin antigeeneihin. Kemiallisesti aiheutetut kasvaimet ovat usein antigeenisiä isännässään, mutta niiltä saattaa puut-30 tua virukseen liittyvät kudossiirtoantigeenit.

. Parhaiten tunnettuja kasvaimeen liittyviä antigee nejä, joita esiintyy virusten aiheuttaman solujen transformaation aikana tai sen jälkeen joko in vitro tai in vivo, ovat (1) kasvaimeen liittyvät solun pinta-antigee-35 nit; (2) kalvoon liittyvät kasvainspesifiset tai kasvai- • · 3 92222 meen liittyvät kudossiirtoantigeenit; (3) solunsisäiset, ensisijaisesti tumassa olevat antigeenit, jotka on nimetty kasvain- tai T-antigeeneiksi ja jotka voivat toimia immu-nogeeneina vain silloin, kun kasvaimet kasvavat suuriksi 5 ja kuoliota esiintyy; (4) virukseen liittyvät antigeenit, joita esiintyy viruspartikkeleiden pinnalla tai solukalvoissa olevien kypsyvien virusten pinnalla in situ; ja (5) alkio- tai sikiöantigeenit, joita esiintyy uudelleen solun pinnalla ja myös solun ulkopuolisessa nesteessä, kun SV40-10 transformoituja soluja viljellään in vitro. Alkio- tai sikiöantigeenit voidaan todeta vasta-aineen avulla sekä myös kudossiirtohylkäyskokeilla. (Tämä johdanto on oleellisesti otettu julkaisusta Coggin, Jr. ja Ambrose, Methods in Cancer Research, volyymi 18, luku 10, sivut 371 - 389.) 15 Lukuisia kertoja on yritetty kehittää sekä poly- klonaalisia että monoklonaalisia vasta-aineita kasvainan-tigeeneja vastaan siinä toivossa, että valmistetaan diagnostisia ja terapeuttisia reagensseja. Kahdentyyppisiä immunisointeja on suoritettu alalla aikaisemmin tämä toive 20 mielessä, nimittäin ksenogeenisiä ja allogeenisiä immunisointeja. Ksenogeeninen immunisointi tarkoittaa immunisointia, jossa eläin, kuten hiiri tai rotta, immunisoidaan eri lajista (esimerkiksi ihmisestä) peräisin olevalla eläinkudoksella (esimerkiksi kasvainkudoksella). Allogee-25 ninen immunisointi saadaan immunisoimalla tiettyä lajia oleva eläin kudoksella, joka on peräisin samaa lajia mutta eri kantaa olevasta eläimestä. Hiirien ksenogeeniset immunisoinnit, joilla saadaan aikaan monoklonaalisia vasta-aineita esimerkiksi ihmisen neuroblastoomia vastaan, kuva-30 taan julkaisussa Kennett, R. H., Monoclonal Antibodies.

Hybridomas: A New Dimension In Biological Analysis, luku 10, ss. 155 - 168. Ihmisen leukemiasoluja vastaan kseno-geenisesti tuotetut monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat peräisin hiiren haimasoluista, kuvataan esimerkiksi 35 julkaisussa Sato et ai., Development, Growth and Differentiation 25 (1983) 333 - 344.

4 92222

Ksenogeenisillä immunisoinneilla valmistettuihin vasta-aineisiin (olivatpa ne polyklonaalisia tai monoklo-naalisia) liittyy useita ongelmia. Ehkäpä tärkein ongelma on selvä vaikeus koskaan aikaansaada näiden vasta-aineiden 5 absoluuttinen kasvainspesifisyys. Harvat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on saatu immunisoimalla ksenogeenises-ti hiiriä tai rottia tietyllä ihmisen kasvainkudoksella, ovat osoittaneet absoluuttista spesifisyyttä kyseiselle kasvainluokalle ja monet reagoivat jonkin normaalin aikui-10 sen ihmisen kudoksen kanssa (katso esimerkiksi Rosenberg, S. A., kirjassa Rosenberg, toim., Serological Analysis of Human Cancer Antigens, New York, Academic Press, 1980). Nämä ongelmat johtuvat siitä tosiasiasta, etteivät ihmisen kasvainsolut sisällä vain kasvainspesifisiä antigeenejä 15 vaan sisältävät myös suuren joukon muita, kasvaimeen liittymättömiä antigeenejä, kun niitä injektoidaan kudossopi-mattomiin isäntiin. Siten eri lajin tai kannan kasvainso-luja vastaan tuotettu polyklonaalinen seerumi pakostakin reagoi immunologisesti sekä kasvainspesifisten että kas-20 vaimelle epäspesifisten antigeenien kanssa. Mahdollisuus saada monoklonaalisia (Mc) vasta-aineita spesifisiä epi-tooppeja vastaan on herättänyt toiveen, että jotkut hybri-doomasupernatanteista satunnaisesti valitut monoklonaaliset vasta-aineet olisivat todella kasvainspesifisiä. Tämä ' 25 on kuitenkin vaivalloinen ja työläs menetelmä ja antaa huonon vakuuden tulosten toistettavuudesta. Tulokset ovat umpimähkäisiä ja perustuvat klassisiin immunologisiin lähestymistapoihin vasta-aineiden "nostattamisessa”.

Viimeisten 10-15 vuoden kuluessa syöväntutkimuk-30 sen toisenlaisen suunnan mukana on kehittynyt mahdollisuus, että ihmisten ja jyrsijöiden pahalaatuisten kasvainten pääosa sisältää yhteisiä, alkioperäisiä determinantteja (EA), jotka saattavat olla immunogeenisiä syngeenises-sä isännässä ja jotka liittyvät solun plasmamembraaneihin 35 [katso esimerkiksi Coggin, Jr., Fetal Antigens and Cancer, • ' 5 92222 ss. 28 - 54, Pittman, Lontoo (Ciba Foundation Symposium 96), 1983]. Tässä käytetyn määritelmän mukaan oikeat EA:t esiintyvät ainoalaatuisesti sukusolu-, alkio- ja joillakin sikiöasteella olevien solukalvojen pinnalla eikä niitä 5 esiinny (immunogeenisesti) normaaleissa aikuisen kudoksissa eikä uudistuvissa kudoksissa. Alkioantigeenien immunologinen rooli sikiönkehityksessä kohdussa on yhä epäselvä. Tiedetään, että äidissä kehittyy vasta-aineita kohdussa esiintyviä EA:ita vastaan. EA:n uudelleenesiintymiseen 10 esiintulevassa pahanlaatuisessa solukloonissa johtavan onkogeenisen prosessin biologinen tuote näyttää liittyvän läheisesti kasvaimelta suojelevan immuunivasteen nousuun isännässä. Nämä vasteet matkivat raskaudenaikaisia immuunivasteita, joiden tehtävänä saattaa olla suojella EA-po-15 sitiivista sikiötä äidin immuunisysteemin hyökkäykseltä.

Alkioantigeeneja esiintyy todellakin jyrsijöiden ja ihmisen kaikissa kasvainluokissa. Jotkut vastaavat sikiö-antigeenit, onkofetaaliantigeenit tai 0FA:t, joita esiintyy ihmisen kasvaimissa (esimerkiksi ihosyöpäkasvaimissa), 20 näyttävät ryhmittyneen erillisiin histologisiin luokkiin, vaikkakin yhteisiä EA:ita on myös raportoitu. On osoitettu [Ambrose, K. R. et ai., Nature 233 (1971) 194; Coggin, J. et ai., Advances in Cancer Research 19 (1974) 105 ja Coggin, CIBA Symposium, yllä], että jyrsijäin ja ihmisen 25 alkioantigeenit, jotka ovat yhteisiä immunogeenisiä deter minantteja ja jotka säilyvät lajikehityksessä, esiintyvät uudelleen 0FA:ina ihmisen samoin kuin jyrsijäin kasvaimissa. Tämä ajatus syntyi alunperin havainnosta, että sätei-lytetyt ihmisen sikiöperäiset munuaissolut samoin kuin 30 syngeeniset, säteilytetyt hamsterin sikiöperäiset solut saattoivat keskeyttää SV40-onkogeneesin hamstereissa. Aikuisen ihmisen kudokset eivät suojanneet samalla tavalla. Tämä viittaa siihen, että jyrsijäin alkioantigeenit liittyvät läheisesti jyrsijäin onkofetaaliantigeeneihin ja 35 että jyrsijäin alkioantigeenit ovat identtisiä joidenkin 6 92222 ihmisen alkioantigeenien kanssa. Koska alkioantigeenit, joita on läsnä ihmisen sikiöperäisissä munuaissoluissa, suojasivat SV40-aktivoiduilta alkioantigeeneiltä, ainakin jotkut ihmisen alkioantigeenit ovat yhtäläisiä jyrsijäin 5 onkofetaaliantigeenien kanssa.

Viimeaikoihin asti EA:iden luonne oli epäselvä, koska saatavissa ei ollut reagensseja niiden immunokemial-liseen karakterisointiin. Useat työryhmät ovat kuitenkin raportoineet osoittaneensa joukon väitettyjä sikiöperäisiä 10 antigeenejä, vaikkakaan yhtään niistä ei ole puhdistettu monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen. Price, M., Soc. Trans. 2 (1974) 650, osoitti rotan maksasyöpäkasvaimesta suuren, karakterisoimattoman sikiöön liittyvän antigeenin, jonka arvioitu molekyylipaino oli 100 kD. Evans et ai., 15 Can. Res. 39 (1979) 2006, havaitsivat, että rottien sar-koomissa esiintyi kaksi onkofetaalista antigeeniä, joiden arvioitiin olevan kooltaan alueella 3,5 - 10 kD. Dickinson et ai., Br. J. Cancer 29 (1974) 425, raportoivat, että rinnasta, kohdunkaulasta, emättimestä ja vastapaidasta 20 peräisin olevat ihmisen kasvainuutteet sisälsivät useita pieniä, yhteisiä proteiineja, jotka näyttivät olevan sikiöön liittyviä ja joiden koko oli 16 - 18 kD. Jornvall et ai., P.N.A.S. USA 79 (1982) 287, raportoivat osoittaneensa 53 kD:n onkofetaaliproteiinin, joka on sekventoitu ja jol-25 la havaittiin olevan yhteisiä DNA:ta sitovia ominaisuuksia polyooma-keski-T-antigeenin (polyoma middle T antigen) (55 kD) kanssa. Tämä transformaatioon liittyvä proteiini esiintyi raskausajan keskivaiheen sikiöperäisissä soluissa monissa lajeissa samoin kuin useissa määritetyissä ihmisen 30 ja täysikasvuisissa kasvaintyypeissä.

:· Tutkiessaan jyrsijäin ja/tai ihmisen alkioantigee nien esiintymistä ihmisen kasvainsolujen pinnalla jotkut tutkijat ovat tehneet syngeenisiä immunisointeja. Syngee-ninen immunisointi on sellainen immunisointi, joka saa-35 daan eläinsysteemistä, josta puuttuu immunologisin mene- 7 92222 telmin määritettynä havaittavissa olevat kudossopimatto-muusdeterminantit. Toisin sanoen syngeeniset immunisoinnit ovat sellaisia, jotka saadaan immunisoimalla tietty eläin geneettisesti identtisestä eläimestä (tämä tarkoittaa, 5 sama laji, sama kanta) saadulla kudoksella.

Coggin, Jr. et ai., The Journal of Immunology 105 (1970) 524, ja Coggin et ai., Adv. Can. Res. 19 (1974) 105 - 165, osoittivat, että hamsterin ja hiiren sikiösolut sisälsivät antigeenejä, jotka ristireagoivat SV40:llä ai-10 heutetun sarkooman kanssa ja joita esiintyy muissa virusten avulla tai kemiallisesti aiheutetuissa sarkoomissa, siten, että ne stimuloivat vasta-aineen muodostumisen. Vasta-ainetta syntetisoitui, kun 10 päivää vanhoja mutta ei 14 päivää vanhoja, säteilytettyjä hamsterin sikiösoluja 15 injektoitiin täysikasvuisiin syngeenisiin hamstereihin ja näiden eläinten havaittiin sen jälkeen olevan immuuneja SV40-kasvainsolualtistukselle. Säteilyttämättömät sikiö-solut eivät saaneet aikaan kudossiirtoimmuniteettiä.

Hanna, Jr., Coggin et ai., Proceedings of the Na-20 tional Academy of Sciences, USA 68 (1971) 1748, tutkivat immunisoinnin estäviä vaikutuksia hiiren sikiöantigeenilla RLV-viruksella infektoitujen solujen kasvuun sekä plasma-solukasvaimiin. Nuoret BALB/c-uroshiiret käsiteltiin kolmen viikon välein röntgensäteilytetyillä syngeenisillä 25 alkiosoluilla. Kasvainten kehittyminen estyi hiirissä. Samanlaista estymistä ei havaittu hiirissä, jotka oli käsitelty vastasyntyneestä peräisin olevilla tai normaaleilla ksenogeenisillä soluilla.

Ting, In Vitro 14 (1978) 207, seuraten Coggin, Jr. 30 et ai'n, yllä, kuvaamaa työtä, jossa käytetään syngeeni- • sille sikiöille herkistämistä hamstereissa ja Balb/c-hii-rissä, tutki hiiren sikiösoluista peräisin olevien sikiö-antigeenien esiintymistä. Antiseerumi tuotettiin syngee-nisellä immunisoinnilla 5000 R:llä (1290 mC:llä) röntgen- 35 säteilytettyjen, yhdestä kahteen viikon raskausaikaisista • 8 92222 hiiren sikiöistä peräisin olevilla kudoksilla. Sikiöanti-geeneja havaittiin olevan jäljellä vielä viiden vuoden kuluttua varsinaisista hiiren sikiökudoksista peräisin olevissa in vitro -transformoiduissa solulinjoissa.

5 Kaikkien näiden syngeenistä immunisointia käyttä vien tutkimusten suorittamisen tarkoituksena oli analysoida alkioantigeenin läsnäoloa solujen pinnalla sekä niiden isännässä aiheuttamaa immuniteettia kasvaimia vastaan. Hybridoomien ja syngeenisestä isännästä peräisin olevien 10 sikiökudosten sikiöspesifisiä determinantteja vastaan muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamista ei ole kuvattu. Mitä tahansa tunnetun raskausajan ikäisten hamsterin tai hiiren sikiösolujen pinnalla olevaa alkioan-tigeenideterminanttia vastaan reagoivien monoklonaalisten 15 vasta-aineiden synnyn on odotettu olevan parhaimmillaankin ongelmallista, sillä tällaiset pyrkimykset koskisivat immunisointia syngeenisten systeemien sisällä. Asiaa monimutkaistaisi edelleen se, että tavanomaisen, monoklonaali-sia vasta-aineita koskevassa kirjallisuudessa usein kuva-20 tun, useita immunisointeja käyttävän menettelytavan liukoisia, alkioantigeenia sisältäviä valmisteita käyttäen on jo osoitettu aktivoivan T-estäjälymfosyyttejä ja häiritsevän kasvainkudossiirtoimmuniteettiä annoksesta riippuvalla tavalla [Weppner, W. A., et ai., Cancer Research 40 (1980) 25 1380]. Syngeenisellä sikiöllä tehdyn hyperimmunisoinnin « vaikutuksia B-lymfosyyttiaktivaatioon ei myöskään tunnettu ennen tätä keksintöä. On havaittu, että naarasjyrsijät kehittävät sytostaattista IgG:tä SV40-sarkoomasolujen kanssa ristireagoivia alkioantigeeneja vastaan, kun ne 30 immunisoitiin suoraan säteilytetyillä, syngeenisiä sikiö-soluja sisältävillä valmisteilla, jotka sisältävät monia hajoitettuja sikiösoluja, mutta eivät kehittäneet kasvain-resistenssiä eivätkä oletettavasti solulle myrkyllisiä efektori-T-soluja näissä olosuhteissa [Ambrose, K. R., 35 yllä; Coggin, J. H., Cancer Research 39 (1979) 2952].

« > li 9 92222

Shevinsky et al., Cell 30 (1982) 697 - 705, todellakin raportoivat suuria vaikeuksia saada hybridoomia alkiolla herkistettyjen hiiren tai rotan pernoilla. Vain yksi alkiospesifinen monoklonaalinen vasta-aine (2000 5 kloonista 14 fuusiossa) voitiin saada ja raportoida. Lisäksi tämä oli saatu ksenogeenistä immunisointia käyttäen.

Siten ennen tätä keksintöä alalla oli useita syitä odottaa, että syngeeninen immunisointi ei ehkä toimisi tai jopa osoittautuisi immunogeeniseksi tuotettaessa lymfo-10 syyttejä, jotka olisivat käyttökelpoisia muodostettaessa hybridoomia ja monoklonaalisia vasta-aineita, joita voitaisiin soveltaa diagnostiikassa ja/tai hoidossa.

Koska tarvitaan suuresti sellaisia immunologisia reagensseja, jotka ovat hyvin spesifisiä ihmisen kasvai-15 mien säilyneiden EAriden ja 0FA:iden osoittamisen suhteen, alalla aikaisemmin vallinneet ennakkoluulot jätettiin kuitenkin ottamatta huomioon, kun tähän keksintöön johtaneet alkututkimukset suoritettiin.

Keksinnön sisältö 20 Tämä keksintö syntyi siitä odottamattomasta keksin nöstä, että on mahdollista immunisoida syngeenisesti eläin nopeasti lisääntymättömillä (esimerkiksi kuolettavasti sä-teilytetyillä ), raskauden keskivaiheesta olevilla, syngee-nisillä sikiösoluilla, jolloin saadaan lymfosyytteja ja 25 lopulta monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erittäin spesifisiä jyrsijöiden ja ihmisen alkioantigeeneille. Tällä tavoin herkistettyjen hiirien pernasolut voidaan fuusioida sopivien immortaliteettisolujen kanssa tunnetuissa olosuhteissa, jolloin saadaan hybridimyeloomia (hybridoo-30 mia), joiden valinnan, seulomisen ja kloonauksen jälkeen havaitaan tuottavan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat erittäin spesifisiä alkioantigeeneille. Näiden mono-klonaalisten vasta-aineiden erityisominaisuus on se, että ne tunnistavat ristiin ihmisen onkofetaaliantigeenit, jot-35 ka näyttävät olevan identtisiä tai lähes identtisiä jyrsi- 10 92222 jäin ja ihmisen EAiiden kanssa. Tällä menetelmällä saadut monoklonaaliset vasta-aineet pystyvät spesifisesti tunnistamaan tähän mennessä julkaistussa kirjallisuudessa kuvaamattoman, ainoalaatuisen onkofetaalipolypeptidin determi-5 nantit.

Siten keksintö sisältää menetelmän hybridoomien ja monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi seuraavien vaiheiden avulla: a) immunisoidaan sopiva eläin sopivilla määrillä 10 syngeenistä, nopeasti lisääntymätöntä raskausajan keski vaiheesta peräisin olevaa sikiösoluvalmistetta; b) eristetään herkistetyt lymfosyytit mainitusta eläimestä; c) fuusioidaan mainitut lymfosyytit sopivissa fuusio-olosuhteissa immortalisoivan solulinjan kanssa, jol- 15 loin saadaan hybridooma; ja d) otetaan talteen monoklonaaliset vasta-aineet mainitusta hybridoomasta.

Yksi menetelmän ratkaisevista puolista on eläinten syngeeninen immunisointi nopeasti leviämättömillä sikiö-20 soluilla. Kyky saada keksinnön mukaisia tuloksia on vastoin alalla aikaisemmin vallinnutta uskoa ja ennakkoluuloa, että alkioantigeeneja olisi vaikea käyttää immunogee-neina, koska niiden yleisesti uskottiin olevan ei-immuno-geenisiä tai heikosti immunogeenisiä in vivo Balb/c-hii- • 25 rissä ja hamstereissa ja olevan immunosuppressiivisia, kun niitä annetaan pidennettyjen immunisointiaikataulujen kuluessa soluttomia antigeenin raakavalmisteita käyttäen, ja että ne olivat ehdottomasti faasispesifisiä estäen niiden viljelyn in vitro. Menetelmä vahvistaa edelleen, että on 30 mahdollista kehittää monoklonaalisia immunoglubuliineja • evoluutiossa säilyneitä alkioantigeeneja vastaan, joita antigeenejä esiintyy laajasti jyrsijöiden ja ihmisten kasvaimissa.

Tämä keksintö koskee myös menetelmässä saatujen 35 monoklonaalisten vasta-aineiden tyyppiä, tarkemmin sanot-

II

11 92222 tuna monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on seuraavat spesifisyysominaisuudet: a) immunoreaktiivisuus jyrsijäin ja ihmisen raskauden keskivaiheen aikaisia alkio-sikiöantigeeneja vas- 5 taan; b) immunoreaktiivisuus ihmisen onkofetaalisia kas-vainantigeeneja vastaan; c) oleellisesti ei-havaittava immunoreaktiivisuus jyrsijäin raskauden myöhäisvaiheen sikiökudosta tai hii- 10 ren, hamsterin tai ihmisen täysikasvuisia kudoksia vastaan; ja d) oleellisesti ei-havaittava immunoreaktiivisuus ihmisen normaalia kudosta vastaan.

Vasta-aineita voidaan käyttää eristettäessä affini-15 teettikromatografisesti kasvaimeen liittyviä antigeenejä; identifioitaessa kasvaimia, joissa diagnoosin mukaan esiintyy 0FA:ita, primaarikasvainten samoin kuin metastaasien toteamisessa tai kasvaimen tyypityksessä.

Keksintö koskee myös tiettyjä uusia onkofetaalian-20 tigeeneja, joita voidaan käyttää kasvainten diagnostisina ja/tai tyypittävinä merkkiaineina ja joista yksi on poly-peptidi, jonka molekyylipaino on noin 44 000 - 48000 ja toinen on polypeptidi (joka saattaa olla ensimmäisen kova-lenttisesti sitoutunut multimeeri), jonka molekyylipaino 25 on noin 200 000.

Tämä keksintö avaa tien todella onkofetaalispesi-fisten reagenssien luokalle.

Piirrosten kuvaus

Kuvio 1 esittää hybridoomien 10 - 12 päivän vilje-30 lyn supernatanteissa olevien useiden monoklonaalisten vas ta-aineiden titrausta muovisiin, pienoiskaivoihin ELISA-määrityksessä kiinteäfaasi (SP) kiinnitettyjä 12 dmfc -soluja (day gestation mouse fetal cell, päivän raskausai-kaisen hiiren sikiöperäinen solu) kohteina käyttäen. Kaik-35 ki esitetyt anti-EA-monokloonit olivat IgM-isotyyppiä 12 92222 poikkeuksena monoklooni 58, joka on IgG2a~isotyyppiä.

MPC 11 on kontrollina käytetty IgG-luokan monoklonaalinen vasta-aine, joka valittiin vertailun vuoksi, sillä se kohdistuu tuntematonta determinanttia vastaan, joka determi-5 nantti ei ole sikiöön liittyvä determinantti (IE-määrityk-sen perusteella). MPC-ll:ta käytettiin negatiivisena kontrollina kaikissa kokeissa kunkin kokeen ELISA:n taustatasojen määrittämiseksi.

Kuvio 2 osoittaa toisen anti-EA-monokloonin, IgM 10 69,l:n sikiöspesifisyyden. Monoklonaalista immunoglobu- liinia (650 absorbanssiyksikköä) käsiteltiin alkuabsorp-tiossa kasvavilla pitoisuuksilla täysikasvuisen hiiren perna-, maksa-, lihas-, keuhko- ja ihosoluilla ( ) tai 12 - 13 päivän raskausaikaisen, kerran synnyttäneen hiiren 15 sikiösoluilla (o) tai 24 päivää vanhoilla hiiren lihas- ja pernasoluilla ( ) 12 tunnin ajan 4 °C:ssa, sentrifugoitiin solunapin poistamiseksi ja titrattiin uudelleen kiinteä-faasi-ELISA-määrityksellä.

Kuvio 3 esittää immunosuodatus-ELISA:n tulokset, 20 joissa verrataan satunnaisesti valittujen hybridoomasuper-natanttien sitoutumisaffiniteetin (maksimaaliseen reaktiivisuuteen kulunut aika) muutosta käyttäen kohteena hiiren 12 - 13-päiväisiä sikiösoluja, jotka oli vasta kerätty talteen tai joita oli kasvatettu in vitro 4 tai 24 tunnin 25 ajan ennen kokeen suorittamista. Solut vakioitiin samaan lukumäärään kaikissa tapauksissa ja niiden elävien solujen lukumäärä oli sama (10 %).

Kuvio 4 esittää kuvion 3 yllä olevien supernatant-tien vertailun tuloksia niiden kapasiteetin suhteen rea-30 goida 13 dmfc-solujen kanssa, jotka oli joko vasta kerätty talteen ja käytetty välittömästi tai jäädytetty nestemäisessä typessä yhden viikon ajan ja sulatettu ja käytetty immunosuodatus-ELISA-määrityksessä. Molemmat määritykset tehtiin samana päivänä samassa kokeessa. ELISA-reaktiot 35 määritellään kromogeenin lisäystä seuranneen värinkehitty- 13 92222 misen mukaan (++++ = täysi väri 5 minuutissa; +++ = täysi väri 10 minuutissa; ++ = väri 15 minuutissa; + = jonkin verran väriä 20 minuutissa; o = ei väriä.)

Kuvio 5 esittää fetaalispesifisten 44 - 48 kD:n ja 5 200 kD:n polypeptidien osoittamista 12 dmfc -solujen tai täysikasvuisen hiiren kudosten NP40-uutteista (4 pg), jotka oli laitettu Sepharose 4B -pylvääseen, johon luetellut monoklonaaliset vasta-aineet oli kiinnitetty. Geelikomp-leksi pestiin perusteellisesti, eluoitiin ja eluaatti valio mistettiin SDS-PAGE-elektroforeesia varten ja värjättiin Coomassie-sinisellä. Hiiren monoklonaalista IgM-vasta-ai-netta Moloney-sarkoomaviruksen vaippaglykoproteiinideter-minanttia (MSV) vastaan käytettiin monoklonaalinen vasta-aine -kontrollina sikiösolu-uutteiden kanssa, f = sikiö-15 uute; a = täysi-ikäinen kudosuute. Oikeanpuolimmainen rivi esittää vakiona käytetyt molekyylipainomerkkiaineet. 19 -20 päivän ikäiset hiiren sikiösolut antoivat identtiset tulokset yllä esitettyjen, täysi-ikäisillä soluilla saatujen tulosten kanssa.

20 Kuvio 6 esittää Mcl15 shIII:n kapasiteettia poistaa kasvavat määrät sikiöspesifisiä 46 ja 200 kD:n polypepti-dejä 12 päivän ikäisten hiiren sikiösolujen NP40-uutteis-ta. Rivi 1 = molekyylipainovakiot; Rivi 2 = Mc 115 shIII + 10 μΐ sikiöuutetta; Rivi 3 = Mc 115 shIII + 20 μΐ uutetta; 25 Rivi 4 = Mc 115 shIII + 30 μΐ uutetta; Rivi 5 = Mc 115 shIII + 10 μΐ kymmenkertaista täysi-ikäistä uutetta; Rivi 6 = 20 μΐ uutetta; Rivi 7 = 30 μΐ uutetta.

Paras tapa keksinnön suorittamiseksi Menetelmät 30 Keksintö perustuu eläinten syngeenisen immunisoin nin suorittamiseen nopeasti leviämättömällä, raskauden keskivaiheen sikiösoluvalmisteella. Mitä tahansa sopivaa eläintä, esimerkiksi jyrsijöitä, kuten hiiriä, rottia tai hamstereita, vuohia, hevosia, kananpoikia ja vastaavia 35 voidaan käyttää. Edullisimpia ovat hiiret. Laajojen kokei- 14 92222 den jälkeen keksittiin todellakin, että hyvin karakterisoitu, sisäsiittoinen hiirikanta, jonka alan asiantuntijat hyvin tuntevat ja joka on kaupallisesti saatavissa, C57BL/6n, oli kaikkein paras lopullisten hybridoomien saa-5 miseksi. Toista sisäsiittoista Balb/c-hiiri-kantaa ei voitu helposti käyttää alkukokeissa.

On ratkaisevaa, että syngeeniset sikiösolut ovat valitun lajin raskausajan raskauden keskivaiheilta ja saatu kerran synnyttäneistä naaraista. Siten esimerkiksi hii-10 ren raskauden keskivaihe on välillä 12 - 14 päivää, kun taas hamsterilla se on 9 - 10 päivää. Syy tähän vaatimukseen on se, että alkioantigeenit ovat faasispesifisiä. Raskausajan varhaiset vaiheet ovat todennäköisesti anti-geenipositiivisia, mutta sikiökudoksen määrä on hyvin pie-15 ni, eivätkä nämä varhaisen ajan kudokset ole käyttökelpoisia. Jos käytetään normaaleja täysi-ikäisiä soluja, raskauden loppuajan sikiösoluja (19 - 21 päivää hiirellä tai 15 päivää hamsterilla) tai vastasyntyneen soluja tai täysi-ikäisen hiiren tai hamsterin kudoksia, ei voida saada 20 onnistuneita tuloksia.

Toinen ehto menestykselliselle immunisoinnille on tarve estää nopeasti lisääntyminen syngeenisessä, immunisoivassa sikiösoluvalmisteessa. Nopeasti lisääntymisen estäminen voidaan suorittaa millä tahansa lukuisista, hy-25 vin tunnetuista menetelmistä pysäyttää DNA:n replikaatio, kuten esimerkiksi säteilyttämällä röntgensäteillä, ultra-violetti- tai cesiumsäteilytyksellä tai jodideoksiuridii-ni-käsittelyllä. Edullista on säteilyttää röntgensäteillä annoksella noin 4000 - 6000 R (1032 - 1548 mC) kokonaisia 30 soluja ennen immunisointia. Jos jatkuva solureplikoitumi- · nen sallitaan immunisoinnin aikana, alkioantigeenit katoa vat solujen pinnalta nopeasti (immunogeeneina), eikä haluttujen hybridoomien saannissa onnistuta.

Sikiösolujen talteenotto ja dispergointi (ennen 35 immunisointia) on kuvattu artikkelissa Coggin, J. H. et • 4 15 92222 al., Advances in Cancer Research 19 (1974) 105. Entsyymi-dispergoimista ei edullisesti käytetä.

Kannattaa mainita, että monet alussa tehdyt immuni-sointiyritykset käyttäen raskaana olevia luovuttajia, 5 Balb/c-luovuttajia, jotka injektoitiin sikiösoluilla, ja suurella annoksella tehtyä pitkäaikaista herkistämistä, jota perinnäisesti käytetään hybridoomien tuottamiseksi, eivät onnistuneet. Paras immunisointi saadaan soluilla, jotka ihannetapauksessa annetaan joko lyhytaikaisena, 10 kaikkiaan kolmen injektion sarjana mukaan lukien viimeinen tehosteannos. Solut voidaan injektoida yksinään tai Freun-din adjuvantissa joko Mycobacterium smegmatitis - tai M. tuberculosis -bakteerien kanssa, jonka jälkeen seuraa tehosteinjektio sikiösoluilla ja epätäydellisellä Freun-15 din adjuvantilla ja lopullinen tehosteannos vain sikiö-soluilla. Injektiot voidaan antaa vatsaonteloon tai suoneen edellisen ollessa edullisin. Herkistetyt pernasolut voidaan saada noin kolmen päivän kuluttua lopullisesta tehosteannoksesta, joka yleensä annetaan noin 2-3 vii-20 kon kuluttua viimeisestä immunogeeni-injektiosta. Immuni soivat määrät sikiösoluja ovat tavallisesti mitä tahansa 6 8 10 - 10 solun välillä injektiota kohti. Kokonaisia solu ja tai huolellisesti valmistettuja solukalvoja tai muita EA:ta sisältäviä solu-uutevalmisteita voidaan käyttää, 25 mutta tässä tapauksessa immunisointijärjestelmän tulee olla ankarasti kontrolloitu, jotta rajoitetaan estäjäsolu-jen kehittyminen [Weppner & Coggin, Cell Imm. 54 (1980) 193] .

Kun herkistetyt pernasolut on saatu, ne fuusioidaan 30 sopivissa fuusio-olosuhteissa minkä tahansa halutun immor- • taliteettisolulinjan kanssa, jolloin saadaan hybridoomia.

Hybridoomien valmistusmenetelmät sekä niiden valitseminen ovat hyvin kuvatut kirjassa Monoclonal Antibodies. Hybri-domas: a New Dimension in Biological Analysis, Kennett, 35 McKearn ja Bechtol, toim., Plenum Press, New York ja Lon- 16 92222 too (1982), erityisesti liite, joka on nimeltään "Methods of Reproduction and Characterization of Monoclonal Antibodies" sivuilla 363 - 417 ja joka on liitetty tähän viitteeksi kokonaisuudessaan. Yksi edullisista immortaliteet-5 tisolulinjoista on P3X63Ag8.653. Fuusio voidaan suorittaa solusuhteessa 1:10 hiiren myeloomasolujen suhde pernaso-luihin polyetyleeniglykolin läsnäollessa. Valinta suoritetaan tavallisesti valikoivassa väliaineessa, kuten esimerkiksi HAT-väliaineessa. Hybridisolut pidetään yllä HT-vä-10 liaineessa, jota on täydennetty makrofaagisolulinjan RAW264.7 supernatanteilla. Tämä väliaine on oleellinen voimakkaasti kasvavien, IgM-vasta-ainetta tuottavien hyb-ridoomien saamiseksi. Tämä makrofaagilinja on talletettu ennen tämän hakemuksen jättöpäivämäärää American Type Cul-15 ture Collection -talletuslaitokseen ja sille on annettu numero CRL 8668.

Massahybridoomapesäkkeiden kloonaus voidaan suorittaa millä tahansa lukuisista menetelmistä, kuten esimerkiksi terminaalisella laimennuksella tai pesäkkeen muodos-20 tuksella metyyliselluloosassa. Immunoglobuliiniluokka voi daan määrittää esimerkiksi immunodiffuusiomäärityksillä ja tyypittäviä vasta-aineita (anti-hiiri-immunoglobuliineja) käyttäen. On havaittu, että kaikissa tätä keksintöä koskevissa tapauksissa monoklonaaliset vasta-aineet ovat IgM-• 25 luokkaa, kun ne on aiheutettu kokonaisilla sikiösoluilla, ja IgG-isotyyppisiä, kun ne on aiheutettu liukoisilla sikiösoluilla. Tämän ei kuitenkaan tulisi olla rajoittavaa ja muita luokkia voidaan saada ja niitä voidaan käyttää

Ratkaiseva koe monoklonaalisten vasta-aineiden spe-30 sifisyydestä alkioantigeenien suhteen suoritetaan pesäke- '· supernatanttien absorptioseulonnalla vastasyntyneen tai täysikasvuisen hiiren kudoksista (C57BL/6n tai kokonaisella kudoksella, joka on vasta otettu talteen) valmistetuilla asetonipulvereilla. Pakattu tilavuus asetonipulveria 35 sekoitetaan yhtä suuren tilavuuden hybridoomasupernatant- 17 92222 tia kanssa ja seosta inkuboidaan. Seos sentrifugoidaan, ennen kuin sitä käytetään ELISA (enzyme linked immuno absorption assay) -määrityksessä. Jos absorboitu hybridoo-masupernatantti antaa positiivisen reaktion, sen katsotaan 5 silloin olevan oikeaa determinanttia vastaan ja prosessoidaan kloonausta varten.

Tuotteet

Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka voidaan saada yllä mainitulla menetelmällä, oleellisesti reagoivat immu-10 nologisesti alkuperäisen eläimen raskauden keskivaiheen alkio-sikiöantigeenien kanssa; oleellisesti reagoivat im-munologisesti ihmisen ja jyrsijäin onkofetaalikasvainanti-geenien kanssa; oleellisesti eivät havaittavasti reagoi immunologisesti alkuperäisestä eläimestä peräisin olevan 15 myöhäisraskaudenaikaisen sikiökudoksen kanssa; eivätkä ne oleellisesti havaittavasti reagoi immunologisesti ihmisen normaalin kudoksen kanssa.

Kun immunisoitava eläin on hiiri, keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat immunologisesti 20 jyrsijäin raskauden keskivaiheen antigeenien kanssa, mutta eivät reagoi immunologisesti jyrsijäin myöhäisraskaudenaikaisen kudoksen kanssa.

Koska raskauden keskivaiheen alkioantigeenit ilmestyvät uudelleen ihmisen syöpäsoluihin, mutta eivät esiin-* 25 ny havaittavissa olevissa pitoisuuksissa ihmisen normaaleissa täysi-ikäisissä tai vastasyntyneen tai raskauden loppuvaiheen sikiön soluissa, saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat korkeasti sikiö- ja kasvainspesifisiä. Todellakin, koskapa raskauden keskivaiheen syngeenisissä so-30 luissa ei ole mitään antigeenejä (muita kuin alkioantigee-l neja), jotka eroavat immunisoitavan isännän antigeeneistä, niistä peräisin olevat monoklonaaliset vasta-aineet ovat todella EA- ja OFA-spesifisiä.

Mielenkiintoista tämän keksinnön mukaisten monoklo-35 naalisten vasta-aineiden spesifisyyttä koskien on keksi- l · 18 92222 jöiden havainto, että 10 päivän raskausaikaisia hamsterin sikiösoluja vastaan saatu polyklonaalinen, in vivo -absorboitu ksenogeeninen antiseerumi saostaa immunologisesti selvät sikiöspesifiset polypeptidit 12 - 13 päiväisten 5 hiiren tai 10-päiväisten hamsterin sikiösolujen 3 mol/1 KC1 - tai NP-40-uutteista. Tällaiset tutkimukset osoittavat myös, että jotkut 10 - 12-polypeptidit ovat läsnä raskauden tänä ajankohtana, mutta eivät ole läsnä vastasynty- · neestä tai täysikasvuisesta peräisin olevissa kudoksissa; 10 jotkut näistä saattavat olla pienempien polypeptidien polymeerisiä muotoja. Useimmat havaitut alkioantigeenit ovat yhteisiä molemmille jyrsijälajeille (hiirelle ja hamsterille). Polyklonaalinen antiseerumi tappaa myös joukon kasvainlinjoja, joilla tiedetään olevan yhteisiä alkioan-15 tigeeneja 10-päiväisten hamsterin sikiösolujen kanssa. Toisaalta tiettyjä kasvainlinjoja, joilla ei ole yhteisiä, havaittavia onkofetaaliantigeeneja hamsterin sikiösolujen kanssa, ei tapeta, eikä myöskään aikuisen ihmisen normaaleja fibroblasteja. Polyklonaalisessa seerumissa olevat 20 anti-EA-IgG:t spesifisesti saostavat immunologisesti useita alkioantigeenideterminantteja, mikä osoittaa, että on olemassa useita, mutta vain rajoitettu lukumäärä läsnäolevien IgG:iden tunnistamia EA-polypeptidejä.

Nämä polyklonaalisella seerumilla saadut tulokset 25 ovat yhdenmukaisia keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyden kanssa. Keksinnön mukaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on kapea spesifisyysalue.

Kaikissa tapauksissa ne tunnistavat yhden ainoalaatuisen polypeptidin, jonka molekyylipaino on noin 44 000 -30 48 000 Daltöniä (tässä nimetty myös "46 kD:n polypeptidik- si"). Ne tunnistavat samoista sikiösoluista myös polypeptidin, jonka molekyylipaino on noin 200 000 Daltonia. Jälkimmäinen saattaa olla 46 kD:n polypeptidin multimeeri tai se saattaa olla toinen polypeptidi, joka sisältää sa-35 man EA-epitoopin, joka on 46 kD:n proteiinissa. 46 kD:n 19 92222 polypeptidi on alkioasteen, raskauden keskivaiheelle ainoalaatuinen antigeeni ja se näyttää olevan oikea alkiope-räinen antigeeni ja siten onkofetaaliantigeeni.

Kävttömenetelmät 5 Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää suuressa joukossa eri sovellutuksia. Näitä sovellutuksia ovat diagnostiset sovellutukset sekä analyyttiset kuvantamis- ja tutkimussovellutukset.

Käytettävissä olevien diagnostisten menetelmien 10 joukosta yksi keksinnön puoli kohdistuu menetelmään, jossa osoitetaan ihmisen kasvaimeen liittyvä onkofetaaliantigeeni ja jossa: a) inkuboidaan ihmisen näytettä, jonka epäillään sisältävän mainittua onkofetaaliantigeenia, keksinnön mu- 15 kaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; ja b) määritetään, tapahtuuko mitään oleellista sitoutumista mainitun antigeenin ja mainitun vasta-aineen välillä.

Onkofetaaliantigeenin osoittaminen voidaan tehdä 20 käyttäen menetelmiä, jotka immunologisten määritysmenetelmien tekniikan asiantuntijat hyvin tuntevat. Voidaan käyttää esimerkiksi kompetetiivisia määritysmenetelmiä tai immunometrisiä määritysmenetelmiä. Kompetetiivisessa määritysmenetelmässä monoklonaalista vasta-ainetta inkuboi-25 daan havaittavaksi leimatun määrän kanssa onkofetaaliantigeenia ja näytteiden kanssa, joiden epäillään sisältävän tuntematon määrä onkofetaaliantigeenia. Syntyy kilpailu havaittavaksi leimatun antigeenin ja näytteessä olevan antigeenin välille, mikä johtaa suhteellisen suoraviivai-30 sella tavalla näytteessä olevan antigeenimäärän kvantitoi-miseen.

Immunometrisissä määritysmenetelmissä keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine kiinnitetään (etukäteen tai myöhemmässä vaiheessa) sopivaan kiinteään faasiin 35 ja sitä inkuboidaan näytteen kanssa, jonka epäillään si- 20 92222 sältävän ihmisen kasvaimeen liittyvää onkofetaaliantigee-nia. Sitten näytteen kanssa inkuboidaan samaa tai eri rao-noklonaalista vasta-ainetta, joka on liukoisessa, havaittavaksi leimatussa muodossa, ja sopivien pesuvaiheiden 5 jälkeen muodostuu kompleksi, joka samanaikaisesti sitoo leiman kiinteään faasiin. Voidaan saada suoraviivainen suhteellinen riippuvuus leiman ja näytteessä olevan onko-fetaaliantigeenimäärän välille. Immunometriset määritysmenetelmät voidaan suorittaa suorilla, käänteisillä tai 10 samanaikaisilla tavoilla. Alan asiantuntijat tuntevat nämä kaikki hyvin. Katso esimerkiksi David et ai.'Ile myönnettyä US-patenttijulkaisua 4 376 110 nimeltään "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies" ("Immunometriset määritysmenetelmät monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen"). 15 Koskien immunometrisiä määritysmenetelmiä, joissa spesifisesti käytetään IgM-luokan monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on multivalentteja antigeenejä vastaan, katso myös esimerkiksi Wands et ai., PCT/US 81/01270.

Mitä tahansa havaittavaa leimaa voidaan käyttää 20 joko leimatussa antigeenissä tai leimatussa vasta-aineessa. Näitä leimoja ovat radioisotooppileimat (esimerkiksi 125 2 25 14 P, 3I, h, S, C ja vastaavat). Niitä ovat ELISA-tekniikoissa käytettävät entsyymit (esimerkiksi alkalinen fosfataasi, piparjuuriperoksidaasi, penisillinaasi ja vas-25 taavat), fluorogeeniset yhdisteet (kuten fluoreseiini), bakteriofaagit, NMR-kuvantamistekniikoissa käyttökelpoiset metallit, muut radiokuvantamistekniikoissa käyttökelpoiset radioisotooppileimat ja vastaavat. Radioisotooppileimat tai entsyymit ovat edullisia määritysmenetelmissä käy-30 tettäviksi.

v Mitä tahansa sopivaa ja hyvin tunnettua, immunolo gisissa määritysmenetelmissä käyttökelpoista kiinteää faasia voidaan käyttää. Näitä ovat lateksipartikkelit, poly-styreenihelmet, koeputket, kuidut, kaivot, muut luonnolli-35 set ja/tai synteettiset polymeeriset aineet ja vastaavat.

Il 21 92222

Monoklonaalisen immunoglobuliinin avulla puhdistettuja antigeenejä voidaan käyttää tavanomaisissa ihokokeis-sa OFA:lle herkistymisen testaamiseksi sekä antigeeneinä lymfosyyttitransformaatiomäärityksissä. Antigeenit voivat 5 myös olla käyttökelpoisia herkistettäessä isännän immuuni-systeemi kasvaimen kehittymistä tai uudelleenesiintymistä vastaan.

Keksinnön mukaisia alkioantigeeneja voidaan myös käyttää merkkiaineina kasvainten toteamisessa ja/tai diag-10 nostisoinnissa aikaisemmin kuvattuja, normaaleja immunologisia määritysmenetelmiä käyttäen. Näissä määritysmenetelmissä voidaan käyttää keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja vasta-aineita tai muita niiden kanssa ekvivalentteja analogisia vasta-aineita, jotka on valmistettu 15 millä muulla menetelmällä tahansa. Määritysmenetelmä voi käyttää mainittuja polypeptidejä havaittavaksi leimatussa muodossa (esimerkiksi kompetetiivisella tavalla) tai liukenemattomaksi saatetussa muodossa (vasta-aineiden agglu-tinaatiomääritys tai vasta-aineen sitoutumismääritys). 20 Siten esimerkiksi havaittavaksi leimatut tai kiinnitetyt polypeptidit, joiden molekyylipaino on 44 000 - 48 000 ja joilla on tässä kuvattuja alkioantigeeni-OFA-erityisomi-naisuuksia, ovat myös osa keksintöä.

Polypeptideistä muodostuvien antigeenien monoklo-25 naalisten vasta-aineiden kanssa muodostamat kompleksit ovat myös osa keksintöä. Näitä komplekseja syntyy esimerkiksi silloin, kun monoklonaalinen vasta-aine sitoutuu polypeptidiin diagnostisessa määritysmenetelmässä in vitro tai diagnostisessa menetelmässä tai kuvantamismenetelmäs-30 sä. Siten radiokuvantamismenetelmissä (esimerkiksi radio-* aktiivisissa tai ydinmagneettista resonanssia käyttävissä menetelmissä), joissa monoklonaalinen vasta-aine sitoutuu radioisotooppiin tai metalliatomiin tai -atomeihin, käyttökelpoiset kompleksit ovat myös osa keksintöä.

22 92222

Muita antigeenien ja/tai vasta-aineiden käyttösovellutuksia alkioantigeenin toteaminen ihmisen sikiössä raskauden normaalisuuden varmistamiseksi, erilaistumis-merkkiaineiden analyysi sikiöbiologiassa, alkioantigeenien 5 ja onkofetaaliantigeenien puhdistus, ihmisten ja eläinten kasvainten tyypitys, kiertävien onkofetaaliantigeenien seulonta kasvainpotilaissa ja kasvaimen erilaistumismerk-kiaineiden analyysi.

Kasvaintyypitys on erityisen mielenkiinnon kohtee-10 na. On olemassa neljä perustyyppiä kasvainluokkia: karsi-noomat, lymfoomat, leukemiat ja sarkoomat. Jokaisessa on useita alaluokkia. Onkofetaaliantigeeneja voi esiintyä eri kudoksissa. Esimerkiksi tietyt onkofetaaliantigeenit saattavat esiintyä paksusuolisyövässä ja eri onkofetaalianti-15 geenit rintasyövässä. Siten voidaan valmistaa tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden paneeleja, joiden avulla voidaan nopeasti suorittaa seulonta ei vain tietyn onkofetaaliantigeenin läsnäolon varmistamiseksi vaan myös sen luokittelu karsinoomaksi, lymfoomaksi, 20 leukemiaksi tai sarkoomaksi sekä edelleen lähdekudos (paksusuoli, rinta jne.)

Siten tätä keksintöä voidaan käyttää testipakkausten valmistamiseen mainittujen sovellutusten suorittamiseksi. Nämä testipakkaukset saattavat sisältää pakkauksen, , 25 joka on jaettu lokeroihin, joihin lähekkäin mahtuu yksi tai useampia astioita, ja joissa ensimmäinen astia saattaa sisältää (esimerkiksi) tämän keksinnön mukaisen monoklo-naalisen vasta-aineen liukenemattomassa muodossa ja toinen astia saattaa sisältää saman tai eri monoklonaalisen vas-30 ta-aineen liukoisessa, havaittavaksi leimatussa muodossa. Sitten käyttäjä voisi suorittaa tietyn onkofetaaliantigeenin immunometrisen määrityksen. Joukko astioita, jotka sisältävät vaihtelevia pitoisuuksia onkofetaaliantigeenia, saattaisi olla mukana testipakkauksessa, jolloin käyttäjä 35 voisi valmistaa vakiokalibraatiokäyrän.

li 23 92222

Lisäksi kasvaintyypityksen mahdollistamiseksi testipakkaus saattaa sisältää sarjan astioita, jotka sisältävät ennalta määritettyjä, erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita havaittavaksi leimatussa muodossa tai liukenemat-5 tomassa muodossa tai molemmissa muodoissa niin, että nopea seulonta ja erilaistumismääritys voidaan suorittaa tietylle ihmisen kasvainnäytteelle (kuten koepalalle jne).

Nyt kun tämä keksintö on yleisesti kuvattu, se voidaan paremmin ymmärtää tiettyjen spesifisten esimerkkien 10 perusteella, jotka on otettu tähän mukaan tarkoituksena vain valaista keksintöä, eikä niiden tarkoiteta rajoittavan keksintöä, jollei toisin ole mainittu.

Esimerkki I

Tässä esimerkissä kuvataan menetelmät, joilla voi-15 daan menestyksellisesti kehittää useita hiiren alkioanti-geeneja vastaan muodostettuja monoklonaalisia vasta-aineita; nopean monoklonaalisten vasta-aineiden seulontasystee-min aikaansaaminen kokonaisia hiiren sikiösoluja käyttäen; monoklonaalisten vasta-aineiden isotyyppien määrittäminen 20 ja niiden spesifisyyden EA:a sisältäville kudoksille ja soluille selvittäminen; ja kiinteäfaasi-ELISA-menetelmän kuvaus solun pintaan liittyvää EA:a vastaan muodostetun monoklonaalisen vasta-aineen tiitterin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Epitoopin havaitaan esiintyvän ihmisen ja 25 hamsterin samoin kuin hiiren sikiössä ja joukossa jyrsijöiden kasvaimia.

Materiaalit 1a menetelmät

Kemikaalit

Hanker/Yates, fenyylihydratsiini ja dimetyylisulf-30 oksidi (DMSO) hankittiin kaupallisesti.

Solut

Hiiren magrofaagisolulinja RAW 264.7 kasvatettiin Dulbeccon väliaineessa, joka sisälsi 10 % vasikan sikiön seerumia (CS), 2 mmol/1 L-glutamiinia ja 0,045 % natrium-35 bikarbonaattia. Suodatettua, näiden solujen yhdistetyistä 24 92222 viljelmistä saatua viljelyväliainetta käytettiin täydentämään hybridoomakasvuväliainetta. Hiiren L-solut kasvatettiin Eaglen välivaiheessa, joka sisälsi minimimäärät tarpeellisia aineita, (Eagle's minimum essential medium) ja 5 joka sisälsi Eaglen suolat täydennettynä 5 %:lla naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mmol/1 L-glutamiinilla ja 0,045 % natriumbikarbonaatilla. WF5-1-SV40:llä indusoidut hamsterin (LVG) sarkoomasolut ja mKSA-solut, jotka ovat SV40:llä transformoidusta hiiren (Balb/c) sarkoomasta, 10 kasvatettiin 199-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 % FBS:llä, 2 mmol/1 glutamiinilla ja 0,045 % natriumbikarbonaatilla, GD-36-solut, SV40-transformoidut hamsterin (LVG) lymfoomasolut ylläpidettiin RPMI 1640 -väliaineessa, joka sisälsi 10 % FBS:a, 2 mmol/1 L-glutamiinia ja 0,045 % 15 natriumbikarbonaattia.

Hvbridisoluien fuusioissa käytettyjen C57BL/6n-hii-rien immunisointiprotokollat

Yritykset selvittää tuottoisinta immunisointiproto-kollaa stimuloida humoraalinen vaste sikiöantigeeneilla 20 syngeenisissä urosvastaanottajissa tehtiin käyttäen seit semää erillistä eläinryhmää, jotka saivat pitoisuuksia kokonaisten, syngeenisten 12-päiväisen raskausajan sikiö-solujen uutteita 3 mol/1 KCl:ssa, eri tavoilla annettuna ja/tai eri injektioiden aikatauluja käyttäen. Immunisoin-25 tia varten sikiösolut otettiin talteen ja dispergoitiin, kuten Coggin et ai., Advanced Cancer Research 19 (1974) 105, ovat kuvanneet. Entsyymidispergointia ei käytetty koskaan. Kuten taulukossa 1 on esitetty, hiiriryhmät sai- 7 6 vat joko suuria (10; tai pieniä (10°) pitoisuuksiasyn-30 geenisiä, kuolettavasta säteilytettyjä (5000 R, 1290 mC) raskausajan keskivaiheen (10 - 12 päivää) hiiren sikiö-soluja.

25 92222

Taulukko 1 a

Immunisointiryhmät immuunipernasoluien (C57Bl/6n) stimuloimiseksi slklödetermlnanteille (EA:t) 1. (SH) = ryhmä, joka sai lyhyen aikaa suuren an-5 noksen. Kaksi 10^ elävää, 13 päivän C57BL/6n-sikiösolua sisältävää annosta annettuna vatsaonteloon yhden viikon välein. Yksi samansuuruinen tehosteannos kolmen viikon kuluttua viimeisestä annoksesta ja kolme päivää ennen pernasolujen talteenottoa fuusiota varten.

10 2. (SL) = ryhmä, joka sai lyhyen aikaan pienen annoksen. Sama kuin nro 1 paitsi että käytettiin 10° elävää, 13 päivän C57BL/6n-sikiösolua.

3. (CFA Ms) = ryhmä, joka sai annoksensa Freundin täydellisessä adjuvantissa, joka sisälsi Mycobacterium 15 smegmatitis -bakteeria. Yksi annos Freundin täydellistä adjuvanttia ja pakattuja sikiösoluja sekoitettuna 1:1 (v/v) annettuna 0,03 ml kummankin takajalan anturaan ja 0,04 ml ihon alle keskiselkään. Viikon kuluttua siirros-tukset toistettiin käyttäen Freundin epätäydellistä adju- 20 vanttia. Vain soluja sisältävä lopullinen tehosteannos annettiin kolmen viikon kuluttua.

4. (CFA Mt) = ryhmä, joka sai annoksensa Freundin täydellisessä adjuvantissa, joka sisälsi M. tuberculosis -bakteeria. Sama kuin nro 3 paitsi että käytettiin eri My- 25 cobacterium-lajia.

5. (LH) = ryhmä, joka sai pitkän aikaa suuren annoksen. Sama kuin SH-ryhmä, mutta annettiin viisi viikottaista annosta ennen lopullista tehosteannosta.

6. (LL) = ryhmä, joka sai pitkän aikaa pienen an- 30 noksen. Sama kuin SR-ryhmä, mutta annettiin viisi viikot taista annosta ennen lopullista tehosteannosta.

a) Neljä (4) täysikasvuista (viisiviikkoista) C57BL/6n -uroshiirtä ryhmää kohti.

35 b) Immunisointiin käytetyt sikiösolut olivat kaikki 13 päivän syngeenisiä soluja, jotka oli valmistettu äskettäin ja jotka olivat saaneet 5000 R (1290 mC) röntgensäteitä ennen injektioita.

26 92222

Taulukko 1 (jatkuu) 7. (3M KC1) = ryhmä, joka sai 3 mol/1 KClilla liu koiseen muotoon saatettuja sikiösoluja. Kaksi annosta 13 5 päivän C57BL/6n-sikiösolujen 3 mol/1 KC1 -uutetta annettiin vatsaonteloon annoksina 700 μΐ proteiinia ja vastaavasti 450 μΐ proteiinia. Lopullinen, 100 μΐ proteiinia sisältävä tehosteannos annettiin suoneen.

10 Solut annettiin joko kaikkiaan kolmen injektion, mukaan lukien lopullinen tehosteannos, lyhytaikaisena sarjana tai kaikkiaan kuuden injektion pitkäaikaisena sarjana. Kaksi muuta ryhmää saivat sikiösolut Freundin adju-vantissa, joka sisälsi joko Mycobacterium smegmatitis tai 15 M. tuberculosis -bakteereja, jonka jälkeen seurasi tehos-teinjektio sikiösoluilla ja Freundin epätäydellisellä ad-juvantilla ja lopullinen, pelkästään sikiösoluja sisältävä tehosteannos. Adjuvantit sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen pakattuja soluja ja 0,03 ml antigeenivalmistetta 20 annettiin kummankin takajalan anturoihin ja 0,04 ml annettiin ihon alle jokaisen hiiren selkään. Yksi hiiriryhmä immunisoitiin kahdella vatsaonteloon annetulla injektiolla, jotka sisälsivät 3 mol/1 KCl:lla liukoiseen muotoon saatettuja kalvoja pitoisuudessa 0,5 mg proteiinia hiirtä 25 kohti, jonka jälkeen seurasi lopullinen 0,1 mg:n tehosteannos suoneen annettuna. Kaikki lopulliset tehosteannokset annettiin 2-3 viikon kuluttua viimeisestä immunogee-ni-injektiosta. Herkistetyt pernasolut otettiin talteen kolme päivää lopullisesta tehosteannoksesta.

30 Hvdridoomavilielmät

Hydridoomasolut valmistettiin fuusioimalla hiiren myelooma, P3X63Ag8.653, ja pernasolut, jotka saatiin täysikasvuisista C57BL/6n-uroshiiristä, jotka oli immunisoitu kuolettavasti säteilytetyillä, raskauden keskivaiheen syn-35 geenisillä vastaavilla sikiösoluilla. Fuusiot suoritettiin käyttäen Kohlerin ja Milsteinin menetelmän [Nature

II

27 92222 256 (1975) 495] muunnelmaa käyttäen solusuhdetta 1:10 hiiren myeloomasolujen suhde pernasoluihin 50 % (v/v) poly-etyleeniglykoli 4000:ssa. Hybridisolut valittiin käyttäen RPMI 1640 -väliainetta, joka sisälsi hypoksantiinia, ami-5 nopteriinia, tymidiiniä, 15 % FBS:a, 2 mmol/1 L-glutamii-nia, 0,045 % natriumbikarbonaattia ja 50 pg/ml gentamy-siiniä (HAT-väliaine). Solut ympättiin 96-kuoppaisille, 5 tasapohjaisille Linbro-levyille pitoisuudessa 3,5 x 10 solua kuoppaa kohti. Sen jälkeen kun hybridisolut oli 10 siirretty 24-kuoppaisille Linbro-levyille, niitä ylläpidettiin RPMI 1640 -väliaineessa, jota oli täydennetty hy-poksantiinilla, tymidiinilla, 15 % FBS:11a, 2 mmol/1 L-glutamiinilla, 0,045 % natriumbikarbonaatilla ja genta-mysiinillä (HT-väliaine). Siirtoväliaine oli myös täyden-15 netty 10 %:n tilavuudella suodattamalla steriloituja mak-rofaagisolulinjan RAW 264.7 72 tunnin viljelyn superna-tantteja (HAT + RS-väliaine). Viljelysupernatanteissa olevat sikiöperäisiä determinantteja vastaan muodostuneet vasta-aineet mitattiin, kun hybridiviljelmät olivat täysin 20 sopeutuneet ja ne voitiin helposti siirtää in vitro.

Massahvbridoomavilielmien kloonaus monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hvbridoomien tuottamista varten

Massahybridoomapesäkkeiden kloonaus suoritettiin terminaalisella laimennuksella HT-väliaineessa, jota oli 25 täydennetty 10 % RAW 264.7 viljelysupernatanteilla. Sata (100) ja kaksi sataa (200) hybridisolua massaviljelmästä suspendoitiin 10 ml:aan yllä mainittua kloonausväliainetta ja jaettiin 96-kuoppaiselle levylle, jossa oli 100 μΐ HAT + RS -väliainetta/kuoppa. Sitten kloonit siirrettiin 24-30 kuoppaisille levyille ja myöhemmin kypsät pesäkkeet määritettiin niiden anti-EA-aktiivisuuden suhteen. Uudelleen-kloonaus suoritettiin kerran tai useamman kerran kullekin hybridoomalle.

Monoklonaalisen vasta-aineen immunoalobuliiniluokka 35 Kaksoisimmunodiffuusiomääritystä käytettiin mono- , · · 28 92222 klonaalisen vasta-aineen immunoglobuliiniluokan selvittämiseksi. Viisi millilitraa l,5-%:ista agaroosia, joka sisälsi 2,5 % polyetyleeniglykoli 4000:ta, sulatettiin kiehuvassa IVOissa ja tasapainotettiin sen jälkeen 56 °C:seen 5 15 minuutin ajan. Sitten agaroosiliuos kaadettiin immuno- diffuusiolevylle (Miles Laboratory, Inc.) ja sen annettiin jähmettyä 25 °C:ssa kolmen minuutin ajan. Agaroosiin leikattiin 5 mm:n kaivot siten, että keskuskaivoa ympäröi symmetrisesti kuusi kaivoa. 10 μΐ 25-kertaisesti konsent-10 roitua monoklonaalisen hybridooman supernatanttia annosteltiin keskuskaivoon ja 10 μΐ kuutta anti-hiiri-immunog-lobuliini-seerumia, nimittäin anti-IgG.^:tä, anti-IgG2:ta, anti-IgG2Q:ta, anti-IgG^: tä, anti-IgG^ia ja anti-IgM:ää (Miles Laboratory, Inc.), annosteltiin ympäröiviin kalvoi-15 hin. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 25 °C:ssa ja niitä tarkkailtiin päivittäin presipitaativiivojen havaitsemiseksi. Normaalia hiiren seerumia ja P3X63 Ag8.653 -viljelysuper-natanttia käytettiin positiivisena ja vastaavasti negatiivisena kontrollina.

20 Immunosuodatus-ELISA:n laitteisto

TM

Reusable Microfold -laitteistoa V and P Scientific, Inc. -yhtiöstä, San Diego, Kalifornia, käytettiin ELISA-menetelmän suorittamiseksi. Lasikuitusuodatinpaperia V & P Scientific -yhtiöstä käytettiin kohdesolujen pyydys-25 tämiseksi ja kiinnittämiseksi paikoilleen. Suodatinpaperia esikäsiteltiin 2-%:isella gelatiinilla, joka sulatettiin pois kuoppien alta kuumalla vedellä (90 °C) ennen solujen pipetointia.

Immunosuodatus-ELISA:n kohdesolut 30 ELISA-menetelmässä käytetyt kohdesolut olivat äs kettäin talteenotettuja, kerran synnyttäneistä ja samaan aikaan pariutetuista naaraista peräisin olevia 12 - 13 päivän raskausajan C57BL/6n-sikiösoluja. Kokonaiset, elävät sikiöt poistettiin aseptisesti kohdusta ja pestiin 35 perin pohjin 5 kertaa Hankin tasapainotetulla suolaliuok- 29 92222 sella (HBSS), pH 7,0, ennen kuin ne puristettiin 20 gaugen neulan läpi tuoreeseen HBSS:ään 37 °C:ssa. Sen jälkeen kun soluja oli varovasti pipetoitu 2-3 kertaa, ne suodatettiin steriilin, 4x4 -suuruisen puuvillaisen harsokangas-5 tyynyn läpi jätteiden poistamiseksi. Solut pestiin HBSS:ssä sentrifugoimalla hitaalla nopeudella, minkä jälkeen ne laskettiin ja 5 x 10^ solua suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan 0,05-%:ista fenyylihydratsiinia fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), 10 10 mmol/1, pH 7,4, ja suspensiota inkuboitiin 30 minuuttia 25 °C:ssa endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden inhiboi-miseksi. Sitten käsitellyt solut käytettiin suoraan ELISA:ssa.

Suodatus-ELISA:ssa käytetyt viljellyt kasvainsolu-15 linjat suspendoitiin raaputtamalla solut pulloista ja dis-pergoimalla ne pipetoimalla. Sitten solut pestiin kahdesti HBSS:llä, ennen kuin ne suspendoitiin uudelleen fenyyli-hydratsiiniliuokseen.

ELISA- (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay)

TM

20 -määritys Reusable Microfold -laitteistoa käyttäen Käytetty immunosuodatus-ELISA-menetelmä oli epäsuora immunoperoksidaasireaktio. Fenyylihydratsiinilla käsitellyt sikiösolut laitettiin 96-kuoppaiseen Reusable TM 4

Microfold -laitteistoon pitoisuudessa 5 x 10 solua 25 kuoppaa kohti. Solut kiinnitettiin vakuumin avulla lasi-kuitusuodattimen päälle laitteen keski- ja yläosien väliin laitettuna. Suodatinpaperi esikäsiteltiin gelatiinilla (3 %) kuoppien välisen reaktioiden ristikontaminaation estämiseksi. Gelatiini poistettiin yksittäisistä suodatus-30 kanavista antamalla kuuman veden kulkea gelatiinilla käsitellyn suodattimen läpi ennen käyttöä. Soluja inkuboitiin 50 μ1:η kanssa normaalia vuohen seerumia (NGS) 20 minuutin

ajan 25 °C:ssa ja NGS poistettiin vakuumin avulla Reusable TM

Microfold -laitteistossa olevista soluista. Sitten jokai-35 seen kuoppaan lisättiin 100 μΐ hybridisolupesäkesuperna- 92222 30 tanttia ja inkuboitiin 60 min:n ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut käsiteltiin vakuumilla, pestiin paikoillaan laitteessa kuusi kertaa 250 pl:lla PBS:ää, joka sisälsi 5 % CS:ää, ennen kuin lisättiin 100 μΐ peroksidaasilla 5 konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG - ja -IgM-seerumia (af-finiteettipuhdistettu, absorboitu ihmisen seerumilla, KPL, Incorporated, Gaithersburg, Maryland). Peroksidaasilla konjugoitua antiseerumia käytettiin laimennoksena 1:300 PBS:ssä, joka sisälsi 5 % CS:ää. 30 minuutin inkuboinnin 10 jälkeen 25 °C:ssa solut pestiin kolmesti PBS + CS -seoksella ja kolmesti Tris:llä puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, 10 mmol/1, pH 7,4, (TBS). Näytteisiin lisättiin 100 μΐ Hanker/Yates-reagenssia (8 mg/10 ml TBS) ja 0,03 % H2^*2:a reaktiota tarkkailtiin 30 minuutin ajan. 15 Positiiviset reaktiot käsittivät tumman, mustanruskean sakan muodostumisen. Reaktiot pysäytettiin 25 pl:lla 4 N HoS0.:a ja kuivattiin vakuumilla suodatuslaitteistossa. Vierekkäin olevat negatiiviset ja positiiviset kuopat voitiin helposti erottaa toisistaan. Suodatinpaperi voitiin 20 myös säilyttää pysyvänä todisteena ja uusi gelatiinilla käsitelty suodatin laitettiin laitteistoon välitöntä uudelleenkäyttöä varten.

Kiinteäfaasi-ELISA ( Enzyme-Linked-Immunosorbent-

Assav) 25 Monoklonaalisen anti-EA-vasta-aineen titraus 5 ELISA:11a suoritettiin seuraavasti. 100 μΐ 5 x 10 äskettäin talteenotettuja kokonaisia, pestyjä (viisi kertaa) C57Bl/6n-sikiösoluja kiinnitettynä 0,2-%:iseen puskuroituun glutaraldehydiin, joka sisälsi 1 % BSA:a, lisättiin 30 jokaiseen tasapohjaisen polyvinyylikloridi-mikrotiitteri-levyn kuoppaan ja inkuboitiin 2-3 tuntia 25 °C:ssa. So-lususpensiliuos sipaistiin pois ja 100 μΐ 50-%:ista NGS:a lisättiin kuoppaa kohti ja levyä säilytettiin 4 °C:ssa käyttöön asti. ELISA-menetelmä aloitettiin poistamalla 35 50-%:inen NGS-seos ja 100 μΐ monoklonaalista hybridoomasu- 31 92222 pernatanttia, joka oli laimennettu PBS - l-%:isella BSA-seoksella (2-kertainen sarjalaimennus) lisättiin jokaiseen kuoppaan ja levyjä inkuboitiin huoneenlämpötilassa yli yön. Menetelmä suoritettiin tästä lähtien kuten normaali 5 epäsuora ELISA inkuboiden kahden tunnin ajan peroksidikon-jugaatin (laimennettu 1:500) kanssa. 30 minuutin kuluttua kromogeenin lisäyksestä ABTSrää ja 1^02:a lisättiin perok-sidaasireaktion aktivoimiseksi, levyt luettiin Multiscan ELISA -spektrofotometrillä 414 nm:n valon aallonpituudelle la. Sikiösolukalvoja, jotka oli valmistettu kuten Coggin, Cancer Research 39 (1979) 2752; tai Coggin, Methods in

Cancer Research XVIII (1979) 371 - 389, on kuvannut, voitiin myös käyttää.

Hybridipesäkkeiden seulonta vasta-aineiden EA-spe-15 sifiswden suhteen

Hybridipesäkesupernatantit, jotka olivat positiivisia kohdesikiösoluille, seulottiin spesifisyyden suhteen absorboimalla hybridoomaviljelysupernatantit vastasyntyneen tai täysikasvuisen hiiren (C57BL/6n)) kudosten so-20 lususpensioilla. Täysikasvuisen hiiren aivot, lihas, sy dän, maksa ja munuaiset kerättiin ja laitettiin HBSS:ään, pH 7,4. Näiden kudosten solut dispergoitiin puristamalla ne hienolankaisen 40 mesh:n seulan läpi ja pestiin kahdesti HBSS:llä. Kolmentoista päivän sikiösoluja kerran syn-25 nyttäneistä luovuttajista käytettiin EA-positiivisena kontrollina. Sikiösolujen vakioabsorptiokäyrä valmistettiin käyttäen 1 x 10^ - 3 x 10® solua 200 μ1:η kanssa tiettyä monoklonaalista supernatanttia. Jokaisen absorptio-näytteen absorbanssilukemaa verrattiin saman monoklonaali-30 sen supernatantin absorboimattomalta titrauskäyrältä saa tuun vastaavaan absorbanssiin. Laimennosten lukumäärän ero laskettiin ja poistetun aktiivisuuden suhde määritettiin 50-%:isella poistolla laimennosta kohti (tämä tarkoittaa, yksi laimennos, 50 %; 2 laimennosta, 75 %; 3 laimennosta, 35 87,5 %, jne). Sitten vakioabsorbanssi esitettiin graafi- • 32 92222 sesti käyttäen poistetun aktiivisuuden prosenttisuutta solujen lukumäärää kohti.

Myös monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyys sikiösolujen suhteen ja kasvaimien pinnalla olevien, ris-5 tireagoivien OFA:iden osoittamisen suhteen testattiin kiinteäfaasi (SP)-ELISA:a käyttäen. Kohdesoluina käytettiin jyrsijäin kasvainsolulinjoja, jotka oli dispergoitu ei-entsymaattisesti. Jokaiselle jyrsijäin kasvainsolulin-jalle määritettiin sikiösoluekvivalentti-absorptioarvo 10 vertaamalla poistettujen aktiivisuuksien prosenttia vastaavaan saman lukumäärän sikiösoluja avulla poistetun aktiivisuuden prosenttiin. Nämä solutyypit sisälsivät hiiren SV40-transformoidun mKSA-linjan samoin kuin hamsterin SV40-transformoidut WF5-l-ja GD-36-linjat.

15 Tulokset

Aikaisemmassa työssä (Coggin, J. et ai., Ciba Foundation Symposium (toim. ), Embryonic Antigens in Malignancy and Pregnancy: Common Denominators in Immune Regulation, Lontoo: Pitman Books, sivut 28 - 54, havaittiin, että 10 20 päivän raskausaikaisia hamsterin sikiösoluja vastaan saatu polyklonaalinen, in vivo absorboitu, ksenogeeninen anti-seerumi saosti immunologisesti sikiöspesifiset polypepti-dit 12 - 13 päivän hiiren tai 10 päivän hamsterin sikiösolujen 0,5-%:inen Nonidet-P-40- ja 3 mol/1 KC1 -uutteista. 25 Useita selviä sikiöspesifisiä polypeptidiviivoja esiintyi SDS-PAGE-määrityksessä. Monoklonaalisen vasta-aineen saamisen mitä tahansa näitä EA-determinantteja vastaan odotettiin olevan vaikeaa, sillä herkistämispyrkimykset käsittäisivät immunisoinnin syngeenisillä sikiösoluilla. 30 Raskaana olevat, syngeenisesti pariutetut naarashiiret ja -hamsterit saattaisivat olla hyvä EA-herkistettyjen B-so-lusplenosyyttien lähde hybridoomafuusiota varten, mutta aikaisemmissa tutkimuksissa näissä pernakudoksissa oli havaittu estäjäaktiviteettia anti-EA-immuunivasteita vas-35 taan ja tämä saattaisi rajoittaa hybridooman kehittymistä.

« 33 92222

Syngeenisesti pariutettuja, raskaana olevia Balb/c-hiiriä käytettiin toistuvasti EA-herkistettyjen haimasolu-jen lähteenä fuusioon ja hybridooman tuottamiseen, eikä stabiileja hybridoomia saatu. Edelleen kokonaisten, sätei-5 lytettyjen, syngeenisten sikiösolujen tai näiden solujen liukoisten uutteiden injektoiminen LSH-hamstereihin pyrkimyksenä saada hamsteri: hiiren P3X63Ag8.653 -myeloomaso-luhybridejä syngeenisillä sikiösoluilla herkistettyjen hamsterin pernasolujen kanssa epäonnistuivat. Lisäksi 10 Balb/c-hiiret osoittautuivat myös varsin huonoiksi vastaajiksi syngeeniselle sikiölle, vaikka muutamia anti-EA+-reaktiivisia hybridoomia saatiinkin EI-määritystä 12 dmfc -soluja kohdesoluina käyttäen. Valitettavasti näitä hybridoomia ei voitu siirtää in vitro.

15 Pyrkimys onnistui kuitenkin C57Bl/6n-hiirellä.

Säteilytetyillä 12 dmfc -soluilla immunisoidut C57Bl/6n-hiiret osoittautuivat erinomaisiksi pernasolujen lähteeksi haluttujen anti-EA-immunoglobuliinia tuottavien hybridoo-mien tuottamiseksi. Kuten taulukossa 2 on esitetty, huo-20 mättäviä määriä hybridipesäkkeitä, jotka tuottivat vasta-ainetta EA+-12 dmfc -soluja vastaan EI-määrityksessä, saatiin 12 dmfc -soluille herkistettyjen C57Bl/6n-hiirien pernasolujen fuusioista.

34 92222 Ή \ I 1-1 C Λ C I :(τ) id <U id 0) 3 > esi tn ^ cu a; i

H «1 li A! 3 H

. C *rl r—I I—I ·—I tC

"A Iti .C Γ-l nti <q x h -n e e U e P <U Id id

C nti i—I C Ή Id C

(U > O O > IM · ·—I S -H

rt *H C/3 'rl -H CN E-ι H id d)

c 3 ild lO H O -'Id \ \ > H

<u h a h a O' n o z o ω ,c HO Ai H Iti nti Id0 (/] M ' N τ) O Φ lid Ai Ai

I h w m H S

2 O 4J Id "S Id -Π CL H C >3

CL' Ό C I <U -H r—I

&) σι Ο X) I -h 3 0 r-H<U(di-i> h tn bi e ’id -h h :o

^ >1 ID n O O -H

(Λ < H H O' «d ha:

Dl) C H C Iti Π <N · H H H

e >1 *h o oi iid cn E-· i—i · ,q cn :id tn ω ci) h m iid \ \ e id !<d P Iti Ai H S CM Z ι-l Q) +j q H P H o a C P cn i—i cutniid <u 8 tn Ό h tu Ai x >

HO id 3 O O 3 i—I (ti H

H H > X en x H Ild -n ild tn H -n a a) id i a) o E i i i tn i e h cn o

Id H H P H Φ H llti Ild i—I r—I f—I

tn O nti H O H H H g H

tn o> -n o tp\ > m r-i>i(d>: o <d ui id nti o nti <u > h -n <u G I <U H Ai S H td Ο 13

H >i O M Ild H 3 φ H H M

“ h ή m id ^ CHiid id iid O) S id E -n 3 φ φ a: nti

h a: -n -p tn p h e h id E

h φ h tn a: e M-ι oh <u 3 ·· cn H (N e P 0) 3 LD · H h Li x C > h m h -n di oi H ,—i tntni3

,WC0Ai3-rl\ . r—I p -H < H

™H<VXGGjJ£ cv z \ · 3 iti M en

HCHOCtDHHCN H C H a H H

Ow-Hidtutu-Hidti) h φ a H (ti

X I G ^ >1 -n > +J -n H iti O W C

x « «o H tn 3 O

3 3 h <d ta m x id x "" H H Cl — > ω I H o H nj h e <u 3 ,jp φ ^ cn Ai

Ρ Ό O Φ Ό H ^ e (N -H

o} o tn h -h tn id h > e p_, P O > 01 -H 105 H 3 id H 0)

^ tn Ή ^ id C| ^ —H -H H HO

O e o Ai e nti in o co ,c i—i tn h h C (U O' nti o i<d n in cp o «d O h tu G G ta en X s — — -- a: > H tn a:

S η φ φ o p cn LO h tn i e o X

8 > (¾ Oi Ai Ai cn *3· -H H H Qi iid •rl -H r% -H tn h h S tn m ai

Id H C C I H a

H H φ Φ 3 WHildC

5 » "'OH, Ai Id tn lid C

OO ph tnu >, > tn iid tu H Oi H CU -H Ild id -H H *n 3HA!(dO H > Cn C 3

φ iti a! e nti en o cNudcnCHH

tnoHiidond lo m cn S id φ .e h 3 h tn tn Ai S i—i t—t x x iid -h

AiEtUCUOP tu >8 r-t Ό tr< Qt X X H id H -3 <d — <u a; nd H o ^ ^ ^ ^ CH>idQi cc cc a> o h > \

Φ CU CU ω Λ 8 -Γ-ι >1 H H

Ό -n -π Ό I nti H O CU

rl 3 3 H tn Li id H H Φ CU H H CU H Ild -n H ild e Ai a; O H Ai id (td n cn <3· (utnidAi ;· AI tn -H Ai C S cn cn ^31 H Φ iid iid iO 8 iid O P h i-ι h Ai id id tn W ‘Ί '3 £ -¾ -¾ H A Ai Ji J) (UAiOtUOP (ti nti H H a ft -H dl Q| A H I cätnoo·

id cn :0 ‘rl tu Ή -n ild H

tn C.H m a tn ω inci "Π ® id - ·> tn tn

Id CU H (LrX I HBHHCU H

8h hi C-h i id ‘ri h idOtuid®((d>>,

Id -H C Id Η (β I HrHQi U SOtUtnCUHHH

S -h h h id h ie id p W ό a: en h h ,q

O -C O H X ” O A H rl OHAitUAicUHlU

O tn o -H (ti H -H id O (0 H U> M «ti φ nti H Ai H

Ό e η Aiid id m ή (tiSinp \ H λ tn e t» > id

Η Ild C 0 Ild H y Q| H iO 3 H Id >1 O H <U ild <U H

h > P h § >1^ ρω >,vhw o ^EcuiddiAiciw

Λ H g O 5 .C ^ H 3 XCAi-rlS

.. >, Ild E H >, >1 O OP >1 <U H o ^ ^ S ft h a H JA tn tn J e tn h m <a X) υ Ό cum 35 92222

Suuria eroja havaittiin eri immunisointiprotokol-lien tehokkuudessa saatujen hybridoomien lukumäärän perusteella arvioituna. Immunisointi sekä kokonaisilla sikiöso-luilla suurta annosta ja lyhytaikaista immunisointimene-5 telmää käyttäen että 12 dmfc -solujen 3 mol/1 KCl-uutteel-la johti korkeimpiin anti-EA-hybridoomalukumääriin, joilla saatiin positiiviset ELISA-reaktiot syngeenisiä 12 dmfc -soluja vastaan ΕΙ-seulontamäärityksessä. Glassy et ai.’n, J. Immuno. Methods 58 (1983) 119, ELISA-immunosuodatus 10 (EI) -määrityksellä voitiin osoittaa ja nopeasti seuloa vasta-aine niitä EA-determinantteja vastaan, joita esiintyi 12 päivän raskausaikaisissa hiiren sikiösoluissa, sillä edellytyksellä, että endogeeninen, solussa oleva pe-roksidaasi estettiin riittävässä määrin vuohen seerumilla 15 ennen testattavan hybridoomasupernatantin lisäystä (katso menetelmät-osa yksityiskohtia varten). Täysikasvuisen hiiren kudokset 19 päivän, EA" [Weppner, W. A. ja Coggin, J.

H., Cancer Res. 40 (1980) 1380] raskausajan loppuvaiheen sikiöperäiset hiiren solut eivät reagoineet minkään hybri-20 doomasupernatantin kanssa. Varovaisuutta täytyi noudattaa valittaessa oikeat kromogeenipitoisuudet korkeiden tausta-tasojen välttämiseksi. Eivät adjuvanttia käyttävät immuni-sointiprotokollat sikiösoluilla eivätkä pitkäaikaiset, useita inokulaatioita sisältäneet protokollat olleet me-25 nestyksellisiä tuotettaessa sopivia anti-EA-hybridoomia.

Taulukossa 2 on esitetty myös anti-EA-vasta-ainetta sisältävien alkuhybridoomapesäkkeiden eloonjääminen jatko-viljelyn jälkeen. Vaikka kaikkiaan 201 pesäkettä (70 %) jäi eloon jatkoviljeltyinä 24-kuoppaisilla muovilevyillä 30 ja kasvoi HT-väliaineessa, joka oli täydennetty RAW 264.7-solusupernatanteilla, suuri joukko pesäkkeitä kuoli myöhemmin, kun hybridisolut stabiloituivat. Seuranneet yritykset, jotka suoritettiin ilman 10 % RAW-supernatantti-täydennystä, osoittivat, että normaalit lymfosyyttejä ra-35 vitsevat solut eivät olleet kyenneet stabiloimaan hybri-doomia. Tulokset, jotka saatiin kudosviljelyn läpikäynei- 36 92222 den hybridoomapesäkkeiden alkuseulonnasta niiden spesifisen sitoutumisen suhteen kerran synnyttäneestä naaraasta peräisin oleviin syngeenisiin EA+ 12 - 13 päivän hiiren sikiön soluihin (12 dmfc -solut) EI-määrityksessä, on esi-5 tetty taulukossa 2. Kaikki taulukon 2 sarakkeen 4 positiiviset hybridoomapesäkkeet, jotka tuottivat anti-EA-vasta-ainetta, reagoivat EA+-sikiösolujen kanssa vähintään kolmessa erillisessä ELISA-kokeessa kolmella peräkkäisellä kloonaamattomalla hybridoomajatkoviljelmällä. Kun vasta- g 10 syntyneen tai täysikasvuisen hiiren soluja (10 /ml) sus-pendoitiin vasta-aineeseen ja käytettiin absorptiokohde-soluina ennen testausta EI-määrityksellä 12 dmf -kohdeso-luilla (sarakkeet 5 ja 6, taulukko 2), hybridoomat yhdenmukaisesti eivät reagoineet näiden ei-sikiöperäisten ku-15 dosten kanssa eivätkä absorption jälkeiset vasta-ainetiit- terit muuttuneet. Täydellinen vasta-aineiden absorptio EI- 6 8 määrityksellä havaittuna saatiin kuitenkin 10 - 10 12 dmfc -soluilla.

Näiden alkuperäisten hybridoomien kloonatuista hyb-20 ridoomista peräisin olevan monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyyden osoittaminen kuvataan seuraavassa osassa. Vedettiin se johtopäätös, että immunisointimenetelmät, joissa käytettiin lyhytaikaista, suuriannoksista menetelmää ja 3 mol/1 KCl-menetelmää, olivat parempia kuin kaikki 25 muut testatut menetelmät. Kolmekymmentäviisi alkuperäistä, kloonaamatonta hybridoomaviljelmää, jotka siirtyivät ku-dosviljelyyn RAW:11a täydennetyssä väliaineessa ja joilla saatiin positiiviset tulokset EA+-kohdesikiösoluja käyttävässä EI-määrityksessä valittiin satunnaisesti lisätutki-30 mukseen. Nämä jatkoviljeltiin ja määritettiin myöhemmin EA-spesifisyyden suhteen absorboimalla hybridoomasuper-natantit vastasyntyneen hiiren EA -kudoksen tai EA+ 12 dmfc -solujen asetonipulverin kanssa (taulukko 2). Positiiviset ELISA-reaktiot havaittiin EA+ 12 dmfc -kohde-35 soluilla vielä sen jälkeen, kun supernatantteja oli toistuvasti absorboitu vastasyntyneen C57Bl/6n-hiiren kudok-sen kanssa, 32:ssa 35:stä supernatanttiviljelmänesteestä, 37 92222 mikä osoittaa kloonaamattomissa viljelysupernatanteissa olevien anti-EA-vasta-aineiden suunnatonta spesifisyyttä. Anti-EA-reaktiivinen immunoglobuliini(t) poistui, kun suoritettiin yksi ainoa laimentamattomien hybridoomasuperna-5 tanttien absorptio EA+ 12 dmfcs -soluilla, 32:ssa 32:sta in vitro siirretyistä kloonaamattornista hybridoomista.

EA-determinanttia vastaan saatujen monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi ia titraus

Alussa saatiin kolme monoklonaalista vasta-ainetta 10 tuottavaa hybridoomasolulinjaa kloonaamalla lyhytaikaisesta, suuriannoksisesta immunisointimenetelmästä 12 dmfcs -soluja käyttäen peräisin olevia massapesäkkeiden soluja RAW-supernatanttitäydennystä käytettiin, kun saatiin nämä kloonatut solut. Yksi kloonattu hybridooma saatiin 3 mol/1 15 KC1 -ryhmästä ja yksi saatiin lyhytaikaisesta, matala-an-noksisesta ryhmästä. Kummankin kloonaus saatiin aikaan pesäkkeenmuodostuksella metyyliselluloosaan ja terminaalisella laimennuksella nestemäisessä väliaineessa. Seuraava kloonaus vielä yhtä loppupistelaimennus- ja yksisolueris-20 tys -menetelmiä käyttäen suoritettiin kautta koko tutkimuksen. Neljä monoklonaalista vasta-ainetta oli IgM-iso-tyyppiä ja yksi oli IgG-isotyyppiä. Kaikki viisi monoklo-naalisen vasta-aineen tuottajaa ovat yhdenmukaisesti tuottaneet vasta-ainetta, joka reagoi spesifisesti 12 dmfc 25 -solujen kanssa mutta ei täysikasvuisten solujen kanssa SP-ELISA:ssa monissa perättäisissä kokeissa. Isotyypin muuttumista (IgM IgG) neljän IgM:ää tuottavan monokloonin joukossa ei havaittu edes käänteisen viljelyshokin olosuhteissa. Yksikään vasta-aineista ei ristireagoinut vasikan 30 fetaaliseerumin tai tavallisen vasikan seerumin kanssa geelidiffuusio- tai SP-ELISA-menetelmässä edes 25-kertai-sesti konsentroituna.

Kvantitatiivista PVC-levyillä suoritettua SP-ELISA-menetelmää käyttäen viiden hybridooman supernatantin im-35 munoglobuliinit voitiin titrata tiitteriin >1024 neljän monokloonin kohdalla ja tiitteriin >2048 monoklonaalisen • vasta-aineen 155 (sh) kohdalla käyttäen kohdeantigeenina 38 92222 syngeenisiä 12 dmfc -soluja (kuvio 1). Hyvin samantapaisia tuloksia saatiin monilla monoklooneilla, jotka testattiin glutaraldehydillä kiinnitettyjä sikiösolukalvoja vastaan, jotka oli valmistettu aikaisemmin kuvatulla tavalla [Lef-5 fell, M. S. ja Coggin, J. H., Cancer Res. 37 (1977) 4112 ja Sijens, R. J. et ai., Hybridoma 2 (1983) 231 - 234] ja joita käytettiin kohdeantigeenina SP-ELI-SA:ssa.

Anti-EA-monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyys Viiden yllä luetellun monokloonin tuottamien viiden 10 vasta-aineen spesifisyys testattiin joko 13 dmfs-solujen tai raskauden loppuvaiheen (19 pv) hiiren sikiösolujen tai täysikasvuisen C57Bl/6n-hiiren solujen avulla tehdyn ab-sorboinnin jälkeen. Kuten kuviossa 4 on esitetty, mono-kloonille 69.1, joka tuottaa IgM:ää, yksi ainoa absorptio 7 15 10 13 dmfc-soluilla, mutta ei yhtä suurella määrällä täy sikasvuisen hiiren soluja, poisti IgM:n taustan tasolle, kun absorboitu supernatantti myöhemmin testattiin EA+ 12 dmfc -soluja vastaan SP-ELISA-määrityksessä. Toisessa kokeessa kahdentoista päivän raskausaikaiset sikiösolut 20 poistivat kaiken monoklooni 69.1:n aktiivisuuden vain 10° g solulla, kun taas 10 täysikasvuisen hiiren solua ei poistanut merkittävästi vasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty). Oleellisesti identtisiä tuloksia taulukossa 2 esitettyjen tulosten kanssa saatiin neljälle muulle monokloonil-25 le, kun kantasupernatantit (tiitterit yli 1024) laimennettiin siten, että saatiin 600 - 800 absorbanssiyksikköä (SP-ELISA) IgM:ää tai IgG:tä, ja absorboitiin kerran 5 x 6 7 10 tai 10 sikiösolun tai täysikasvuisen hiiren solulle.

Absorptiotulokset, jotka saatiin monoklonaalisille 30 immunoglobuliineille EA+-soluja tai -kudoksia käyttäen korreloivat täsmällisesti aikaisemmin havaittuun näiden • ' eri kudosten tai kasvainten potentiaaliin ristireagoida hiiren tai hamsterin sikiösolujen kanssa kudossiirtomääri-tyksissä (Coggin, J. H. ja Anderson, N. G., Adv. Cancer 35 Res. 19 (1974) 105, ja Coggin, J. H. ja Ambrose, K. R.,

Cancer Research Voluumi XVIII, ss. 371 - 389 (Academic • Press, New York, 1979) (taulukko 3).

I

39 92222

Taulukko 3

Monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyys siJciösoludeterminan-teillea absorptioanalyysin perusteella

Osoitetun kudoksen kapasiteetti poistaa 5 12 dmfc-solujen kanssa reaktiiviset monoklonaaliset vasta-aineet ELISA-määrityksessä

Absorptiokohdesolut (EA-esiintyminen)b_ KC158 SL13.1 SH115 SH38,46 SH69.1 10 13 pv C57-hiiren sikiösolut (EA+) + + + + + 10 pv LVG-hamsterin sikiö- + + + + solut (EA ) + + + + + + 10 vk ihmisen sikiösolut (EA ) + + + + + + 17 vk ihmisen sikiösolut (EA ) WF5-l-hamsterinsolut (EA+) + TC + + + ++ + lo mKSA-hiiren sarkoomasolut (EA ) GD- 36-hamsterin lymfocmasolut + + + + + (EA ) _ L-solut (EA?) BHK-solut (EA-) 16 pv C57-hiiren sikiösolut (EA ) 14 pv LVG-hamsterin sikiösolut - - 20 (EA-)

Vastasyntyneen C57Bl/6n:n solut ~ Täysikasvuisen C5 7-hiiren - - - - - solut (EA ) Täysikasvuisen hamsterin solut (EA ) - ~

Aikuisen ihmisen fibroblastit (EA )

Aikuisen ilmisen esinahka (EA?) - _ _ _ _ 25 Aikuisen ihnisen perifeerinen veri - - - -

Lymfosyytit (EA?) - - - 40 92222 a) Spesifisyys mitattiin kiinteäfaasi-ELISA:11a 12 dmfc -kohdesikiösoluja käyttäen senjälkeen, kun oli suoritettu yksi ainoa monoklonaalisten supernatanttien absorptio mainituilla absorptiokohdesoluilla.

5 b) Absorptiokohdesolut valmistettiin suspendoimalla solut ei-entsymaattisia menetelmiä käyttäen ja käsitellen niitä l-%:isella BSA:lla PBS:ssä. (EA+) = Solulinjat, joiden tiedetään aktivoivan T-lymfosyyttien välittämän kas-vainresistenssin. (EA ) = Solut, jotka eivät osoittaneet 10 aktiivisia kasvainresistenssiä. Identtiset tulokset voitiin saada asetonilla uutetuista sikiökudoksista tai täysikasvuisten kudoksista.

c) Yhtä suuret tilavuudet monoklonaalisia superna-tantteja ja pakattuja absorptiokohdesoluja sekoitettiin ja 15 inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa ja 18 tuntia 4 °C:ssa ennen käyttöä immunosuodatus-ELISA:ssa EA+-dmfc-soluja käyttäen.

d) +, osoittaa yli 400 absorbanssiyksikön vasta-ainetta täydellistä absorboitumista aallonpituudella 490 nm yhdessä ainoassa absorptiokokeessa; ELISA-reaktio ei 20 osoita 400 absorbanssiyksikön vasta-ainetta absorptiota yhdessä ainoassa absorptiokokeessa jättäen yli 350 absorbanssiyksikön suuruisen vasta-ainereaktiivisuuden 12 dmfc -kohdesoluja käytettäessä; NT tarkoittaa ei määritettyä.

e) Ei määritetty.

25 Monoklonaalista vasta-ainetta sisältävät superna- tantit reagoivat voimakkaasti ksenogeenisten LVG-hamsterin 10 pv:n EA+-sikiöperäisten kohdesolujen kanssa, mutta eivät näiden jyrsijöiden täysikasvuisten kudosten kanssa (taulukko 3). Useimpien käytettyjen varhaisviljelmäsuper-30 natanttien monoklonaalisen vasta-aineen tiitterit olivat 1:512 tai suuremmat kvantitatiivisessa SP-ELISA-määrityk-sessä. Sekä tuoreet täysikasvuisen jyrsijän kudokset että asetonilla uutetut täysikasvuisen kudokset, mukaan lukien aivo-, keuhko-, sydän-, maksa-, perna- tai munuaissolut 35 testattiin, eivätkä ne pysytyneet poistamaan vasta-aineita li 41 92222 eri monokloonien supernatanteista. Jokaisesta viidestä viljellystä linjasta saatu monoklonaalinen vasta-aine reagoi myös EA+:n SV40:llä indusoitujen tai transformoitujen WF5-l-solujen, GD-36- ja mKSA-solujen kanssa El-määrityk-5 sen mukaan (taulukko 3), mutta eivät reagoineet pitkäaikaisten in vitro -viljeltyjen L-solujen (hiiri) tai kontakti-inhiboitujen BHK (hamsteri) -solujen kanssa.

Erittäin mielenkiintoista oli, että raskauden toisen kolmanneksen ihmisen sikiön tuoreet homogenaatit 10 (taulukko 3) absorboivat jokaisen vasta-aineen. Tuoreet tai tuoreiden, viljelemättömien esinahkasolujen asetoni-pulverit tai ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit eivät kyenneet absorboimaan monoklonaalisia vasta-aineita (taulukko 3).

15 EA:n säilyttäminen jäädyttämällä

Kloonaamattomien hybridoomien supernatanttien, jotka oli saatu 12 dmfc -soluilla lyhytaikaista, korkea-annoksista immunisointiprotokollaa käyttäen herkistetyistä hiiristä, alkuseulonnoissa havaitsimme, että voitiin ha-20 väitä huomattava siirtymä tietyn supernatantin reaktiivi-suusmalleissa (kuvio 3), kun äskettäin talteenotettuja sikiösoluja verrattiin kasvuväliaineessa 24 tunnin ajan in vitro viljeltyihin kahteen sikiösoluun. Tarkemmin sanottuna, huomattava siirtymä ELISA-reaktiivisuuden astees-25 sa (2+, 3+-lukumäärästä reaktiivisia pesäkkeitä lukumäärään 0 tai 1+ reaktiivisia pesäkkeitä) havaittiin monissa reaktiivisissa supernatanteissa, jotka sisälsivät IgM:iä kloonaamattornista, 12 dmfc -soluja vastaan muodostetuista hybridoomista. Kuten kuviossa 4 on esitetty, 13 dmfc-solu-30 jen jäädytys kuukauden ajaksi -70 °C:ssa ja sen jälkeinen nopea sulatus säilyttivät saman kuvion ja kloonaamattomien

• V

supernatanttien ELISA-reaktiivisuuden asteen EI-ELISA-mää-rityksessä, joka havaittiin vasta talteenotetuilla ja pestyillä 13 dmfc-soluilla.

35 42 92222

Pohdinta

Monet syyt voivat vaikuttaa siihen, että on vaikeaa saada useammin kuin kolme kertaa syngeenisillä alkioso-luilla immunisoiduista hiiristä pysyviä hybridoomia. Liu-5 koiset sikiösolu-uutteet, jotka sisältävät EA:ta, indusoivat estäjä-aktiivisuutta hamstereissa ja hiirissä, jotka saavat useita injektioita tai suuria pitoisuuksia EA+-so-lujen raakauutetta [Coggin, J. H., Ciba Foundation Symposium, yllä; Weppner, W. A. et ai., Cell. Immunol. 54 10 (1980) 445; Weppner, W. A. ja Coggin, J. A., Cancer Res.

40 (1980) 1380; ja Coggin, J. H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 72 (1984) 853 - 862], Tämä estäjäaktiivisuus havaittiin niitä lymfosyyttejä ja/tai makrofaageja vastaan, jotka liittyivät sarkoomasolujen pinnalla olevia EA-determi-15 nantteja vastaan kohdistuvaan kasvainspesifiseen kudos-siirtoresistenssiin. Naarasjyrsijoiden havaittiin kehittävän sytostaattista IgGrtä EArille, jotka ovat risti-reagoivia SV40-sarkoomasolujen kanssa, kun ne immunisoitiin suoraan säteilytetyillä syngeenisillä sikiösoluilla, 20 mutta eivät kehittäneet kasvainresistenssiä eivätkä oletettavasti solulle myrkyllisiä efektori-T-soluja näissä olosuhteissa [Ambrose, K. R. et ai., J. Immunol. 105 (1970) 524; Coggin, J. H., Cancer Res. 39 (1979) 2952; Irie, R. F. et ai., J. Natl. Cancer Inst. 63 (1979) 367]. 25 Raskaana olevat Balb/c-hiiret eivät tuottaneet an- ti-EA:ta tuottavia hybridoomia, kuten tuottivat Balb/c-uroshiiret, jotka oli immunisoitu säteilytetyillä 12 dmfc -soluilla. Myöskään hamsterit eivät tuottaneet hybridoomia, kun ne immunisoitiin säteilytetyillä sikiösoluilla. 30 Hamsterin ja hiiren sikiösolujen pinnalla olevia EA:ita on ollut yleisesti vaikea karakterisoida. Nämä determinantit olivat faasispesifisiä tietyille alkion- tai sikiönkehityksen vaiheille. Sikiösoluissa ei enää esiintynyt antigeenejä in vitro -viljelmässä [Irie, R. F. et ai., J.

35 Natl. Cancer Inst. 63 (1979) 367; Hellström, I. et ai., il 43 92222

Inter. J. Cancer 7 (1971) 1, 10; Leffell, M. S. ja Coggin, J. H. , Cancer Res. 37 (1977) 4112) vain harvaa poikkeusta lukuunottamatta (Ting, C. C. et al., In Vitro 14 (1978) 207]. Balb/c-hiiret osoittautuivat huonoiksi vastaajiksi 5 syngeeniselle sikiöperäiselle herkistämiselle, kuten Ting et ai. yllä, ehdottivat, SV40-transformoituja kohdesoluja käytettäessä.

Kuten tässä raportoidaan, C57Bl/6n-uroshiiriä käytettiin menestyksellisesti EA:lle vasta-aineita tuottavi-10 en, pysyvien hybridoomien saamiseksi, kun ne immunisoitiin syngeenisillä 5000 R:n (1290 mC:n) röntgensäteillä inakti-voiduilla sikiösoluilla. Tehokkain immunisointiprotokolla sisälsi syngeenisen isännän herkistäminen sikiösoluille lyhyen immunisointiaikataulun kuluessa.

15 Kloonaus tuotti viisi pysyvää monokloonia ensimmäi sestä seitsemästä satunnaisesti valitusta hybridoomasta. Kaikki monoklonaaliset vasta-aineet, jotka saatiin kokonaisia sikiösoluja vastaan, olivat IgM-tuottajia. Myöhemmin havaittiin, että kaikki hybridoomat, jotka oli saatu 20 herkistämällä uroshiiret kokonaisille, säteilytetyille sikiösoluille sekä lyhyitä että pidennettyjä sarjoja käyttäen, tuottivat vain IgM-tuottajia. IgG:tä tuottavia hyb-ridoomia saatiin vain hiiristä, jotka saivat liukoiseen muotoon saatettuja (3 mol/1 KC1) sikiösolu-uutteita pikem-25 minkin kuin kokonaisia EA+-sikiösoluja. Ei tiedetä, pysyy- ‘ kö tämä ehdottomana havaintona jokaiselle kokonaisia si kiösoluja vastaan tuotetulle hybridomalle, mutta tulokset, jotka on saatu tutkittaessa useita tusinoita eri hybridoo-maklooneja tähän päivään mennessä, tuottivat vain IgMrää 30 tuottaviin monoklooneihin.

Alkukokeissa menetettiin usein kokonaisia sikiö-soluja vastaan tehtyjä hybridoomia aikaisissa jatkovilje-lyvaiheissa hiiren pernasolu-ravintokerroksiin. Oli mahdollista saada erinomainen hybridooman jatkoviljelmien 35 eloonjääminen ja suorittaa tehokas IgM:iä tuottavien hyb- 44 92222 ridoomien kloonaus täydentämällä siirtoväliaine makrofaa-gin kaltaisen solulinjan RAW 264.7 supernatanteilla. Ravitsi jana käytetyt hiiren pernasolut eivät olleet käyttökelpoisia, kuten ne ovat olleet muille antigeeneille tuo-5 tettujen hybridoomien saamisessa. RAW-viljelysupernatan- tilla täydentämistä ei ole raportoitu aikaisemmin ja sen käyttö oli helpompaa kuin ravintosolukerrosten. Näyttää siltä, että RAW 264.7 -solut antavat käyttöön kasvutekijän (-tekijöitä), joita IgM-hybridoomaa tuottavat solut tar-10 vitsevat. Suodatetun RAW-solusupernatantin käyttö poisti myös mahdollisen kontaminoivien aineiden lähteen, joka esiintyy normaaleja hiiren pernasoluja hybridoomaviljel-miin lisättäessä.

Kyky käyttää äskettäin talteenotettuja, kokonaisia, 15 raskauden keskivaiheen sikiösoluja kerran synnyttäneistä äideistä seulottaessa hybridoomia, jotka tuottivat anti-fetaali monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat solun pinnalla olevien luonnollisen EA:n kanssa, oli

TM

Reusable Microfold -laitteiston suuri etu; koesoluja ei 20 tarvinnut kiinnittää glutaraldehydillä eikä kiinnittää sentrifugoimalla poly-L-lysiinillä esikäsitellyille levyille. Tuoreista kudoksista peräisin olevat solut voitiin

TM

prosessoida ja pipetoida Reusable Microfold -suodatti-melle minuuteissa ja laaja hybridoomasupernatanttien seu-25 lonta oli suoritettu loppuun alle kolmessa tunnissa. Samanlaisen menetelmän ihmisen muuntyyppisiä solun pinta-aktigeeneja vastaan nostettuja IgGtitä tuottavien ihmisen hybridoomien seulomiseksi ovat äskettäin raportoineet Glassy et ai. [J. Immuno. Methods 58 (1983) 119].

30 Edelleen SP-ELISA:n kehittäminen (kuvio 1) joko kiinnitettyjen sikiösolujen tai sikiösolukalvojen määrittämiseksi teki mahdolliseksi suorittaa kvantitatiivisia EA:ta vastaan tuotettujen vasta-aineiden absorptiospesi-fisyysanalyysejä raakakudoksilla. On tärkeää, että kudok-35 set, jotka on määritetty niiden EA- tai OFA-esiintymisen 45 92222 suhteen, voidaan analysoida tarvitsematta viljellä niitä in vitro, mikä on selvä etu primaarikasvainten tai normaa-likudosten seulonnassa. SP-ELISA-menetelmä oli sekä herkkä että hyvin toistettava.

5 EA:ita vastaan syngeenisessä hiiren sikiössä tuo tettujen hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden avulla tehty raskauden keskivaiheen hamsterin samoin kuin ihmisen sikiössä esiintyvien (taulukko 3) evoluutiossa säilyneiden epitooppien osoittaminen on samansuuntainen kuin 10 aikaisemmat näiden sikiösolutyyppien immunogeenisyyttä koskevat havainnot kasvainresistenssin saamiseksi, yllä. Samanlaista ristireaktiivisuuspaneelia ei havaittu näistä lajeista peräisin olevilla raskauden loppuaikaisilla si-kiösoluilla eikä täysikasvuisilla kudoksilla absorptio-15 analyysillä eikä immunopresipitaatiolla täysikasvuisista kudoksista (Muller, R. et ai., Nature 299 (1982) 640), mikä osoittaa monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyyttä oikeille EA:ille (alkio-sikiöspesifinen antigeeni).

Se havainto, että sitoutuminen tai absorptioreak-20 tiivisuus on erilainen jyrsijöiden SV40-indusoiduille sar- koomille tai lymfoomille, joiden tiedetään olevan EA+, mutta ei hiiren L-soluille tai BHK-21-soluille, osoittaa tähän päivään mennessä testatun viiden monoklonaalisen vasta-aineen avulla osoitettujen EAriden mahdollista ra-25 joittumista tai jakautumista.

Monien tutkimusten tulokset (Coggin, J. H. et ai., J. Natl. Cancer Inst. 72:853-862; Rosenberg, S. A. kirjassa Serological Analysis of Human Cancer Antigens, Rosenberg, S. A. (toim.) (Academic Press, New York); ja 30 Brown, J. P. et ai., J. Immunol. 127 (1981) 539) tukevat sitä mahdollisuutta, että tietyt EA:t (0FA:t) rajoittuvat määrättyihin kasvainten histologisiin luokkiin, vaikka Salinas et ai. (Serological Analysis of Human Cancer Antigens, Rosenberg, S. A. (toim.) (Academic Press, New York), 35 ss. 539 - 564), Brown et. al. (J. Immunol 127, 539), 46 92222

Jornvall et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. (US) 79 (1981) 287 - 291 ja Granatek et ai. (Science 224 (1984) 1198 - 1206] ovat raportoineet ihmisen kasvainten pinnalla olevista yhteisistä EA:ista. Ihmisen sikiö reagoi näitä OFA:ita 5 vastaan tuotettujen ksenogeenisten, polyklonaalisten ja monoklonaalisten immunoglobuliinien kanssa useimmissa raporteissa ja keksinnön monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Useat polypeptidin sisältävät, polyklonaalisten 12 päivän hiiren tai vastaavasti 10 päivän hamsterin sikiöso-10 luja vastaan tuotettujen antiseerumien, immunologisesti saostamat EA-lajit jakautuivat selektiivisesti SV40- ja Adv. 7-indusoitujen sarkoomien joukossa. Näillä sarkoomil-la tiedetään olevan yhteisiä 0FA:ita, joita ei havaittu kemiallisesti indusoiduissa sarkoomissa, joilla ei ollut 15 ristiinsuojelevaa immuniteettia SV40-sarkoomille. Kolmen 160, 45 - 48 ja 23 dD:n polypeptidin sisältävän lajin havaittiin olevan yhteisiä SV40- ja Adv 7 -sarkoomasoluille [Hellström, I. et ai., Inter. J. Cancer 7:1:10, ja Wepp-ner, W. A. et ai., Cell Immunol. 54 (1980) 445].

20 Immunogeenisen samoin kuin antigeenisen aktiivisuu den menetys talteen otetussa sikiössä näyttää olevan nopeaa ja täydellistä eräiden sikiöepitooppien kohdalla. EA+-sikiösolujen on osoitettu menettävän kapasiteettinsa aktivoida soluvälitteistä immuniteettia EA+-kasvainsoluil-: 25 le vain muutamien tuntien in vitro -viljelyn jälkeen ja ne olivat täysin ei-immunogeenisiä, jos ne säteilytettiin kuolettavasta ennen viljelyä [Coggin, J. H. ja Anderson, N. G., Cancer Res., 40 (1980) 1568, ja Coggin, J. H. ja Ambrose, K. R., Methods in Cancer Research, (Fishman, W. 30 H. ja Busch, H., toim.), Volyymi XVIII, ss. 371 - 389 (Academic Press, New York)]. Tässä saadut tulokset (kuvio 3) hybridoomasupernatantteja ja EI-määritystä käyttäen sen jälkeen, kun kohteena olleita 12 päivän raskausaikaisia hiiren sikiösoluja oli viljelty lyhyitä aikoja (24 tun-35 tia), olivat yhdenmukaisia tämän aikaisemman havainnon kanssa.

II

47 92222

Pysyvän varaston tietyn raskausajan sikiösoluja saaminen rutiinimäärityksiin on tärkeää vaikeaa, sillä samanaikaisesti pariutettujen, sisäsiittoisten hiirien kasvattaminen ei ole tehokasta. Kun sikiösoluja oli käy-5 tettävissä määritykseen muutamasta, samanaikaisesti pa- riutetusta raskaana olevasta luovuttajasta, niitä oli usein enemmän kuin tarvittiin tietyn päivän kokeeseen. Mahdollisuus jäädyttää ylimääräiset sikiösolut tulevaa käyttöä varten poistaa näiden vaikeasti saatavien ja kal-10 Uiden solujen tuhlauksen. Havaittiin myös, että glutaral-dehydillä kiinnitettyjä sikiösoluja voitiin menestyksellisesti säilyttää 4 °C:ssa viikon ajan ilman herkkyyden laskua kiinteäfaasimäärityksessä.

Seuraavassa esimerkissä kuvatuissa tutkimuksissa on 15 karakterisoitu anti-EA monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivat sikiösolujen polypeptidit. Huomautetaan, että kaikki viisi taulukossa 3 lueteltua monoklonaalista vasta-ainetta reagoivat ilmeisesti saman polypeptidin kanssa, kuten SDS-akryyliamidigeelielektroforeesimäärityk-20 sellä on osoitettu.

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivien polypeptidien identifiointi

Materiaalit ja menetelmät 25 Kasvainsolut SV40:llä indusoidut hiiren sarkoomasolut (mKsa) tai hamsterin lymfoomasolut (GD-36) saatiin syngeenisten hiirien tai hamsterien pienistä kasvainsiirrännäisistä seulomalla ne lankaverkon läpi, kuten julkaisussa Payne, W. J. 30 ja Coggin, J. H., J. Natl. Cancer Inst. (1984).

Ihmisen kasvaimet saatiin vasta jäädytettyinä pri-maarikasvaimina Kansallisen Syöpäinstituutin tukemasta Alabaman Yliopiston (Birmingham, Alabama) kasvainpankista. Kaikki kasvaimet luokiteltiin histologisesti patologista 35 paneelia käyttäen ja jäädytettiin suojäävässä väliaineessa. Jäädytetyt kudosfragmentit sulatettiin nopeasti ja 48 92222 dispergoitiin lankaverkon läpi ilman entsyymidissosiaa-tiota raakasolususpensioiden valmistamiseksi, pestiin kuten aikaisemmin on kuvattu, ja käytettiin absorptiotutki-muksiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (Payne, W. J. ja 5 Coggin, J. H., yllä). Kontrollina käytetty normaali kudos saatiin monissa tapauksissa histologisesti normaalista kudoksesta kasvaimen vierestä tai muuten normaalista terveestä potilaskudoksesta, joka oli poistettu viereisen vaurioituneen kudoksen kanssa oleellisten kirurgisten syi-10 den takia.

Monoklonaaliset vasta-aineet

Monoklonaaliset immunoglobuliinit 69.1, 38,7, 8 ja 14 olivat peräisin, kuten aikaisemmin tässä selityksessä on kuvattu, C57Bl/6n-hiiren sikiötä vastaan syngeenisistä 15 vastaanottajista. Monoklonaaliset vasta-aineet 69.1, 38,7 ja 8 olivat IgM-luokkaa ja ne oli stimuloitu kokonaisilla sikiösoluilla, kun taas monoklonaalinen vasta-aine 14 oli saatu aikaan sikiösolujen KCl-uutteilla ja se oli IgG-iso-tyyppiä. Kaikkien tiitterit olivat yli 1024 testattaessa 20 12 dmfc -soluja vastaan kiinteäfaasi (SP)-ELISA-menetel- mällä yllä.

EA;n eristys ia molekvvlipainoien määritys

Sikiöperäinen antigeeni(t) eristettiin käyttäen affiniteettipylvästä, jonka muodosti Sepharose 4B:hen 25 kiinnitetty anti-hiiri-immunoglobuliini. Jokaisen raono- klonaalisen vasta-aineen kahden viikon vanhat, tiheydeltään suurten viljelmien supernatantit sekoitettiin pestyjen, tasapainotettujen affiniteettigeelien kanssa ja niitä inkuboitiin 12 tunnin ajan 4 °C:ssa. Geeli pestiin 100-30 kertaisella tilavuudella Trisillä puskuroitua fysiologista suolaliuosta (TBS), 10 mmol/1, pH 7,4, ja 5 ml 12 dmfc -solujen tai täysiaikaisten solujen vakio-NP40- (40 pg/0,1 ml) tai KCl-uutetta (10 μ/0,1 ml) sekoitettiin geelin kanssa.

35 Solu-uutteet valmistettiin käsittelemällä koekudok- sen tai solujen pakattua solunappia 10-kertaisella tila- 49 92222 vuudella 0,5-%:ista NP 40: tä fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisälsi 1 mmol/1 PMSF:ää. Tunnin 25 °C:ssa inkuboinnin jälkeen solut sent-rifugoitiin napiksi 1500 rpm:n nopeudella, minkä jälkeen 5 supernatantti kirkastettiin sentrifugoimalla 50 000 x g:n nopeudella 30 minuutin ajan. Uutteita ja affiniteettigee-lejä inkuboitiin 12 - 15 tuntia 4 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin uuttopuskurilla, kunnes pesuliuoksessa ei voitu osoittaa proteiinia. KCl-uutteet valmistettiin kuten yllä 10 on kuvattu.

Sitten vasta-aine-antigeeni-Sepharose 4B -kompleksi eluoitiin 5 mol/1 MgC^^lla käyttäen tilavuutta, joka oli sama kuin pylvään tilavuus, yhden tunnin ajan. Tämä vaihe toistettiin uudelleen. Eluaatit dialysoitiin 100-kertai-15 sella tilavuudella TBS:ää ja käytettiin SDS-PAGE:en. Eluaatit käsiteltiin liukoiseksi tekevällä puskurilla, joka sisälsi 2,5 % SDSrää, 1,25 mmol/1 ureaa ja 1 % B-merkapto-etanolia 12,5 mmol/1 Tris:ssä. Sitten näytteistä ajettiin elektroforeesit 20 %:sta 7 %:iin (pohjasta yläosaan) ole-20 valla akryyliamidigradienttigeelilevyllä Laemmlin epäjatkuvaa puskurisysteemiä käyttäen. Elektroforeesin jälkeen geelit värjättiin Commasie-sinisellä R-250 (BioRab Labs, Incorporated, Richmond, Virginia) etikkahappo: metanoli: vesi -seoksessa (7:40:53) ja väri poistettiin jälkimmäi- 25 sellä liuoksella.

Blastooeenisen aktiivisuuden arviointi

Lymfosyyttitransformaatiomääritys (LTA) suoritettiin käyttäen pernasoluja, jotka oli herkistetty säteily-tetyille mKsa-soluille, joiden tiedettiin olevan EA-posi-30 tiivisia ja stimuloituvan, kun ne altistetaan 12 dmfc -solujen KCl-uutteille. Täysikasvuisen hiiren solujen KCl-uutteet eivät olleet stimuloivia. LTA-määrityksen olosuhteet olivat kuten Weppner, W. A. ja Coggin, J. H., Cell Immunol. 54 (1980) 193, ovat kuvanneet. Käytettiin 0,01 -35 0,05 g uutetta maksimaalisen stimulaation aikaansaamisek si ja stimuloitumisindeksi laskettiin kuvatulla tavalla.

50 92222

Tulokset

Monoklonaaliselle vasta-aineelle spesifisen polv-peptidin osoitus

Kolmen IgM-luokan monoklonaalisen immunoglobuliinin 5 (69.1, 38.7 ja 8) ja IgG-luokan monoklonaalisen immunoglo buliinin havaittiin kaikkien sitovan selektiivisesti 44 -48 kD:n polypeptidin samoin kuin suuremman, 200 kD:n poly-peptidimultimeerin. 46 kD:n proteiini osoitettiin vain sikiösolu-uutteessa, eikä sitä esiintynyt täysikasvuisen 10 hiiren kudoksista, mukaan lukien lihas, iho, maksa, perna, sydän, suoli, aivo, valmistetuissa uutteissa eikä C57BL/6n-hiiren 19 - 21 päivän sikiön kokonaisen eläimen homogenaateissa. Tämä tulos saatiin silloinkin, kun täysikasvuisen hiiren uutteita käytettiin pitoisuuksina, jotka 15 olivat 25-kertaiset 12 - 13 dmfc -solujen sikiöuutteisiin nähden.

Af finiteettigeelin eluaateissa olevat muut viivat olivat: lisätystä monoklonaalisesta vasta-aineesta peräisin oleva IgM:n kevyt ketju + J-ketju (20 - 23 kD); raskas 20 ketju, joka oli peräisin "sandwich"-affiniteettigeelin

IgGistä, jota käytettiin sitomaan hiiren monoklonaalista lgM:ää (57 kD), seerumin albumiini (70 kD) ja IgM:n raskas ketju (75 kD) yhdessä sikiöspesifisen 200 kD:n polypeptidin kanssa, joka saattaa olla 46 kD:n proteiinin multimee- • 25 ri. Affiniteettigeelistä peräisin olevia vasta-ainefrag- mentteja esiintyi molemmissa riveissä, jotka kuvaavat täysikasvuisia samoin kuin sikiöperäisiä affiniteettigeelejä, kuten oli odotettukin. Tärkeää on, että 46 ja 200 kD:n polypeptidin affiniteettigeelin sitoutumisen spesifisyys 30 lisättyjen EA-spesifisten monoklonaalisten immunoglobulii- nien suhteen osoitettiin käyttämällä merkityksetöntä hiiren monoklonaalista IgMrää, jonka tiedettiin olevan spesifinen Moloney-sarkoomaviruksen vaipan glykoproteiinille (MSV). Tämä asiaankuulumaton monoklonaalinen immunoglobu-35 liini ei sitoutunut kumpaakaan epitoopin sisältävää poly- 51 92222 peptidiä, jonka yllä luetellut monoklonaaliset vasta-aineet tunnistivat.

Valmistettiin monoklonaalisen vasta-aineen 69.1 25-kertainen konsentraatti ja sitä käytettiin absorboimaan 12 5 dmfc -solujen KCl-uute (500 pg proteiinia) yllä kuvattua affiniteettigeeliä käyttäen. Uute otettiin talteen geelistä monoklonaalisen IgM:n poistaessa siitä sidotun EA:n ja konsentroitiin alkuperäiseen tilavuuteensa. Näyte analysoitiin uudelleen SDS-PAGE-määrityksellä ja verrattiin 10 alkuperäiseen KC1-uutteeseen. Tulokset osoittivat, että kaikki havaittavat 46 ja 200 kD:n viivat olivat poissa.

Sitten affiniteettigeelillä absorboitu uute testattiin LTA:lla sen määrittämiseksi, estikö 46 kD:n polypep-tidin (tai sen multimeerin poisto) Webbnerin W. A. ja Cog-15 ginin, J. H. Cell Immunol. 54 (1980) 193, kuvaamalla tavalla valmistettujen, EA-herkistettyjen hiiren pernasolujen stimulaation. Taulukon 4 tulokset osoittivat, ettei IgM-absorboitu uute todellakaan stimuloinut EA-herkistet-tyjä lymfosyyttejä, kun taas absorboimaton KCl-uute oli 20 stimuloiva.

Taulukko 4 12 dmfc -solujen KCl-uute, jota oli käsitelty ennen Sepha-rose 4B-affiniteettigeelillä, johon oli kiinnitetty mono-25 klonaalinen lgM-vasta-aine 69.1, käsittelyä ja sen jälkeen.

Uutteen käsittely Stimuloitumisindeksi lymfosyyt ti transformaatiomäärityksessä 30 Käsittelemätön 12 dmfc- 27 ± 5 eluaatti (46 kD:n ja 200 kD:n polypeptidit mukana) 69.1-käsitelty 12 dmfc- 6 ± 3 35 eluaatti (46 ja 200 kD:n polypeptidit eivät mukana) 52 92222 46 kD:n proteiini ihmisen kasvaimissa Kuten taulukossa 5 on esitetty, joukon ihmisen kasvaimia, mukaan lukien keuhkon, rinnan, paksusuolen ja peräsuolen karsinoomat, havaittiin selektiivisesti absorboi-5 van useita yllä mainituista monoklonaalisista vasta-aineista analysoitaessa myöhemmin SP-ELISA-määrityksellä 12 dmfc -soluja käyttäen. Aikuiset kontrollikudokset ja monien potilaiden, joiden kasvaimet olivat myös mukana, normaalit kudokset olivat negatiivisia samojen monoklonaalis-10 ten vasta-aineiden absorptiolle. Kahden keuhkon adenokar- sinooman KCl-uutteen affiniteettigeelianalyysi paljasti merkittävän 46 kD:n viivan ja pienen jäljen 200 kD:n viivaa molemmissa kasvaimissa sekä näiden polypeptidien puuttumisen yhtä suurissa proteiinipitoisuuksissa normaaleja 15 täysikasvuisen kudoksia.

53 92222

•H

•P

- -μ g g ηΗ Q)

I—I f—I

•H G

<D > i—I Ή H £>

Q X! «d< CO CT> ° 00 CN CN m VO

J_l d) CNJ ΓΜ CN 'T I—I ^ CO t—I I O

11 I *. *. * ·· ·. «- » » O «·

COO O CD O O O ι-H O I I—I

O 4-m λ; ε tn

G

td CN G

•n Ή U)

G

i—I i—I

•H

S CN

H CD

G Td > £

en G

rO tn ^3* oo ro o r-' n* 00 oo n O m m m m o cn o m >r«| «^ ^ k. ^ ·» ^ *· s C -P O O O O o o o o o o CD 04 COiH S-l

•H :cd O

g G tn •H -P <3

-p O CD •H -P -P -H

04 M G

M :G tl) 0 -'G -o

, en g G

m Λ Ή

G G O

O Ή en

Xl G Ή

X Q) ·· G

G Td C CD

Hi H CO -t—>:cts G (D h >1 n t" r~ r-~ r-- oo η- vo co co r-~ rd| G PI -P :G o o o o o o o o O o SH| -H W -P :G I—I Ή Ή I—I ι—I <—I <—1'—I*—1'—1 G I (D g

1 -Η -P 3 X X X X X XXXX

G in >iX

.p G :G G co r-~ vo rH in cn m cn cnGXJiH - '

'G 0-1 Ί* ι—I H rH

.> :G

Ή d) rdGGG G GG

-p e e e e g eg G C OOOO 0 00 G-h 0 0 0 0 0 0 0 _ _ _

p-Η GG GG GG GG GG GG GG :G :G :G

<D X (D H <D H CD H 0) -H CD H CD -H CD H 04 04 04 G iHcn i—ι tn rHtn H in rHen ή en h tn :0 :0 :0 'G H OM OM OM OM OM OM OM >i >i >i H r-ι td G G o G G vo G G en G G o GG GG G G in en .H tn vo tn

Dh > tnXn· tn λ; cn bi^h toX r- mx; tnX tn X vo oc- Om o G -H m GO GO GO GO GOvo GO GO X X X Γ' g en g ggi en c ι en g i en g i en g cn en g cn en g i x!i .G ι A ^ x « x cd x <d x ω x ω xiD~.xiD.HxeD g g gi

o G G H G Td CN GG (S G G) Ή G Td vo G Td H G G Τ' CD -31 <D -Τ’ (D CO

' G (¾ G vo C^Gin Oi G vo Oi G vo O4 G in O d X (O4 G tn X vo X vo X K

CD G

-P X O

(Λ li

P G G

^ rH

G ,H -H VO VO VO

CO .,-1 £ rH Ή ^ ^ ι-H rH iH «H rH

C Q) O ^ *> *- * *- ·* »k*.·.

0 ,—I O CT» <T> 00 00 00 <T» <T» CT» CT» CT» —* fO «—1 v£> ko ro ro ro κθ vo ko ko ko -¾ g x • IB § •«S Ä « 54 92222 d -ρ

- -P

3 3 id O)

I-1 I—I

d (0 3 > I—I -r-i 'ο δ rn oj rn in οί oooco Μ 3 ομγμ^οίι oo σ> cH d r- 4J| *·«·*···νΟ ' V ^ ·. ^

3 U INOOOOI CNCNO O O

0 dro λ; ε tn 3 3 CM 3 n rH co

(0 I—I i-H

•H

ε cm -d 3 (0 Ό > Λ tn 3 3 tn

Ai O

3 -P tnoiHon^ id to o m m a) CL, ^ m m Ί1 fl H ΓΟ d< [— ID ΓΜ 3rd p _* ' ' ' ' - ^ ^ ^

d :3 O OO O OOO O o o O O

EC tn S >i Λ •d -P <

-P

3 o QJ

3 d -P

Ai -P d 4J DjH 3 3 P :3 cd -n O :3 ti tn E 3 m Λ d

3 3 O

O ή tn „ ^ £j H Γ" 00 0O 00 MU·· β oooo oo r~r~oo oo r-~

3 tJi< U "Hid id I—I Γ~- O O O O o O

'—I -d CO -n :3..,. O d Ή I—I id id id 3 3 H >, d X X X <d

3 3 31 -P :3 , X XXX X X

Eh| -d W -P :3 in 00 Π X

3 I CD E id ro in d1 VDld 1 -d -P 3 ·* ' 00 ^ v. *

3 3 >ιΑί 1—1 1-1 rd (N d< CM Γ0 ID

-P 3 :3 3 3 3 «id 3 >d i> :3 _ 3 CO <Tl <3> ΓΟ 00 id d d CM fN d1

•pjj ·—i cm cm cn m <T> co <d d d rH

^ 3 I I 1 I 1 I III I I

3 -d H d· d1 Eh Eh <Ti cn id id io ph 3d K id id M K n id n n in m <D 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 V <0 d ^ 3 3 3 3 :3 :3 :ίθ ά I , I d 3 *X ·Χ ·Χ iX iX :3 :3 :3 :3 p p h > 3 3 e 2 3 a a a a 3333 -rl <0 iO fo ro fO rd G G G G G ^ g G ^ 2

£ cn (0 r-j :ro »H :nj H :rd H :(ö H :nj G :<d G t*Ö G G :<fl iti O O fö O O

^’X x 2 ·& 2 28* 3a «a Aio, md, ac a ai a cso 330 Ο ·2 '9 ·£ '9 ·% 'P Λ .O X! :θ P :0 p :0 p :0 p :θ 3 3 3 3 3 3 8Ί2 3>,3>, 3 >1 3^3^ 3^3^ 3>i 3 >i d Ό d d -Ö d <D3 S tn S tn Sen StnStnXitnlXtn t*J tn ΪΧ to (X 3 tn (X 3 tn P ,χ o

3 P

•d 3 β id rd 3 id d 3 d 3 io ID i0 3 3 0 ^ ^ ^ ^ id id id id rd rH d· o id O ' - v ^ ^ ' - - *. *.

id3rHCT'CT' oo oo tn σι tn σι <y> σι oo AC 3 λ; <Ω m oo rOlDlDVO ID ID ID ro o E 0 e P 3 .: ooo S3 s

II

55 9 2 2 2 2 -p -Ρ *· jj Ό c

Ή (D

Ή i—I

P

0) > '-Ί ·Η 'H > rn σ> oo O Ai r" to i o r—i vo «a· M <d ''9' I i i o o o -P I O O I o o o o

Cu I I I o o o 0 U-iro

Ai g in 3 Π N 3 n r-H in ro

P t—I P

E OM

-H O) (0 Ό

> A

in 3 Π3 to

Ai O „ .p -<3· en ro oo C _ρ ro ro o to o p p ω α o o o o o o o o o o 10·—i #-| H :ro o EC tn -Ξ >, A3 •H 4-> <

-P

- O tl) ^ -H 4-> d -P -p +3 Qj p c

C J-ι :ra CD

-ΓΊ1 O :C -n tO g 3 LD A3 p roro o 0 ή to a: c i—i

Ai CD ·· C

3 '‘D <c O

’—1 A W -r-ι :ro ^33 ^ r*i P <3 roccj-ptro o o i—i r—i co oo oo co co, co H | -a o -P :ro r-H ρ ° ° d S 2 3

ro | <D E XX ,-| rH Ρ Ρ Ρ P

ro» >,1 κ Ό « * * * * * * -pro ;ro 3 ^ ^ ^ n m ro ro ro ro

t0 ro «H CO 00 .H rH

ro tp ^ :!H iiit·· •h ω in rö in tn jo jo rH-P I ta σί ro ro ro ro *5 & 3 3 3 3 3 3 ^ Q £3 £p a-H £p g.-h g,-h .g,-h

0) ·* C II I p :ro P :ro p :ro P :ro P :ro P -ro P

UH c φ H i c H C p -P -P -P p -P p -P p -U P -p p 1 · "d 12 IHO as (DJ jil jr n!ä •H1-1 <0 d P P P P H£ HA Ha HA Hi. aa ^p £ ci äs 9 BS rocrocrocrocrocroc

5* « li li Ja Ia li li il l| 11 IS

g 5 sraasäsras? s g a g a g a g ai s s

Ai O

p ° d ro c 'A ή ro p "d to 2 2 2 r-P P _l _i A) p ^ i—I Ρ P P1 ^ 2 <D O 'A , v. - J· 5 '“t O en tn oo en ^ tn en co oo co ^rop S S ro S ^ ^ Ά) ro ro ro 3 <0 Ai

O E O

g P C

O O O

Se s 56 92222 1. Kunkin tyyppiset luetellut, standardoidut monoklonaaliset immunoglobuliinit absorboitiin 12 tunnin ajan osoitetulla määrällä kasvainsoluja tai normaalin kontrol-likudoksen seoksilla (perna, sydän, lihas, paksusuoli, 5 keuhko ja maksa) ja määritettiin uudestaan kiinteäfaasi- ELISA:lla EA+ 12 päivän raskausaikaisella hiiren sikiöso-luilla.

2. Apsorptio- = Absorboidun Iq:n abs (414 nm); suhde Absorboimattoman Ig:n abs (414 nm) 10 0 = ei absorptiota; 1,0 = täydellinen absorptio.

3. Määritetty vertaamalla koekasvaimen tai normaalien kohdesolujen absorptiosuhdetta (AR) samojen mono-klonaalisten immunoglobuliinien 12 dmfc -solujen AR:ään.

15 (esim.

4 1.8 x 10 kohdesolua = 1 abs. yksikkö_ 4 3,3 x 10 12 dmfc = 1 abs. yksikkö (vakioabsorptiokäyräl- tä) = 0,54)

Pohdinta 20 Nämä tulokset identifioivat hiiren sikiösoluista yhteiset 46 ja 200 kD:n polypeptidit, jotka reagoivat useiden anti-EA spesifisten monoklonaalisten immunoglobuliinien kanssa ja joita ei voitu osoittaa täysikasvuisen hiiren soluuutteissa eikä hiirien tai ihmisten raskauden • 25 loppuvaiheen sikiösoluissa. Proteiinit osoitettiin myös joukossa ihmisen karsinoomia, mutta niitä ei voitu osoittaa tutkituissa normaaleissa ihmisen kudoksissa, mukaan lukien paksusuoli, perna, aivot, iho ja lihas. 200 kD:n sikiöspesifisen polypeptidin, jonka kaikki monoklonaaliset 30 immunoglobuliinit sitoivat Sepharose 4B -affiniteettigee-. liin, läsnäolo viittaa siihen, että monoklonaalisten im munoglobuliinien tunnistamat epitoopit saattavat sijaita 46 kD:n proteiinin multimeerissa natiivissa muodossaan sikiösoluissa ja kasvainsoluissa.

35 57 92222

Havainto, että hiiren ja ihmisen sikiö- ja kasvain-soluissa on yhteisiä, evoluutiossa säilyneitä 46 ja 200 kD:n polypeptidejä, on mitä paljastavin. Se lisähavainto, että polypeptidien valikoiva poisto monoklonaalista IgM:ää 5 käyttävän afiiniteettikromatografiän avulla teki uutteen ei-stimuloivaksi EAzlle tai kasvain- ja sikiösoluille herkistetyille lymfosyyteille, on myös mielenkiintoinen. Tämä havainto viittaa selvästi siihen, että nämä polypeptidit saattavat sisältää ainakin yhden niistä EA-determinanteis-10 ta, jotka ovat vastuussa sikiösolujen tai niiden uutteiden syngeenisessä hiiressä tai hamsterissa aiheuttaman ris-tiinsuojelevan kasvaimen siirron resistenssin indusoinnis-ta.

Viisi hybridoomaa, jotka tässä keksinnössä valit-15 tiin satunnaisiin, spesifisiin jatkotutkimuksiin, talle tettiin 30 vuodeksi ATCCzhen, Rockville, Maryland, ennen hakemuksen jättöpäivämäärää. Talletusnumerot ovat:

Hybridooma 8 (nimetty myös 8 KCL Uliksi): ATCC-nro HB-8663; 20 Hybridooma 69,1 (nimetty myös 69,1 sh III:ksi): ATCC-nro HB-8664;

Hybridooma 38,46 (nimetty myös 38,46 sh Illrksi): ATCC-nro HB-8665;

Hybridooma 38,7 (nimetty myös 38,7 sh III:ksi): 25 ATCC-nro HB-8666; ja

Hybridooma 115 (nimetty myös 115 sh III:ksi): ATCC-nro HB-8667.

Claims (13)

92222

1. Menetelmä onkofetaalispesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita erittävän hybridooman valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että a) immunisoidaan eläin immunisoivilla määrillä nopeasti lisääntymätöntä, syngeenistä raskauden keskivaiheen sikiösoluvalmistetta; b) eristetään immunisoidut lymfosyytit mainitusta 10 eläimestä; ja c) fuusioidaan mainitut lymfosyytit sopivissa fuu sio-olosuhteissa immortalisoivan solulinjan kanssa, jolloin saadaan hybridoomat, joilla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset 15 tunnistusominaisuudet.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua hybridoomaa viljellään hiiren makrofaagisolulinjan RAW 264.7, ATCC TIB 71, läsnäollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittujen solulinjojen erittämät monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä jyrsijöiden ja ihmisen alkio- ja sikiösoluille ja jyrsijöiden ja ihmisen kasvainsoluille.

4. Menetelmä sellaisen monoklonaalisen vasta-ai neen valmistamiseksi, joka on spesifinen tietylle eläin-kasvaimelle, tunnettu siitä, että viljellään hybridoomaa, jolla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset tunnistusominaisuu-30 det; ja otetaan talteen mainittu sen erittämä monoklonaa-linen vasta-aine.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seulotaan mainittu monoklonaalinen vasta-aine niiden vasta-aineiden joukosta, joilla vasta-35 aineilla ei oleellisesti ole affiniteettia normaalille täysikasvuisen eläimen kudokselle. 92222

6. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat spesifisyysominaisuudet: a) immuunireaktiivisuus jyrsijöiden raskauden keskivaiheen antigeenejä kohtaan; 5 b) immuunireaktiivisuus ihmisenonkofetaalikasvain- antigeeneja kohtaan; c) oleellisesti ei immuunireaktiivisuutta jyrsijöiden myöhäisraskaudenaikaista sikiökudosta kohtaan; ja d) olellisesti ei immuunireaktiivisuutta ihmisen 10 normaalia kudosta kohtaan; ja että sitä tuotetaan hybri- dooman avulla, jolla on ATCC-talletusten HB-8663, HB-8664, HB-8665, HB-8666 tai HB-8667 mukaiset tunnistusominaisuu-det.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen 15 vasta-aine, tunnettu siitä, että se on immuuni- reaktiivinen molekyylipainoltaan noin 44 000 - 48 000 olevaa onkofetaalipolypeptidiä kohtaan.

8. Menetelmä ihmisen kasvaimeen liittyvän onkofe-taaliantigeenin osoittamiseksi, tunnettu siitä, 20 että inkuboidaan ihmisen näytettä, jonka epäillään sisältävän mainitun onkofetaaliantigeenin, patenttivaatimuksen 6 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa; ja määritetään, tapahtuuko mitään oleellista sitoutumista mainitun antigeenin ja mainitun vasta-aineen välillä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että se on immunometrinen määritysmenetelmä tai kompetetiivinen immunologinen määritysmenetelmä.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun antigeenin ja mai- 30 nitun vasta-aineen välisen oleellisen sitoumisen määrittäminen suoritetaan havaittavaksi leimatun onkofetaaliantigeenin läsnäollessa.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni on poly- 35 peptidi, jonka molekyylipaino on noin 44 000 - 48 000. • 92222

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni on poly-peptidi, jonka molekyylipaino on noin 200 000.

13. Molekyylikompleksi, joka sisältää antigeeniin 5 sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni on polypeptidi, jonka molekyylipaino on 44 000 - 48 000, tai polypeptidi, jonka molekyylipaino on 200 000 ja että vasta-aine on patenttivaatimuksen 6 mukainen vasta-aine. 10 li 92222