JP2735947B2 - Ｂ細胞リンパ腫に対するイディオタイプのワクチン接種 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 脊椎動物の免疫系は、宿主に異物であると認識され
る、病原体、細菌およびウイルスのような物質を認識し
排除するように機能する。さらに、免疫系はまた、細胞
表面上に改変されたタンパク質を発現するために異物で
あると見なされる悪性細胞を、排除する監視系としての
役割も果たす。この抗原と呼ばれる、異物物質に対する
免疫応答には、体液性応答および細胞性応答が包含され
る。体液性応答には、抗原を認識して抗原に結合する。
特異的な抗体または免疫グロブリンの生産が含まれる。
細胞性応答には、抗原の排除を助ける細胞の増殖が含ま
れる。

免疫応答は、抗原または抗原に類似した分子を含むワ
クチン（または免疫原）による能動免疫によって、しば
しば誘導または増強され得る。しばしば、免疫原に加え
て、アジュバントと呼ばれる免疫増強剤を提供すること
が必要とされる。

本発明は、能動免疫の分野に関し、より詳細には、リ
ンパ腫に対する免疫に有用なワクチン、および免疫応答
の程度および特性を変化させるのに有用なアジュバント
に関する。

Ｂリンパ系腫瘍の大部分は、細胞膜上の免疫グロブリ
ン（Ig）の発現により特徴づけられる。表面Igのイディ
オタイプ（id）は、腫瘍特異的抗原またはマーカーと見
なし得、これは免疫療法の標的として使用されてきた。
モノクローナル抗id抗体は、これらの腫瘍の免疫生物学
の研究に用いられ、治験にも使用された。しかし、抗id
モノクローナル抗体（Mabs）、特にマウス起源のものの
受身投与は、多数の問題によって妨害されており、その
ため、これらの抗体の臨床上の応用性が限定されてき
た。これらの問題としては、（ｉ）循環しているフリー
の抗原、（ii）マウスIgに対する免疫応答の生起、およ
び（iii）腫瘍細胞の不均一性がある。いくつかの研究
により、イディオタイプタンパク質またはサブフラグメ
ントによる免疫が形質細胞腫またはIgを表面に有するリ
ンパ腫の過成長から動物を防護し得ることが報告されて
いる。誘導される免疫応答には、抗イディオタイプ抗体
およびＴ細胞依存性免疫が含まれる。腫瘍細胞のチャレ
ンジに対してこのような抗体および免疫を引き起こすた
めには、イディオタイプタンパク質を強力な免疫原性キ
ャリヤに結合させ、この複合体を強力なアジュバントの
存在下に提供する必要があることが、繰り返し示されて
いる。

イディオタイプの不均一性が、抗イディオタイプ抗体
を用いた臨床治験において開示されている。モノクロー
ナル抗体によって誘導される初期の部分的応答の後、オ
リジナルの腫瘍部位からイディオタイプ変異腫瘍細胞が
出現した。このようなイディオタイプ変異腫瘍細胞は、
モノクローナル抗体処置前から既に存在していたが、こ
れらはイディオタイプ陽性腫瘍細胞の選択的な除去の
後、増殖可能になったものと思われる。

同系腫瘍由来のIgまたはそのサブフラグメントによる
動物の能動免疫は、抗id抗体の生産を生じ、これは引続
き腫瘍細胞に曝されて防御を誘導する。しかし、大抵の
場合、腫瘍は、あまりにも弱いか、または治療上有利に
間に合うには遅すぎる応答しか引き起こさない。従っ
て、修飾されたid−Igまたは強力な非生理的アジュバン
トのいずれかが必要であった。非生理的免疫原または非
特異的アクチベーターは、ヒトの患者への使用には非常
に望ましくないものである。自己免疫疾患の発生を導き
得るポリクローナルβ細胞応答の誘導の可能性を含む、
副作用のためである。

従って、ワクチンの免疫原性を高める方法が長年望ま
れてきた。好ましくは、このような免疫と一緒に使用さ
れる全てのアジュバントは、治療上有用であるのに十分
な強さの免疫応答を提供すべきである。特に、有効なポ
リクローナル応答が引き起こされるように、同系Igで腫
瘍宿主を能動免疫する手段が、必要とされている。本発
明は、この必要性を満足し、それに関連した利点をも提
供する。

発明の要旨 本発明は、目的のイディオタイプタンパク質を予めパ
ルスした樹枝状細胞を投与することにより、病原性リン
パ球に対する有効な免疫応答を誘導する方法を提供す
る。１つの実施態様においては、リンパ腫に対する哺乳
類の能動免疫の方法が提供される。この実施態様は、樹
枝状細胞をイディオタイプIgにさらして、イディオタイ
プをパルスされた樹枝状細胞を作成する工程と、このイ
ディオタイプをパルスされた樹枝状細胞を哺乳類に戻す
注射を行う工程とを包含し、これにより、リンパ腫細胞
に対する免疫が誘導される。もう１つの実施態様では、
本発明は、イディオタイプ細胞およびパルスされた樹枝
状細胞の両方を投与することに関する。

図面の簡単な説明 図1.イディオタイプ−KLH複合体による免疫によって
誘導された腫瘍免疫。C₃H/Heマウスを、38C13 IgMのKLH
複合体 グループII、−Ｏ−Ｏ−３回注射：グループＩ、−Ｏ−
Ｏ−１回注射：グループIII）またはコントロールIgM
（−Ｏ−Ｏ−２回注射：グループIV）により、一週間間
隔で免疫した。最終免疫の一週間後、マウスに、10²個
の38C13腫瘍細胞を接種した。数字は、表Ｉの実験グル
ープに対応する。

図2.イディオタイプIgMをパルスされた樹枝状細胞（D
C）による免疫の、マウスの腫瘍接種後の生存に対する
影響。C3H/Heマウスを、38IC13 IgM−DC（−Ｏ−Ｏ−：
グループＶ）、またはコントロールIgM−DC または可溶性イディオタイプタンパク質 により、腫瘍細胞（10²個）チャレンジの28日前に免疫
した。７日前にマウスは可溶性IgMでもう一度ブースト
免疫した。数字は、表Ｉの実験グループに対応する。

図3.フロイントアジュバント中の38C13−KLHを用いた
免疫と、38C13をパルスされたDCとで、誘導された同系
抗イディオタイプ抗体を比較。フロイントアジュバント
中に乳化した38C13 KLH複合体により、または38 C13を
パルスされたDCにより、３回（−Ｏ−Ｏ−：グループ
Ｉ）または２回 免疫されたマウスの血清を、予め38C13 IgMでコートさ
れたウエルに加えた。血清を、８個のウエルにわたって
希釈した。結合した抗体を、酵素標識したヤギ抗マウス
IgGを加えて検出した。

発明の詳細な説明 本発明は、免疫の効果を高める方法に関する。このよ
うな方法は、多くの腫瘍マーカーのように、有効な免疫
応答を生じさせるのが困難な状況での免疫に対して、特
に有用である。しかし、この方法はまた、様々な病原に
対する免疫に組み合わせても適用される。

近年、インビトロでウイルスまたはポリクローナル抗
イディオタイプ抗体（Ab₂）をパルスされたマウスの樹
枝状細胞が、劇的に抗ウイルス免疫応答を増大させるこ
とが、FrancotteおよびUrbain PNAS 82:8149（1985）に
よって報告された。樹枝状細胞（DC）は、その細胞表面
上に付着した抗原に対する免疫応答の強力な刺激者であ
ることが示されている。抗原をパルスされたDCは、休眠
Ｔリンパ球を始動させ、このリンパ球は次に、抗原特異
的Ｂリンパ球に、必要な介助を与える。

本発明は、インビトロにおいて病原性リンパ球からの
イディオタイプタンパク質をパルスされたマウスDCが、
これまでは病原性リンパ球に対して有効な免疫応答を生
起させるのに必要と考えられていた、免疫原生キャリヤ
および非生理的アジュバントの代わりをし得る、という
予期されなかった結果を含んでいる。本願で使用される
用語「病原性リンパ球」とは、制御されない悪性リンパ
球、または自己免疫応答に関連するリンパ球のいずれか
を指す。用語「病原性リンパ球からのイディオタイプタ
ンパク質」とは、免疫グロブリン、またはイディオタイ
プエピトープを有する免疫グロブリンのフラグメント
（FAB）を指す。

引続く腫瘍細胞投与に対する防御は、免疫原性キャリ
ヤに結合させ、フロイントアジュバントに乳化させた同
系イディオタイプを用いて、またはインビトロでイディ
オタイプをパルスされたDCを用いて、予め免疫すること
によって得ることができる。無関連なIgMをパルスされ
た同数のDCで処理され、または可溶性同系38C13 IgMの
同一の投与量で免疫されたコントロール群は、長期にわ
たる生存を示さなかった。これらのデータは、樹枝状細
胞による増大効果および腫瘍増殖のイディオタイプ特異
的抑制を、明確に示している。

C₃H/Heマウスを、同系38C13リンパ腫由来のイディオ
タイプ免疫グロブリンＭ（IgM）で免疫した。イディオ
タイプ特異的な体液性および細胞性の免疫、および致死
の腫瘍細胞チャレンジに対する防御を得るためには、免
疫原性キャリヤタンパク質（キーホールリンペットヘモ
シアニン;KLH）および強力な非生理的免疫刺激剤（完全
なフロイントアジュバント;CFA）との複合体化が必要で
あった。しかし、樹枝状細胞が、イディオタイプ提示の
ために用いられる場合には、免疫原ギャリヤもアジュバ
ントも必要ではなかった。インビトロで非修飾イディオ
タイプタンパク質をパルスされ、動物に再注射された樹
枝状細胞は、続く腫瘍接種に対して有意な抵抗性を誘導
し得た。あるいは、FABフラグメントまたはイディオタ
イプエピトープを有する合成ペプチドを、接種に使用し
得た。天然の38C13イディオタイプ（id）に対する応答
として増殖した、イディオタイプ特異的Ｔリンパ球およ
び細胞障害性Ｔリンパ球が、両群において観察された。
細胞免疫応答は、38C13−KLHおよび完全フロイントアジ
ュバントで処理した場合よりも、樹枝状細胞で処理した
動物においてより強かった。両免疫方法の結果は、イデ
ィオタイプ変異体の出現に起因する腫瘍細胞のエスケー
プ、または腫瘍細胞の休眠を伴うことなく、長期間の生
存を得た。注目すべきことには、一年後では、80％のマ
ウスがまだ生存していた。

免疫した動物の血清分析によると、防御効果は、血清
抗イディオタイプ力価と単純には相関していなかった。
フロイントアジュバントを用いた過免疫によって誘導さ
れた、高レベルの抗イディオタイプ抗体は、腫瘍細胞の
表面Igを改変し得、次いでこの腫瘍細胞は、id特異的Ｔ
細胞による破壊を免れることができたのであろう。

イディオタイプタンパク質の存在下に増殖したＴ細胞
は、免疫の３ヶ月以降でも実証することができた。これ
らの細胞は、その表現型は知られていないが、同系腫瘍
細胞に細胞障害性効果を有していた。

以下の実施例は、本発明を説明することを目的として
おり、本発明を限定するものではない。

実施例Ｉ 樹枝状細胞の調製 樹枝状細胞（DC）はSteinmanおよびCohen,J.Exp.Med.
139:380−397（1974）に記載の方法を用いて単離した。
簡単に述べると、凝集物またはクラスターを含まない脾
臓細胞の懸濁液をウシ血清アルブミン（BSA）（Ｐ＝1,0
82g/cm³）；画分Ｖ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O）の溶液に、1ml当り1x10⁸細胞の濃度で懸濁した。低
密度のBSA溶液（ｐ＝1,060g/cm³）を、この上に積層し
た。試験管を、４℃、10,000gで30分間回転させて平衡
化した。浮遊細胞を回収し、RPMI 1640培地で２回洗浄
した。細胞を完全培地（RPMI 1640、５％FCS、5x10^-5M
2−メルカプト−エタノール、ペニシリン、ストレプト
マイシン、最小必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリ
ウム）に再懸濁し、1ml当り1x10⁵細胞の濃度でプラスチ
ックペトリ皿に移して、５％のCO₂中で37℃で３時間放
置した。非付着細胞を、ゆるやかにピペットで除去し、
付着細胞を完全培地にさらに16時間維持した。低密度の
非付着細胞を含む上清み液を、DC源として使用した。マ
クロファージはプラスチック表面に再度付着する傾向が
あるが、DCは付着しないままであったことから、夾雑し
ているマクロファージを抗原をパルスする間に除去し
た。最終細胞調製物の純度は、走査型電子顕微鏡、透過
型電子顕微鏡、免疫蛍光検査、およびアクリジンオレン
ジ染色により調べた。FITCで標識したヤギ抗マウスIg、
およびビオチンで標識した抗Thy−1.2（Becton Dickins
on）を用いて、それぞれＢおよびＴ細胞を特徴づけた。

樹枝状細胞は、24ウエルの平底プレート（１ウエル当
り1ml）に1ml当り5x105細胞濃度で、完全培地に再懸濁
した。50マイクログラムの精製した38C13 IgM（κ）イ
ディオタイプタンパク質、または無関連のマウスIgM
（κ）（ABPC−Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を加
えた。プレートを、５％のCO₂中に37℃で、４から５時
間放置した。細胞を無菌PBSで数回洗浄し、1ml当り2.5x
10⁵細胞に再懸濁した。

実施例II イディオタイプIgを用いた同系の免疫 C₃H/Heマウスは、Catholic University of LeuvenのL
aboratory Animal Centerより入手した。Balb/cおよびF
1（C₃H/He x Balb/c）マウスは、Free University of B
russels（VUB）のLaboratory Animal Facilityで飼育さ
れた。38C13は、C₃H起源の、発がん物質（DMBA）により
誘導されたＢ細胞腫瘍である。これらの腫瘍細胞および
この研究に使用したインビトロ適合された細胞系は、細
胞膜上にIgM（κ）を発現するが、大量のIgは分泌しな
い。イディオタイプIgM（κ）を分泌する細胞系は、腫
瘍細胞を非分泌骨髄腫細胞系（P3 x 63 Ag 8.653）と融
合させることにより得られた。

各々10匹のマウスからなる４つの群を、表１に示すス
ケジュールに従って、KLHに架橋し、フロイント完全ア
ジュバント（CFA）、不完全アジュバント（ICFA）また
はPBSに乳化した50μｇのイディオタイプ38C13 IgM、ま
たは無関連のABPC IgMで免疫した。最後の注射から一週
間後、38C13腫瘍細胞（10²細胞／マウス）を、腹腔内注
射した。この投与量は、30日目までに、非処理動物の10
0％を致死させる。腫瘍の存在および死亡日を記録し
た。

図１は、生存率に対する免疫処置の防御効果を、典型
的実験について示す。最も効果的な免疫スケジュール
は、イディオタイプIgMをCFAを用いて１回、ICFAを用い
て１回の２回投与するものであった（群II）。これらの
結果には再現性があった。無関連のIgM−KLH複合体（群
IV）または複合体にしないイディオタイプIgM（群VII）
を用いた場合には、長期にわたる生存例はなかった。

実施例II イディオタイプIgMをパルスされた樹枝状細胞による免
疫 表IIの免疫スケジュールに従って、各10匹のC₃H/Heマ
ウスからなるこれらの群に、実施例Ｉのように調製した
5x10⁴IgMをパルスした樹枝状細胞を腹腔内注射した。

抗原の最終投与から一週間後、100個の38C13細胞を腹
腔内に注射した。腫瘍細胞の存在および死亡日を記録し
た。

イディオタイプIgMをパルスした樹枝状細胞による免
疫の防御効果を、図２に示す。イディオタイプをパルス
したDCの単回注射の後、可溶性イディオタイプタンパク
質のダースター投与を行った結果、38C13−KLH複合体に
CFAを用いた実験と同等な、腫瘍投与後の生存を得た。
コントロールの免疫動物（無関連なIgMをパルスしたDC
またはイディオタイプタンパク質単独）は、何等防御を
示さなかった。

実施例IV 体液性および細胞性免疫の評価 体液性免疫の役割を評価するために、同系の抗イデイ
オタイプ抗体のレベルを、以下のように調製したIgG特
異的ELISAで測定した。

Maloneyら、Hybridoma 4:191−209（1985）の方法に
従って、グルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペ
ットヘモシアニン（KLH）（Calbiochem−Behring,Hoech
st）と架橋した精製イディオタイプタンパク質で、Balb
/cマウスを免疫した。上記文献はここに援用される。脾
臓細胞を、P3 x 63 Ag 8.653骨髄腫細胞系にハイブリダ
イズした。モノクローナル抗体E4および8E3は、38C13 I
gM（κ）と強く反応し、正常なC₃H血清によって阻害さ
れず、正常な脾臓細胞にも精製されたIgM骨髄腫タンパ
ク質にも結合しなかった。C₃H起源のモノクローナル抗
イディオタイプ抗体S5A8およびラットモノクローナル抗
体R7D7を、硫酸アンモニウム（40％）を使用して２回沈
澱によって、腹水液から精製した。当該技術分野で周知
の方法に従って、抗体のビオチン標識を行った。

腫瘍細胞を注射する前に、眼窩静脈叢の穿刺により、
マウスから採血した。個々のマウスからの血清を同一の
実験群についてプールした。同系の抗イディオタイプ抗
体を、上記のELISAアッセイによって検出した。

図３の結果は、38C13−KLHとCFAにより免疫したマウ
スで抗id抗体レベルが高いことを示している。DCで免疫
した動物の血清では、これよりはるかに低レベルの抗id
抗体が検出され、このことは、抗体レベルと生存との間
には明確な相関関係がなかったことを示している。CFA
中のIgM−KLHを３回注射することにより、血清の抗id抗
体のレベルは高いが、生存率は低い結果となった（図
１）。

両免疫方法における長期生存者の脾臓にイディオタイ
プ特異的Ｔリンパ球を検出することによって、細胞性免
疫を測定した。Ｔ細胞について富化した脾臓細胞を、可
溶性イディオタイプタンパク質またはセファロースビー
スに結合させたイディオタイプIgMの存在下で３日間培
養した。コントロールのウエルは、４μg/mlのコンカナ
バリンＡを含有させて24時間培養したラット脾細胞培養
物の培養上清を10％（v/v）含むIL2含有培地中に、脾細
胞を含むか、または無関連のIgMタンパク質を含んでい
た。生存する動物の脾臓細胞の懸濁液を0.2％のBSAでプ
レコートしたプラスチックペトリ皿（80mm）に、3mlの
完全培地に10⁷細胞/mlで移し、37℃で１時間（27）維持
した。非付着細胞を、ウサギ抗マウス（κ）（10μg/m
l）でプレコートしたプレートに移し、４℃で１時間放
置した。２回目のプレーティングを、ヤギ抗マウスig
（Tago,Burlingame,CA）でプレコートしたプレートで行
った。この２回にわたるプレーティング工程後の回収率
は、一般に、有核細胞の25から30％であった。後の実験
では、Ｔ細胞は、当該技術分野に周知の方法により、ナ
イロンウールに結合させることにより富化された。Ｂ細
胞の混入は、蛍光ヤギ抗マウスIg抗体（Tago）を用いた
免疫蛍光検査によって調べた。Ｂ細胞画分は、通常、５
から７％であった。Ｔ細胞が富化された細胞懸濁液を、
丸底ウエル（200μl/ウエル、5x10⁵細胞/ml）に置い
た。20μｌの刺激剤（50μg/ml）をウエルに加えた。３
日間培養の後、1.5μCiの［メチル³H］−チミジンを各
ウエルに加えた。こうして18時間のパルスを行った後、
細胞をガラスファイバーフィルターに収穫し、組み込ま
れた放射能をシンチレーションカウンティングによって
測定した。測定はすべて４試行で行い、データは、平均
cpm±SEMで表した。

インビトロにおける刺激の結果を表IIに示す。DC−38
C13で処理されたマウスからのＴ細胞は、CFA中のイディ
オタイプKLH複合体で処理されたマウスまたはコントロ
ールマウスと比較して、イディオタイプタンパク質によ
り良く反応した。

表2.“富化された脾臓Ｔ細胞を、38C13IgM、セファロー
スビーズに結合した38C13 IgM、IL2含有培地または可溶
性無関連IgMの存在下で、３日間インビトロで培養し
た。培養の最後の18時間に、³H−チミジン取り込みの程
度により、刺激を測定した。^＋正常なC₃H/Heマウスを使
用して、未感作Ｔ細胞を精製した。^＋無関連IgMと比較
したｔ−テストで有意、ｐ＜0.001。^§未感作Ｔ細胞と
比較したｔ−テストで有意、ｐ＜0.001。^＃未感作Ｔ細
胞と比較したｔ−テストで有意、ｐ＞005。”未感作Ｔ
細胞と比較したｔ−テストで有意、ｐ＜0.002。

Ｔ細胞を富化した脾臓細胞はまた、以下のように、通
常の細胞で媒介性の細胞障害性アッセイにも使用した。

腫瘍細胞をＬ−［4,5^-3H］ロイシン（Amersham）で標
識し、Ｕ底のマイクロウエルに1x10⁴個の標的細胞（100
μｌ）で、入れた。エフェクター細胞（生存動物からの
富化された脾臓Ｔ細胞）を、100/1、50/1、25/1、6.25/
1、3/1、1.5/1の割合で３試行ずつ、最終容量を200μｌ
となるように加えた。細胞を、ゆるやかな遠心分離によ
り沈降させ、プレートを５％CO₂を含む湿潤雰囲気中に3
7℃で16時間インキュベートした。50マイクロリットル
の上清み液を用いて、遊離した放射能をカウントした。
自発遊離および最大遊離は、Ｔ細胞の代わりに100μｌ
の完全培地または100μｌの0.1％NP40を加えることによ
って決定した。特異的な細胞障害性を、以下の式に従っ
て計算した。

免疫リンパ球による細胞障害性を、Ｔ細胞を単離した
日、およびインビトロにおいて38C13が結合したセファ
ロースビーズで刺激した３日後に、測定した。刺激しな
いＴ細胞は、38C13標的細胞を溶解できなかった。しか
し、インビトロにおける刺激後は、（100/1のエフェク
ター／標的比で16時間インキュベーションしたアッセイ
において）38C13−KLHで刺激された細胞による38C13腫
瘍細胞の特異的溶解が11％であったのに対して、DC−38
C13で刺激されたＴ細胞による溶解は21％であった。

実施例Ｖ 残存腫瘍細胞 長期生存動物の脾臓における残存腫瘍細胞の存在を、
免疫組織学およびインビトロにおける培養により追跡し
た。クリオスタット切片をアセトン中に固定し、モノク
ローナル抗体、次いでストレプトアビジン−ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロリドで染色した。長期生存動物からの脾
臓の凍結切片を、ビオチン化モノクローナル抗イディオ
タイプ抗体で染色した。これらの抗体は、腫瘍が侵襲し
た脾臓切片で予めテストした。この脾臓切片において、
これらの抗体は表面と細胞質イディオタイプIgMとの両
方を染色する。長期生存動物の脾臓の連続切片で、残存
腫瘍細胞は検出され得なかった。脾臓から単離されたＢ
リンパ球を、富化された馴化培地においてインビトロで
培養した。この研究で使用された38C13腫瘍細胞は、イ
ンビトロでの増殖に適応しているが、いずれの培養物も
腫瘍細胞の発生を示さなかった。最後に、Ｂ細胞を、放
射線照射した同系の未処置動物に移入した。６ヶ月間観
察した結果、腫瘍の増殖は見られなかった。これらのデ
ータは、長期生存動物の脾臓に、残存腫瘍細胞が残って
いなかったことを示す。

実施例VI 樹枝状細胞のその他の調製法 10×ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（10xHBSSから希
釈;Gibco Cat.Nr.310−4065A/J.）中の、100ユニット/m
lのコラゲナーゼ（CLS III,Worthington,Cat.Nr4182,＜
lg/バイアル）溶液（無菌GIBCO7.5％重炭酸イオンでpH
7.2に調節）を用いて、脾臓を還流した。細胞を10％のF
CSを含むRPMI培地を含む試験管に収集した。残った部分
を、インキュベータ中で、400ユニット/mlのコラゲナー
ゼ溶液中で15分間インキュベートした。この溶液を約50
回ピペッティングして、大半の細胞を収集した。すべて
の細胞をプールし、ペレット化した。

ウシ血清アルブミンを以下のように調製した:BOVUMIN
AR COHN FRACTION V粉末（Armour Pharmaceutical Comp
any,Kankakee,Illinois）を、デシケータ中に４℃で保
存した。ガラスビーカー（アルミニウム箔で封鎖した）
中に、65mlの蒸溜水、186mlのPBS、29mlの1M NaOHおよ
び107gのBSAを混合し、撹拌せずに４℃で24時間放置し
た。屈折率測定器で濃度を調べて、1.3855−1.3865の間
に維持した。溶液の濃度が高すぎる場合には、ゆっくり
と撹拌して、冷PBSを加えた。溶液を濾過し、４℃で放
置した。ペレットを冷えたBSA溶液に再懸濁し、約2mlの
血清を含まない培地を勾配の一番上に加えて10,000gで
遠心分離した。低密度の細胞を収集したところ、脾臓細
胞の約10％であった。

100mmの培養皿を用いて、10％のFCSを含む培地で、細
胞を２時間培養した。激しくピペッティング（１皿当り
15分間）することによって、非付着の細胞を洗浄除去し
た。細胞を再び血清を含まない培地で１時間インキュベ
ートし、ゆるやかにピペットすることによって非付着の
細胞を除去した。残った付着細胞を、10％のFCSを含むR
PMI中で、１晩培養した。次ぎの日、非付着の細胞を、
ゆるやかにピペットすることによって収集した。脾臓１
個当り、2x10⁵から5x10⁵個の樹枝状細胞が得られた。

本発明は、好ましい上記の実施態様を参照して説明し
たが、本発明の精神を逸脱しない限り、様々な改変が可
能であることを理解されたい。従って、本発明は、以下
の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バン キャン，ベンジャミン ベルギー国 ベー―1090 ブリュッセル ラービークラーン 103 (72)発明者 ティエレマンス，クリスチャン ベルギー国 ベー―1090 ブリュッセル ラービークラーン 103 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．82，ＰＰ．8149− 8152，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ 1985

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞膜上にイディオタイプタンパク質を発
   現する病原性リンパ球に対して有効な体液性および細胞
   性免疫応答を哺乳類に誘導するための注射用組成物であ
   って、インビトロにおいて、樹枝状細胞を該病原性リン
   パ球のイディオタイプタンパク質にさらして、イディオ
   タイプをパルスした樹枝状細胞を含有する組成物。
2. 【請求項２】前記病原性リンパ球が腫瘍細胞である、請
   求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】前記腫瘍細胞が、リンパ腫細胞である、請
   求項２に記載の組成物。
4. 【請求項４】前記リンパ腫細胞が、Ｂリンパ球様細胞で
   ある、請求項３に記載の組成物。
5. 【請求項５】前記イディオタイプタンパク質が、免疫グ
   ロブリンである、請求項１に記載の組成物。
6. 【請求項６】前記イディオタイプタンパク質が、イディ
   オタイプを有する免疫グロブリンのフラグメントであ
   る、請求項１に記載の組成物。
7. 【請求項７】前記哺乳類が、ヒトである、請求項１に記
   載の組成物。
8. 【請求項８】インビトロにおいてイディオタイプ免疫グ
   ロブリンにさらされた樹枝状細胞を含む、イディオタイ
   プをパルスした樹枝状細胞。