JPH05507905A - Ｂ細胞リンパ腫に対するイディオタイプのワクチン接種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明細書 Ｂ　リンパ　に　る イディオ　イブのワクチン 発明の背景 を椎動物の免疫系は、宿主に異物であると認識される、病原体、細菌およびウィ ルスのような物質を認識し排除するように機能する。さらに、免疫系はまた、細 胞表面上に改変されたタンパク質を発現するために異物であると見なされる悪性 細胞を、排除する監視系としての役割も果たす。この抗原と呼ばれる、異物物質 に対する免疫応答には、体液性応答および細胞性応答が包含される。体液性応答 には、抗原を認識して抗原に結合する、特異的な抗体または免疫グロブリンの生 産が含まれる。細胞性応答には、抗原の排除を助ける細胞の増殖が含まれる。

免疫応答は、抗原または抗原に類似した分子を含むワクチン（または免疫原）に よる能動免疫によって、しばしば誘導または増強され得る。しばしば、免疫原に 加えて、アジュバントと呼ばれる免疫増強剤を提供することが必要とされる。

本発明は、能動免疫の分野に関し、より詳細には、リンパ腫に対する免疫に有用 なワクチン、および免疫応答の程度および特性を変化させるのに有用なアジュバ ントに関する。

Ｂリンパ系腫瘍の大部分は、細胞膜上の免疫グロブリン（Ｉｇ）の発現により特 徴づけられる。表面１ｇのイディオタイプ（ｉｄ）は、腫瘍特異的抗原またはマ ーカーと見なし得、これは免疫療法の標的として使用されてきた。モノクローナ ル抗ｉｄ抗体は、これらの腫瘍の免疫生物学の研究に用いられ、油膜にも使用さ れた。しかし、抗ｉｄモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）、特にマウス起源のもの の受身投与は、多数の問題によって妨害されており、そのため、これらの抗体の 臨床上の応用性が限定されてきた。これらの問題としては、（ｉ）循環している フリーの抗原、（ｉｉ）マウス■ｇに対する免疫応答の生起、および（ｉｉｉ） Ｉｌｌ瘍細胞の不均一性がある。いくつかの研究により、イディオタイプタンパ ク質またはサブフラグメントによる免疫が、形質細胞腫またはＩｇを表面に有す るリンノス腫の過成長から動物を防護し得ることが報告されている。誘導される 免疫応答には、抗イデイオタイプ抗体およびＴ細胞依存性免疫が含まれる。腫瘍 細胞のチャレンジに対してこのような抗体および免疫を引き起こすためには、イ ディオタイプタンパク質を強力な免疫原性キャリヤに結合させ、この複合体を強 力なアジュバントの存在下に提供する必要があることが、繰り返し示されている 。

イディオタイプの不均一性が、抗イデイオタイプ抗体を用いた臨床油膜において 開示されている。モノクローナル抗体によって誘導される初期の部分的応答の後 、オリジナルの腸瘍部位からイディオタイプ変異腫瘍細胞が出現した。このよう なイディオタイプ変異腫瘍細胞は、モノクローナル抗体処置前から既に存在して いたが、これらはイディオタイプ陽性腫瘍細胞の選択的な除去の後、増殖可能に なったものと思われる。

同系腫瘍由来のＩｇまたはそのサブフラグメントによる動物の能動免疫は、抗ｉ ｄ抗体の生産を生じ、これは引続き腫瘍細胞に曝されて防御を誘導する。しかし 、大抵の場合、腫瘍は、あまりにも弱いか、または治療上有利に間に合うには遅 すぎる応答しか引き起こさない。従って、修飾されたｉｄ−１ｇまたは強力な非 生理的アジュバントのいずれかが必要であった。非生理的免疫原または非特異的 アクチベーターは、ヒトの患者への使用には非常に望ましくないものである。自 己免疫疾患の発生を導き得るポリクローナルβ細胞応答の誘導の可能性を含む、 副作用のためである。

従って、ワクチンの免疫原性を高める方法が長年型まれてきた。好ましくは、こ のような免疫と一緒に使用される全てのアジュバントは、治療上有用であるのに 十分な強さの免疫応答を提供すべきである。特に、有効なポリクローナル応答が 引き起こされるように、同系１ｇで腫瘍宿主を能動免疫する手段が、必要とされ ている。本発明は、この必要性を満足し、それに関連した利点をも提供する。

発明の要旨 本発明は、目的のイディオタイプタンパク質を予めノイルスした樹枝状細胞を投 与することにより、病原性リンパ球に対する有効な免疫応答を誘導する方法を提 供する。１つの実施態様においては、リンパ腫に対する哺乳類の能動免疫の方法 が提供される。この実施態様は、樹枝状細胞をイディオタイプＩｇにさらして、 イディオタイプをパルスされた樹枝状細胞状細胞を哺乳類に戻す注射を行う工程 とを包含し、これにより、リンパ腫細胞に対する免疫が誘導される。もう１つの 実施態様では、本発明は、イディオタイプ細胞およびパルスされた樹枝状細胞の 両方を投与することに関する。

図面の簡単な説明 図１．イディオタイプ−ＫＬＨ？！！合体による免疫によって誘導された腫瘍免 疫。Ｃ３■／Ｈｅ　７ウスを、３ｇＣｌ３　［ｇＭめＫＬＦｉ複合体（−ｍ−２ 回注射ニゲループ１１．−０−０−ｊ回注射ニゲループ１１−０−０−１回注射 ニゲループＩＩ＋）またはコントａ　−／ｌ／　［ｇＭ　（−〇−０−２回注射 ニゲループＩＶ）により、−週間間隔で免疫した。

最終免疫の一週間後、マウスに、１０２個の３８Ｃ１３１１瘍細胞を接種した。

数字は、表１の実験グループに対応する。

図２．イディオタイプＩｇＭをパルスされた樹枝状細胞（ＤＣ）による免疫の、 マウスの腫瘍接種後の生存に対する影響。Ｃ３Ｈ／Ｒｅｖ　ウスを、３ｇＩＣｌ ３１ｇＭ−ＤＣ（−０−０−ニゲループｖ）、またはコントロールＩｇＭ−ＤＣ （−・−・−二グループＶ［）または可溶性イディオタイプタンパク質（−◆− ◆−ニゲループＶｌｌ）により、腫瘍細胞（１０２個）チャレンジの２８日前に 免疫した。７日前にマウスは可溶性１ｇＭでもう一度ブースト免疫した。数字は 、表Ｉの実験グループに対応する。

図３．フロインドアジュバント中の３８Ｃ１３−ＫＬＨを用いた免疫と、３８Ｃ １３をパルスされたＤＣとで、誘導された同系抗イディオタイプ抗体を比較。フ ロイントアジニノ＜シト中に乳化した３８Ｃ１３ＫＬＥＩ複合体により、または ３８　Ｃ１３をノくパルスされたＤＣＩこより、３回（−ｏ−ｏ−ニゲループ１ ）または２回（−一・−ニゲル−プＩ！＞免疫されたマウスの血清を、予め３８ Ｇ１３１ｇＭでコートされたウェルに加えた。血清を、８個のウェルにわたって 希釈した。結合した抗体を、酵素標識したヤギ抗マウスＩｇＧを加えて検出した ０ 発明の詳細な説明 本発明は、免疫の効果を高める方法に関する。このような方法は、多（の腫瘍マ ーカーのように、有効な免疫応答を生じさせるのが困難な状況での免疫に対して 、特に有用である。

しかし、この方法はまた、様々な病原に対する免疫（こ組み合わせても適用され る。

近年、インビトロでウィルスまたはポリクローナル抗イディオタイプ抗体（Ａｂ ２）をフィルスされたマウスの樹枝状細胞力（、劇的に抗ウイルス免疫応答を増 大させること力（、ＦｒａｎｃｏｔｔｅおよびＵｒｂａｉｎ　ＰＮＡＳ　８２： ８１４９　（１９８５）によって報告された。樹枝状細胞（ＤＣ）は、その細胞 表面上に付着した抗原（こ対する免疫応答の強力な刺激者であることが示されて （入る。抗原を、＜ルスされたＤＣは、休眠Ｔリン、＜球を始動させ、この１ノ ンノ＜球は次に、抗原特異的Ｂリン、ｆ球に、必要な介助を与える。

本発明は、インビトロにおいて病原性リンノく球力）らのイディオタイプタンパ ク質をフィルスされたマウスＤＣ力（、これまでは病原性リンパ球に対して有効 な免疫応答を生起させるの（こ必要と考えられていた、免疫原性キャリヤおよび 非生理的アジュバントの代わりをし得る、という予期されなかった結果を含んで いる。本願で使用される用語「病原性リンパ球」とは、制御されない悪性リンパ 球、または自己免疫応答に関連するリンパ球のいずれかを指す。用語「病原性リ ンパ球からのイディオタイプタンパク質」とは、免疫グロブリン、またはイディ オタイプエピトープを有する免疫グロブリンのフラグメント（ＦＡＢ）を指す。

引続く腫瘍細胞投与に対する防御は、免疫原性キャリヤに結合させ、フロインド アジユバントに乳化させた同系イディオタイプを用いて、またはインビトロでイ ディオタイプをパルスされたＤＣを用いて、予め免疫することによって得ること ができる。無関連なＩｇＭをパルスされた同数のＤＣで処理され、または可溶性 同系３８Ｃ１３１ｇＭの同一の投与量で免疫されたコントロール群は、長期にわ たる生存を示さなかった。これらのデータは、樹枝状細胞による増大効果および 腫瘍増殖のイディオタイプ特異的抑制を、明確に示している。

Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを、同系３１１Ｃ１３リンパ腫由来のイディオタイプ免疫グ ロブリンＭ（ＩｇＭ）で免疫した。イディオタイプ特異的な体液性および細胞性 の免疫、および致死の腫瘍細胞チャレンジに対する防御を得るためには、免疫原 性キャリヤタンパク質（キーホールリンベットヘモシアニン；にＬＨ）および強 力な非生理的免疫刺激剤（完全な７０インドアジュバント；ＣＦディオタイブ提 示のために用いられる場合には、免疫原キャリヤもアジユバントも必要ではなか った。インビトロで非修飾イディオタイプタンパク質をフィルスされ、動物に再 注射された樹枝状細胞は、続く腫瘍接種に対して有意な抵抗性を誘導し得た。あ るいは、ＦＡＢフラグメントまたはイディオタイプエピトープを有する合成ペプ チドを、接種に使用し得た。天然の３８Ｃ１３イデイオタイプ（ｉｄ）に対する 応答として増殖した、イディオタイプ特異的Ｔリンノく球および細胞障害性ＴＩ Ｊン／ｆ球が、両群において観察された。細胞免疫応答は、３８Ｃ１３−にＬＨ および完全フロインドアシュＩインドで処理した場合よりも、樹枝状細胞で処理 した動物においてより強かった。両免疫方法の結果は、イディオタイプ変異体の 出現に起因する腫瘍細胞のエスケープ、または腫瘍細胞の休眠を伴うことなく、 長期間の生存を得た。注目すべきことには、−年後で１よ、８０％のマウスがま だ生存していた。

免疫した動物の血清分析によると、防御効果は、血清抗イデイオタイプ力価と単 純には相関していなかった。フロインドアジユバントを用いた過免疫によって誘 導された、高レベルの抗イデイオタイプ抗体は、腫瘍細胞の表面１ｇを改変し得 、次いでこの腫瘍細胞は、ｉｄ特異的Ｔ細胞による破壊を免れることができたの であろう。

イディオタイプタンパク質の存在下に増殖したＴ細胞（孟、免疫の３ケ月以降で も実証することができた。これらの細胞Ｃよ、その表現型は知られていないが、 同系膿瘍細胞１こ細胞障害性効果を有していた。

以下の実施例は、本発明を説明することを巨的としており、本発明を限定するも のではない。

実施例１ １皮犬葺ｎ旦且里 樹枝状細胞（ＤＣ）は５ｔｅｉｒｖａｎおよびＣｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ。

１３９：３８０−３９７　（１９７４）に記載の方法を用いて単離した。簡単に 述べると、凝集物またはクラスターを含まない肺臓細胞の懸濁液をウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）　（Ｐ　１１１．０８２　ｇ／ｃｍ３）　；画分Ｖ　（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）の溶液に、 １１Ｉｌ当りｌｘ　１０’細胞の濃度で懸濁した。低密度のＢＳＡ溶液（ｐ−１ ，０６０ｇ／ａｍ３）を、この上に積層した。試験管を、４℃、１０．０００ｇ で３０分間回転させて平衡化した。浮遊細胞を回収し、ＲＰＭ！　１６４０培地 で２回洗浄した。細胞を完全培地（１２ＰＭｒ　１６４０．５％ＦＣＳ、　５　 ｘ　１０−５Ｍ　２−メルカプト−エタノール、ペニシリン、ストレプトマイシ ン、最小必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウム）に再懸濁し、１ｍｌ当り １　ｘ　１０’細胞の濃度でプラスチックベトリ皿に移して、５％の００２中で ３７℃で３時間放置した。非付着細胞を、ゆるやかにピペットで除去し、付着細 胞を完全培地にさらに１６時間維持した。低密度の非付着細胞を含む上清み液を 、ＤＣ源として使用した。マクロファージはプラスチック表面に再度付着する傾 向があるが、ＤＣは付着しないままであったことから、夾雑しているマクロファ ージを抗原をパルスする間に除去した。最終細胞調製物の純度は、走査型電子顕 微鏡、透過型電子顕微鏡、免疫蛍光検査、およびアクリジンオレンジ染色により 調べた。ＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウスＩｇ、およびビオチンで標識した抗Ｔ ｈｙ−１，２（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、それぞれＢおよび Ｔ細胞を特徴づけた。

樹枝状細胞は、２４ウエルの平底プレート（１ウエル当す１ｍ１）に１ｍｌ当り ５　ｘ　１０５細胞濃度で、完全培地に再懸濁した。５０マイクログラムの精製 した３８Ｃ１３１ｇＭ　（に）イディオタイプタンパク質、または無関連のマウ スＩｇＭ　（ｘ　）　（ＡＢＰＣ−ＳｉｇｍａＣｈｅ＋＊１ｃａｌ　Ｃｏ、、　 Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）を加えた。プレートを、５％のｃｏ２中に３７℃ で、４から５時間放置した。細胞を無菌ＰＢＳで数回洗浄し、１ｍｌ当り２．５ 　Ｘ　１０５細胞に再懸濁した。

実施例ＩＩ イディオ　イブ１を　いたＥＸＩｓの Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスは、Ｃａｔｈｏｌｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｅ ｕｖｅｎのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｎｔｅｒより入手した。

Ｂａ１ｂ／ｃおよびＦｌ　（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　ｘ　Ｂａ１ｂ／ｃ）マウスは、Ｆｒ ｅｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｒｕｓｓｅｌｓ　（ＶＵＢ）のＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｆａｃｉｌｉｔｙで飼育されたｏ　３ａＣ１３は 、Ｃ３Ｈ起源の、発がん物質（ｆ）ＭＢＡ）により誘導されたＢ細胞腫瘍である 。これらの腫瘍細胞およびこの研究に使用したインビトロ適合された細胞系は、 細胞膜上にＩｇＭ（に）を発現するが、大量のＩｇは分泌しない。イディオタイ プＩｇＭ（に）を分泌する細胞系は、腫瘍細胞を非分泌骨髄腫細胞系（Ｐ３　ｘ 　６３　Ａｇ　８．６５３）と融合させることにより得られた。

各々１０匹のマウスからなる４つの群を、表１に示すスケジュールに従って、Ｋ ＬＨに架橋し、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）　、不完全アジュバント （ＩＣＦＡ）またはＰＢＳに乳化した５０μｇのイディオタイプ３８Ｃ１３１ｇ Ｍ、または無関連のＡＲＰＣＩｇＭで免疫した。最後の注射から一週間後、３ａ ｃｔ［癌細胞（１０２細胞／マウス）を、腹腔内注射した。この投与量は、３０ ０日目でに、非処理動物の１００％を致死させる。腫瘍の存在および死亡日を記 録した。

図１は、生存率に対する免疫処置の防御効果を、典型的実験について示す。最も 効果的な免疫スケジュールは、イディオタイプＩｇＭをＣＦＡを用いて１回、Ｉ ＣＦＡを用いて１回の２回投与するものであった（群Ｉ＋）。これらの結果には 再現性があった。無関連のＩｇＭ−１［ＬＨ複合体（群ｍまたは複合体にしない イディオタイプＩｇＭ（群Ｖ［［）を用いた場合には、長期にわたる生存例はな かった。

（以下余白） 表■ 免疫スケジュール ”　時間１　”　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｖ２１日目　３８Ｃ−ＫＬＨ／　− − ＣＦＡ　ｉ、ｐ。

１４４日目　３８Ｃ−ＫＬＨ／　３８Ｃ−ＫＬＨ／　−ＡＢＰＣ−ＫＬＨ／ＩＣ ＦＡ　ｉ、ｐ、ＣＦＡ　ｉ、ｐ、　ＣＦＡ　ｉ、ｐ。

７日目　３８Ｃ−ＫＬＨ／　３８Ｃ−ＫＬＨ／　３８Ｃ−ＫＬ■／　’ＡＢＰＣ −ＫＬ）ｌ／ＰＢＳ　ｉ、ｖ、　ＩＣＦＡ　ｉ、ｐ、　ＣＦＡ　ｉ、ｐ、　ＩＣ ＦＡ　ｉ、ｐ。

°１０匹のマウスからなる実験群 ゛腫瘍細胞（１０２）のｉ、ｐ、注射日を０日目とした場合の、注射前の日数 （以下余白） 実施例ＩＩ 表１１の免疫スケジュールに従って、各１０匹のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスからなるこ れらの群に、実施例Ｉのように調製した５　ｘ　１０’１ｇＭをパルスした樹枝 状細胞を腹腔内注射した。

表ＩＩ ゛時間　Ｖ　Ｖ［Ｖｌ＋ ２８日目　ＤＣ−３８Ｃ１３ｉ、ｖ、ＤＣ−ＡＢＰＣｉ、ｖ、　３８Ｃ１３ｉ、 ｖ。

７日目　３！１ｃ１３　ｉ、ｖ　ＡＢＰＣｉ、ｖ、　３８Ｃ１３ｉ、ｖ。

実験群は１０匹のマウスからなる ゛腫瘍細胞（１０２）のｉ、ｐ、注射日を０日目とし左場合の、注射前の日数 抗原の最終投与から一週間後、１００個の３８Ｃ１３細胞を腹腔内に注射した。

腫瘍細胞の存在および死亡日を記録した。

イディオタイプＩｇＭをパルスした樹枝状細胞による免疫の防御効果を、図２に 示す。イディオタイプを１４ルスしたＤＣの単回注射の後、可溶性イディオタイ ブタンノでり質のダースター投与を行った結果、３８Ｃ１３−ＫＬＨ複合体にＣ ＦＡを用０た実験と同等な、腫瘍投与後の生存を得た。コントロールの免疫動物 （無関連なＩｇＭをパルスしたＤＣまたはイディオタイプタンノ（り質単独）は 、回答防御を示さなかった。

実施例ＩＶ ゛　および　の一 体液性免疫の役割を評価するために、同系の抗イデイオタイプ抗体のレベルを、 以下のように調製したＩｇＧ特異的ＥＬ［ＳＡで測定した。

Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　４：１９１−２０９　（１９８５）の 方法に従って、グルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペットヘモシアニン （ＫＬＨ）　（Ｃａｌｂｆｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、　Ｈｏｅｃｈｓｔ）と 架橋した精製イディオタイプタンパク質で、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫した。

上記文献はここに援用される。膵臓細胞を、Ｐ３　ｘ　６３　Ａｇ　８．５５３ 骨髄腫細胞系にハイブリダイズした。モノクローナル抗体Ｅ４および１ＩＥ３は 、３８Ｃ１３１ｇＭ　（に）と強く反応し、正常なＣ３１１１血清によって阻害 されず、正常な肺臓細胞にも精製された１ｇＭ骨髄腫タンパク質にも結合しなか った。Ｃ３Ｈ起源のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体５５Ａ８およびラット モノクローナル抗体Ｒ７Ｄ７を、硫酸アンモニウム（４０％）を使用して２回沈 澱によって、腹水液から精製した。当該技術分野で周知の方法に従って、抗体の ビオチン標識を行った。

腫瘍細胞を注射する前に、眼窩静脈叢の穿刺により、マウスから採血した。個々 のマウスからの血清を同一の実験群についてプールした。同系の抗イデイオタイ プ抗体を、上記のＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。

図３の結果は、３８Ｃ１３−にＬＨとＣＦＡにより免疫したマウスで抗ｉｄ抗体 レベルが高いことを示している。ＤＣで免疫した動物の血清では、これよりはる かに低レベルの抗ｉｄ抗体が検出され、このことは、抗体レベルと生存との間に は明確な相関関係がなかったことを示している。ＣＦＡ中のＩｇＭ−ＫＬＨを３ 回注射することにより、血清の抗ｉｄ抗体のレベルは高いが、生存率は低い結果 となった（図１）。

両免疫方法における長期生存者の肺臓にイディオタイプ特異的１９７８球を検出 することによって、細胞性免疫を測定した。Ｔ細胞について富化した膵臓細胞を 、可溶性イディオタイプタンパク質またはセファロースビーズに結合させたイデ ィオタイプＩｇＭの存在下で３日間培養した。コントロールのウェルは、４μｇ ／ｉｔのフンカナバリンＡを含有させて２４時間培養したラット牌細胞培養物の 培養上清を１０％（ｖ／ｖ）含むＩＬ２含有培地中に、肺細胞を含むか、または 無関連の１ｇＭタンパク質を含んでいた。生存する動物の肺臓細胞の懸濁液を０ ．２％のＢＳＡでプレコートしたプラスチックベトリ皿（８０ｍｍ）に、３ｍｌ の完全培地に１０７細胞／ｍｌで移し、３７℃で１時間（２７）維持した。

非付着細胞を、ウサギ抗マウス（に）（１０μｇ／＋＊１）　テプレコードシた プレートに移し、４℃で１時間放置した。２回目のブレーティングを、ヤギ抗マ ウスＩｇ　（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａ＋ｗｅ、　ＣＡ）でプレコートした プレートで行った。この２回にわたるプレーティング工程後の回収率は、一般に 、有核細胞の２５から３０％であった。後の実験では、Ｔ細胞は、当該技術分野 に周知の方法により、ナイロンクールに結合させることにより富化された。Ｂ細 胞の混入は、蛍光ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｔａｇｏ）を用いた免疫蛍光検査によ って調べた。Ｂ細胞画分は、通常、５から７％であった。Ｔ細胞が富化された細 胞懸濁液を、丸底ウェル（２００μｍ／ウェル、５　ｘ　１０５細胞／ｍｌ）に 置いた。２０μｌの刺激剤（５０μｇ／ｍｌ）をウェルに加えた。３日間培養の 後、１．５μＣｉの［メチル３Ｈ１−チミジンを各ウェルに加えた。こうして１ ８時間のパルスを行った後、細胞をガラスファイバーフィルターに収穫し、組み 込まれた放射能をシンチレーシゴンカウンティングによって測定した。測定はす べて４試行で行い、データは、平均ｃｐｍｔｓＥＭで表した。

インビトロにおける刺激の結果を表Ｉ＋に示す。ＤＣ−３８Ｃ１３で処理された マウスからのＴ細胞ｉよ、ＣＦＡ中のイディオタイプＫＬＨ複合体で処理された マウスまたはコントロールマウスと比較して、イディオタイプタンパク質により 良（反応した。

（以下余白） 長期生存動物“における増殖応答 ［３Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ＋ｓＥＭ）表２．゛富化された膵臓子細胞を 、３８Ｃ１３１ｇＭ、セファロースビーズに結合した３８Ｃ１３１ｇＭ、　ＩＬ ２含宵培地または可溶性無関連ＩｇＭの存在下で、３日間インビトロで培養した 。培養の最後の１８時間に、３トチミジン取り込みの程度により、刺激を測定し た。′正常なＣ３Ｈ／Ｈ６マウスを使用して、未感作Ｔ細胞を精製した。゛無関 連１ｇＭと比較したｔ−テストで有意、ｐ（０，００１゜５未感作Ｔ細胞と比較 したｔ−テストで有意、ｐ＜ｏ、　００１゜′未感作子細胞と比較したｔ−テス トで有意、ｐ＞０．０５゜”未感作Ｔ細胞と比較したｔ−テストで有意、ｐ＜０ ．００２゜（以下余白） Ｔ細胞を富化した膵臓細胞はまた、以下のように、通常の細胞で媒介性の細胞障 害性アッセイにも使用した。

腫瘍細胞をＬ−［４，５−”［１］ロイシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識し、Ｕ 底のマイクロウェルに１　ｘ　１０’個の標的細胞（１００μｍ）で、入れた。

エフェクター細胞（生存動物からの富化された膵臓Ｔ細胞）を、１００／１．５ ｏ／１．２５／１．６．２５／１．３／１．１．５／１の割合で３試行ずつ、最 終容量を２００μｌとなるように加えた。細胞を、ゆるやかな遠心分離により沈 降させ、プレートを５％ｃｏ２を含む湿潤雰囲気中に３７℃で１６時間インキュ ベートした。５０マイクロリツトルの上清み液を用いて、遊離した放射能をカウ ントした。自発遊離および最大ｉ！１Ｍは、Ｔ細胞の代わりに１００μｍの完全 培地または１ｏｏμｌの０．１％ＮＰ４０を加えることによって決定した。特異 的な細胞障害性を、以下の式に従って計夏した。

実験Ｒ離　−自発ａＭ 特異的ｉｎ離％　”　ｘ　１００ 最大１１１Ｍ　−自発ｉ１Ｍ 免疫リンパ球による細胞障害性を、Ｔ細胞を単離した日、およびインビトロにお いて３８Ｃ１３が結合したセファロースビーズで刺激した３日後に、測定した。

刺激しないＴ細胞は、３８Ｃ１３標的細胞を溶解できなかった。しかし、インビ トロにおける刺激後は、（１００／ｌのエフェクター／標的比で１６時間インキ コベーションしたアッセイにおいて）　３８Ｃ１３−ＫＬＨで刺激された細胞に よる３８Ｃ１３履瘍細胞の特異的溶解が１１％であったのに対して、ＤＣ−３８ Ｃ１３で刺激されたＴ細胞による溶解は２１％であった。

実施例Ｖ １昆ｌ簾皿思 長期生存動物の肺臓における残存腫瘍細胞の存在を、免疫組織学およびインビト ロにおける培養により追跡した。クリオスタット切片をアセトン中に固定し、モ ノクローナル抗体、次いでストレブトアビジンーホースラディッシコベルオ牛シ ダーゼおよびジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドで染色した。長期生存動 物からの肺臓の凍結切片を、ビオチン化モノクローナル抗イデイオタイプ抗体で 染色した。これらの抗体は、腫瘍が優麗した肺臓切片で予めテストした。この肺 臓切片において、これらの抗体は表面と細胞質イディオタイプＩｇＭとの両方を 染色する。長期生存動物の肺臓の連続切片で、残存膿瘍細胞は検出され得なかっ た。肺臓から単離された８９７３球を、富化された馴化培地においてインビトロ で培養した。この研究で使用された３ｇＣｌ３腫瘍細胞は、インビトロでの増殖 に適応しているが、いずれの培養物も腫瘍細胞の発生を示さなかった。最後に、 Ｂ細胞を、放射線照射した同系の未処置動物に移入した。６ケ月間観察した結果 、腫瘍の増殖は見られなかった。これらのデータは、長期生存動物の肺臓に、残 存腫瘍細胞が残っていなかったことを示す。

実施例ｖ■ のその　の　゛ １０Ｘ／％７クス平衡塩顕溶液（ＩＩＢｓｓ）　（１０ｘ　ＨＢＳＳから希釈； Ｇｉｂｃｏ　Ｃａｔ、　Ｎｒ、　３１０−４０６５Ａ／Ｊ、）中の、１００ユニ ツト／ｍｌのコラゲナーゼ（ＣＬＳ目Ｌ　Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｃａｔ、 　Ｎｒ　４１８２．　Ｉｇ／バイアル）溶液（無菌ＧＩＢＣＯ７，５％重炭酸イ オンでｐＨ７，２に調節）を用いて、肺臓を還流した。細胞を１０％のＦＣＳを 含むＲＰＭＩ培地を含む試験管に収集した。残った部分を、インキニベータ中で 、４００ユニツト／厘１のコラゲナーゼ溶液中で１５分間インキュベートした。

この溶液を約５０回ピペッティングして、大半の細胞を収集した。すべての細胞 をプールし、ベレット化した。

ウシ血清アルブミンを以下のように調製した：　Ｂ（ＩＶＵＭＩＮＡＲＣＯＨＮ 　ＦＲＡＣＴＩＯＮ　Ｖ粉末（Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、にａｎｋａｋｅｅ、１ｌｌｉｎｏｉｓ）を、デシケータ中に４ ℃で保存した。ガラ゛　スピーカー（アルミニウム箔で封鎖した）中に、６５ｍ １の蒸留水、１１１６ｍ１のＰＢＳ、２９＊ｌのＬＭ　ＮａＯＨおよび１０７ｇ のＢＳＡを混合し、攪拌せずｌ二４℃で２４時間放置した。屈折率測定器で濃度 を調べて、１．３８５５−１．３８６５の間に維持した。溶液の濃度が高すぎる 場合には、ゆっくりと攪拌して、冷ＰＢＳを加えた。溶液を濾過し、４℃で放置 した。ベレットを冷えたＢＳＡ溶液に再懸濁し、約２ｍｌの血清を含まない培地 を勾配の一番上に加えて１０．０００ｇで遠心分離した。低密度の細胞を収集し たところ、膵臓細胞の約１０％であった。

１００■■の培養皿を用いて、１０％のＦＣＳを含む培地で、細胞を２時間培養 した。激しくピペッティング（１皿当り１５分間）することによって、非付着の 細胞を洗浄除去した。細胞を再び血清を含まない培地で１時間インキュベートし 、ゆるやかにピペットすることによって非付着の細胞を除去した。残った付着細 胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で、−晩培養した。次ぎの日、非付着の 細胞を、ゆるやかにピペットすることによって収集した。ｎ臓１個当り、２　ｘ 　１０５から５　ｘ　１０’個の樹枝状細胞が得られた。

本発明は、好ましい上記の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神を逸脱 しない限り、様々な改変が可能であることを理解されたい。従って、本発明は、 以下の請求の範囲によってのみ限定される。

ＦＩＧ、　Ｉ ル＾捧社４ｈ昧　ＦＩＧ、２ 要約書 本発明は、目的のイディオタイプタンパク質を予めパルスした樹枝状細胞を投与 することにより、病原性リンパ球に対して有効な免疫応答を誘導する方法を提供 する。１つの実施態様において、哺乳類をリンパ腫に対して能動免疫する方法が 提供される。この実施態様は、樹枝状細胞をイディオタイプ□Ｉｇにさらして、 イディオタイプをパルスした樹枝状細胞を作成する工程と、このイディオタイプ をパルスした樹枝状細胞を哺乳類に注射する工程とを包含し、これにより、リン パ腫細胞に対する免疫が誘導される。もう１つの実施態様では、本発明は、イデ ィオタイプ細胞およびパルスした樹枝状細胞国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞膜上にイディオタイプタンパク質を発現する病原性リンパ球に対して有 効な、体液性および細胞性免疫応答を、哺乳類に誘導する方法であって、 ａ）インビトロにおいて、樹枝状細胞を該病原性リンパ球のイディオタイプタン パク質にさらして、イディオタイプをパルスした樹枝状細胞を得る工程；および ｂ）該イディオタイプをパルスした樹枝状細胞を該哺乳類に注射する工程、 を包含する方法。
2. ２．前記病原性リンパ球が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記腫瘍細胞が、リンパ腫細胞である、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記リンパ腫細胞が、Ｂリンパ球様細胞である、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記イディオタイプタンパク質が、免疫グロブリンである、請求項１に記載 の方法。
6. ６．前記イディオタイプタンパク質が、イディオタイプを有する免疫グロブリン のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記哺乳類が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
8. ８．インビトロにおいてイディオタイプ免疫グロブリンにさらされた樹枝状細胞 を含む、イディオタイプをパルスした樹枝状細胞。