JPH02138994A - モノクローナル抗体、その製造方法及び診断用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なモノクローナル抗体、その製造方法及
びこの抗体を含む診断用試薬に関する。

〔従来の技術〕

腫瘍関連抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体は
、該腫瘍関連抗原との抗原−抗体反応を利用した腫瘍診
断用試薬、腫瘍のミサイル療法等に使用されている。

従来、かかるモノクローナル抗体は、特開昭６０−２３
１６２０号に記載されているよ・うに、腫瘍関連抗原を
動物に免疫し、抗体産生細胞を得た後、該抗体産生細胞
とミエローマ細胞とのハイブリドーマ（融合細胞）を調
製し、このハイブリドーマを培養することによって得ら
れていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、かかる方法においては、目的とする腫瘍
に固有の腫瘍関連抗原（癌マーカー）が既知の場合は該
抗原を精製して上記した動物の免疫に使用できるので、
この抗原を特異的に認識する抗体を得るために有効であ
るが、該腫瘍関連抗原が未知の場合には上記方法がほと
んど適用し得ない。即ち、腫瘍関連抗原が未知の場合、
該抗原を精製することができないため、動物に免疫する
抗原として、目的とする腫瘍をホモゲナイズして得られ
る、腫瘍関連抗原を含む腫瘍細胞由来抗原を使用せざる
を得す、この場合該腫瘍関連抗原を特異的に認識する抗
体が選択的に産生されることは極めて稀であった。

従って１．腫瘍細胞由来抗原を動物に免疫し、比較的低
い確率で目的とする腫瘍関連抗原に対して特異性を有す
る抗体を得ているのが現状であった。

例えば、ＥＰ−１４５９４９号には、前記した特開昭６
０２３１６２０号と同様な方法で得られた、卵巣癌、腎
臓癌、子宮癌、結腸癌、乳癌、子宮けい癌等の腫瘍関連
抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体が記載され
ている。

しかしながら、これらの文献には、卵巣癌及び肺癌に対
して特異的に反応するモノクローナル抗体については、
全く記載されていないし、他に、その報告がされた例は
殆どない。尚、上記のＥＰ１４５９４９号には、ｒ　Ｍ
Ｈ９４Ｊとして卵巣癌及び肺癌と反応性を有するモノク
ローナル抗体が示されているが、このモノクローナル抗
体は、他に正常組繊細胞とも反応性を示すものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、腫瘍関連抗原が未知の特定の腫瘍に対し
て、その腫瘍関連抗原を特異的に認識する抗体を得るべ
く研究を重ねた。その結果、従来、。

腫瘍関連抗原が未知であった卵巣癌及び肺癌の腫瘍関連
抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体の産生に成
功し、本発明を完成するに至った。

本発明は、　（ａ）分子量約６００ＫＤのシアル酸含有
糖蛋白よりなる抗原と反応し、 （ｂ）ヒト肝臓癌細胞、ヒト膀胱癌細胞、ヒト神経癌細
胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト胚細胞腫瘍細胞及びこれらの
細胞の培養上清、並びにこれらの細胞破砕物のノニオン
界面活性剤による可溶化成分と実質的に反応せず、 （ｃ）ヒト腎臓正常細胞、ヒト正常胆嚢細胞、ヒト正常
白血球細胞、ヒト正常胎盤細胞、ヒト正常脾臓細胞、ヒ
ト正常筋肉細胞、ヒト正常肝臓細胞、ヒト正常結腸細胞
、ヒト正常腸細胞、ヒト正常膵臓細胞、ヒト正常食道細
胞、ヒト正常脳細胞、ヒト正常骨細胞及びこれらの細胞
破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分と実質的
に反応せず、（ｄ）正常人血清と反応せず、 （ｅ）　ヒト未分化細胞由来抗原との反応性について、
固相Ｅ　Ｉ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ
５ａｙ）法で測定した吸光度が、該ヒト未分化細胞由来
抗原単独について固相ＥＩＡ法で測定した吸光度に対し
て約２倍〜約５倍である モノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体（Ｉ）
という）を提供する。

本発明において、モノクローナル抗体（１）は、より具
体的には、下記の特性を有するものである。

即ち、本発明のモノクローナル抗体（Ｉ）は、（１）免
疫源：免疫源としてヒト未分化細胞由来抗原（以下、Ｈ
Ｕ抗原という）を使用し、且つ、該免疫源により動物に
免疫した後、被免疫動物に対して更に追加して行う免疫
（追加免疫）において使用する免疫源（以下、追加免疫
源という）として卵巣癌細胞由来抗原（以下、ＱＣ抗原
という）を使用する。

上記のＨＵ抗原は、ヒト未分化細胞に由来する抗原であ
る。このヒト未分化細胞は、多潜能細胞とも呼ばれ、ま
だヒトの各臓器あるいは機能を持った細胞に完全に分化
しておらず、かつ各臓器あるいは機能を持った細胞に分
化する能力を有した細胞である。すなわち、心臓、肝臓
、腸、脳等の臓器や赤血球、リンパ球等の血球細胞等に
は、分化してはいないが、これらの臓器や血球細胞のど
れにでも分化する能力を持った細胞のことである。

また、ＱＣ抗原は、卵巣癌を構成する細胞に由来する抗
原である。

（２）特異性： （ａ）分子量約６００ＫＤのシアル酸含有糖蛋白よりな
る抗原と強く反応する。

（ｂ）ヒト肝臓癌細胞、ヒト膀胱癌細胞、ヒト神経癌細
胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト胚細胞腫瘍細胞及びこれらの
細胞の培養上清、並びにこれらの細胞破砕物のノニオン
界面活性剤による可溶化成分と実質的に反応しない。

（ｃ）　ヒト腎臓正常細胞、ヒト正常胆嚢細胞、ヒト正
常白血球細胞、ヒト正常胎盤細胞、ヒト正常脾臓細胞、
ヒト正常筋肉細胞、ヒト正常肝臓細胞、ヒト正常結腸細
胞、ヒト正常脳細胞、ヒト正常膵臓細胞、ヒト正常食道
細胞、ヒト正常脳細胞、ヒト正常骨細胞及びこれらの細
胞破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分と実質
的に反応しない。

（ｄ）正常人血清と反応しない。

（ｅ）ヒト未分化細胞由来抗原との反応性について、固
相ＥＩＡ法で測定した吸光度が、該ヒト未分化細胞由来
抗原単独について固相ＥＩＡ法で測定した吸光度に対し
て約２倍〜約５倍である 尚、かかる（ａ）〜（ｄ）における反応性についても固
相Ｅ　Ｉ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５
ａｙ）法及びホルマリン固定パラフィン切片上でのＡＢ
Ｃ（Ａｖｉｄｉｎ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｈｏｒ
ｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｍｐｌ
ｅｘ　ａｓｓａｙ）法により測定したものである。

また、「実質的に反応しない」とは、対象とする細胞の
破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分とモノク
ローナル抗体との反応性について、固相ＥＩＡ法で測定
した吸光度が、該可溶化成分単独について固相ＥＩＡ法
で測定した吸光度（ブランク値）に対して５倍以下であ
ることを意味し、「強く反応する」とは、ブランク値に
対して３０倍以上の場合を言う。

本発明の特定モノクローナル抗体が認識する上記抗原は
、分子量約６００ＫＤ　（キロダルトン）のシアル酸含
有糖蛋白を含むことが確認された。

これは、分子量については、５Ｏ３−ＰＡＧＥ電気泳動
法及びイムノプロット法で調べた。また、該抗原を４０
％ノイラミダーゼ溶液で処理すると、該モノクローナル
抗体との反応性が失活するのに対し、トリプシン処理で
は、高濃度トリプシン溶液でも反応性が失活しないこと
より、該抗原に糖鎖が存在し、該Ｉｌ！鎖がシアル酸で
あることを、確認した。

上記シアル酸含有蛋白は、ヒト卵巣癌細胞及びヒト肺癌
細胞の細胞内に存在し、これら細胞から血液中にも、ヒ
ト神経癌細胞にあっては、羊水中にも放出される。

従って、本発明の上記モノクローナル抗体（Ｉ）は、ヒ
ト上皮性卵巣癌細胞、ヒト肺癌細胞、及びこれらの細胞
の培養上清、並びにこれら細胞のノニオン界面活性剤に
よる可溶化成分と、さらに、ヒト上皮性卵巣癌患者の血
清及びヒト肺癌患者の血清とも強く反応することが確認
されている。

また、モノクローナル抗体（Ｉ）は、その理由はよくわ
からないが、ヒト正常肺細胞、ヒト正常卵巣細胞又はヒ
ト正常甲状腺細胞とも弱く反応し、具体的には、ヒト正
常肺細胞、ヒト正常卵巣細胞またはヒト正常甲状腺細胞
の破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分とモノ
クローナル抗体（Ｉ）との反応性について、同相ＥＩＡ
法で測定した吸光度が、該可溶化成分単独について固相
ＥＩＡ法で測定した吸光度に対して、約２倍〜約５倍反
応した。

この反応は、交叉反応（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
）によるものと推定される。

しかし、本発明のモノクローナル抗体日）のＨＵ抗原及
びヒト正常肺細胞、ヒト正常卵巣細胞又はヒト正常甲状
腺細胞に対する上記の如き弱い反応性は、前述したシア
ル酸含有糖蛋白に対する反応性に比べて格段に弱く、モ
ノクローナル抗体（ｒ）を利用したシアル酸含有糖蛋白
の検出に際して実質的支障を生ずることはない。

（３）抗体のタイプ：　ＩｇＭである。

また、本発明は、上記の特定モノクローナル抗体を含め
た、未知の腫瘍関連抗原を特異的に認識し得るモノクロ
ーナル抗体（１）の新規な製造方法をも提供する。

即ち、本発明は、７〜１０週齢のヒト胎児破砕物のノニ
オン界面活性剤による可溶化成分（ヒト未分化細胞抗原
）で動物を免疫し、次いでヒト癌細胞破砕物のノニオン
界面活性剤による可溶化成分（腫瘍細胞由来抗原二以下
、ＴＣ抗原ともいう）を追加免疫して抗体産生細胞を得
た後、該抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハ
イブリドーマを調製し、該ハイブリドーマより所望のハ
イブリドーマを選択、培養して産生ずるモノクローナル
抗体（１）を回収することを特徴とするモノクローナル
抗体（１）の製造方法である。

更に、本発明はモノクローナル抗体（１）を含む乳癌又
は肺癌の診断用試薬である。

本発明において、ＨＵ抗原は、前記したようにヒト未分
化細胞に由来する抗原である。このヒト未分化細胞は、
例えば、７〜１５週齢のエンブリオ・ヒユーマン（Ｅｍ
ｂｒｙｏ　ｈｕｍａｎ、以下ＥＨｕという）、妊娠初期
の羊水、骨髄等に存在する。このうち、ヒト未分化細胞
が最も大量に存在するのは上記７〜１５週齢のＥＨｕで
ある。上記ＥＨｕの週齢が１５週齢を超えた場合には、
ヒト未分化細胞は各臓器に分化しており、抗原的には成
人細胞と変わりなくなるため、本発明の目的を達成する
ことが困難となる。かかるＥＨｕは、日本産婦人科学会
規約に従い、合法的に取得することができる。

ＨＵ抗原を調製する方法は特に制限されないが、代表的
な方法として、ＥＨｕより調製する方法を以下に具体的
に例示する。

ＥＨｕの組織の一部又は全部をポモゲナイズし、その上
清を抗原として用いてもよいが、該抗原の免疫によって
生成される抗体産生細胞の選択性を小さくするため、該
Ｅ　Ｈｕ中で分化が終了した各臓器、すなわち小腸、肝
臓等を取り除いて、ホモゲナイスし、その上清を抗原と
して用いた方が好ましい。かかるホモゲナイズは、該Ｅ
Ｈｕの細胞表面抗原だけでなく、細胞内の成分も抗原と
するために、細胞膜を破壊する各種界面活性剤を添加し
、細胞を可溶化することが好ましい。即ち、細胞の可溶
化によって、未分化細胞のすべての成分を抗原として利
用することができるため、より多くの腫瘍関連抗原を含
有させることができる。該細胞を可溶化するための界面
活性剤は、公知の細胞可溶化用界面活性剤を用いてもな
んら支障はない。該界面活性剤を具体的に例示すれば、
ノニオン系界面活性剤として、ポリオキシエチレンドデ
シルエーテル、ポリオキシエチレン２−メチルドデシル
エーテル、ポリオキシエチレンへブタメチルヘキシルエ
ーテル、ポリオキシエチレン１−オクチルフェニルエー
テル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル、ボリオシキエチレン
ソルビトールエステル等が、アニオン系界面活性剤とし
て、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、テトラデ
シルアンモニウムプロミド、ドデシルピリジニウムクロ
リド等が、カチオン系界面活性剤として、ドデシル硫酸
ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル
−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム等が、また、両性界面活
性剤として、バルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ
−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が挙げられる。

上記方法によりヒＩ・未分化細胞を可溶化した後得られ
る粗末分化細胞可溶化物は、そのままＨＵ抗原として用
いても良いが、遠心分離により、不溶性成分を除去した
後、抗原として用いた方が好ましい。即ち、不溶性成分
が混在した場合は、抗体産生能が低く、免疫を行う上で
好ましくない。

本発明において、ＨＵ抗原を免疫する被免疫動物として
は、一般に用いられる各種の被免疫動物を同等支障なく
用いることが出来る。具体的に例示すれば、マウス、ラ
ット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等の哺乳動物
を挙げることができる。そのうち、該免疫によって得ら
れた抗体産生細胞（Ｂ細胞）と融合させるミエローマ細
胞の入手の容易なマウス、ラットの中から被免疫動物を
選ぶ事が好ましい。かかるマウス及びラットの系統は特
に制限されるものではなく、公知のものから選択すれば
良い。例えば、マウスの系統としては、系統名Ａ、ＡＫ
Ｒ，ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＣＢＡ、、ＣＥ、Ｃ３Ｈ，
、Ｃ’５７ＢＬ、、Ｃ５７ＢＲ，、Ｃ５７Ｌ、、ＤＢＡ
、、ＦＬ、、ＨＴＨｌＨ１”　ｌ、ＬＰ、ＮＺＢ、、Ｎ
ＺＷ、ＲＦ、、Ｒ１、ＳＪＬ、、ＳＷＲ，、ＷＢ、１２
９等が挙げられる。また、ラットの系統としては、Ｌｏ
ｕ、、Ｌｅｉｖｉｓ、　５ｐｒａｑｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ
、　Ａ　ＣＩ　。

Ｂ　Ｎ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ等が挙げられる。この内、後
述のミエローマ細胞との融合の適合性を勘案すれば、マ
ウスでは、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系統、ラットでは、
Ｌｏｕ系統が最も好ましい被免疫動物である。また免疫
時の該マウス及び、ラットの週齢は、好ましくは、５〜
１２週齢、更に好ましくは６〜８週齢である。５週齢以
下では、免疫が困難であり、１２週齢以上では、免疫効
率が低下する傾向がある。

本発明においてＨＵ抗原を被免疫動物に免疫する方法は
、−船釣な公知の免疫法を支障なく用いることが出来る
。例えば、日本免疫学金線：［免疫実験操作法Ｊ　　（
１９７１〜１９８０）や松橋　直、成内秀雄、臼井　美
津子著＝　「免疫学実験入門」学会出版センター（１９
８５）等に詳しく掲載されている。

かかる免疫法のうち、本発明において好適な免疫法を、
以下に具体的に示す、ます、ＨＵ抗原の投与方法は、腹
腔内投与または、経静脈投与どちらでも可能である。し
かし、免疫効率を高めるために、両者の併用が好ましい
。特に免疫効率を高めるため、前半は腹腔内投与、後半
或いは、最終回のみ経静脈投与が好ましい。免疫スケジ
ュールとしては、被免疫動物の種類、個体差等により異
なり一概に決定できないが、一般に該ＨＵ抗原投与回数
３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましい。

更に好ましくは、投与回数３〜４回、投与間隔３〜４週
間である。投与回数を過度に増やすと、貴重な該ＨＵ抗
原を浪費し、また投与間隔を広げると、被免疫動物の老
齢化ひいては、細胞の低活性化を招くため好ましくない
。また、ＨＵ抗原の被免疫動物への免疫量は、被免疫動
物の種類、個体差等により異なるため一概に決定できな
いが、般に０．０５〜５　ｍｌ、好ましくは０．１〜０
．５　ｍ（ｌが適当である。

本発明の方法における重要な要件は、上記したＨＵ抗原
を免疫した後、更にＴＣ抗原を追加免疫することである
。即ち、ＨＬＪ抗原の免疫により被免疫動物内では、該
ＨＵ抗原に対応する種類の抗体産生細胞が形成されるが
、これに特定のＴＣ抗原を追加免疫することにより、該
抗体産生細胞の中より該ＴＣ抗原を特異的に認識する抗
体産生細胞のクローンを選択的に増加させることが可能
となる。従って、後記の細胞融合における該抗体産生細
胞とミエローマとの融合効率を高めることができ、かか
る細胞融合によって得られるハイブリドーマを培養して
目的とするモノクローナル抗体を効率よく産生ずること
ができる。

従来、追加免疫として知られていた方法は、被免疫動物
にＴＣ抗原を免疫した後、さらに同種のＴＣ抗原を免疫
する方法である。かかる方法によれば、追加免疫により
増加される抗体産生細胞は、前段の免疫において、比較
的高い割合で産生されたものに限られる。そのため、上
記の抗体産生細胞により産生される抗体が該ＴＣ抗原中
の腫瘍関連抗原を特異的に認識するものでない場合は、
追加免疫が全（意味のないものとなるのである。

本発明において追加免疫を行う際に用いるＴＣ抗原は、
目的とするモノクローナル抗体に対応する腫瘍のＴＣ抗
原が適宜選択される。例えば、ヒフ ト卵巣癌に対して特異的に反応性を示すモノクローナル
抗体を得ようとした場合には、ヒト卵巣癌のＴＣ抗原が
使用される。その他にも、目的とするモノクローナル抗
体に応じて、ヒト胃癌、ヒト肝癌、ヒト肺癌、ヒト膀胱
癌、ヒト膵臓癌、ヒト腎臓癌、ヒト大腸癌等の公知で、
かつ入手可能な任意の癌細胞を用いてＴＣ抗原を調製す
ることができる。該腫瘍細胞からのＴＣ抗原の調製法と
しては、上記癌細胞を破砕し、そのまま用いても良いが
、前述の様に、界面活性剤を用いて可溶化し、これをそ
のまま、或いは必要に応じて不溶物を遠心分離により除
去し追加免疫抗原として用いることが好ましい。

また、追加免疫の方法としては、腹腔内投与または、経
静脈投与のどちらでも良いが、追加免疫の効率を高める
ためには、経静脈投与の方が好ましい。

更に追加免疫のスケジュールとしては、上記Ｉ］Ｕ抗原
の被免疫動物への最終回の免疫後、１〜６週間、好まし
くは、２〜４週間、更に好ましくは、２〜３週間を経過
後、追加免疫を行うことが好ましい。その後、１〜１０
日後、好ましくは、２〜５日後、更に好ましくは、２〜
３日後に、抗体産生細胞を含む脾臓細胞を取り出すこと
が好ましい。

追加免疫が免疫後６週間目より遅すぎたり、１週日より
早すぎると、追加免疫の効果が少なく、また、脾臓細胞
を取り出す時期が１０日を過ぎると、追加免疫したＴＣ
抗原に対する抗体産生細胞が出来易くなり、１日以下で
は追加免疫の効果が少なくなる傾向がある。

上記の追加免疫を行う際のＴＣ抗原の量は、被免疫動物
の種類、大きさによって異なるため、概には、決定でき
ないが、マウスの場合、０．０５〜５　ｍｌ、好ましく
は、０．１〜０．５　ｍｌ、更に好ましくは、０．１〜
０．２　ｍｌの範囲内が適当である。即ち、不必要に大
量の抗原投与は、免疫効率を低下させるだけでなく、被
免疫動物にとっても好ましいものではない。

上記の被免疫動物より無菌的に取り出された脾臓細胞か
ら抗体産生細胞を分離する方法は、公知の方法が特に制
限なく採用される。例えば、上記脾臓細胞を細切し、ス
テンレスメツシュで濾過した後、イーグルス・ミニマム
・エッセンシャル、メディウム（Ｍ　Ｅ　Ｍ）に浮遊さ
せて分離する方法が一般的である。

本発明において、該抗体産生細胞は、モノクローナル抗
体を得るために、ミエローマ細胞と細胞融合してハイブ
リドーマとされる。

モノクローナル抗体を得るために該抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞を融合する際、用いるミエローマ細胞は、特
に制限されるものではなく、公知のミエローマ細胞株か
ら選択することができる。

これらの細胞株を具体的に例示すると、マウス由来（７
）Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、　ＮＳｌ−Ａｇ４／１（
ＮＳＩ）、　Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、　
Ｘ６３−Ａｇ３．６５３（Ｘ６３．６５３）、　ＳＰ２
１０−Ａｇ１４（ＳＰ２１０）、　ＭＰＣｌｌ−１４，
６ＴＧ１．７（４５，６ＴＧ）、　ＦＯ，５１４９１５
ＸＸＯＢＵ、　１等；ラット由来の２１０．１１ＣＹ３
．八ｇ１．２．３（Ｙ３）等：ヒト由来のＵ−２６６＾
Ｒ（ＳＫＯ−００７）、　ＧＭ１５００・６ＴＧ−八１
２（ＧＭ１５００）、　ＵＣ７２９−６，１１ＣＲ−Ｌ
ＯＮ−１（Ｍｙ２（ＨＭｙ２）、　８２２６八Ｒ／ＮＩ
Ｐ４−１（ＮＰ４１）等（但し、（）内は略号を示ず。

）が挙げられる。上記のミエローマ細胞株は、細胞融合
後のハイブリドーマを選択する手法が確立されているＨ
　Ｇ　Ｐ　ＲＴ　（ｌ（ｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕ
ａｎｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ）欠損株であることが好ましい。上記例示
した細胞株は、すべてＨＧＰＲＴ欠損株である。

本発明において、前記の抗体産生細胞とミエローマ細胞
との融合方法は、ポリエチレングリコールなどの高濃度
ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混
合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法な
ど特に制限はなく、細胞の生存率を強く低下させない程
度の条件下で適宜実施すれば良い。これらの方法は、「
免疫実験操作法」日本免疫学会１　（１９８１）に記載
されている。例えば上記化学的方法をより具体的に示せ
ば、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコール
を用いる場合、分子量１５００〜６０００、好ましくは
２０００〜４０００のポリエチレングリコール中で、３
０〜４０″Ｃ１好ましくは３５〜３８°Ｃの温度下に抗
体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好まし
くは５〜８分間混合する方法が一般的である。

上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択法は
特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミ
ノブリテリン・チミジン）選択法が用いられる。ＨＡＴ
選択法の詳細については、「動物組織培養法」黒１）行
昭著、井守出版（１９７４）　Ｐ３１３〜３２９に示さ
れている方法である。この方法は、アミノプテリンで生
存し得ないＨＧ　Ｐ　ＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用
いてハイブリドーマを得る場合に有効である。即ち、前
記細胞融合によって得られたハイブリドーマをＨΔＴ培
地（ヒポキシサンチン、アミノプテリン、チミジンを含
む培地）で培養を続けることにより、アミノプテリンに
対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみ選択的に
残存させ、且つ増殖せしめることができる。また、上記
ハイブリドーマのクローニング法としては、メチルセル
ロース法、軟アガロース法、限界希釈決算公知の方法が
特に制限なく採用される。これらの方法の内、特に、限
界希釈法が好適である。この方法は、マイクロプレート
にラット胎児由来線繊芽細胞株、あるいは正常マウス脾
臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダ（Ｆｅｅｄ
ｅｒ）を接種しておく。一方、あらかじめハイブリドー
マは培地で０．２〜０．５個／　０．２　ｍｌになるよ
うに希釈しておき、この希釈したハイブリドーマの浮遊
液を各ウェルに０．１滅ずつ入れる。一定期間、例えば
３日毎に約１７３の培地を新しいものに交換する。そし
て２週間程度培養を続けるとハイブリドーマのクローン
が増殖してくる。

この劣うにして選択されたハイブリドーマは、これを培
養することにより、モノクローナル抗体を効率よく産生
ずることができるが、培養に先立ち、目的とするモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマをスクリーニン
グすることが好ましい。このスクリーニングには、公知
の方法が、採用できる。例えば、固相ＥＩＡ法又は、液
相ＥＩＡ法、固相ＲＩＡ法又は、液相ＲＩＡ法、蛍光抗
体法、等が挙げられるが、本発明では、全く未知の抗原
に対する抗体が産生されている可能性があるため、固相
ＥＩＡ法を用いることが好ましい。

この方法は、マイクロプレートの各ウェルに、腫瘍細胞
関連抗原を固定化した後、ハイブリドーマを含む上清を
加え、抗原−抗体反応をおこなわしめ、その後、ウェル
を洗浄し、ベルオキシダーセ標識抗マウスＩｇＧ抗体や
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体等の標識抗体
を加える。更に洗浄後、基質の過酸化水素と発色剤を加
え、吸光度を測定し、活性を測定する。この方法により
目的とするモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マをスクリーニングすればよい。かかるスクリーニング
は、上記のようにハイブリドーマをクローニングした後
で行ってもよいし、その前に行ってもよい。

本発明において、ハイブリドーマの培養方法は、特に制
限されるものではない。例えば、前記したクローニング
法で使用した培地で培養してもよく或いはモノクローナ
ル抗体を大量に生産するためには、マウス腹腔内にハイ
ブリドーマを注射し、腹水からモノクローナル抗体を採
取することができる。この方法は、該ハイブリドーマと
同系統のマウスの腹腔内にあらかじめ免疫抑制剤を注射
し、Ｔ細胞を不活性化した後、１０６〜１０７個の該ク
ローン細胞を血清を含まない培地中に浮遊（０，５ｍｌ
１．）させ、腹腔内に入れる。通常１０〜２０日後に腹
部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を
採取する。この方法で、培養液中に比べ、約１００倍以
上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。

上記方法によって得られたモノクローナル抗体の精製方
法は特に制限されない。精製法については、底置「免疫
実験操作法」日本免疫学会ｇ（１９８１）や「役に立つ
免疫実験法」西岡　入歯　、嶋田孝吉、真崎　知生編集
、講談社すイエンティフィク（１９８４）に詳しく記載
されている。この内代表的な方法を例示すれば、次の方
法が挙げられる。すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロ
マトグラフィー法等である。

これらの方法のうち、硫安塩析法を３〜４回、好ましく
は３〜６回繰り返す事によって、該モノクローナル抗体
を精製する事は可能である。しかしこの方法では精製モ
ノクローナル抗体の収率が極めて低くなる。そのため、
硫安分画法を１〜２回行った粗精製モノクローナル抗体
について、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等のうち、少
なくとも１種類、好ましくは２種類の方法を選択し、行
う事によって高純度に精製されたモノクローナル抗体を
高収率で得る事ができる。硫安塩析法と他法との組み合
せと順序としては、（１）硫安塩析法−イオン交換クロ
マトグラフィー法−ゲル濾過法、（２）硫安塩析法−イ
オン交換りロマトグラフィー法−アフィニティークロマ
１〜グラフイー法、（３）硫安塩析法−ゲル濾過法−ア
フィニティークロマトグラフィー法等である。

高純度でかつ高収率にモノクローナル抗体を得るために
は、（３）の組み合せが最適である。

上記モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、
液体窒素中または一８０°Ｃ以下の冷凍庫中に凍結状態
で保存することができる。

なお、上記モノクローナル抗体（１）の製造ムこ際して
使用されるＨ　Ｕ抗原としては、例えば、７〜１０週齢
のヒト胎児の破砕物を前述した如きノニオン界面活性剤
により溶解処理して得られる可溶化成分が好適であり、
また、ヒト卵巣癌細胞由来抗原としては、例えばヒト卵
巣癌細胞の破砕物を前述した如きノニオン界面活性剤に
より溶解処理して得られる可溶化成分が好適に使用され
る。

本発明の提供する前記モノクローナル抗体（ｒ）を産生
ずるハイブリトーマ５Ｆ１１は寄託番号、微工研条寄第
１９９７号（ＦＲＥＭ　ＢＰ−１９９７）として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

また、本発明の前記したモノクローナル抗体−）の製造
方法において、追加免疫の抗原として、ヒト肝臓癌細胞
破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分（肝臓癌
細胞抗原）を用いることにより、下記の特異性を有する
モノクローナル抗体（以下、モノクローナル抗体（ＩＩ
）という）を得ることができる。

（ａ）　　α−フェトプロティンよりなる抗原と反応（
ｂ）ヒト卵巣癌細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト膀胱癌細胞、
ヒト神経癌細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト胚細胞腫瘍細胞
及びこれらの細胞の培養上清、並びにこれらの細胞破砕
物のノニオン界面活性剤による可溶化成分と実質的に反
応せず、 （ｃ）ヒト腎臓正常細胞、ヒト正常胆嚢細胞、ヒト正常
白血球細胞、ヒト正常胎盤細胞、ヒト正常脾臓細胞、ヒ
ト正常筋肉細胞、ヒト正常肝臓細胞、ヒト正常結腸細胞
、ヒト正常腸細胞、ヒト正常膵臓細胞、ヒト正常食道細
胞、ヒト正常脳細胞、ヒト正常骨細胞及びこれらの細胞
破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分と実質的
に反応せず、（ｄ）正常人血清と反応せず、 （ｅ）ヒト未分化細胞由来抗原との反応性について、固
相ＥＩＡ法で測定した吸光度が、該ヒＩ・未分化細胞由
来抗原単独について同相ＥＩＡ法で測定した吸光度に対
して約２倍〜約５倍である即ち、上記モノクローナル抗
体（ＩＴ）は、αフェトプロティンよりなる抗原と強く
反応し、従って、α−フェトプロティンを構成成分とし
て含む物質の同定・確認に使用することができる。αフ
ェトプロティン標品を、４０％ノイラミダーゼ溶液で処
理すると、該モノクローナル抗体（旧との反応性が失活
するのに対し、トリプシン処理では、高濃度トリプシン
処理でも反応性が失活しないことより、該モノクローナ
ル抗体（旧は、αフェトプロティンの糖鎖部分を認識し
ているものと思われる。

上記α−フェトプロティンは、ヒト肝臓癌細胞の細胞内
に存在しａｎｄ１０ｒ該細胞から血液中に放出されるこ
とが知られている（Ｔ、Ｍ、Ｃｈｕ：“＾１ｐｈａ−ｆ
ｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ”ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎ５ｅｒＫａａｒｅｅ
ｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２））。

従って、上記モノクローナル抗体（ＩＩ）は、ヒト肝臓
癌細胞、ヒト肝臓癌細胞の培養上清、肝臓癌細胞のノニ
オン界面活性剤による可溶化成分と、さらにヒト肝臓癌
患者の血清とも強く反応することが確認されている。

また、モノクローナル抗体（ＩＩ）は、細胞の頻僚性に
基づく交叉反応のためヒト正常肝臓細胞の抽出物とも弱
く反応する。しかし、本発明のモノクローナル抗体（ｎ
）のＨＵ抗原及びヒト正常肝臓細胞に対する上記の如き
弱い反応性は、α−フェトプロティンに対する反応性に
比べて格段に弱く、モノクローナル抗体（ＩＩ）を利用
したα−フェトプロティンの検出に際して実質的支障を
生ずることはない。

尚、上記モノクローナル抗体（ｎ）は、ヒト正常肝臓細
胞の破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分との
反応性について、固相ＥＴＡ法で測定した吸光度が、該
可溶化成分単独について固相ＥＩＡ法で測定した吸光度
に対して、約２倍〜約５倍反応した。

上記モノクローナル抗体（ＩＩ）を産生ずるハイブリド
ーマ６Ｈ１３寄託番号、微工研条寄第２５２５号（ＦＲ
ＥＭ　ＢＰ−２５２５）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

本発明において、提供される上記のモノクローナル抗体
（１）及び（ＩＴ）は、それぞれシアル酸含有糖蛋白及
びα−フェトプロティンを特異的に認識しうるという特
性を有することを利用して、以下の様な応用が可能であ
る。即ち、モノクローナル抗体（１）は、Ｗｅｉｒ、Ｄ
、Ｍ、：Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１＋２＋３　
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、０ｘｆｏｒｄ（１９７Ｂ）に記載さ
れているＲＩＡ法＜Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５
ａｙ）や固相ＥＩＡ法や蛍光抗体法等を用い、体液中の
抗原濃度を測定したり、放射性同位元素で標識したモノ
クローナル抗体（１）の放射活性をイメージングするな
どして、卵巣癌及び肺癌の非常に精度の高い診断を行う
ことができる。また、卵巣癌や肺癌組織を標的とした免
疫療法や、抗癌剤を卵巣癌や肺癌に特異的に運搬する抗
癌剤−モノクローナル抗体複合体によるミサイル療法等
の治療への応用も可能である。更にモノクローナル抗体
（ＩＩ）　も同様の方法で肝臓癌の診断及び治療に応用
可能である。

上記診断用試薬としての用途において、モノクローナル
抗体は、０．０５ｍｇ／ｍ１〜０．５＋ｎｇ／ｍｌ濃度
に、０．０５Ｍ〜０．２Ｍ濃度の公知の緩衝液（ｐＨ６
，５〜ｐＨ８，５）で希釈して用いることが好適である
。このとき用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、マク
シーレン緩衝液、トリス緩衝液、ベロナール緩衝液、グ
リシン緩衝液等が考えられる。更にこれらの緩衝液で緩
衝化した生理食塩水を用いることも好適である。また、
該モノクローナル抗体を担体に固定化し、凝集反応用試
薬として使用する場合は、公知の担体を使用することが
できる。例えば、特開昭６１−２２３６４７号に記載さ
れている様な担体を用いる場合、該モノクローナル抗体
を担体に０．０５ｍｇ／戚〜１■／ｒｄ濃度の感作し、
該感作担体を、０．Ｏ１％〜０．１％になるように、１
％〜５％濃度の正常ウサギ血清を含む緩衝液中に分散し
、試薬として使用できる。このとき用いる緩衝液として
は、上記した緩衝液及び緩衝化生理食塩水が好適である
。

〔効　果〕

以上の説明より理解されるように本発明によれば、今ま
で有効なモノクローナル抗体の存在しなかった卵巣癌及
び肺癌について、卵巣癌関連抗原及び肺癌関連抗原を特
異的に認識する新規なモノクローナル抗体が提供される
。

また、上記卵巣癌及び肺癌のように、腫瘍関連抗原が未
知の腫瘍に対して、その腫瘍関連抗原を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を効率的に得ることができるモノ
クローナル抗体の製造法が提供される。勿論、肝臓癌等
のように、腫瘍関連抗原が既知の腫瘍に対してもかかる
方法は適用可能である。

〔実施例〕

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ ■）ヒト未分化細胞抗原（ＨＵ抗原）の調製性日本産婦
人科学会規約に基づき合法的に入手した７−１０週齢の
死亡した胎児から分化済みの肝臓及び腸を取り除き、こ
の処理胎児に０．１％ＮＰ−４０を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）　１５０ｍｆｆ１を加え、細胞
破砕機で破砕した。この破砕物を４°Ｃ１−晩攪拌後、
不溶成分を遠心分離（１００００ｒｐｍ、　１時間）し
た。この遠心上清を旧Ｉ目ｐｏｒｅ　ｆｉｌｔｅｒ　Ｏ
，４５ｕｍ（日本ミリボア社製）を通し、抗原として用
いた。

この抗原の蛋白濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。

２）追加免疫用卵巣癌由来抗原（ＱＣ抗原）の調製 ヒト卵巣癌組織を、０．１％ＮＰ−４０を含む０．　Ｉ
　ＭＰＢＳ中で破砕し、４°Ｃ−晩攪拌し、可溶化抽出
する。この抽出液を遠心分離し、不溶成分を除く。

得られた抽出液を旧１１ｉｐｏｒｅ　ｆｉｌｔｅｒ　０
．４５ｕｍ（Ｅ１１本ミリボッ製）に通し、蛋白濃度が
、５　ｍｇ　／　ｍｌになるように０．ＩＭＰＢＳで希
釈し、追加免疫抗原として用いた。

３）ＢＡＬＢ／Ｃ′？ウスへの免疫 １）で得られた抗原を０．　Ｉ　ｍｌｔずつ、２週間間
隔で３回、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系統マウスに腹腔的
投与する。次いで最終回投与として、同マウスに１）で
得られた抗原０．１　ｍｌｌを、経静脈投与する。最終
回投与後、２週間後に上記２）で８）１製したＱＣ抗原
０、１　ｒｒｆｔを同マウスの経静脈に投与し追加免疫
を行った。

４）細胞融合法 ３）で追加免疫を行って３日後の該被免疫マウスから脾
臓細胞を無菌的に摘出し、該脾臓細胞を細切した後、ス
テンレスメツシュで圧迫、濾過しイーグルス・ミニマム
・エッセンシャル・メディウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、
脾臓細胞浮遊液を得た。この脾臓細胞浮遊液とマウスミ
エローマ細胞Ｎ５−１をそれぞれ血清を含まないＭＥＭ
で３回洗浄し、脾臓細胞とＮ５−１　とを１０：１で混
合して遠心後（８００ｒｐｍ、　　５分間）、沈澱をほ
ぐし、４４％ポリエチレングリコール２０００／Ｍ　Ｅ
　Ｍ溶液１　ｍｌを徐々に加え、３３７°Ｃ１８分間イ
ンキュベーションし、細胞融合を行った。８分後、Ｍ　
Ｅ　Ｍ　１　ｔｔｄｌを加え、更に毎分２　ｍｌの割合
でＭＥＭを添加し、計１０戚とした後、１１０００ｒｐ
　、５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈澱物を
１０％ウシ胎児血清含有ロズウェル・パーク・メモリア
ル・インスティチュート　（ＲＰＭ　Ｉ）　１６４０培
地にＮ５−１がｌＸｌ０’個／ｍ１になるように懸濁し
、９６穴マイクロプレートに０、１　ｍＲずつ植え付け
た。１日後、ＨＡＴ　（ヒボキサンチンＩ　Ｘｌ０−’
Ｍ　、アミノプテリン４　Ｘｌ０−７Ｍ　。

チミジン１．６　ＸＩＯ−５Ｍ）を含んだＲＩ）　Ｍ　
］　］１６４０−１％ＦＣ３培地（以下、ＨＡＴ培地と
いう）を各ウェルに０．１　ｔｎｌずつ添加し、その後
、３〜４日後にＡ量をＨＡＴ培地で交換して、ＨＡ　Ｔ
培地によるハイブリドーマの選択を進めた。１０−１４
日後にほぼ完全ウェルでバイプリドーマが増殖した。こ
のとき、ハイブリドーマの出現率は、１８．７％であっ
た。

５）抗体産生細胞の選択 以下のＴＣ抗原を用意した。ヒト肺癌系列として、５Ｒ
−１！Ｓ−１，ＭＥ　１８０．　ＭＢＩ；　ヒト肝臓癌
系列として、Ｌｌ−７，ＨｕＨ−７，ＩＣ−４；　ヒト
膀胱癌として、ＨｕＢ−４，ＨｕＢ−１５，Ｈｕ−１５
Ｎ、　ＨｕＢ−４０；ヒ１〜神経癌として、５Ｋ−Ｎ−
ＦＩ、　５Ｋ−Ｎ−ＡＳ、　５Ｋ−Ｎ−ＤＺ、ヒト大腸
癌として、Ｃ０−３；ヒト卵巣癌として、ＮＥＣ，以上
１５種類、更にヒト正常細胞としてヒト腎臓細胞、ヒト
甲状腺細胞、ヒト胆嚢細胞、ヒト白血球細胞、ヒト胎盤
細胞、ヒト脾臓細胞、ヒト筋肉細胞、ヒト肺細胞、ヒト
肝臓細胞、ヒト結腸細胞、ヒト腸細胞、ヒト膵臓細胞、
ヒト食道細胞、ヒト脳細胞、ヒト骨細胞及びＨＵ抗原で
ある。ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞を、０．１％ＮＰ−４０を
含む０．ＩＭＰＢＳ中で破砕し、４°Ｃ−晩攪拌し、可
溶化抽出した。この抽出液を遠心分離し、不溶成分を除
き、得られた抽出液の蛋白濃度が、０．５　ｍｇ　／　
ｍｌになるように、Ｏ，ＩＭＰＢＳで希釈する。次に９
６穴のＥＩＡ用マイクロプレートを用意し、このプレー
トに希釈した抽出液を、各ウェルに５０μ！ずつ分注し
た。分注済みプレートを、３７°Ｃ１２時間インキュベ
ーションし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰ　Ｂ　
Ｓ　（Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗浄した後、各ウェ
ルに０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を５０μ！加
え、そのまま４°Ｃに保存した（腫瘍細胞固定化プレー
ト）。同様にして、前記各ＴＣ抗原及び正常細胞につい
て、ＴＣ抗原固定化プレート及び正常細胞固定化プレー
トを作製した。保存したＴＣ細胞固定化プレートを、Ｔ
−８０ＰＢＳで３回洗浄し、上記４）で得られた培養上
清を、各ウェルに５０μβずつ加え、１時間、３７°Ｃ
でインキュベーションした後、Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　Ｓで３
回洗浄し、更にペロオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウ
スＩｇＧ抗体を、１ｏｏｏ倍希釈し、各ウェルに５０μ
ｌずつ加え、１時間、３７°Ｃでインキュベーションし
た。このプレートを、Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し
、０．０２Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ８，０）６
０ｍＮ、過酸化水素水５μ！、ＡＢＴ３５０ｍｇ含む発
色液を各ウェルに、１００μβずつ加え、発色させた後
、０．２５％ＨＦ溶液で反応を停止させ、５１０ｎｍの
吸光度を測定して抗体産生細胞より産生される抗体の各
ＴＣ抗原に対する反応性をみた。このときのＴＣ抗原と
の反応率は、１５．３％であった。

６）ハイブリドーマのクローニング 上記５）で反応性を示したマイクロプレートのウェルの
ハイブリドーマを取り出し、１０％ウシ胎児血清添加Ｒ
Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地で希釈し、マイクロトレイに
０．５個／ウェルの割に接種した。マイクロトレイは、
予め、マウスの腹腔細胞をＦｅｅｄｅｒｃｅｌｌとして
、２Ｘ１０６個／　ｍＲ接種、培養したものを用いた。

培地交換しながら約２週間培養を続け、ハイブリドーマ
のコロニーの出現したウェル中の抗体を、５）に示した
方法により測定し、ＱＣ抗原に対して陽性を示したハイ
ブリドーマを選択し、再度クローニングした。得られた
ハイブリドーマの５Ｆ１１は寄託番号、微工研条寄第１
９９７号（ＦＲＥＭＢＰ１９７７）として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託した。

７）モノクローナル抗体の作製 ７週齢以上のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系統マウスにプリ
ンスクン（アイドリッチ社製）０．５ｍｆｉを腹腔的投
与し、１週間以上経過した後、ｉｎ　ｖｉｖｏで培養、
増殖させたバイブリド′−７５Ｆ１１１〜９Ｘ１０６個
／マウスを腹腔的接種した。ハイブリドーマ５Ｆ１１を
接種した１週間後から、マウスの体重は急激に増加し、
１０〜１５日にピークに達した。体重がピークの前後に
マウスから腹水を採取した。これを３００Ｏｒｐｍ、　
　１０分間遠心分離し、５〜１５ｄ／匹のモノクローナ
ル抗体含有腹水を得た。

８）モノクローナル抗体の精製 ７）で得られた腹水１０ｍ２から、Ｈｕｄｓｏｎら（Ｐ
ｒｅｃｔｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｂｌａｃｋ
ｉｙａｌｌ　Ｓｃｉ、　Ｐｕｂ、＋　１９７６年）の方
法に準じてモノクローナル抗体を精製した。

腹水１０ｍ２に飽和硫安水１０ｄを加え、静置後、遠心
分離する。得られた沈澱を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ
）５−に溶解し、０．　Ｉ　Ｍ　Ｐ　Ｂ　５００ｍｆｆ
１に対し透析を行う。透析後１１００００ｒｐ、１０分
間遠心分離して、上清をえた。この上清をＤＥＡＥセフ
ァロースカラム（ファルマシア社製）にかけ、ＰＢで洗
浄後、塩濃度によるリニアグラシュエンドをかけ、抗体
画分を溶出する。得られた抗体画分を更にセファデック
スＧ−２００カラム（ファルマシア社製）にかけ、分画
溶出し、５Ｆ１１モノクロ一ナル抗体１５３μｇをえた
。

９）モノクローナル抗体の反応性 （ａ）細胞抽出物との反応性 ５）で用意したＴＣ抗原固定化プレート、正常細胞固定
化プレー）ＨＵ抗原固定化プレートを用い、８）で得ら
れたモノクローナル抗体を１０μｇ／ｄになるように、
ＰＢで希釈し、８）の培養上清のかわりに用い同様の操
作を行い、ＴＣ抗原、正常細胞及びＨＵ抗原の抽出物に
対するモノクローナル抗体の反応性をみた。結果を第１
表に示した。

（ｂ）ｔＩＩＩＩ胞培養上清との反応性５）のＴＣ抗原
細胞を無血清培地（ＧＩＴ・ダイゴＴ培地、日本製薬■
製）を用い、継代培養し、馴化し、培養上清をえた。こ
れらの培養上清を１ｍｇ　／　ｍｌの蛋白濃度になるよ
うに、濃縮し、５）と同様の方法で各ＴＣ抗原細胞培養
上清固定化プレートをえた。このＴＣ抗原細胞培養上清
固定化プレートを用い、９）、（ａ）と同様の方法でモ
ノクローナル抗体との反応性をみた。結果を第２表に示
した。

（重置以下余白） ４・３ （ｃ）細胞との反応性 ５）で用意したＴＣ抗原細胞及び正常細胞についてパラ
フィン切片上でのＡＢＣ法による免疫組織染色法（Ｈｓ
ｕ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ、＋２９＋５７７−５８Ｌ　Ｌ９８１）を用い
て該モノクローナル抗体との反応性を調べた。細胞のパ
ラフィン切片は、細胞を１０％リン酸緩衝ホルマリンで
固定化し、パラフィン包埋し、薄切した後、スライドグ
ラスに貼布する。次いで２０分間脱パラフインした後、
ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン溶液に３７°Ｃ
１１時間浸漬する。浸漬後、ＰＢＳで洗浄し、０．３％
Ｈ，０□溶液に室温、３０分間浸漬する。ついで、ヤギ
正常血清（Ｎ　Ｇ　Ｓ）でマスキングを行い、該モノク
ローナル抗体を１ｍｇ／ｍｌ＠度で１時間反応させる。

反応後ＰＢＳで洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＴｇ
Ｇ（ＴＡＧＯ社製）を２０倍希釈で反応させ、ＰＢＳで
洗浄する。洗浄後、ペクタスティンＡＢＣキットより調
製したＡＢＣ溶液０．５　ｍｌを反応させ、ＰＢＳで洗
浄し、０．００５％ＨｚＯ□・Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚ
ｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　（
ＤＡＢ）溶液と反応させ、ＰＢＳで洗浄し、１％メチル
グリーンで後染し、グリセリンセラチンで封入する。封
入後のサンプルを光学顕微鏡で観察し、細胞の被染色度
からモノクローナル抗体と細胞の反応性を調べた。

結果を第３表に示した。

（重置以下余白） ４−ｔ １０）モノクローナル抗体（１）のＩｇツクラス１１５
Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓにアガロース１％を加え、煮沸溶解後、
スライドグラス上で厚さ１ｍｍに固化する。

直径３胴の穴を３１ＴＩＩｎ間隔で開け、各人に、抗マ
ウスＩｇクラスの血清１５μ！と、８）で得られたモノ
クローナル抗体溶液１５μ２を入れ、湿潤相中に１６時
間放置する。８）で得られたモノクローナル抗体は、抗
マウスｒｇＭ血清に抗原−抗体反応に基づく沈降線を示
した。

１１）モノクローナル抗体（１）の認識抗原の同定スラ
ブ電気泳動装置（アＩ・−社製）の１０ｃｍｘ１０〔・
ｍのガラス板２枚の間に、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含む５％アクリルアミド溶液と０．１
過硫酸ナトリウムを注入し、固化させ、ＳＤＳ電気泳動
用プレートを２枚作製する。２）で得られたＱＣ抗原１
０μ！と、０．０１％ブロモフェニールブルー（シグマ
社製）を含む２ｍＭ）デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
溶液４０μ！を加え、１００°Ｃ１１分間加熱した。加
熱後、各々のＳＤＳ電気泳動用プレートに添加し、５ｍ
Ａで１０時間通電し電気泳動を行った。通電後、−枚の
プレートは、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製
）で染色し、分子量を測定した。ニトロセルロース膜を
用意し、もう−枚のプレートをプロッティング装置（ア
ト−社製）を用いて、ニトロセルロース膜に転写した後
、モノクローナル抗体と反応させた。

次いで、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭ抗体を反応させた後
、発色液を用いて染色し、抗原のバンドを確認した。こ
のとき、該抗原の分子量は、約６０万であった。

更にこの抗原を４０％のノイラモダーゼ溶液で、３７°
Ｃ１３０分間処理し、５）と同様に腫瘍細胞固定化プレ
ートを作製し、反応を調べたところ、反応性が消失した
。このことより、この抗原は糖鎖を含み、この糖鎖は、
シアル酸であると推測された。

実施例２ 実施例１の１）と同様の方法で、ＨＵ抗原を調製した。

次いで、ヒト肝臓癌細胞から実施例１の２）と同様の方
法で、ＴＣ抗原を調製した。これらの抗原を、実施例１
の３）と同様の方法で、免疫及び、追加免疫した。追加
免疫後、実施例１の４）と同様に細胞融合を行い、実施
例１の５）と同様に、ハイブリドーマから抗体産生細胞
を選択した。このときの融合率は１８．６％、反応率は
１５．３％であった。そのうちの反応陽性のハイブリド
ーマを実施例１の６）と同様の方法でクローニングし、
得られたハイブリドーマ６Ｈ１３を得た。　（この６Ｈ
１３は寄託番号、微工研条寄第２５２５号（ＦＲＥＭＢ
Ｐ−２５２５）として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した。このハイブリドーマより実施例１の７）、
８）と同様の方法で、モノクローナル抗体（ｎ）を精製
した。得られたモノクローナル抗体（ｎ）の反応性を前
記第１表に示した。

実施例３ 実施例１の１）と同様の方法で、ＨＵ抗原を調製した。

次いで、ヒト膀胱癌細胞から実施例１の２）と同様の方
法で、ＴＣ抗原を調製した。これらの抗原を、実施例１
の３）と同様の方法で、免疫及び、追加免疫した。追加
免疫後、実施例１の４）と同様に細胞融合を行い、実施
例１の５）と同様に、ハイブリドーマから抗体産生細胞
を選択した。このときの融合率は１６．２％、反応率は
１４．３％であった。反応陽性のハイブリドーマを、実
施例１の６）と同様の方法でクローニングし、得られた
ハイブリドーマ６Ｇ１２から、実施例１の７）、８）と
同様の方法で、モノクローナル抗体を精製した。得られ
たモノクローナル抗体の反応性を、前記第１表に示した
。

比較例１ １）Ｈす抗原の調製法 日本産婦人科学会規約に基づき合法的に入手した７−１
０週齢の死亡したＥＨｕに、０．１％Ｎ１１−４０を含
む０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　１５０ｍＲ
を加え、ホモゲナイズした。この物を４°Ｃ１−晩攪拌
後、不溶成分を遠心分離（１００００ｒｐｍ、　１時間
）した。この遠心上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ｆｉｌｔ
ｅｒ　Ｏ，４５μｍ（日本返りポア社製）に通し、ＨＵ
抗原として用いた。このＨＵ抗原の蛋白濃度は、１５ｍ
ｇ／ｍｌ！であった。

２）ＢＡＬＢ／Ｃ？ウスへの免疫 １）で得られたＨＵ抗原を０．１　ｍｌずつ、２週間間
隔で３回、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系統マウスに腹腔内
投与する。次いで最終回投与として、同マウスに１）で
得られた抗原０．１　ｍｌを、経静脈投与する。最終回
投与後、３日目に、マウスから全採血した。

３）抗体の精製 ２）で得られた血液を、室温に２時間放置し、凝固させ
、血清化する。この血清を飽和硫安を用い、３３％飽和
硫安塩析を３回繰り返し、０．１５Ｍリン酸緩衝化生理
食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）　（ｐＨ７，４）に対し透析を行
い、精製抗体を得た。精製抗体の蛋白濃度は、１．５　
ｍｇ　／　ｍＡであった。抗体使用時は、ＰＢＳで１０
倍希釈して用いた。

４）抗体の反応特異性の検討 以下のＴＣ抗原を用意した。ヒト肺癌系列として、ＳＫ
−ＭＥＳ−１，ＭＥ　１８０．　ＭＢｌ、ヒト肝臓癌系
列として、Ｉ、Ｉ−７，ＨｕＨ−７，ＩＣ−４；ヒト膀
胱癌として、１ＩｕＢ４、　ＨｕＢ−１５，Ｈｕ−１５
Ｎ、　ＨｕＢ−４０；ヒト神経痛として、５Ｋ−Ｎ−Ｆ
ｌ、　５Ｋ−Ｎ−ΔＳ、　５Ｋ−Ｎ−ＤＺ、ヒト大腸癌
として、ＧＯ−３ｉヒト卵巣癌として、ＮＥＣ，以上１
５種類及びヒト正常細胞である。ＳＲ−ＭＥＳ−１細胞
を、０．１％ＮＰ−４０を含む０．ＩＭＰＢＳ中で破砕
し、４°Ｃ−晩攪拌し、可溶化抽出した。この抽出液を
遠心分離し、不溶成分を除き、得られた抽出液の蛋白濃
度が、０．５　ｍｇ　／　ｍｌｌになるように、０．１
ＭＰＢｓで希釈した。次に、９６大のＥｔＡ用マイクロ
プレートを用意し、このプレートに希釈した抽出液を、
各ウェルに５０μ！ずつ分注した。分注済みプレートを
、３７°Ｃ１２時間インキュベーションし、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　
Ｓ）で３回洗浄した後、各ウェルに０．１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を５０μ！加え、そのまま４°Ｃに保
存した（ＴＣ抗原固定化プレート）。同様にして、各腫
瘍培養細胞について、腫瘍細胞固定化プレートを作製し
た。保存したＴＣ抗原固定化プレートを、Ｔ−８０Ｐ　
Ｂ　Ｓで３回洗浄し、３）で得られた精製抗体を、各ウ
ェルに５０μｌずつ加え、１時間、３７°Ｃでインキュ
ベーションした後、Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し、
更にペロオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗
体を、１０００倍希釈し、各ウェルに５０μβずつ加え
、１時間、３７°Ｃでインキューベージヨンした。この
プレートを、Ｔ−８０ＰＢＳで３回洗浄し、０．０２Ｍ
リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ８，０）６０ｍれ過酸化
水素５μｆｆｉ、ＡＢＴ３５０ｍｇ含む発色液を各ウェ
ルに、１００μρずつ加え、発色させた後、０．２５％
ＨＦ溶液で反応を停止させ、５１０ｎｍの吸光度を測定
した。

この結果、得られた抗体は、すべての腫瘍細胞系列及び
正常細胞に対して反応性を示した。また、該抗体より特
定のＴＣ抗原に対して特異的に反応する有用な抗体を単
離することはほとんど不可能であった。

比較例２ 実施例１の２）と同様にして調製されたＱＣ抗原を実施
例１の３）の免疫に用いたＨＵ抗原に代えて使用した以
外は実施例１と同様な方法によって追加免疫、細胞融合
、抗体産生細胞の選択、ハイブリドーマのクローニング
、モノクローナル抗体の作製及びモノクローナル抗体の
精製を行った。

その結果、得られたモノクローナル抗体は、いずれも卵
巣癌に対する特異性は全くなく、全ての癌のＴＣ抗原及
び正常細胞と強く反応するものであった。

実施例４ モノクローナル抗体の診断薬への応用（免疫抑制固相Ｅ
ＩＡ法） ヒト卵巣癌系列として、ＮＥＣ，ヒト肺癌系列として、
ＳＫ−ＭＥＳ−１，ＭＥ　１８０．　ＭＢＩを用意した
。ＮＥＣを０．１％ＮＰ−４０を含む０．ＩＭＰＢＳ中
で破砕し、４°Ｃ−晩攪拌し、可溶化抽出する。この抽
出液を遠心分離しく不溶成分を除く。得られた抽出液の
蛋白濃度が、０．５　ｍｇ　／　ｍｌになるように、０
．１ＭＰＢＳで希釈する。次に、９６穴のＥＴＡ用マイ
クロプレートを用意し、このプレートに希釈した抽出液
を、各ウェルに５０μ！ずつ分注する。分注済みプレー
トを、３７°Ｃ１２時間インキュベーションし、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（Ｔ−８０Ｐ　
Ｂ　Ｓ）で３回洗浄した後、各ウェルに０．１％牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）を５０μｌ加え、そのまま４°Ｃ
に保存した（ＴＣ抗原固定化プレート）。同様にして、
各腫瘍培養細胞について、腫瘍細胞固定化プレートを作
製した。保存した腫瘍細胞固定化プレートを、Ｔ−８０
Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し、実施例１の４）で得られたモ
ノクローナル抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で０．１ｍｇ／蔵で希釈した。このモノクローナル抗
体の希釈液５０μｌと任意数の担癌患者血清又は、健常
血清を各ウェルに５０μｌずつ加え、１時間、３７°Ｃ
でインキュベーションした後、Ｔ−８０ＰＢＳで３回洗
浄し、更にペロオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩ
ｇＭ抗体を、１０００倍希釈し、各ウェルに５０μ！ず
つ加え、１時間、３７°Ｃでインキュベーションした。

このプレートを、Ｔ−８０Ｐ　Ｂ　Ｓで３回洗浄し、　
０．０２Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　
６０ｍ、過酸化水素５μ！、ＡＢＴ３５０ｍｇ含む発色
液を各ウェルに、１００μｌずつ加え、発色させた後、
０．２５％ＨＦ溶液で反応を停止させ、５１０ｎｍの吸
光度を測定して陽性又は陰性を判断し、診断した。結果
を表４に示す。

第４表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）分子量約６００ＫＤのシアル酸含有糖蛋白よ
   りなる抗原と反応し、 （ｂ）ヒト肝臓癌細胞、ヒト膀胱癌細胞、ヒト神経癌細
   胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト胚細胞腫瘍細胞及びこれらの
   細胞の培養上清、並びにこれらの細胞破砕物のノニオン
   界面活性剤による可溶化成分と実質的に反応せず、 （ｃ）ヒト腎臓正常細胞、ヒト正常胆嚢細胞、ヒト正常
   白血球細胞、ヒト正常胎盤細胞、ヒト正常脾臓細胞、ヒ
   ト正常筋肉細胞、ヒト正常肝臓細胞、ヒト正常結腸細胞
   、ヒト正常腸細胞、ヒト正常膵臓細胞、ヒト正常食道細
   胞、ヒト正常脳細胞、ヒト正常骨細胞及びこれらの細胞
   破砕物のノニオン界面活性剤による可溶化成分と実質的
   に反応せず、 （ｄ）正常人血清と反応せず、 （ｅ）ヒト未分化細胞由来抗原との反応性について、固
   相ＥＩＡ法で測定した吸光度が、該ヒト未分化細胞由来
   抗原単独について固相ＥＩＡ法で測定した吸光度に対し
   て約２倍〜約５倍である モノクローナル抗体。 ２．７〜１０週齢のヒト胎児破砕物のノニオン界面活性
   剤による可溶化成分（ヒト未分化細胞抗原）で動物を免
   疫し、次いでヒト癌細胞破砕物のノニオン界面活性剤に
   よる可溶化成分（腫瘍細胞抗原）を追加免疫して抗体産
   生細胞を得た後、該抗体産生細胞をミエローマ細胞と融
   合させてハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマよ
   り所望のハイブリドーマを選択、培養して産生する請求
   項１記載のモノクローナル抗体を回収することを特徴と
   する前記モノクローナル抗体の製造方法。 ３、請求項１記載のモノクローナル抗体を含む乳癌又は
   肺癌の診断用試薬。