JP3733998B2 - 薬用人参主要成分ジンセノサイド類の免疫染色法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は人参の特異的な成分であるジンセノサイド類に対する抗体、すなわち抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体(抗GRb1MAb)を用いたジンセノサイド類の免疫学的染色による特異的検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
酵素機能を持つ蛋白やペプチド等に対する抗体を用いた組織染色は動物、植物を問わず広く行われており、グリコスフィンゴリピッド類を薄層クロマト(TLC)にて分離し、膜に転写する方法(T.Taki et al., Analytical Biochemisry, 221巻、312-316頁、1994年)が開発されている。
しかしながら、ジンセノサイド類の様な低分子化合物に対しては膜に対する固定化が困難なことから、成功例は報告されていない。
また、抗GRb1MAbによるジンセノサイド類の免疫学的染色は現技術において見られない。
一方、ジンセノサイドRb1は有用な薬理活性を有する人参の主要な配糖体であり、医薬品としての候補化合物と目されている物質である。
しかしながら、ジンセノサイドRb1の人参中の含有量は少なく、その検出は容易ではない。まして漢方薬中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため、前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度な評価方法が熱望されているが、未だ満足できる方法は開発されていない。
【0003】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ジンセノサイド類等の低分子化合物を膜に転写し、転写後この膜を過ヨウ素酸塩で処理し蛋白を加えることにより、ジンセノサイド類は蛋白抱合体を形成し、ジンセノサイド類が膜に吸着(固定化)し、抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応で特異的に染色することができることを見出し、本発明を完成させたものである。
本発明方法は、例えば薄層クロマト(TLC)上に展開したジンセノサイド類をポリビニリデンジフルオリド(PVDF)などの膜に転写し、ついで、過ヨウ素酸ナトリウムでジンセノサイド類の糖部分を開環し、蛋白と抱合体を形成させ、該膜に吸着させる。この操作により膜にジンセノサイド類を吸着させ、薬用人参の主要成分であるジンセノサイドRb1(GRb1)に対するモノクローナル抗体(MAb)を用いて抗原抗体反応を行い、パーオキサイド標識2次抗体を添加し、過酸化水素と基質を加えてジンセノサイド類を発色させる方法に関する。
【0004】
また、薬用人参の根切片をPVDF膜でカバーし、ジンセノサイド類を膜に転写し、この膜をTLCと同様な手順で処理しジンセノサイド類を発色させる方法にも関する。
本発明方法によれば、ジンセノサイド類のアグリコンであるダンマラン骨格を持つパナクサトリオールを特異的に認識し、他の骨格を持つ化合物は一切認識しない。
【0005】
本発明方法に用いられる蛋白としては、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、スキンミルク、ゼラチン等が挙げられ、特にBSAが好ましい。
転写液としては、ノルマルブタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、メタノール、エタノール等低級アルコール類が挙げられ、特にノルマルプロパノールが好ましい。
転写用膜としてはPVDF膜以外ではニトロセルロース膜、ナイロン膜が使用でき、PVDFが好ましい。
基質としては4−クロロ−1−ナフトール、ジアミノベンジジンが挙げられ、特に4−クロロ−1−ナフトールが好ましい。
以下本発明方法について、さらに詳細に説明する。
【0006】
(1) 人参や関連生薬の粗抽出エキスをTLCにスポットし、適切な展開溶媒で展開する。展開したTLCをPVDF膜で被い、熱をかけて転写する。
(2) 転写した膜を過ヨウ素酸塩溶液中で反応させ、ついで蛋白溶液につけて蛋白抱合体を形成させることにより吸着を完結する。
(3) 抗GRb1MAbと反応させた後、パーオキサイド標識2次抗体と過酸化水素、基質を加えて反応させ、発色させる。
【0007】
【発明の実施の形態】
(a) 各種人参や人参製剤、関連植物等の粉末10mg程度をメタノール1mlにて5回抽出する。遠心にかけ上清のメタノールを窒素気流中で留去する。小量のメタノールに溶解し、TLCプレートにスポットする。クロロホルム−メタノール−水(7:4:1)またはブタノール−酢酸エチル−水(15:1:4)で展開する。展開したTLCにノルマルプロパノール−メタノール−水混合液をスプレーする。TLCをPVDF膜で被い、グラスフィルターをカバーし、その上にステンレスの板を置き、その上からアイロンで140℃、30秒加熱する。この操作によりTLC上の化合物は全てPVDF膜に転写される。
(b) (a)で転写した膜を過ヨウ素酸ナトリウム溶液(10mg/ml)中で1時間反応する。反応後PVDF膜を水洗し、BSA含有炭酸緩衝液に移し3時間反応する。反応後PBSで洗浄する。非特異的結合を避けるためにスキンミルク−リン酸緩衝食塩水(PBS)で3時間ブロッキングを行う。これによりジンセノサイド類が完全にPVDF膜へ吸着する。
(c) PVDF膜へ抗GRb1MAbを添加し3時間反応する。ツイーン添加PBS溶液で洗浄し、1,000倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgGヤギ抗体を加えて3時間反応を行う。ツイーン添加PBS(T−PBS)で洗浄後、基質の4−クロロ−1−ナフトールと過酸化水素を添加して15分間反応して発色する。 また、組織染色は以下の通りである。
人参の根の切断面をPVDF膜で被い、5時間放置する。転写した膜を上記の(b)、(c)と同様に処理して発色させる。
【0008】
実施例1 TLCによるジンセノサイド類の検出
白人(図1のレーン6:以下同じ)、紅人(レーン5)、ヒゲ人参(レーン4)、田七人参(レーン3)、アメリカ人参(レーン2)、竹節人参(レーン1)のメタノール抽出粗エキス、およびジンセノサイド類のスタンダードである、ジンセノサイドRb1(レーン12)、ジンセノサイドRc(レーン11)、ジンセノサイドRd(レーン10)、ジンセノサイドRe(レーン9)、ジンセノサイドRg1(レーン8)、並びに竹節サポニン(レーン7)を2枚のシリカゲルTLCプレートにスポットする。これらのTLCをブタノール−酢酸エチル−水(15:1:4)で展開する。そのうちの1枚のプレートは通常の硫酸を噴霧して加熱により発色する。もう1枚のプレートは上記の方法により抗体染色する(図1)。
図1のa図は硫酸により発色したものである。図1のb図はPVDF膜に転写後本発明の抗体染色したものである。硫酸染色においてはスタンダードは勿論のこと、多くのスポットが発色している。
【0009】
一方抗体染色の方はスタンダードおよびそれに相当するスポットのみが発色している。例えばオレアナン骨格のアグリコンを持つ竹節サポニン(レーン7)は発色していない。このことから人参に固有なダンマラン骨格を持つジンセノサイド類のみが検出されていることがわかる。
ジンセノサイドReとジンセノサイドRg1(レーン9と8)は最初発色するものの、時間の経過とともに退色する。このことから糖の結合位置を類推することが可能となった。
また、硫酸発色でトップ付近にアグリコンと思われるスポットが認められるが、本発明の抗体染色では認められない。これはアグリコンが糖を持たないため、PVDF膜に吸着されず洗浄の過程で流失したためである。
上記ジンセノサイド類の構造式は下記表1に示される。
【表1】
【0010】
実施例2 人参器官の抗体染色
人参の根の部分を縦および横に切断する。直ちにPVDF膜を被い、5時間放置する。膜を洗浄後、上記の方法で抗体染色する。図2にこれらの抗体染色を示す。内皮部分にジンセノサイド含有量が高く、内部の髄部分には含有量が少ないことがわかる。また、髄線に沿って放射状に分布していることが明確にわかる。人参の根を縦割に、上記と同様にして抗体染色したのが図3である。この染色からも内皮部分に多く、中心部には少ないことが良くわかる。これらの抗体染色からジンセノサイドを効率良く抽出単離するためには濃く染色した部分を分離し、原料とすることが好ましい。
【0011】
参考例 抗GR1MAbの製造
抗GRb1MAb産生ハイブリドーマの製造
(1) 抗原の調整: GRb1(10mg)を80%メタノール0.7mlに溶かした溶液を、4mgの過ヨウ素酸ナトリウムを水0.5mlに溶かした溶液に撹拌しながら添加する。1時間反応後、BSAを溶かした炭酸塩バッファーを上記反応液に添加して、5時間撹拌反応する。反応後透析して17mgのGRb1−BSA抱合体を得た。GRb1−HSA抱合体も同様にして得た。
(2) 免疫脾臓細胞の調整:GRb1−BSA抱合体50μgをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳濁化させ、BALB/C系マウスの腹腔内に投与した。以後、2週間の間隔で50μgのGRb1−BSA抱合体アジュバント溶液を2回同様に投与し、最後にGRb1−BSA抱合体のみを100μg投与し免疫を完了した。3日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、100メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【0012】
(3) ハイブリドーマの調整:単離した免疫脾臓細胞に低張液(155mM塩化アンモニウム)を加えて赤血球を溶血した後、Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)で細胞を3回洗う。マウスミエローマ細胞もIMDMで3回洗浄した。両細胞数を計測し脾臓細胞と骨髄腫細胞を10:1の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポリエチレングリコール(PEG)4000を培地で希釈した45%液を0.5ml滴下して融合を行った。37℃、30秒間静置した後、IMDM1mlを1分間かけて添加した。引き続き10mlを5分間かけて添加した。1,000rpmで10分間遠心した。沈殿を10%FeS添加IMDMにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン10-4M、アミノプテリン4x10-7Mおよびチミジン1.5x10-5Mを加えた(HAT−)10%FeS添加IMDMを用いて沈殿を再び浮遊させ、96ウエルマイクロプレートに100μlずつ分注した。3日毎に同一培地を50μl追加し、細胞の増殖を確認した。
【0013】
(4) 抗体産生ハイブリドーマの検索:ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、GRb1−HSA抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ELISAによりGRb1に対するMAb産生ハイブリドーマを検索した。すなわち、96ウエルマイクロプレートにGRb1−HSA抱合体0.1μg/100μl/ウエルを分注し、25℃で5時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を100μlずつ分注し抗原抗体反応を行った。0.05%ツィーン20含有リン酸緩衝食塩水(T−PBS)で3回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体1000倍希釈液をウエルあたり100μl添加し、1時間後にT−PBSで洗浄した。0.003%過酸化水素、ABTS0.3mg/ml含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。20分後プレートリーダーを用いて405nmの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【0014】
(5) 抗GRb1MAb産生ハイブリドーマのクローニング:抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に3回クローニングしてクローンを得た。
(6) 抗GRb1MAbの調整:上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地(10μg/mlインスリン、35μg/mlトランスフェリン、20μMエタノールアミン、25nMセレニューム添加eRDF培地)で37℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインGFFカラムを用いて精製した。すなわち、上清をトリス緩衝液でpH7に調整し、カラムに付す。カラムを10mMリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を100mMクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液はPBSに対して3回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体を得た。
【0015】
【発明の効果】
抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体(抗GRb1MAb)を用いることで、ジンセノサイド類のアグリコンであるダンマラン骨格を持つパナクサトリオールを特異的に認識し、他の骨格を持つ化合物には一切反応しないため、非常に特異的であり、ジンセノサイド類のみを検出することができる。このため本発明方法により新活性ジンセノサイド類を発見し、容易に構造解析を行うことが可能になった。すなわち糖鎖部分のみの構造を解明することにより全体構造決定ができる。
【0016】
また、薬用人参の組織、器官等はその切片にPVDF膜を被うことでジンセノサイド類を膜に転写させ、簡便に発色、定量(検出)することができ、従って高含有部位の検索が極めて迅速に行える。
本発明方法は配糖体全般にわたり応用可能な技術であり幅広い応用面が考えられる。人参は大変高価であるので、ジンセノサイドの抽出原料としては適切ではないが、本発明方法により薬理活性の強いジンセノサイド含有植物のスクリーニングが容易に行え、適切な原料植物の発見が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 TLC展開図の図面代用写真である。
【図2】 人参の根の部分の横断面抗体染色図の図面代用写真である。
【図3】 人参の根の部分の縦断面抗体染色図の図面代用写真である。
Claims (4)
- ジンセノサイド類を膜に転写し、この膜を過ヨウ素酸塩で処理し、蛋白を加え抱合体を形成させ、ジンセノサイド類を膜に固定化し、ついで抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応でジンセノサイド類を特異的に染色する方法。
- ジンセノサイド類をポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、この膜を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、ヒトまたはウシ血清アルブミンを加え抱合体を形成させ、ジンセノサイド類を膜に固定化し、ついで抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応でジンセノサイド類を特異的に染色する請求項1の方法。
- 薄層クロマトにより薬用人参のジンセノサイド類を分離し、転写液を用いてポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、ついで過ヨウ素酸塩で処理し、アルブミンを加えてジンセノサイド類を膜に固定化させ、さらに抗ジンセノサイドRb1モノクローナル抗体、パーオキシダーゼ標識2次抗体、基質の順に添加してジンセノサイド類を特異的に発色させる方法。
- 薬用人参の器官の切片をポリビニリデンジフルオリド膜で被いジンセノサイド類を膜へ転写し、膜を過ヨウ素酸塩で処理し、蛋白を加えてジンセノサイド類を膜に固定化させ、ついで抗ジンセノサイドRb1モノクロナール抗体、パーオキシダーゼ標識2次抗体、基質の順に添加して、ジンセノサイド類が存在している部位を特異的に発色させる方法。
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