JPS6344895A - 抗アミロイドａ蛋白質単クロ−ン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトのアミロイドＡ蛋白質に対する単クロー
ン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗体は続発性
アミロイド−シスの検出に有用である。

従来技術 アミロイドＡ蛋白質に対する単クローン性抗体としては
、ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・エンド
・サイトケミストリー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）　　３２．　３２２〜３２８．１
９８４に報告があるが、アミロイド−シス患者組織から
精製したアミロイドＡ蛋白質を免疫源に用いており、抗
体の認識する抗原部位（エピトープ）は明らかでない。

発明が解決しようとする問題 アミロイド−シスは、不溶性のアミロイド蛋白質が種々
の組織に沈着し、アミロイド線維やアミロイド班を形成
し、その沈着した組織＜ｍ器）の機能障害を引き起こし
、進行性に病態が悪化し、ついには死に到る難病である
。昭和５０年に厚生省特定疾患アミロイドーシス調査研
究班が組織され、病理学的に、（１）原発性アミロイド
−シス、（２）多発性骨髄腫に合併するアミロイド−シ
ス１、（３）続発性アミロイド−シス、（４）分類困難
なアミロイド−シス、（５）遺伝性アミロイド−シスお
よび、（６）限局性アミロイド−シスに分類されている
。その分類によって、沈着するアミロイド蛋白質の種類
も異なり、アミロイドＡ蛋白質は、続発性アミロイド−
シスのほとんどすべてと、家族性地中海熱に伴うアミロ
イド−シス（遺伝性アミロイド−シス）の一部に沈着が
認められる。一種類の単クローン性抗体によって、全て
のアミロイド−シスの病理診断を行うことは、原理的に
も不可能であるが、それぞれのアミロイド蛋白質に特異
的な単クローン性抗体を確立すれば、アミロイド−シス
の病理、。

診断上有用である。

本発明者は、続発性アミロイド−シスを検出するのに有
用な単クローン性抗体を製造すべく研究″を行った。す
なわち、下記第１表で示′されるヒトのアミロイドＡ蛋
白質の中から、１〜１２番目のアミノ酸配列で示される
ペプチド（以下ペプチド１という）、１５〜２５番目の
アミノ酸配列で示されるペプチド〈以下ペプチド２とい
う）、３７〜４７番目のアミノ酸配列で示されるペプチ
ド（以下ペプチド３という）、５６〜６６番目のアミノ
酸配列で示されるペプチド（以下ペプチド４という）お
よび６６〜７６番目のアミノ酸配列で示されるペプチド
（以下ペプチド５という）を合成し、これらをそれぞれ
担体蛋白質と結合させ、結合物を用いてマウスを免疫し
、常法に従って単りローン性抗体産、生ハイブリドーマ
細胞株を造成した。その結果、ペプチド３には反応する
が、ペプチド１．２．４および５には実質的に反応性を
示さない単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株を得、本発明を完成するに至った。

第　　　　１　　　　表 以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、アミロイドＡ蛋白質に反応し、Ｈｉｓ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇで示されるペプチドと反応し
、かツＡｒｇ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１．ｕ−Ａ　１ａ−Ｐｈｅ
−＾Ｓｐ、　Ａｒｇ−ＡＳｐ−Ｍ１１！ｔ−Ｔｒｐ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ、　Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒ
ａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−ＧｌｎおよびＧ
ｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｔで示されるペプチ
ドとは実質的に反応しない単クローン性抗体を提供する
。

本発明の単クローン性抗体はＩｇＧまたはＩｇＭクラス
に属し、その具体例としてはＫＭ−２６８およびＫＭ−
１９６と名付けたものがそれぞれあげられる。

本発明の単クローン性抗体は、旧ｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
Ｇ、１ｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇで示されるペプチドまたはその担体蛋白
質との結合物で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞
と哺乳動物め骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブ
リドーマ細胞株から該ペプチドに特異的に反応するハイ
ブリドーマ細胞株を選び、該細胞株を培地に培養するか
、哺乳動物の腹腔に投与して腹水化し、培養物または腹
水中に該ペプチドに特異的に反応する単クローン性抗体
を蓄積させ、該培養物または腹水から該単クローン性抗
体を採取することにより製造することができる。

哺乳動物としては、マウス、ラット、ウシ、ウマなどが
あげられる。

哺乳動物としてマウスを用いた本発明単クローン性抗体
の具体的製造法を以下に示す。

（１）免疫動物脾細胞の調製 マウスを、ペプチド３または、その担体蛋白□質との結
合物で免疫して、そめ免疫マウ及から脾細胞を調製する
。

ペプチド３の合成は、ペプチド合成機（アプライド・バ
イオシステム社製）で行う。

免疫の方法は、８〜１０週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮
下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバ
ント〔例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　、Ｆｒｅｕｎｃｌ’　５Ａｄｊｕｖａｎｔ
）あるいは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチ
ンなど〕とともにペプチド３またはその担体蛋白質との
結合物を１０〜２００■／匹投与し、以後１〜２週問お
きに初回免疫に使ったと同じ抗原を同量、２〜５回投与
する。

各免疫後４〜７日目に、眼底静脈数より採血し、血清中
のアミロイドＡ蛋白質およびペプチド３に対する抗体価
を調べる。

抗体価の測定は、面相酵素免疫測定法（酵素免疫測定法
：医学書院列１９７８１年）により下記のとおり行う。

９６大のＥＩＡ用プレート［１？１ｏｗじａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ社（米）製〕に、特異抗原（アミロイドＡ蛋白質
。

ペプチド３．ペプチド３と担体蛋白質〔サイログロブリ
ン（以下Ｔｈｙと略記する場合もある）またはキーホー
ルリンペットヘモシアニン（以下ＫＬ、Ｈと略記する場
合もある）〕との結合物、担体蛋白質の１〜５０μｇ／
ｍｌ　’Ｊン酸バッファー・セライン（リン酸２ナトリ
ウム１．８３ｇ、　　リン酸１カリウム０．２１ｇ、食
塩７．６５　ｇ　、蒸留水１７゜ｐＨ７，２，以下ＰＢ
Ｓという）溶液）を５０１ｄ！／穴ずつ分注し、４℃で
一晩放置して抗原をプレートにコートする。次いで、１
％牛血清アルブミン＜ＢＳＡ）　−ＰＢＳ　２０　ｏＪ
Ｉｆｌ／穴を分注して底面上の蛋白質結合性残基をＢＳ
Ａでブロックする。

上記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、第１抗体として、
段階希釈した試料（マウス抗血清、ハイブリドーマ培養
上清、精製抗体）を５０ＪＩ！ｌ／穴分注し、４℃で一
晩または室温で３〜４時間放置する。

ＰＢＳで６回洗浄した後、第２抗体として、ウサギの抗
マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物（Ｄ
ＡＫ○社製、販売：協和メデックス〕の４００倍希釈液
を１００ｍ／大分注し、室温で２時間放置する。ＰＢＳ
で洗浄後、ＡＢＴＳ基質液Ｃ２，２’−アジノビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモ
ニウム５５０■を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，２
）１［に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素ｌＪＩ
！ｌ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発色をＯＤ、、’５
ｎｍで吸光度を測定する。

免疫に用いたペプチド３およびアミロイドＡ蛋白質に対
する抗体価が、正−常マウス血清の１０３倍以上（４１
５ｎｍでのＯＤ値）になったマウスを免疫化動物細胞の
供給源として使う。−細胞融合に供するために、免疫マ
ウスに融合処理の３〜４日前に、ペプチド３と担体蛋白
質との結合物１０〜２０’Ｏｘｒ／匹を腹腔内に投与し
、追加免疫後、肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
　　（Ｐ３−０１）（カレント・トピックス・イン・ミ
クロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ−ｂ’ｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　４８．　１〜
７　（１９７Ｂ））、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４１　　
（Ｎｓ−１）（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロシイ（口ｕｒｏ−ｐｅａｎ　Ｊ、−’Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）、　　６．５１１〜５１９　（１９７６））
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ−２）Ｃネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、　２７６、２６９〜２７０　（１９７
８）−）　、Ｐ　３　＝Ｘ６３＝Ａｇ８６５３　（６５
３）Ｃジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ）、旦１５４８〜１５５０　（１９７９
）　）　、Ｐ３−７Ｘ６３７Ａｇ８　（Ｘ６３）〔ネイ
チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２５６．　４９５〜４９
７　（１９７５）Ｅなどが用いられる。

これらの細胞株は、８−アザグアニン培地ＣＲＰＭＩ−
１６４０培地にグルタミン（１５ｍＭ）、２−メルカー
プトエダノール（５×１・０−５Ｍ）、ジエンタマイシ
ン（１０に／ｍｌ　）および牛胎児血清（ＦＣ３Ｌ（１
０％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（
１５ｔｔｇ　７ｍ１．）を加えた培地〕で、継代するが
、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日
２Ｘ１０’以上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫したマウスに１０〜２００■／匹のペプチ
ド３とサイログロブリンとの結合物を腹腔内に投与し、
３〜４日後に肺臓を摘出し、脾細胞を調製する。この脾
細胞と（２）で得られる骨髄腫細胞株をＭＥＭ培地（日
永製薬社製）または、ＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が、
脾細胞：骨髄腫細胞−５〜１０：１になるように混合し
、遠心分離にかける。上清を捨て、沈殿した細胞群をほ
ぐした後、攪拌しながらポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ１０００〜４．０００＞１〜４ｇＳＭＥＭ培地１〜４
ｍｌ、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌ
、ｆｏ、ｘｉｄｅ）０、５〜１．０ｍｌの混液０．１〜
１．．０；ｍｌ／１０！　Ｉｊｌ！細胞を加え、Ｏ，、
、５〜、、　１．０分後にＭＥＭ培地０．５〜３ｍｌを
加える。その後０．５〜２分毎にＭＥＭ培地０，５〜３
ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜６０ｍ１加え
る。

遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地５０〜２０　Ｑｍｌを加え、メスピペットでゆる
やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養用プレートに
半容量／穴ずつ分注し、３〜７％Ｃ○２インキュベータ
ー中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培養する。培養プ
レートに半容量／穴のＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン（１０−５〜１０−３Ｍ）、チミジン（１０−’
〜１．０−’Ｍ）およびアミノプテリン（１０−８〜１
．　Ｏ，−’　Ｍ　）を加えた培地〕を加え、さらに１
０〜３０時間培養する。

以後１〜３日間日間１０註３０ 清半容量を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、Ｃ　
Ｏ　２インキユベーター中、３５〜４０℃で１０〜１４
日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間日間１０註３０ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上
清の一部をとり上記の酵素免疫測定法により、抗アミロ
イドＡ蛋白質抗体価を測定する。

抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗アミロイドＡ蛋白質単りローン性抗体産
生ハイブリドーマ株として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン（２．　６，　１０．　１４−テトラメチル
ペンタデカン）処理した８〜１０週令ＢＡＬＢ／Ｃ系マ
ウスに（３）で得られた抗アミロイドＡ蛋白質単りロー
ン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０’〜７個
／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマ
は腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分
離して固形分を除去後、５０％硫安、４０％硫安塩析し
、ＰＢＳ　（ｐＨ７、２）で１〜２日間透析する。この
透析画分を粗精装車クローン性抗体として精製、定量用
に供することができる。

さらに精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム、プロティンへーカラムあるいはセファクリル５
＝３００カラムなどに通塔し、活性画分（ＩｇＧＳ　Ｉ
ｇＭあるいはＩｇＡ画分）を集める。

抗体のイソタイプ、サブクラスの決定はロｕｃｈーｔｅ
ｒｔｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１５。

学会出版センター刊、ｐ．７４．　１９８１年）によっ
て行つ〇 蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍの吸光
度より算出する。

本発明の単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ細
胞株ＫＭ−１　９　６，ＫＭ−２　６　８は英国、Ｂｕ
ｒｏｐｅａｎ　ＣｏＩｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍ
ａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）に１９
８６年７月３日付でそれぞれＥＣＡＣＣ　　Ｎα８６０
７０３０５および８６０７０３０３として寄託しである
。

（５）ペプチド３と担体蛋白質の結合法（ｉ）担体蛋白
質として牛サイログロブリンを用いる場合： ペプチド３（２ｍｇ／ｍｌ蒸溜水）０．５ｍｌと牛サイ
ログロブリン（以下Ｔｈｙという）　　（Ｓｉｇｍａ社
製、（１０■／ｍｌ蒸溜水））０．５ｍｌを混ぜ、Ｉ　
Ｍ　　Ｃ　Ｈ３　Ｃ　Ｏ　Ｏ　Ｎ　Ｈ４を加えてｐＨを
７．Ｏｊトする。０．　０　２　’Ｍゲルタールアルデ
ヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）　０．　５　’
４ｍｌを加え、室温にて５時間攪拌し、室温で５０〜１
００容の蒸溜水で１日間透析する。この透析界を超音波
破砕〔超音波洗浄機（サンヨーＳ’ＵＷ−　１　５　０
　）で１０分間〕して、免疫あるいは酵素免疫測定法に
供した〔参考文献：Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ，　Ｂｘｐ，　Ｂ
ｉｏｌ。

ｌｅｄ，　　、１４ｇ．７，８４〜？３９　（１９７５
）］。

（　ｉｉ　）担体蛋白質としてキーホールリンペットヘ
モシアニン（、　Ｋ　Ｌ　Ｈ　）を用いる場合：２０ｍ
ｇのＫ　Ｌ　Ｈ　（Ｓｉｇｍａ社）を１２．５ｍｌの１
０ｍＭリン酸バッフｙ−（ｐＨ７．２）に溶かし、温浴
中で超音波にかけた後、１　２．　０　０　Ｏｒｐｍ。

１０分間遠沈した上清に、Ｍ　Ｂ　Ｓ　（ｍ−ｍａｌｅ
ｉｍｉｄ。

−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ，半井化学）４．３ｍｇを、１０
０ＪｄｌのＮ　−　Ｎ　’　−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒ
ｍａｍｉｄｅ　　’（半井化学）に溶解し、その８１ρ
を加え、室温で３０分間攪拌した。その溶液を５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　　Ｇ　−２５　（ファルマシア製）に通塔し
、５０ｍＭリン酸バッファーで溶出し、ＫＬＨ−ＭＢの
ｆｒａｃｔｉｏｎを取り、その１００Ｉｌ！！とペプチ
ド３　５■を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）
１ｍｌに溶解した溶液０．５〜２．５ｍｌを加え、室温
で３時間攪拌し、１００容のＰＢＳで透析したものをＫ
ＬＨ−結合物として用いる□〔参考文献：Ｃｅ１１．　
２８．　４７７　＝４８７　（１９８２）：ｌ。

本発明の単クローン性抗体は、通常の免疫組織化学的手
法などにより、続発性アミロイド−シスの検出に用いる
ことができる。

実施例１゜ 〔１）免疫マウス牌細胞の調製 ８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（静岡県実験動物農業協
同組合）にアジユバントとして水酸化アルミニウムゲル
２ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉県血清研
究所）１’Ｘ１０ｓ細胞／匹と抗原としてペプチド３と
サイログロブリンとの結合物１１００Ｉ１／匹を腹腔内
投与し免疫した。

以後、１ないし２週問おきに、ペプチド３とサイログロ
ブリンの結合物１００ｇ／匹を腹腔内に投与し、２回目
以降の免疫をかけた。３回目の免疫以降、免疫の５〜７
日後に眼底静脈束より採血し、血清中の抗−アミロイド
Ａ蛋白質抗体価を面相法による酵素免疫測定法で調べた
。血清中のアミロイドＡ蛋白質に対する抗体価が、正常
マウス血清の１０３倍以上のマウスに、更にペプチド３
とサイログロブリンとの結合物１００■／ｍｌを腹腔内
投与して追加免疫し、３日後このマウスから脾細胞を調
製して細胞融合に用いた。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｌを正
常培地（ＲＰ’ＭＩ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ
、２−メルカプトエタノ−Ｊ１１５　Ｘ　Ｉ　Ｑ−５Ｍ
１ジ工ンタマイシン１０■／ｍｌおよび牛胎児血清０、
ｌ　ｍｌ　／ｍｌを加えた培地〕に培養（３７℃、Ｃｏ
、５％通気）し、４日後に２Ｘ１０’以上の細胞を得る
。

（３）ハイブリドーマの作製 ＭＥＭ　（日永製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス牌
細胞ｌＸＩＯ３個とマウス骨髄腫細胞２×１０７個とを
混合し、１，２０Ｑｒｐｍで５分間遠心分離にかける。

沈殿として得られた脾細胞とＰ３−０１の混合した細胞
群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃、ポリエチレ
ングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇＳＭ
ＥＭ２ｍｌおよびＤＭＳＯＯ，７ｍｌの混液Ｑ、５ｍｌ
を加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを加えた。その後ＭＥＭ
１ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭを全容量が５０
ｍ１となるよう加える。

９００ｒｐｍで遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細
胞をほぐした後、ＨＡＴ培地〔上記正常培地にヒポキサ
ンチン′１０−４Ｍ１チミジン１．５×ｉ　ｏ−’Ｍ、
およびアミノプテリン４Ｘ１０−７Ｍを加えた培地１１
００ｍｌを加え、１０ｍ１メスピペツトでゆるやかに細
胞を懸濁する。

懸濁液を９６穴培養用プレー）　（ｆａｌｃｏｎ、　　
ベクトン・ディッキンソン社製〕に２００１１ｔｌ／穴
ずつ分注し、５％Ｃ０２インキニベ一ター中３７℃で、
１０〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上清１００ＡＩ！を捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培
地よりアミノプテリンを除いた培地〕を１００ｐ加え、
３７℃で培養する。以後２日間同様にＨＴ培地への交換
を行い、培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、
抗アミロイドＡ蛋白質抗体価を上記の同相酵素免疫測定
法により測定する。

抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンＫＭ−１９６，ＫＭ−２６８を抗アミロイド
Ａ蛋白質単りローン性抗体産生ハイブリドーマ株として
選択する。

（４）単クローン性抗体の製造 プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン０．５ｍｌ／匹を腹腔内投与し、１〜２週間
飼育する。〕した８週令タードマウス（ＢＡＬＢ／ｃｎ
ｕ−／ｎｕ−）雌マウスに上記で得られたハイプリドー
マ株各４Ｘ１０６細胞／匹を腹腔的注射する。

１０〜２１日後にハイプリドーマ株は腹水癌化する。１
０〜２１日後に腹水のたまったマウスから腹水（４〜１
０ｆｆｌｌ／匹）を採取し、遠心分離して固形分を除去
した。上清を５０％硫安塩析、４０％硫安塩析し、ＰＢ
Ｓ（ｐ）（７，２＞で２日間透析する。これを粗精製単
クローン性抗体とする。粗精製単クローン性抗体をＤＥ
ＡＥ−セファロースカラムに通塔後、溶出し、ＩｇＧ画
分を集め、精製単クローン性抗体とする。

（５）単クローン性抗体の抗原特異性 面相酵素免疫測定法により、精製単クローン性抗体の特
異性を検討した。抗原としては、アミロイドＡ蛋白質、
ペプチド１〜５．ペプチド１〜５とサイログロブリンと
の結合物、ペプチド１〜５トキーホールリンペツトヘモ
シアニンの結合物。

サイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン
、および牛血清アルブミンを用いた。その結果を第２表
に示す。

第　　　　２　　　　表 注：　＋＋＋１ｔＯＤ４＋ｓが０．３００以上、＋＋ハ
ＯＤ４＋ｓが０、２００〜０．２９９、士はＯＤ　４１
　Ｓが０．１９９〜０．１００、−はＯＤ　４１５が０
．０９９以下を示す。

実施例２゜ ミクロトームで５ＩＩｎにスライスした続発性アミロイ
ド−シス患者由来の肝や腎のホルマリン固定パラフィン
包埋組織切片を、卵白アルブミンでコートしたスライド
グラスに固定し、キシレンで脱パラフイン後、アルコー
ル−水で段階的に親水化した。レジン水で５分間すすぎ
、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノール中で室温３０分間
静置し、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次に
切片を２０分間ＰＢＳで洗浄後、希釈したウマ正常血清
中で室温２０分間静置した。切片から過剰の血清を吸い
取り、第１抗体（抗−アミロイド単クローン性抗体ＫＭ
　−２６８、２０ｘｒ／ｍｌ）と３００分間反応せた。

洗浄後、希釈ビオチン化抗体（ビオチン化ウサギ抗Ｉｇ
Ｇ抗体）を３００分間反応せ、さらに洗浄後、アビジン
−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクター社製）
を３００分間反応せた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ
基質（０，０２％Ｈ２０２を含む０．１　Ｍ　）　！Ｊ
スス−酸バッファー（ｐ　Ｈ７，２）で調整した０、１
％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ｄｉａ
ｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈ
ｌｏｒｉｄｅ）　）を２分間反応させ、水冷中で反応を
停止した。ヘマトキシレン染色後、アルコール−水およ
びキシレンで脱水後、カナダバルサムで固定し、検鏡し
た。

その結果、続発性アミロイド−シス患者の肝や腎では、
水沢に、アミロイドＡ蛋白質の沈着像が観察された。

一方、健常人の肝や腎組織切片は、同様の処響をほどこ
しても、全く染色像は認められなかった。

発明の効果 本発明によれば、続発性アミロイド−シスの検出に有用
な単クローン性抗体が提供され、続発性アミロイド−シ
スの病理診断が効率よく行うことができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミロイドＡ蛋白質に反応し、Ｈｉｓ−Ａｌａ−
   Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａ
   ｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇで示されるペプチドと反応し、か
   つＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
   Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ，Ａ
   ｒｇ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙ
   ｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ，Ｇｌｕ−Ａｌａ
   −Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
   Ａｓｎ−Ｉｌｅ−ＧｌｎおよびＧｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
   −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
   Ａｓｎ−Ｓｅｒで示されるペプチドとは実質的に反応し
   ない単クローン性抗体。
2. （２）ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する特許請求の範
   囲第１項記載の単クローン性抗体。
3. （３）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙ
   ｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇで示され
   るペプチドまたはその担体蛋白質との結合物で哺乳動物
   を免疫し、該免疫動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞
   とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞株から該ペ
   プチドに反応するハイブリドーマ細胞株を選び、該細胞
   株を培地に培養するか、哺乳動物の腹腔に投与して腹水
   化し、培養物または腹水中に該ペプチドに反応する単ク
   ローン性抗体を蓄積させ、該培養物または腹水から該単
   クローン性抗体を採取することによって得られる特許請
   求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。