JPS617299A

JPS617299A - ヒトアポリポ蛋白ｂ４８に高い特異性を有する単クローン性抗体

Info

Publication number: JPS617299A
Application number: JP59126663A
Authority: JP
Inventors: Tatsuhiko Kodama; 龍彦児玉; Hiroshige Itakura; 弘重板倉; Hiroyuki Yuya; 浩幸油谷; Makoto Onishi; 真大西
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd; Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd; Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1984-06-20
Filing date: 1984-06-20
Publication date: 1986-01-13
Also published as: JPH0513635B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はアポリー蛋白Ｂ４８〔以下「アー？Ｂ４８」と
略す〕に高い特異性を有する抗体及びこれを産生ずるハ
イブリドーマに関する。

〔従来の技術〕

アボリー蛋白Ｂ（以下［アポＢＪと略す）はヒト血漿ト
リグリセリドリツチリ、＋３５白の合成、分泌に重要な
役割をもっている。ア？Ｂには肝で産生され超低比重す
？蛋白（ＶＬＤＬ）合成に関与するア４ヒリ？蛋白Ｂ１
００　（以下アポｎ１ｏｏと略す）と、小腸で産生され
カイロミクロン合成に関与するアポＢ４８がある。アポ
Ｂを含むＩＪ　、ｌｅ蛋白は動脈硬化惹起性を有すると
考えられ、両者を分析、定量する事は重要である。アポ
Ｂの遺伝的欠損によりひきおこされる無βす？蛋白血症
には、アポＢ１００、アーＢ４８両者共欠損する古典型
と、ア、ｔｆ３１００のみが欠損するＴＧ正常型があり
、アポＢ１００とアｉｖ　ｎ　４　ｓは異なる遺伝的支
配の下にある。このように１アポＢは様々な機能を廟す
るにもかかわらず、難溶性であり、分解しやすい高分子
蛋白のためその研究は遅れている。

また、ア？Ｂの特異的抗原決定基を認識する単クローン
性抗体としてはアポＢ１００のみに結合する抗体（単ク
ローン性抗体抗Ｂ１００−１）と、アポＢ１００及びア
飲Ｂ４８に同様に結合する抗体（単クローン性抗体抗Ｂ
４８−１）が知られる。しかしながら、アｚｎｔｏｏに
比しア？Ｂ４８に高い特異性を有する抗体は従来えられ
ていなかった。

〔本発明が解決しようとする問題点〕叙上の現状において、各種免疫疾患の治療、診断及びこ
れらに関する研究で利用し得る、アポＢ４８に高い特異
性を有する抗体及びこれを有利に製造する方法の開発が
望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはアＴＩＥ！Ｂ４８に高い特異性を有する抗
体を得べく鋭意研究をおこなった結果、精製したアｆ′
Ｂ４８に対する単クローン性抗体の中からア、ｌｆ′ｎ
１ｏＯ１ＬＤＬに比しアポＢ４８に胃い特異性を有する
抗体を見出した。

すなわち本発明は精製されたヒトアポ′り畔蛋白Ｂ４８
で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細
胞ラインからの細胞との細胞融合で得られたハイブリド
ーマによって産生され、次の特徴を有する単クローン性
抗体を提供するものである。

（１）　　正常ヒト血中ア４？す４？蛋白ｎ４８と結合
する。

（２）　　アポリポ蛋白Ｂ１００に対する結合性は、ア
？リホ蛋白Ｂ４８に対する結合性に比べ低く、その他の
正常ヒト血中蛋白とは反応しない。

（３）　　ＴＧ正常壓無βり御飯白血症患者の血中り？
蛋白と結合する。

本発明のアポＢ４８に特異的な抗体（以下［抗ア、ｆｎ
４８−ＩＪと称する）は、次のようにして調製される。

まず抗ア＆Ｂ４８−ｎを産生するハイブリドーマを準備
する。このハイブリドーマは次の５工程により得られる
。

（ｉ）　　アＸＩｆ’Ｂ４８Ｏｆｆ製 ■　免疫 ■　細胞融合 ■　ハイブリドーマの選択 ■　単クローン性抗体産生株の確立ア＆１４８の精製に当っては、カイロミクロンを多量に
要するので正常人の大量脂肪食１：摂取後の血漿を用いる。サンプル１鮪凝契彎ヒ豊遠→は
、ＥＤＴＡ％Ｎ　ａＮ３及びカナマイシンを加えて処理
後、ｉｏｏ、ｏｏｏｔで２０時間超過心し、ＶＬＤＩ、
十カイロミクロン分画をえる。この分画より、再び超遠
心法でカイロミクロン分画を分取する。得られたカイロ
ミクロン分画をエーテル：エタノール−１：３で脱脂後
、１０　Ｘ　ｓＤ８を含有する１％２−メルヵゾトエタ
ノ〜ル溶液に溶解する。この溶液を、ウォーターノアケ
ラトで５０’Ｃに保ったセファロース４Ｂ−ＣＬカラム
にて、ダルＰ遇する。

（溶媒は０，５％ＳＤＳ　％０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｍ　
ＨＣＩｐ）（７，４）。得られたア、１ｅＢ４８にとむ
分画をプレ／９レイテイブ（Ｐｒｅｐａｒａｔｌｖｅ　
）　ＳＤＳ電気泳動装置を用いて更に精製する。この工
程を２日以内におえることにより、アｙｌｅＨの分解を
少なくすることができ、はぼ純粋なアポＢ４８をうるこ
とができる。

次いでこのア、ＩＰ　１４　Ｂを用い、常法によりマウ
スに免疫を行なう。免疫されたマウスより取り出された
脾細胞とマウス骨髄腫（ＮＢ　−１）からのハイブリドーマの作成は０１（７
）方法（ｓｗＬｚｃｒＥＤＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　＋Ｊ
ＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｐ　３５１−３７
２　（１９８０）　）により行なった。ハイブリドーマ
の中には、種々のアポＢ４８に対する抗体を作る細胞が
存在するが、ア？Ｂ４８に対し高い特異性を有する抗体
産生株は次の方法により選択される。まず、低比重り？
蛋白（ＬＤＬ）、カイロミクロンそしてＳＤＲにより脱
脂したアポＬＤＬ　。

アポカイロミクロンのり？蛋白もしくはアポ蛋白でコー
トした４種のＥＩＡ法用法用−レート意する。なお、ア
ボヵイロミクｏ７Ｉｆｉこれ−８〜を脱脂後、純水と手透膜にて透析することにより、効率
よくプレートに付着させられ、アポＢ４８に対する特異
性の高い抗体をひろい出すことが容易となる。次にチェ
ックしたい細胞の培養上清を適量釜プレートに取りイン
キユヘートシ、結合した免疫グロブリン量を／Ｑ−オキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体で測定する。ＬＤＬ及び
アポＬＤＬは、アポＢ１００のみを含むのに対し、カイ
ロミクロン及びアポカイロミクロンは、ア＆ｎｔｏｏと
アポＢ４８両者を含む。この結果、ＬＤＬ又はアポＬＤ
Ｌに比し、カイロミクロン及びアポカイロミクロンに高
い親和性を有する抗体及びこれを産生ずるハイブリドー
マが選択される。この中からアポＥ４８との結合性がア
ポＢ１００と比し１０倍以上高い抗体〔抗ア＝ｔｅＢ４
８−１１）を産生ずるハイブリドーマが選択され２回の
限界稀釈法にて単クローン化される。

こうして目的のハイブリドーマが得られたなら、目的の
抗体（抗アＸＩＰｎ４８−１）は次の２つの方法で量産
される。その１つはハイブリドーマを適当な培養液中（
ｉｎマ１ｔｒｏ　）で培養し、その上清に生成された抗
体を回収する方法でるり、他の１つはハイブリドーマを
マウスに注射し、（Ｉｎｖ１マ０）生体内で培養し、マ
ウスの腹水中に生成される抗体を回収する方法である。

前者の方法では抗体価は低いが純度の高いものが得られ
る。これに対し、扱者の方法では純度はやや劣るが、非
常に抗体価の高いものが得られる。どちらの方法を選択
するかは目的により使いわけられる。

〔作用〕

次に斯くして得られた抗アＴＩ？Ｂ４８−…を利用して
おこなわれる免疫ｒｔＰ素抗体測定方法（ＥＩＡ法）に
ついて説明する。このＢＩＡ法としては、測定したいサ
ンプルを叡すステレン製９６穴マイクロプレートへ付着
させ、その後抗ア＆Ｂ４８−１、パーオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧを反応させる間接法と、プレートへあら
かじめウサギ（又はヤギ）抗ア？Ｂポリクローナル抗体
を付着させておき、これにサンプルを結合させ、次いで
抗アポＢ４８−Ｕを添加するサンドインチ法のいずれを
も採用することができる。そして、本発明の抗アポＢ４
８−［は上記したようにアポＢ４８には結合するがアポ
Ｂ１００との結合性はア＆Ｂ４８の結合性のｌ／１０程
度又はそれ以下と弱く、また、他の珀［中アポり厳蛋白
、例えばアルブミン、アｚ＋Ｈｓ’蛋白Ｅ等とは結合し
ないのであるから、他の従来知られている単クローン性
抗体を用いた場合の結果と照合することによりアＴＮ？
８４８の正確な定量が可能となった。この結果、カイロ
マイクロンレムナンドの検出、ア＆Ｂ１００欠撰者のア
ポＢの測定、腸管で合成されるア破り？蛋白の数量的診
断、食後に血中に増加するＴＧ　リッチリ？蛋白におけ
る小腸由来リポ蛋白の割合、食事性因子の動脈硬化にお
よばず影響等を知ることができるようになった。

〔実施例〕

次に実施例を皐げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１単クローン性抗体抗アポ１１４８−■及びそれを産生ず
るハイブリドーマの製法：（１）　　アポ８４８の精製カイロミクロンの分取は種々のサンプルより行なわれる
が、ここでは血漿よりの分離法についてのべる。

正常人の大量脂肪食摂取後の血漿約２ｔを採取後直ちに
ｌ　ｍＭ　ＥＤＴ人、０．０２％Ｎ＆Ｎ３となるよう調
製し、ＢｅｅｋｍａｎＳｗ　２７０−ター１０００００
　ｆで２０時間超遠心し、カイ日ミクロン＋ＶＬＤＬ分
画を得る。

更にこの分画をＢｅｅｋｍａｎ　４０％　　３０−ター
で２０．００Ｏｒｐｍ　３０分間遠心踵浮上したカイロ
ミクロン分画を取る。このカイロミクロン分画は２０倍
量のエーテル：エタノール（ｌ：　３　ｖｏｌ　／マｏ
ｔ）溶液中にてｌＯ時間脱月旨する。沈澱した蛋白を２
．００　Ｏｒｐｍ　５分遠沈にて回収したのち、約１０
ｍ１のｌＯ％ＳＤＳ、１％２−メルカゾトエタノール溶
液に溶解する。

このうち約５Ｔｎｌをウォータージャケットで５０℃に
したセファロース４　Ｂ　−ＣＬカラムによりグルＰ遇
する。溶媒は０．５％ＳＤＳ　。

０．０１　ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐＨ７，２０，１５
Ｍ　ＮａＣ１を用いる。得られたアｄｅ　Ｂ　４８にと
む分画をタイアフロ−メンブレンＰＭ　１０　（アミコ
ン社）を用いて濃縮後、３５１６１！？リアクリルアミ
ド、０．１％ＳＤＳ電気泳動を行ないダルを切断してア
、１ｅＢ４８のみを含む分画を回収し、０．５％ＳＤＳ
　　Ｏ，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ溶液中にアポＢ４８
を溶出させる。

（２）免疫精製したＳＤＳ溶液中のアポＢ４８　１００μ２を、フ
ロイント完全アゾユバンドと共にＢＡＬＢ　／　ｃマウ
ス（６週令〕に皮下注射し、３週後に５０μ９をアゾユ
ノミンドと共に腹腔内へ注射した。

（３）　　細胞融合２回目の免疫より３日後、マウスの牌臓をとりだし、脾
細胞の懸濁液とする。１ｘｉｏ”個の脾細胞を３ＸｌＯ
’個の８−アザグアニン耐性骨髄細胞腫（ＭＳ　−１）
とポリエチレングリコールを用いて融合した。＃１胞は
、９６穴マイクロ培養プレート５枚に分配された。

２４時間後、上清の半分をＨＡＴ培地（ヒ辿キサンチン
ｌＸｌ０−’Ｍ％アミノゾテリン４Ｘ　ｌ　Ｏ−’　Ｍ
ｓチミゾン１．６　Ｘ　ｌ　Ｏ−”Ｍ　）におきかえる
。ＨＡＴ耐性細胞（）・イブリドーマ〕が、２−３週後
に大半のウェルに増殖するのが観察される。

（４）　　ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの産生ずる抗体が、ア＆ｎ４８に高い特
異性を有するか否かは、ＥＩＡ法を用いて検討した。ア
Ｔｆ′ｎ１００のみを有するＬＤＬ又はアポＬＤＬをコ
ートしたｌ、ＩＡ用プレートと、アポＢ１００及びア？
Ｂ４８を有するカイロミクロン及びア？カイロミクロン
をコートしたＥＩＡ用プレートの計４種のプレートを用
意する。ア破カイロミクロンのｋＩＡ用プレートへの同
相化にあたっては次の処置を懺する。まず、カイロミク
ロンを既述のごとくエーテル：エタノール脱脂後ＳＤＳ
溶液に可溶化する。しかしながらＳＤＳを多量に含むま
までは、プレートへのコートの効率が悪いため、ア叡カ
イロミクロンを含む８ＤＳ溶液を純水と２時間半透膜に
て透析後、プレートへのなうことで、アポＢ４８を自む
ア畔カイ日ミク日ンを効率よくゾレートヘ付看すること
ができる。これらのＩＩＡ用グレグレートイクロプレー
ト中の培養上清（２５−１００μｔ）を試料穴へ添加し
プレートに付着する免疫グロブリン量をノＱ−オキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて測定した。抗アｚｎ
４ｓ−Ｉｔのハイブリドーマ上清は、ア？Ｂ４８を多く
含むカイロミクロン又はアポカイロミクロンに強い親和
性を有した。

（５）　　単クローン化単クローン化は、選択されたハイブリドーマを、フィー
ダー細胞にマウス胸腺細胞を用いる限界稀釈法に２度か
け、ＥＩＡ法でア＆Ｂ４８に強い親和性を有する株のみ
を選択、増殖させた。

（６）　　単クローン性抗体の作成（ａ）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ法ハイブリドーマは適当な培養液（例えば牛胎児血清を１
０％含むＲＰＭＩ　ｌ　６４０培地）で培養し、その培
養上清を回収した。上清中に分泌された抗体ｉ、ｓｏ％
飽和硫安で沈澱精製し抗体濃度を高めて使用できる。

（ｂ）ｉｎ　ｖｌｖｏ法ハイブリドーマを注射するＢＡＬＢ　／　ｃマウス（４
月令）には、あらかじめ（４日前）２゜６．１０．１４
−テトラメチルペンタデカンを腹腔内に注射しておく。

次に抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス１匹あたり
５ＸｌＯ’個腹腔内に注射する。その後１〜２週後に腹
水により腹部が肺大したマウスより腹水を採取する。こ
の腹水はゾロテアーゼ活性をのぞくため５６℃で３０分
加熱し不活化する。このように処理された腹水は特に精
製することなくそのまま使用できる。

実施例２単クローン性抗体の特異性抗ア１ｒｎ４ｓ−Ｂの各種ア辿り日″蛋白との結合性は
ＥＩＡ法及びトランスブロッティング法を用いて検討し
た。まずＥＩＡ法では、抗ア＆ｎ４８−ＩＩＨ、ヒト血
漿カイロミクロンと強く反応し、ＶＬＤＬ、　　ＬＤＬ
とは弱く反応し、ＨＤＬ　、比重１．２１以下の分画と
は結合しない。

８種のＬＤＬとアポカイロミクロンとの抗アポＢ４８−
１の結合の比率を表１に示す。なお、８種のＬＤＬ　、
　　カイロミクロ／に結合した抗Ｂ４８−川に対し、ノ
Ｑ−オキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を結
合させ、発色後０Ｄ４９雪−１１１（＋を測定した。ま
た、ＬＤＬ及びアポカイロミクロンはそれぞれｔｌぼ同
音のア？Ｂを含むよう調整した。

一２〇− 表１ＬＤＬとアポカイロミクロンに対する抗ア畔Ｅ４８−Ｉ
ｆの結合の比較トランスプロッティング法による抗アポＢ４８−■とア
＆ｎ群の結合性の検討は次の様に竹なった。１ず各アポ
゛リポ蛋白は油谷らの方〆により５ＯＳ−＆リアクリル
アミドグラジェントグル電気泳動を行ない、その後Ｔｏ
ｖｂｌｎ率＊の方法により、セルロースニトレート膜へ移される。こ
のセルロースニトレート膜ヲ抗アｆ′Ｂ４８−ｎと室温
で１時間インキュベートしたのち、ノＱ−オキシＩ−ゼ
標識抗マウスＩｇ抗体を用いて各ア？リーＥ′蛋白を検
出した。すなわち、正常者脂肪食後３時間の血漿中のＴ
Ｇ・リツチリ鑓蛋白（ａ＜１．００６分画）のアポ蛋白
をＳＤＳ　−＆リアクリルアミドグラジェントグル電気
泳動しく第１図、ム）それをセルロースニトレート膜へ
トランスプロッティングした後抗Ｂ４ｓ−ｌと結合させ
、抗マウスＩｇＧ・、Ｑ−オキシダーゼで発色させた（
第１図、Ｂ）。へ第１図、ム箋のクマゾー染色ではＢ１
００がＢ４８よりがなり多いが、抗Ｂ　４８−１は、８
４８とよく結合することが第１図、Ｂに示されている。

ア＆Ｂ１００とＢ４８をｓｏｓｙｘｇリアクリルアミド
電気泳動後電気泳動−スニトレート膜へトランスプロッ
トしその後抗Ｂ４８−１［、抗Ｂ４８−１と反応させ、
結合したＩｇを、Ｑ−オキシダーゼ標識抗マウスＩｇＫ
よシ検討した結果を第２図に示す。従来より知られる抗
Ｂ４８−１は主にＢ１００へ結合するが（第２図、ｎ）
、抗Ｂ４８−■はＢ１００へは＃１とんど結合せず、Ｂ
４８へはよく結合する（第２図、Ａ）。

これらの結果から、抗ア畔Ｂ４８−１ｆは、’＃ｆ’Ｂ
４８とけ強く結合するが、アポＢ１００とは弱く結合す
るにすぎないことがわかる。

表１の結果とあわせて考えると抗アポＢ４８−］は、ア
＆Ｂ４８に対する結合量の約ｌ。

％以下しかアポＢ１００に結合しえない。

＊油谷らの方法：Ｊｏｇｒｎａｌ　ｏｆ　ＢＩｏｅｈｅｍ１ｓｔｒｙ＋　
９４１１２４１＊＊　’ｌ’ｏｗｂｉｎの方法：Ｐｒｏｃ＠ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ａ
ａａｄｓｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　Ｕ、１３．ム、、
７６．４３５０−４３５４

【図面の簡単な説明】

第１図はアポ蛋白をＳＤＳ　−？リアクリルアミドグラ
ジェントダル電気泳動し九結果（ム）及び更にこれを抗
Ｂ４８−Ｉｔと結合させ発色せしめた結果を示す図ｉノ
である。第２図は、アポＢ４８とアポＢ１００を５ＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動せしめ、抗Ｂ４８−■（刀及び抗
Ｅ　４８−１　（Ａ）と結合させた後発色せしめた結果
を示す図面でおる。以上

Claims

【特許請求の範囲】１、精製されたヒトアポリポ蛋白Ｂ４８で予め免疫され
たマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの
細胞との細胞融合で得られたハイブリドーマによつて産
生され、次の特徴を有する単クローン性抗体。（１）正常ヒト血中アポリポ蛋白Ｂ４８と結合する。（２）アポリポ蛋白Ｂ１００に対する結合性は、アポリ
ポ蛋白Ｂ４８に対する結合性に比べ低く、その他の正常
ヒト血中蛋白とは反応しない。（３）ＴＧ正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白
と結合する。２、精製されたヒトアポリポ蛋白Ｂ４８で予め免疫され
たマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの
細胞との細胞融合によつて得られ、次の特徴を有する単
クローン性抗体を産生するハイブリドーマ。（１）正常ヒト血中アポリポ蛋白Ｂ４８と結合する。（２）アポリポ蛋白Ｂ１００に対する結合性は、アポリ
ポ蛋白Ｂ４８に対する結合性に比べ低く、その他の正常
ヒト血中蛋白とは反応しない。（３）ＴＧ正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白
と結合する。