JPH02167073A - 単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質ｂ１００抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質Ｂ１００抗
体を産生ずるハイブリドーマに関するものである。

従来技術 アポリポ蛋白ｄＢは、ヒト血漿トリグリセリドリンチリ
ポ蛋白質の合成および分泌に重要な役割をもっている蛋
白質である。このアポリポ蛋白質Ｂには、肝で産生され
ＶＬＤＬ　（超低比重リポ蛋白′ｉ！ｔ）の合成に関与
するアポリポ蛋白質Ｂ１００　（以下、アポＢ１００と
略称する）と、小腸で産生されカイロミクロン合成に関
与するアポリポ蛋白質Ｂ４８（以下、アポ８４８と略称
する）がある。アポリポ蛋白質Ｂの遺伝的欠損による疾
患である無βリポ蛋白血症には、アポＢ１００とアポＢ
４８が共に欠損する無βリポ蛋白血症古典型と、アポＢ
１００のみの欠…するトリグリセリド正常型無βリポ蛋
白血症がある。そのいずれもが、赤血球異常、精神神経
症状など重篤な症状を呈するが、トリグリセリド正常型
無βリポ蛋白血症ではカイロミクロンが合成されうる。

またアポリポ蛋白質Ｂを含むリポ蛋白質は動脈硬化を惹
起する性質を有すると考えられ、アポロ１００とアポ８
４Ｂが異なる代謝経路を有するため、動脈硬化の発症機
序を知る上でも両者の分別は重要である。

上記の如く、アポリポ蛋白質Ｂは、様々な機能を有する
にもかかわらず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋
白質から成るため、その研究は未だ詳細になされていな
い。この研究のためには、アポリポ蛋白質Ｂの各構成部
分を特異的に認識する必要がある。従来、我々は抗ヒト
ＬＤＬ　　（正常者血中低比重リポ蛋白質）単クローン
性抗体を作成してきた。しかし、この場合、アポＢ１０
０と脂質の複合体を見ており、また、アポ８１００以外
のアポリポ蛋白質も混入しており、最近、アポＢ１００
とその他のアポリポ蛋白質との特定の複合体を認識した
という報告もある。

発明の目的 本発明の目的はこのようなアポリポ蛋白質Ｂの各構成部
分を特異的に認識する特に抗ヒトアポリポ蛋白質Ｂ１０
０の単クローン性抗体（以下、抗アポ８１００−Ｉと略
称する）を産生ずるハイブリドーマを得ることにある。

発明の構成 本発明の抗アポＢ１００−１を産生ずるハイブリドーマ
は、アポＢ１００で予め免疫されたマウスの脾細胞と、
マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞との融合によって
形成される。このような抗アポＢ１００−１およびこの
抗体を産生ずる本発明のハイブリドーマは、例えば次の
４工程によって作成することができる。

（１）アポＢ１００の精製 （２）免疫 （３）細胞融合 （４）ハイブリドーマの選択および単クローン化。

このようにして作成された抗アポｎ１ｏｏ−ｒは、２元
拡散法の結果、ＩｇＧｌａサブクラスに属することがわ
かった。ＳＯＳポリアクリルアミド・グラジェント電気
泳動法を用いて正常者血中のアポリポ蛋白質Ｂをその亜
種に分け、それをトランス・プロッティング法にてニト
ロセルロース用紙に転移させ、抗アポＢ１００−１との
結合を見た。その結果、抗７　ホＢ１００−１はアポＢ
１００と結合するが、アルブミンやアポリポ蛋白質Ａ−
１などの蛋白質とは結合しない。同じ方法で、アポ旧ｏ
ｏ、アポＢ４８およびアポＢ１００の分解産物との結合
を調べると、抗アポ８１００−１：ＬＤＬおよびＶＬＤ
Ｌ（７）　７ボ８１００と結合するがカイロミクロンの
アポＢ４８とは結合できない。更に、アポＢ４８と類似
した分子量（約２０万）を有するアポＢ１００の分解産
物とは結合する。即ち、この抗体はアポＢ１００の分解
産物とアポ８４８を識別しうる特長を有する。

更に、この抗アポＢ１００−１を用いて免疫酵素抗体の
測定法を開発した。この方法として、測定したいナンプ
ルをポリスチレン９６穴プレートへ付着させる間接法と
、プレートにあらかじめウサギ抗アポＢポリクローナル
抗体を付着させておき、これにサンプルを結合させるサ
ンドイツチ法を用いた。

本発明によって得られる抗アポＢ１００−１を用いると
、比較的よい精度で、ヒトＬＤＬの定量が可能である。

前に述べた無βリポ蛋白血症の患者には、本邦ではアポ
Ｂ１００の単独欠損であるトリグリセリド正常型（名古
屋家系）と、アポＢ１００とアポＢ４８が共に欠損する
古典型（神奈川家系）とが知られている。この両家系患
者のリポ蛋白質中アポリポ蛋白質は、トランスブロッテ
ィング法および免疫酵素抗体法のいずれを用いても、本
発明の抗アポＢ１００−１と結合できなかった。このこ
とはこの抗体がアポＢ１００以外のいかなるアポリポ蛋
白質とも結合できないことを支持している。

以上まとめると、本発明によって得られる抗アポＢ１０
０−１は、１）正常者人血中、アポＢ１００と反応する
が、アポＢ４８とは反応しない、２）　ＴＧ正常型無β
リポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白質とは反応しない、３
）正常者人血中のＬＤＬおよびＶＬＤＬと反応する各性
質を有することがわかった。

次に、本発明の抗アポＢ１００〜■を産生ずるハイブリ
ドーマを作成するための好適例を説明する。

まず、アポＢ１００みを精製するために、正常者から採
血した血漿を速やかに超遠心法にて分離してＬＤＬ分画
を採取し、その後ウォータージャケントで加温したセフ
ァロース４Ｂ・ＣＬカラムを用いて、ＳＯＳ　　（ドデ
シル硫酸すトリウム）を含む溶液でゲル濾過する。この
工程を２日以内に終える場合、アポ口１００の分解は極
めて少なく、はぼ完全なアポＢ１００分画を得ることが
できる。この方法によると、アポＢ４８やアポリポ蛋白
質Ｅ、アポリポ蛋白質＾−■の混入が妨げられる。また
、脱脂は９９％行われ、ＳＤＳとのミセルに置き換わる
。これによりアポＢ１００のみのミセルが得られる。

このようにして精製したアポＢ１００をマウスに投与し
、免疫されたマウスの脾細胞を取り出す。このマウスの
脾細胞とマウスの骨Ｗａｌｌ細胞ラインからの細胞とを
融合させて本発明のハイブリドーマを得る。このハイブ
リドーマの作成は、例えばオーイらの方法を用いること
ができる（ＳＥＬＥＣＴＥＤＭＩＥＴＩＩＯＤＳ　ＩＮ
　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＬＩＮＯＬＯＧＶ、３５１−
３７２．　Ｆｒｅｅｍａｎ１９８０）。

得られた本発明のハイブリドーマから抗アポＢ１００−
１を作成するには、例えば次の２方法を用いることがで
きる。

Ｉの方法は、ハイブリドーマを適当な培養液中（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ）で培養し、その上澄みに生成された抗体を
回収する方法である。他の方法は、ハイブリドーマをマ
ウスに注射しくｉｎ　ｖｉｖｏ）生体内で培養し、マウ
スの腹水中に生成された抗体を回収する方法である。前
者の方法では、抗体価が低いが純度の良いものが得られ
るが、後者の方法では純度はやや劣るが非常に抗体価の
高いものが得られる。

どちらの方法を選択するかは目的によって使いわけられ
る。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明する。

１施■−１ この実施例では、抗アポ旧ｏｏ−ｒ、およびそれを産生
ずるための本発明のハイブリドーマを作成した。

（１）アポＢ１００の精製 正常者から採血したヒト血漿約２００　ｍｌｌを超遠心
法にて分離し、比重１　、０３０〜１　、０５０の純粋
なＬＤＬ分画を採取する。その約３　ｃｃを１　ｃｃの
１０％ＳＯ５および１％２−メルカプトエタノールと混
合し、５０°Ｃで１０分間培養する。この混合液を２　
ｃｍ　Ｘ　１００　ｃｍの５０°Ｃにウォータージャケ
ットしたセファロース４Ｂ　−　ＣＬカラムに通してゲ
ル濾過する。その際に、流出液として０．５％ＳＯＳお
よび０．０１Ｍ　　）リスＩＩＣＩ　を０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣｌでｐＨ７、２に調整した緩衝液を流速２０ｄ／時
で使用した。その結果、はぼ純粋なアポ口１００が得ら
れる。脱脂は９９％以上完全である。

（２）免　疫 精製したＳＯＳ溶液中のアポＢ１００を１００　μｇ、
フロイント完全アジュバントと共に雄のバルブ／Ｃマウ
ス（６週令）に皮下注射した。３週後に再度、前記アポ
口１００の１０μｇを前記アジュバントと共に腹腔内へ
注射した。

（３）細胞融合 ２回目の免疫から３日後に、マウスの肺臓を取り出し、
脾細胞の懸濁液とする。この脾細胞１×１０１′（固を
、３Ｘ１０’（固の８゛−アザグアニン白１性骨髄細胞
１１！１！ＮＳ−１とポリエチレングライコール＃　４
０００を用いて融合した。細胞は９６穴マイクロ培養プ
レ一ト５枚に分配した。

２４時間後、上澄みの半分を）ＩＡＴ培地（ヒボキサン
チンＩ　ＸＩＯ−’Ｍ，　　アミノプテリン４　ＸＩＯ
−’ｌ’！。

チミジン１．６　ＸＩＯ−’Ｍ）に置きかえた。ＨＡＴ
耐性細胞（ハイブリドーマ）が２〜３週間後に大半の培
地に増殖するのが観察される。

（４）ハイブリドーマの選択および単りローン化マ°イ
クロプレート中の培ａ？＆上澄み１００　μＰをＬＤＬ
をコートしたアンセイ用プレートに入れ、室温で１時間
放置後、３回洗浄する。そこへ、１０００倍に希釈した
抗マウスＩｇＧ　　・パーオキシデース標識を加え、ま
た１時間室温で反応させ、さらに３回洗浄後、発色液を
加え、光度計で比色した。

ＨＤＬ　　（α−リポ蛋白質）や１．２１ボトム分画と
反応せず、ＬＤＬと強く反応する抗体を分泌するハイブ
リドーマを選を尺した。

単クローン化は、この選択したハイブリドーマを、フィ
ーダー細胞にマウス胸腺Ｘ、■胞を用い、限界希釈法に
２度かけることによって行った。

（５）抗アポＢ１００−１の作成 ａ）インビトロ法 前記工程で得られたハイブリト−−マは、適当な培養液
（例えば、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭＴ　１６４０
培地）で培養し、その培養上澄みを回収した。上澄み中
に分泌された抗体は、精製せずそのまま使用できる純度
の高いものが得られた。

ｂ）インビボ法 ハイブリドーマを注射するマウスにあらかじめ（４日前
）　、２．　６．１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ンを腹腔内に注射しておく。

次に抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス１匹あたり
５Ｘ１０６個、腹腔内に注射する。

注射後４〜１０日で、マウス腹腔内に高濃度の抗体を有
する腹水が生成してくる。このＩＩＩ水は抗体としてそ
のまま使用できる。

ス尉ｌ殊−」工 この実施例では本発明によって得られた抗アポＢ１００
−１の特異性を調べた。

抗アポＢ１００−１と各種リポ蛋白質との結合は免疫酵
素抗体法を用い、また各種アポリポ蛋白質との結合はト
ランスブロンティング法を用いて行った。

第１表に各種リポ蛋白質と本発明抗体との反応性を示す
。

本アポＢ１００単独欠１員患者からの 血漿を精製し、アポＢ４８およ びアポＥを含む。

測定は次のように行った。

９６六マイクロプレートに、ウサギのポリクローナル抗
アポＢ血清を固定化しておく。そこに測定したいリポ蛋
白試料１００μｌを入れ、室温１時間放置後３回洗浄す
る。洗浄後、抗アポｔ＋１ｏｏ−＋　Ｏｔ！水の場合は
約１０００倍に希釈）を１００μＰ入れて、１時間室温
で反応させた後、３回洗浄する。その後、各ウェルに抗
マウス■ｇＧ　　・パーオキシデース標識を入れ、発色
液を加え、吸光度を測定する（サンドインチ法）。

この結果をみると、抗アポ旧００−■はアポＢ１００を
含むＶＬＤＬ、　ＬＤＬと結合するが、アポＢ４８のみ
を含むカイロミクロンとは結合できない。

次に、各種アポリポ蛋白質と抗アポＢ１００−１との結
合性をトランスブロッティング法により検討した。その
結果を第２表に示す。

各種リポ蛋白質から調製されたアポ蛋白質は、油谷らの
方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｇＡ１２４１−１２４
５．１９８３）によって、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
グラジェントゲル電気泳動により分離される。このゲル
中の蛋白質はトウビンらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７６４３５０−４３５４．１９
７９）により、セルロースニトレート紙にうつされる。

このセルロースニトレート紙は、抗体溶液中で、１時間
室温で反応させた後、洗浄する。セルロースニトレート
ＩＩＥに付着した抗体は、ｉＪプロティンＡを用い、オ
ートラジオグラフィーで検出するか、ツアングらの方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９
２３７７−３９０Ａｃａｄｅｎ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３）にて、パーオキシデース
標識抗マウスＩｇＧと発色液を用いて検出される。

このトランスブロッティング法による検討でも、本発明
によって得られる抗アポＢ１００−１はアポＢ１００お
よびその分解産物とは反応しうるが、アポＢ４８とは反
応し得ないことがわかった。また、ＴＧ正常型無βリポ
蛋白血症患者血中のアポＢ４８とは結合することができ
なかった。

以上、本発明によって得られる単クローン性抗体は各狸
リポ蛋白質およびアポリポ蛋白質を特異的に認、識する
ことができるので、血液の清浄、定量または定性、ある
いは臨床上の治療や病気の診断等に利用することが可能
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトアポリポ蛋白質Ｂ１００で予め免疫されたマウ
   スの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞と
   の融合によって形成され、 １）正常者人血中、アポリポ蛋白質Ｂ１００と反応し、
   アポリポ蛋白質Ｂ４８とは反応しない、２）ＹＧ正常型
   無βリポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白質とは反応しない
   、 ３）正常者人血中低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超
   低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）と反応する各性質を有す
   る単クローン性抗ヒトアポリ ポ蛋白質Ｂ１００抗体を 産生するハイブリドーマ。