JPH02163079A - ヒトアポリポ蛋白質b48に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

ヒトアポリポ蛋白質b48に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ

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JPH02163079A
JPH02163079A JP30066089A JP30066089A JPH02163079A JP H02163079 A JPH02163079 A JP H02163079A JP 30066089 A JP30066089 A JP 30066089A JP 30066089 A JP30066089 A JP 30066089A JP H02163079 A JPH02163079 A JP H02163079A
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JP
Japan
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apolipoprotein
apob48
hybridoma
human
mouse
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JP30066089A
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Inventor
Tatsuhiko Kodama
龍彦 児玉
Hiroshige Itakura
弘重 板倉
Makoto Onishi
真 大西
Hiroyuki Yuya
浩幸 油谷
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University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はヒトアポリポ蛋白質848に対する単クローン
性抗体を産生ずるハイブリドーマに関するものである。
従来技術 アポリポ蛋白質Bは、ヒト血漿トリグリセリドリッチリ
ポ蛋白質の合成および分泌に重要な役割をもっている蛋
白質である。このアポリポ蛋白質Bには、肝で産生され
VLDL (超低比重リポ蛋白質)の合成に関与するア
ポリポ蛋白質B100(以下、アポB100と略称する
)と、小腸で産生されカイロミクロン合成に関与するア
ポリポ蛋白質B48(以下、アポB48と略称する)が
ある。アポリポ蛋白質Bの遺伝的欠損による疾患である
無βリポ蛋白血症には、アポB100とアポB48が共
に欠損する無βリポ蛋白血症古典型と、アポB100の
みの欠損するトリグリセリド正常型無βリポ蛋白血症が
ある。そのいずれもが、赤血球異常、精神神経症状など
重篤な症状を呈するが、トリグリセリド正常型無βリポ
蛋白血症ではカイロミクロンが合成されうる。またアポ
リポ蛋白質Bを含むリポ蛋白質は動脈硬化を惹起する性
質を有すると考えられ、アポB100とアポB48が異
なる代謝経路を有するため、動脈硬化の発症機序を知る
上でも両者の構造を知ることは重要である。
上記の如く、アポリポ蛋白質Bは、様々な機能を有する
にもかかわらず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋
白質から成るため、その研究は未だ詳細になされていな
い。この研究のためには、アポリポ蛋白質Bの各構成部
分を特異的に認識する必要がある。
発明の目的 このために、本発明は、アポB48の精製手段を確立し
、精製したアポB48に対する単クローン性抗体(以下
、抗アポB48−Iと略称する)を産生ずるハイブリド
ーマを得ることを目的とする。
発明の構成 本発明の抗アポB48−1を産生ずるハイブリドーマは
、アポB48で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウ
スの骨髄腫細胞ラインからの細胞の融合によって形成さ
れる。このような本発明の抗アポB48−Iおよびこの
抗体を産生ずる本発明のハイブリドーマは、例えば、次
の4行程によって作成することができる。1.アポB4
8の精製、2.免疫、3.細胞融合、4゜ハイブリドー
マの選択および単クローン化。
このようにして作成された抗アポB48−Tは、2元拡
散法の結果、IgGlaサブクラスに属することがわか
った。トランス・プロッティング法により検討すると、
抗アポB48−Iは、アポB100およびアポB48に
結合するが、アルブミン、アポリポ蛋白質Eその他のア
ポリポ蛋白質とは結合しえない。
更にこの抗体を用いて免疫酵素抗体の測定法を開発した
。この方法として、測定したいサンプルをポリスチレン
96穴プレートへ付着させる間接法と、プレートにあら
かじめウサギ抗アポBポリクローナル抗体を付着させて
おき、これにサンプルを結合させるサンドイツチ法を用
いた。本発明の抗アポB48−Iを用いると、比較的よ
い精度で、ヒト血中アポリポ蛋白質Bの定量が可能であ
る。
前に述べた無βリポ蛋白血症の患者には、本邦ではアポ
B100の単独欠損であるトリグリセリド正常型(名古
屋家系)と、アポB100とアポB48が共に欠損する
古典型(神奈川家系)とが知られている。トランスブロ
ッティング法および免疫酵素抗体法を用いると、名古屋
家系患者のリポ蛋白質およびアポリポ蛋白質Bは本発明
の抗アポB48−Iと結合しえたが、神奈川家系患者の
リポ蛋白質およびアポリポ蛋白質は結合を示さなかった
。このことは抗アポB 48−1が、アポリポ蛋白質B
以外のいかなるアポリポ蛋白質とも結合できないことを
支持している。
以上まとめると、本発明によって得られる抗アポB48
−1は、1) 正常者人血中、アポB48と反応する、
2) アポリポ蛋白質B以外のアポリポ蛋白質とは反応
しえない、3)TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中
リポ蛋白質とは反応しうる各性質を有することがわかっ
た。
次に、本発明の抗アポB48−Iを産生するハイブリド
ーマを作成するための好適例を説明する。
まず、アポB48を精製する。このためには、カイロミ
クロンを多量必要とするため、乳び腹水患者の乳び腹水
、V型窩脂血症患者の血漿または正常人の脂肪食後血漿
を用いる。サンプルが得られたならば、EDTA、 N
aN、、  カナマイシンを加えて処理した後、超遠心
法にて分離してVLDL+カイロミクロン分画を得る。
さらに、このVLDL十カイロミクロン分画から、超遠
心法でカイロミクロン分画を得る。こうして得られたカ
イロミクロン分画を有機溶媒(例えば、エーテルとエタ
ノール、テトラメチルウレアまたはクロロホルムとメタ
ノール)にて脱脂し、SDS (ドデシル硫酸ナトリウ
ム)を含む溶液に溶解する。この溶液をウォータージャ
ケットで加温したセファロース4B−CLカラムを用い
てSDS溶液でゲル濾過する。この工程を2日以内に終
える場合、アポB48の分解が少なく、はぼ純粋なアポ
B48を得ることができる。
このようにして精製したアポ848を用いると、免疫が
良好に行われた。すなわち、アポB48をマウスに投与
し、免疫されたマウスの脾細胞を取り出す。このマウス
の脾細胞とマウスの骨髄腫(MS−1)からの細胞とを
融合させて本発明のハイブリドーマを得る。このハイブ
リドーマの作成は、例えばオーイらの方法を用いること
ができル(SEL[ECTIED MBT)I[lDS
 IN ’CELLULARIMMUNOLOGY。
351〜372、Freeman、 1980)。
得られた本発明のハイブリドーマから、抗アポB48−
Iを作成するには、例えば次の2方法を用いることがで
きる。
1の方法は、ハイブリドーマを適当な培養液中(in 
vitro)で培養し、その上澄みに生成された抗体を
回収する方法である。他の方法は、ハイブリドーマをマ
ウスに注射しくin vivo)生体内でインキュベー
トし、マウスの腹水中に生成された抗体を回収する方法
である。前者の方法では、抗体価が低いが純度の高いも
のが得られ、後者の方法では純度はやや劣るが非常に抗
体価の高いものが得られる。どちらの方法を選択するか
は目的によって使いわけられる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明する。
実施例1 この実施例では、アポB48を精製する。
カイロミクロンの精製は種々のサンプルを用いて行われ
るが、ここでは乳び腹水から精製する。
乳び腹水約2βを採取後、直ちに1mM  EDTA。
0.02%NaN、を加えて調製し、ベックマンSW・
270−ターで27000 rpm、20時間超遠心し
、カイロミクロン+VLDL分画を得る。更に、この分
画をベック7 ン4Q、 3 o−ターで2000Or
pm、 30分間超遠心し、浮上したカイロミクロン分
画を回収する。このカイロミクロン分画を、20倍量エ
ーテルとエタノール(1: 3 vol/vol )溶
液中にて10時間脱脂する。沈殿物は、200Orpm
、5分間遠心して回収し、約10ccの10%SDSと
1%2−メルカプトエタノール溶液に溶解する。このう
ち5CCを、50℃にウォータージャケットした2cm
X100 cmのセファロース4B−CLカラムに通し
てゲル濾過する。その際に、流出液として0.5%SD
Sおよび0.OIM)リスHCIを0.15 M Na
C1でpH7,2に調整した緩衝液を流速20m1Z時
で使用した。
この結果、はぼ純粋なアポB48が得られる。脱脂はほ
ぼ完全である。
実施例2 この実施例では、本発明の単クローン性抗体(抗アポB
48−I)を産生ずるためのハイブリドーマを作成する
1、免 疫 精製したSDS溶液中のアポB48を100μg用いて
、フロイント完全アジュバントと共に雄のバルブ/Cマ
ウス(6退会)に皮下注射した。3週間後に再度、前記
アポB48の10μgを前記アジュバントと共に腹腔内
へ注射した。
2、細胞融合 2回目の免疫から3日後に、マウスの肺臓を取り出し、
脾細胞の懸濁液とする。この脾細胞1×108個を、3
X10’個の8−アザグアニン耐性骨髄細胞腫MS−1
とポリエチレングライコール#4000を用いて融合し
た。細胞は96穴マイクロ培養プレ一ト5枚に配分した
24時間後、上澄みの半分をHAT培地(ヒポキサンチ
ンI Xl0−’M 、アミノプテリン4 Xl0−”
 M、チミジン1.6 Xl0−’ M)  に置きか
えた。HAT耐性細胞(ハイブリドーマ)が2〜3週間
後に大半の培地に増殖するのが観察される。
3、ハイブリドーマの選択および単クローン化マイクロ
プレート中の培養液上澄み10μlを、脂肪食後血漿か
ら得られたアポB48を多く含むトリグリセリドリッチ
リポ蛋白をコートしたアッセイ用プレートに入れ、室温
で1時間放置後、3回洗浄する。そこへ、1000倍に
希釈したパーオキシデース標識抗マウスIgGを加え、
1時間室温で反応させ、さらに3回洗浄後、発色液を加
え、光度計で比色した。
トリグリセリドリッチリポ蛋白と強く反応する抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。
単クローン化は、この選択したハイブリドーマを、フィ
ーダー細胞にマウス胸腺細胞を用い、限界希釈法に2度
かけることによって行った。
4、抗アポB48−Iの作成 a)インビトロ法 前記工程で得られたハイブリドーマは、適当な培養液(
例えば、牛胎児血清10%を含むRPM11640培地
)で培養し、その培養上澄みを回収した。上澄み中に分
泌された抗体は、精製せずそのまま使用できる純度の高
いものが得られた。
b)インビボ法 ハイブリドーマを注射するマウスにあらかじめ(4日前
) 、2. 6. to、 14−テトラメチルペンタ
デカンを腹腔内に注射しておく。
次に抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス1匹あたり
5X106個、腹腔内に注射する。注射後4〜10日で
マウス腹腔内に高濃度の抗体を有する腹水が生成してく
る。この腹水は抗体としてそのまま使用できる。
実施例3 この実施例では抗アポB48−Iの特異性を調べた。
抗アポB48−Iとアポリポ蛋白質との結合は、トラン
スブロッティング法によって検討した。まず、各アポリ
ポ蛋白質は、油谷らの方法(J、 Biochem94
1241−1245.1983)によって、5DS−ポ
リアクリルアミドグラジェントゲル電気泳動を行い、そ
の後、トウビンらの方法(Proc、 Natl、 A
cad、 Sci。
U S A、 764350−4354.1977) 
により、セルロースニトレート紙に移される。このセル
ロースニトレート紙は、抗アポB48−Iと室温で1時
間インキュベートしたのち、パーオキシデース標識抗マ
ウスIgG (7アングらの方法、Methods i
n巳nzymology、   92  377〜39
0.  Academic  Pres、NewYor
k、 1983) 、または125Iプロテイン八によ
って検出される。その結果をまとめたのが第1表である
。第1表には各種アポリポ蛋白質と抗アポB48−■と
の結合を示す。この表から、抗アポB48−■はアポB
48および、名古屋家系のTG正常型無βリポ蛋白血症
患者アポリポ蛋白質Bと結合しうろことがわかる。
第1表 以上、本発明によりアポB48を精製し、単クローン性
抗体を産生ずるハイブリドーマを得ることができるので
、これらを利用して、血液の定性や定量、あるいは臨床
上の治療や病気の診断等が可能である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、ヒトアポリポ蛋白質B48で予め免疫されたマウス
    の脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞との
    融合によって形成され、 1)正常者人血中、アポリポ蛋白質B48と反応する、 2)アポリポ蛋白質B48以外のアポリポ蛋白質とは反
    応しえない、 3)TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白質
    とは反応しうる各性質を有するヒトアポリポ蛋白質B4
    8に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ
JP30066089A 1989-11-21 1989-11-21 ヒトアポリポ蛋白質b48に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ Pending JPH02163079A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0911344B1 (en) * 1997-10-15 2004-03-03 Fujirebio Inc. Anti-Apo-B-48 monoclonal antibody, hybridoma, and methods of use

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0911344B1 (en) * 1997-10-15 2004-03-03 Fujirebio Inc. Anti-Apo-B-48 monoclonal antibody, hybridoma, and methods of use

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