JPH02163079A

JPH02163079A - ヒトアポリポ蛋白質ｂ４８に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH02163079A
Application number: JP30066089A
Authority: JP
Inventors: Tatsuhiko Kodama; 龍彦児玉; Hiroshige Itakura; 弘重板倉; Makoto Onishi; 真大西; Hiroyuki Yuya; 浩幸油谷
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 1989-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1990-06-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明はヒトアポリポ蛋白質８４８に対する単クローン
性抗体を産生ずるハイブリドーマに関するものである。

従来技術アポリポ蛋白質Ｂは、ヒト血漿トリグリセリドリッチリ
ポ蛋白質の合成および分泌に重要な役割をもっている蛋
白質である。このアポリポ蛋白質Ｂには、肝で産生され
ＶＬＤＬ　（超低比重リポ蛋白質）の合成に関与するア
ポリポ蛋白質Ｂ１００（以下、アポＢ１００と略称する
）と、小腸で産生されカイロミクロン合成に関与するア
ポリポ蛋白質Ｂ４８（以下、アポＢ４８と略称する）が
ある。アポリポ蛋白質Ｂの遺伝的欠損による疾患である
無βリポ蛋白血症には、アポＢ１００とアポＢ４８が共
に欠損する無βリポ蛋白血症古典型と、アポＢ１００の
みの欠損するトリグリセリド正常型無βリポ蛋白血症が
ある。そのいずれもが、赤血球異常、精神神経症状など
重篤な症状を呈するが、トリグリセリド正常型無βリポ
蛋白血症ではカイロミクロンが合成されうる。またアポ
リポ蛋白質Ｂを含むリポ蛋白質は動脈硬化を惹起する性
質を有すると考えられ、アポＢ１００とアポＢ４８が異
なる代謝経路を有するため、動脈硬化の発症機序を知る
上でも両者の構造を知ることは重要である。

上記の如く、アポリポ蛋白質Ｂは、様々な機能を有する
にもかかわらず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋
白質から成るため、その研究は未だ詳細になされていな
い。この研究のためには、アポリポ蛋白質Ｂの各構成部
分を特異的に認識する必要がある。

発明の目的このために、本発明は、アポＢ４８の精製手段を確立し
、精製したアポＢ４８に対する単クローン性抗体（以下
、抗アポＢ４８−Ｉと略称する）を産生ずるハイブリド
ーマを得ることを目的とする。

発明の構成本発明の抗アポＢ４８−１を産生ずるハイブリドーマは
、アポＢ４８で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウ
スの骨髄腫細胞ラインからの細胞の融合によって形成さ
れる。このような本発明の抗アポＢ４８−Ｉおよびこの
抗体を産生ずる本発明のハイブリドーマは、例えば、次
の４行程によって作成することができる。１．アポＢ４
８の精製、２．免疫、３．細胞融合、４゜ハイブリドー
マの選択および単クローン化。

このようにして作成された抗アポＢ４８−Ｔは、２元拡
散法の結果、ＩｇＧｌａサブクラスに属することがわか
った。トランス・プロッティング法により検討すると、
抗アポＢ４８−Ｉは、アポＢ１００およびアポＢ４８に
結合するが、アルブミン、アポリポ蛋白質Ｅその他のア
ポリポ蛋白質とは結合しえない。

更にこの抗体を用いて免疫酵素抗体の測定法を開発した
。この方法として、測定したいサンプルをポリスチレン
９６穴プレートへ付着させる間接法と、プレートにあら
かじめウサギ抗アポＢポリクローナル抗体を付着させて
おき、これにサンプルを結合させるサンドイツチ法を用
いた。本発明の抗アポＢ４８−Ｉを用いると、比較的よ
い精度で、ヒト血中アポリポ蛋白質Ｂの定量が可能であ
る。

前に述べた無βリポ蛋白血症の患者には、本邦ではアポ
Ｂ１００の単独欠損であるトリグリセリド正常型（名古
屋家系）と、アポＢ１００とアポＢ４８が共に欠損する
古典型（神奈川家系）とが知られている。トランスブロ
ッティング法および免疫酵素抗体法を用いると、名古屋
家系患者のリポ蛋白質およびアポリポ蛋白質Ｂは本発明
の抗アポＢ４８−Ｉと結合しえたが、神奈川家系患者の
リポ蛋白質およびアポリポ蛋白質は結合を示さなかった
。このことは抗アポＢ　４８−１が、アポリポ蛋白質Ｂ
以外のいかなるアポリポ蛋白質とも結合できないことを
支持している。

以上まとめると、本発明によって得られる抗アポＢ４８
−１は、１）　正常者人血中、アポＢ４８と反応する、
２）　アポリポ蛋白質Ｂ以外のアポリポ蛋白質とは反応
しえない、３）ＴＧ正常型無βリポ蛋白血症患者の血中
リポ蛋白質とは反応しうる各性質を有することがわかっ
た。

次に、本発明の抗アポＢ４８−Ｉを産生するハイブリド
ーマを作成するための好適例を説明する。

まず、アポＢ４８を精製する。このためには、カイロミ
クロンを多量必要とするため、乳び腹水患者の乳び腹水
、Ｖ型窩脂血症患者の血漿または正常人の脂肪食後血漿
を用いる。サンプルが得られたならば、ＥＤＴＡ、　Ｎ
ａＮ、、　　カナマイシンを加えて処理した後、超遠心
法にて分離してＶＬＤＬ＋カイロミクロン分画を得る。

さらに、このＶＬＤＬ十カイロミクロン分画から、超遠
心法でカイロミクロン分画を得る。こうして得られたカ
イロミクロン分画を有機溶媒（例えば、エーテルとエタ
ノール、テトラメチルウレアまたはクロロホルムとメタ
ノール）にて脱脂し、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）を含む溶液に溶解する。この溶液をウォータージャ
ケットで加温したセファロース４Ｂ−ＣＬカラムを用い
てＳＤＳ溶液でゲル濾過する。この工程を２日以内に終
える場合、アポＢ４８の分解が少なく、はぼ純粋なアポ
Ｂ４８を得ることができる。

このようにして精製したアポ８４８を用いると、免疫が
良好に行われた。すなわち、アポＢ４８をマウスに投与
し、免疫されたマウスの脾細胞を取り出す。このマウス
の脾細胞とマウスの骨髄腫（ＭＳ−１）からの細胞とを
融合させて本発明のハイブリドーマを得る。このハイブ
リドーマの作成は、例えばオーイらの方法を用いること
ができル（ＳＥＬ［ＥＣＴＩＥＤ　ＭＢＴ）Ｉ［ｌＤＳ
　ＩＮ　’ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ。

３５１〜３７２、Ｆｒｅｅｍａｎ、　１９８０）。

得られた本発明のハイブリドーマから、抗アポＢ４８−
Ｉを作成するには、例えば次の２方法を用いることがで
きる。

１の方法は、ハイブリドーマを適当な培養液中（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ）で培養し、その上澄みに生成された抗体を
回収する方法である。他の方法は、ハイブリドーマをマ
ウスに注射しくｉｎ　ｖｉｖｏ）生体内でインキュベー
トし、マウスの腹水中に生成された抗体を回収する方法
である。前者の方法では、抗体価が低いが純度の高いも
のが得られ、後者の方法では純度はやや劣るが非常に抗
体価の高いものが得られる。どちらの方法を選択するか
は目的によって使いわけられる。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明する。

実施例１この実施例では、アポＢ４８を精製する。

カイロミクロンの精製は種々のサンプルを用いて行われ
るが、ここでは乳び腹水から精製する。

乳び腹水約２βを採取後、直ちに１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０．０２％ＮａＮ、を加えて調製し、ベックマンＳＷ・
２７０−ターで２７０００　ｒｐｍ、２０時間超遠心し
、カイロミクロン＋ＶＬＤＬ分画を得る。更に、この分
画をベック７　ン４Ｑ、　３　ｏ−ターで２０００Ｏｒ
ｐｍ、　３０分間超遠心し、浮上したカイロミクロン分
画を回収する。このカイロミクロン分画を、２０倍量エ
ーテルとエタノール（１：　３　ｖｏｌ／ｖｏｌ　）溶
液中にて１０時間脱脂する。沈殿物は、２００Ｏｒｐｍ
、５分間遠心して回収し、約１０ｃｃの１０％ＳＤＳと
１％２−メルカプトエタノール溶液に溶解する。このう
ち５ＣＣを、５０℃にウォータージャケットした２ｃｍ
Ｘ１００　ｃｍのセファロース４Ｂ−ＣＬカラムに通し
てゲル濾過する。その際に、流出液として０．５％ＳＤ
Ｓおよび０．ＯＩＭ）リスＨＣＩを０．１５　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１でｐＨ７，２に調整した緩衝液を流速２０ｍ１Ｚ時
で使用した。

この結果、はぼ純粋なアポＢ４８が得られる。脱脂はほ
ぼ完全である。

実施例２この実施例では、本発明の単クローン性抗体（抗アポＢ
４８−Ｉ）を産生ずるためのハイブリドーマを作成する
。

１、免　疫精製したＳＤＳ溶液中のアポＢ４８を１００μｇ用いて
、フロイント完全アジュバントと共に雄のバルブ／Ｃマ
ウス（６退会）に皮下注射した。３週間後に再度、前記
アポＢ４８の１０μｇを前記アジュバントと共に腹腔内
へ注射した。

２、細胞融合２回目の免疫から３日後に、マウスの肺臓を取り出し、
脾細胞の懸濁液とする。この脾細胞１×１０８個を、３
Ｘ１０’個の８−アザグアニン耐性骨髄細胞腫ＭＳ−１
とポリエチレングライコール＃４０００を用いて融合し
た。細胞は９６穴マイクロ培養プレ一ト５枚に配分した
。

２４時間後、上澄みの半分をＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ンＩ　Ｘｌ０−’Ｍ　、アミノプテリン４　Ｘｌ０−”
　Ｍ、チミジン１．６　Ｘｌ０−’　Ｍ）　　に置きか
えた。ＨＡＴ耐性細胞（ハイブリドーマ）が２〜３週間
後に大半の培地に増殖するのが観察される。

３、ハイブリドーマの選択および単クローン化マイクロ
プレート中の培養液上澄み１０μｌを、脂肪食後血漿か
ら得られたアポＢ４８を多く含むトリグリセリドリッチ
リポ蛋白をコートしたアッセイ用プレートに入れ、室温
で１時間放置後、３回洗浄する。そこへ、１０００倍に
希釈したパーオキシデース標識抗マウスＩｇＧを加え、
１時間室温で反応させ、さらに３回洗浄後、発色液を加
え、光度計で比色した。

トリグリセリドリッチリポ蛋白と強く反応する抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。

単クローン化は、この選択したハイブリドーマを、フィ
ーダー細胞にマウス胸腺細胞を用い、限界希釈法に２度
かけることによって行った。

４、抗アポＢ４８−Ｉの作成ａ）インビトロ法前記工程で得られたハイブリドーマは、適当な培養液（
例えば、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭ１１６４０培地
）で培養し、その培養上澄みを回収した。上澄み中に分
泌された抗体は、精製せずそのまま使用できる純度の高
いものが得られた。

ｂ）インビボ法ハイブリドーマを注射するマウスにあらかじめ（４日前
）　、２．　６．　ｔｏ、　１４−テトラメチルペンタ
デカンを腹腔内に注射しておく。

次に抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス１匹あたり
５Ｘ１０６個、腹腔内に注射する。注射後４〜１０日で
マウス腹腔内に高濃度の抗体を有する腹水が生成してく
る。この腹水は抗体としてそのまま使用できる。

実施例３この実施例では抗アポＢ４８−Ｉの特異性を調べた。

抗アポＢ４８−Ｉとアポリポ蛋白質との結合は、トラン
スブロッティング法によって検討した。まず、各アポリ
ポ蛋白質は、油谷らの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ９４
１２４１−１２４５．１９８３）によって、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドグラジェントゲル電気泳動を行い、そ
の後、トウビンらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ　Ｓ　Ａ、　７６４３５０−４３５４．１９７７）　
により、セルロースニトレート紙に移される。このセル
ロースニトレート紙は、抗アポＢ４８−Ｉと室温で１時
間インキュベートしたのち、パーオキシデース標識抗マ
ウスＩｇＧ　（７アングらの方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ巳ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　　９２　　３７７〜３９
０．　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、　１９８３）　、または１２５Ｉプロテイン八によ
って検出される。その結果をまとめたのが第１表である
。第１表には各種アポリポ蛋白質と抗アポＢ４８−■と
の結合を示す。この表から、抗アポＢ４８−■はアポＢ
４８および、名古屋家系のＴＧ正常型無βリポ蛋白血症
患者アポリポ蛋白質Ｂと結合しうろことがわかる。

第１表以上、本発明によりアポＢ４８を精製し、単クローン性
抗体を産生ずるハイブリドーマを得ることができるので
、これらを利用して、血液の定性や定量、あるいは臨床
上の治療や病気の診断等が可能である。

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトアポリポ蛋白質Ｂ４８で予め免疫されたマウス
の脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞との
融合によって形成され、１）正常者人血中、アポリポ蛋白質Ｂ４８と反応する、２）アポリポ蛋白質Ｂ４８以外のアポリポ蛋白質とは反
応しえない、３）ＴＧ正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ蛋白質
とは反応しうる各性質を有するヒトアポリポ蛋白質Ｂ４
８に対する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマ
。