JPH0513635B2

JPH0513635B2 -

Info

Publication number: JPH0513635B2
Application number: JP59126663A
Authority: JP
Inventors: Tatsuhiko Kodama; Hiroshige Itakura; Hiroyuki Yuya; Makoto Oonishi
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority date: 1984-06-20
Filing date: 1984-06-20
Publication date: 1993-02-23
Also published as: JPS617299A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はアポリポ蛋白B48（以下「アポB48」
を略す）に高い特異性を有する抗体に関する。〔従来の技術〕アポリポ蛋白Ｂ（以下「アポＢ」と略す）はヒ
ト血漿トリグリセリドリツチリポ蛋白の合成、分
泌に重要な役割をもつている。アポＢには肝で産
生され超低比重リポ蛋白（VLDL）合成に関与す
るアポリポ蛋白B100（以下アポB100と略す）と、
小腸で産生されカイロミクロン合成に関与するア
ポB48がある。アポＢを含むリポ蛋白は動脈硬化
起性を有すると考えれ、両者を分析、定量する事
は重要である。アポＢの遺伝的欠損によりひきお
こされる無βリポ蛋白血症には、アポB100、ア
ポB48両者共欠損する古典型と、アポB100のみ
が欠損するTG正常型があり、アポB100とアポ
B48は異なる遺伝的支配の下にある。このよう
に、アポＢは様々な機能を有するにもかかわら
ず、難溶性であり、分解しやすい高分子蛋白のた
めその研究は遅れているまた、アポＢの特異的抗原決定基を認識する単
クローン性抗体としてはアポB100のみに結合す
る抗体（単クローン性抗体B100−）と、アポ
B100及びアポB48に同様に結合する抗体（単ク
ローン性抗体抗B48−）が知られる。しかしな
がら、アポB100に比しアポB48に高い特異性を
有する抗体は従来えられていなかつた。〔本発明が解決しようとする問題点〕叙上の現状において、各種免疫疾患の治療、診
断及びこれらに関する研究で利用し得る、アポ
B48に高い特異性を有する抗体及びこれを有利に
製造する方法の開発が望まれていた。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らはアポB48に高い特異性を有するる
抗体を得べく鋭意研究をおこなつた結果、精製し
たアポB48に対する単クローン性抗体の中からア
ポB100、LDLに比しアポB48に高い特異性を有
する抗体を見出した。すなわち本発明は精製されたヒトアポリポ蛋白
B48で予め免疫されたマウスの脾細胞と、マウス
の骨髄腫細胞ラインからの細胞との細胞融合で得
られたハイブリドーマによつて産生され、次の特
徴を有する単クローン性抗体を提供するものであ
る。 (1) 正常ヒト血中アポリポ蛋白B48と結合する。 (2) アポリポ蛋白B100に対する結合性は、アポ
リポ蛋白B48に対する結合性に対し１／25〜１／
11.8であり、その他の正常ヒト血中蛋白とは反応
しない。 (3) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白と結合する。本発明のアポB48に特異的な抗体（以下「抗ア
ポB48−」と称する）は、次のようにして調製
される。まず抗アポB48−を産生するハイブリ
ドーマを準備する。このハイブリドーマは次の５
工程により得られる。アポB48の精製免疫細胞融合ハイブリドーマの選択単クローン性抗体産生株の確立アポB48の精製に当つては、カイロミクロンを
多量に要するので正常人の大量脂肪食摂取後の血
漿を用いる。サンプルは、EDTA、NaN₃及びカ
ナマイシンを加えて処理後、100000ｇで20時間超
遠心し、VLDL＋カイロミクロン分画をえる。こ
の分画より、再び超遠心法でカイロミクロン分画
を分散する。得られたカイロミクロン分画をエー
テル：エタノール＝１：３で脱脂後、10％SDSを
含有する１％２−メルカプトエタノール溶液に溶
解する。この溶液を、ウオータージアケツトで50
℃に保つたセフアロース4B・CLカラムにて、ゲ
ル過する。（溶媒は0.5％SDS、0.01MTrisHC
PH7.4）。得られたアポロB48にとむ分画をプレ
パレテイブ（Preparative）SDS電気泳動装置を
用いて更に精製する。この工程を２日以内におえ
ることにより、アポＢの分解を少なくすることが
でき、ほぼ純粋なアポB48をうることができる。次いでこのアポB48を用い、常法によりマウス
に免疫を行なう。免疫されたマウスより取り出さ
れた脾細胞とマウス骨髄腫（NS−１）からのハ
イブリドーマの作成はOiの方法（SELECTED
METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY
p351−372（1980））により行なつた。ハイブリド
ーマの中には、種々のアポB48に対する抗体を作
る細胞が存在するが、アポB48に対し特異性を有
する抗体産生株は次の方法により選択される。ま
ず、低比重リポ蛋白（LDL）、カイロミクロンそ
してSDSにより脱脂したアポLDL、アポカイロ
ミクロンのリポ蛋白もしくはアポ蛋白でコートし
た４種のEIA法用プレートを用意する。なお、ア
ポカイロミクロンはこれを脱脂後、純水と半透膜
にて透析することにより、効率よくプレートに付
着させられ、アポB48に対する特異性の高い抗体
をひろい出すことが容易となる。次にチエツクし
たい細胞の培養上清を適量各プレートに取りイン
キユベートし、結合した免疫グロブリン量をパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体で測定する。
LDL及びアポLDLは、アポB100のみを含むのに
対し、カイロミクロン及びアポカイロミクロン
は、アポB100とアポB48両者を含む。この結果、
LDL又はアポLDLに比し、カイロミクロン及び
アポカイロミクロンに高い親和性を有する抗体及
びこれを産生するハイブリドーマが選択される。
この中からアポB48との結合性がアポB100と比
し10倍以上高い抗体（抗アポB48−）を産生す
るハイブリドーマが選択され２回の限界稀釈法に
て単クローン化される。こうして目的のハイブリドーマが得られたな
ら、目的の抗体（抗アポB48−）は次の２つの
方法で量産される。その１つはハイブリドーマを
適当な培養液中（in vitro）で培養し、その上清
に生成された抗体を回収する方法であり、他の１
つはハイブリドーマをマウスに注射し、（in
vivo）生体内で培養し、マウスの腹水中に生成さ
れる抗体を回収する方法である。前者の方法では
抗体価は低いが純度の高いものが得られる。これ
に対し、後者の方法では純度はやや劣るが、非常
に抗体価の高いものが得られる。どちらの方法と
選択するかは目的により使いわけられる。〔作用〕次に斯くして得られた抗アポB48−を利用し
ておこなわれる免疫酵素抗体測定方法（EIA法）
について説明する。このEIA法としては、測定し
たいサンプルをポリスチレン製96穴マイクロプレ
ートへ付着させ、その後抗アポB48−、パーオ
キシダーゼ標識抗マウスIgGを反応させる間接法
と、プレートへあらかじめウサギ（又はヤギ）抗
アポＢポリクローナル抗体を付着させておき、こ
れにサンプルを結合させ、次いで抗アポB48−
を添加するサンドイツチ法のいずれをも採用する
ことができる。そして、本発明の抗アポB48−
は上記したようにアポB48には結合するがアポ
B100との結合性はアポB48の結合性の１／10程
度又はそれ以下と弱く、また、他の血中アポリポ
蛋白、例えばアルブミン、アポリポ蛋白Ｅ等とは
結合しないのであるから、他の従来知られている
単クローン性抗体を用いた場合の結果と照合する
ことによりアポB48の正確な定量が可能となつ
た。この結果、カイロマイクロンレムナントの検
出、アポB100欠損者のアポＢの測定、腸管で合
成されるアポリポ蛋白の数量的診断、食後に血中
に増加するTGリツチリポ蛋白における小腸由来
リポ蛋白の割合、食事性因子の動脈硬化におよぼ
す影響等を知ることができるようになつた。〔実施例〕次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１単クローン性抗体抗アポB48−及びそれを
産生するハイブリドーマの製法： (1) アポB48の精製カイロミクロンの分取は種々のサンプルより
行なわれるが、ここでは血漿よりの分離法につ
いてのべる。正常人の大量脂肪食摂取後の血漿約２を採
取後直ちに1mM EDTA、0.02％NaN₃となる
よう調製し、Beckman Sw27ローター100000
ｇで20時間超遠心し、カイロミクロン＋VLDL
分画を得る。更にこの分画をBeckman40、３
ローターで20000rpm30間遠心し、浮上したカ
イロミクロン分画を取る。このカイロミクロン
分画は20倍量のエーテル：エタノール（１：
3vol／vol）溶液中にて10時間脱脂する。沈澱
した蛋白を2000rpm5分遠沈にて回収したのち、
約10mlの10％SDS、１％２−メルカプトエタノ
ール溶液に溶解する。このうち約５mlをウオー
タージヤケツトで50℃にしたセフアロース
4B・CLカラムによりゲル過する。溶媒は0.5
％SDS、0.01MTris−HCPH7.2 0.15MNaC
を用いる。得られたアポB48にとむ分画をダイ
アフローメンブレンPM10（アミコン社）を用
いて濃縮後、３％ポリアクリルアミド、0.1％
SDS電気泳動を行ないゲルを切断してアポB48
のみを含む分画を回収し、0.5％
SDS0.01MTris HC溶液中にアポB48を溶出
させる。 (2) 免疫精製したSDS溶液中のアポB48 100μｇを、
フロインド完全アジユバンドと共にBALB／
ｃマウス（６週令）に皮下注射し、３週後に
50μｇをアジユバンドと共に腹腔内へ注射し
た。 (3) ２回目の免疫より３日後、マウスの脾臓をと
りだし、脾細胞の懸濁液とする。１×10⁸個の
脾細胞を３×10⁷個の８−アザダアニン耐性骨
髄細胞腫（NS−１）とポリエチレングリコー
ルを用いて融合した。細胞は、96穴マイクロ培
養プレート５枚に分配された。24時間後、上清
の半分をHAT培地（ヒポキサンチン１×
10^-4M、アミノプテリン４×10^-7M、チミジン
1.6×10^-3M）におきかえる。HAT耐性細胞
（ハイブリドーマ）が、２−３週後に大半のウ
エルに増殖するのが観察される。 (4) ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの産生する抗体が、アポB48
に高い特異性を有するか否かは、EIA法を用い
て検討した。アポB100のみを有するLDL又は
アポLDLをコートしたEIA用プレートと、アポ
B100及びアポB48を有するカイロミクロン及
びアポカイロミクロンをコートしたEIA用プレ
ートの計４種のプレートを用意する。アポカイ
ロミクロンのEIA用プレートへの固相化にあた
つては次の処置を要する。まず、カイロミクロ
ンを既述のごとくエーテル：エタノール脱脂後
SDS溶液に可溶化する。しかしながらSDSを多
量に含むままでは、プレートへのコートの効率
が悪いため、アポカイロミクロンを含む溶液を
純水と２時間半透膜にて透析後、プレートへの
コートに用いるのが好ましい。この処置を行な
うことで、アポB48を含むアポカイロミクロン
を効率よくプレートへ付着することができる。
これらのEIA用プレートへマイクロプレート中
の培養上清（25−100μ）を試料穴へ添加し
プレートに付着する免疫グロブリン量をパーオ
キシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて測定
した。抗アポB48−のハイブリドーマ上清
は、アポB48を多く含むカイロミクロン又はア
ポカイロミクロンに強い親和性を有した。 (5) 単クローン化単クローン化は、選択されたハイブリドーマ
を、フイーダー細胞にマウス胸腺細胞を用いる
限界稀釈法に２度かけ、EIA法でアポB48に強
い親和性を有する株のみを選択、増殖させた。 (6) 単クローン性抗体の作成 (a) in vitro法ハイブリドーマは適当な培養液（例えば牛胎
児血清を10％含むRPMI1640培地）で培養し、
その培養上清を回収した。上清中に分泌された
抗体は、50％飽和硫安で沈澱精製し抗体濃度を
高めて使用できる。 (b) in vivo法ハイブリドーマを注射するBALB／ｃマウ
ス（４月令）には、あらかじめ（４日前）２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカンを腹腔
内に注射しておく。次に抗体を産生するハイブ
リドーマをマウス１匹あたり５×10⁶個腹腔内
に注射する。その後１〜２週後に腹水により腹
部が腫大したマウスより腹水を採取する。この
腹水はプロテアーゼ活性をのぞくため56℃で30
分加熱し不活化する。このように処理された腹
水は特に精製することなくそのまま使用でき
る。実施例２単クローン性抗体の特異性抗抗アポB48−の各種アポリポ蛋白との結合
性はEIA法及びトランスブロツテイング法を用い
て検討した。まずEIA法では、抗アポB48−
は、ヒト血漿カイロミクロンと強く反応し、
VLDL、LDLとは弱く反応し、HDL、比重1.21
以下の分画とは結合しない。８種のLDLとアポ
カイロミクロンとの抗アポB48−の結合の比率
を表１に示す。なお、８種のLDL、カイロミク
ロンに結合した抗B48−に対し、パーオキシダ
ーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を結合さ
せ、発色後OD_492-610を測定した。また、LDL及
びアポカイロミクロンはそれぞれほぼ同量のアポ
Ｂを含むよう調整した。

【表】トランスブロツテイング法による抗アポB48−
とアポＢ群の結合性の検討は次の様に行なつ
た。まず各アポリポ蛋白は油谷らの方法^*により
SDS−ポリアクリルアミドグラジエントゲル電気
泳動を行ない、その後Towbinの方法^**により、
セルロースニトレート膜へ移される。このセルロ
ースニトレート膜を抗アポB48−と室温で１時
間インキユベートしたのち、パーオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇ抗体を用いて各アポリポ蛋白を検
出した。すなわち、正常者脂肪食後３時間の血漿
中のTG・リツチリポ蛋白（ｄ＜1.006分画）のア
ポ蛋白をSDS・ポリアクリルアミドグラジエント
ゲル電気泳動し（第１図，Ａ）それをセルロース
ニトレート膜へトランスブロツテイングした後抗
B48−と結合させ、抗マウスＩｇＧ・パーオキ
シダーゼで発色させた（第１図，Ｂ）。第１図，
Ａのクマジー染色ではB100がB48よりかなり多
いが、抗B48−は、B48とよく結合することが
第１図，Ｂに示されている。アポB100とB48を
SDSポリアクリルアミド電気泳動後、セルロース
ニトレート膜へトランスブロツトしその後抗B48
−、抗B48−と反応させ、結合したIgをパー
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇにより検討した結
果を第２図に示す。従来より知られる抗B48−
は主にB100へ結合するが（第２図，Ｂ）、抗B48
−はB100へはほとんど結合せず、B48へはよ
く結合する。（第２図，Ａ）。これらの結果から、抗アポB48−は、アポ
B48とは強く結合するが、アポB100とは弱く結
合するにすぎないことがわかる。表１の結果とあわせ考えると抗アポB48−
は、アポB48に対する結合量の約100％以下しか
アポB100に結合しえない。＊油谷らの方法： Journal of Biochemistry，94，1241−1245
（1983）＊＊Towbinの方法： Proccedings of National Academy of
Seience U.S.A.，76，4350−4354（1979）

【図面の簡単な説明】

第１図はアポ蛋白をSDS・ポリアクリルアミド
グラジエントゲル電気泳動した結果及び更にこれ
を抗B48−と結合させ染色せしめた結果を示す
図面である。第２図は、アポB48とアポB100を
SDS・ポリアクリルアミド電気泳動せしめ、抗
B48−Ａ及び抗B48−Ａと結合させた後発色
せしめた結果を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１精製されたヒトアポリポ蛋白B48で予め免疫
されたマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラ
インからの細胞との細胞融合で得られたハイブリ
ドーマによつて産生され、次の特徴を有する単ク
ローン性抗体。 (1) 正常ヒト血中アポリポ蛋白B48と結合する。 (2) アポリポ蛋白B100に対する結合性は、アポ
カイロミクロンに対する結合性に対し１／25〜
１／11.8であり、その他の正常ヒト血中蛋白と
は反応しない。 (3) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白と結合する。