KR100330310B1

KR100330310B1 - 인간혈장아포지단백질b-100에대한신규한단일클론항체및이를생산하는하이브리도마세포주

Info

Publication number: KR100330310B1
Application number: KR1019980022839A
Authority: KR
Inventors: 곽주원; 이정일
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2002-08-08
Also published as: KR20000002227A

Abstract

본 발명은 인간 혈장 아포지단백질(apolipoprotein) B-100에 대한 신규한 단일클론 항체와 이를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 및 상기 신규한 단일클론항체를 이용한 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도 측정방법에 관한 것이다.

본 발명은 인간 아포지단백질 B-100 항원으로 면역화된 생쥐의 췌장세포를 골수종 세포와 융합하여 제조한 하이브리도마 세포주들 중 H-사슬이 IgG2a이고 L-사슬이인 구조를 갖는 단일클론항체 mAbB55와 H-사슬이 IgG2b이고 L- 사슬이

Description

인간 혈장 아포지단백질 Ｂ-100에 대한 신규한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주

본 발명은 인간 혈장 아포지단백질(apolipoprotein) B-100에 대한 신규한 단일클론 항체와 이를 생산하기 위한 하이브리도마 세포주 및 상기 신규한 단일클론항체의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 혈장내에서 콜레스테롤과 중성지방을 체내 필요한 조직으로 운반하는 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein, LDL)중 단백질 부분인 아포지단백질(apolipoprotein) B-100에 대한 신규한 단일클론항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 신규한 단일클론항체를 이용한 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도 측정방법에 관한 것이다.

혈액중에 있는 지방질(중성지방, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터, 인산지방질)은 아포지단백질과 함께 지단백질(lipoprotein)이라는 복합체가 되어 운반된다. 지단백질은 그 중심부에 비극성의 지방질인 중성지방(트리아실 글리세롤, TG), 콜레스테롤 에스터 등을 갖고 있고 그 표면(주위)을 극성지방질인 인산지방질, 콜레스테롤 등이 둘러싸고 있으며 그 위에는 표면성분으로서 수종의 아포지단백질로 된 피막이 있어 전체적으로 수용성의 입자가 된다. 아포지단백질은 혈장으로부터 얻은 지단백질을 유기용매로 처리하여 지방질을 제거하여 얻은 단백질부분으로서 면역학적 및 화학적인 특징이 서로 다른 10여 종류가 알려져 있으며 그 기능은 세포간 지방질의 운반 내지 재분배, 지방질 대사에 관여하는 효소의 활성인자, 지단백질의 수용성 구조 유지, 지단백질 수용체(receptor)에 대한 표적 단백질로서의 역할 등 지방질 대사에 있어서 중요한 핵심기능을 하고 있다.

종래 혈중 아포지단백질의 측정을 위한 많은 면역학적 방법들로는 예를 들면 방사상 면역 확산 분석법(radial immunodiffusion), 전기 면역 분석법(electroimmunoassay), 방사성 동위원소 면역분석법(radioimmunoassay), 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 면역 침전 분석법(immunoturbidimetry) 등이 보고되어 있다(Labeur C., Shepherd J., and Rosseneu,

M., Clin. Chem. 36, 591-597(1990)). 혈장 지단백질들내의 여러 아포지단백질들 중, 특히 저밀도 지단백질(LDL)중의 아포지단백질 B-100은 최근 동맥경화 및 심장 관상동맥 질환 등 순환기질환의 진단과 관련하여 종래의 콜레스테롤 분석(저밀도 지단백질-콜레스테롤)보다 더 신빙성있는 양(+)의 지표로서 알려져 있다(Brustolin D. et al., Clin. Chem. 37, 742-747(1991); Dona V. et al., Giorn. It. Chim. Clin. 12,205-214(1987)). 따라서, 아포지단백질 B-100의 혈중 농도를 측정하므로써 순환기 질환을 일차적으로 용이하고 신빙성있게 진단할 수 있으며 이를 위해서는 아포지단백질 B-100에 특이적인 단일클론 항체의 개발이 필수적이다.

따라서 본 발명의 목적은 아포지단백질 B-100에 대해 특이적으로 반응하는 단일클론항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 아포지단백질 B-100에 대해 특이적으로 반응하는 상기 단일클론항체를 이용하여 아포지단백질 B-100의 농도를 측정하므로써 동맥경화 또는 심장관상동맥 질환 등을 진단하는 혈액순환기 질환의 진단방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 인간 아포지단백질 B-100 항원을 생쥐에 주사하여 아포지단백질 B-100으로 생쥐를 면역화시키고 이 생쥐의 췌장세포를 골수종세포와 융합하여 하이브리도마 세포주를 제조한 후 제조한 하이브리도마 세포주들 중 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론항체를 생산하면서 안정한 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 선별한 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체의 아포지단백질 B-100에 대한 결합특이도를 웨스턴 블랏팅 방법으로 분석하고 이 단일클론항체의 이소타입을 특이한 2차 항체들을 이용한 효소면역 분석법으로 분석한 후 상기 단일클론항체의 역가 및 이 단일클론항체와 결합된 아포지단백질 B-100의 농도를 역시 효소면역 분석법으로 측정하므로써 달성하였다.

이하 본 발명의 상세한 구성 및 작용을 설명하고자 한다.

도 1는 융합반응전 인간 아포지단백질 B-100으로 면역주사한 생쥐에서 채취한 혈액 샘플을 효소면역 분석법(ELISA)으로 분석한 결과를 나타낸다.

도 2a는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주를 1일 배양한 후 현미경으로 관찰한 사진도이다.

도 2b는 HAT 선택배지에서 재조합 하이브리도마 세포주를 배양한 후 형성된 콜로니의 현미경 사진도이다.

도 3a는 본 발명 단일클론 항체 mAbB55의 특이도를 분석하기 위해 혈장 단백질을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동시킨 결과를 나타낸다.

도 3b는 도 3a의 단백질을 단일클론 항체 mAbB55를 사용하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 분석한 결과를 나타낸다.

도 4a는 본 발명 단일클론 항체 mAbB128의 특이도를 분석하기 위하여 혈장 단백질을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동시킨 결과를 나타낸다.

도 4b는 도 4a의 단백질을 단일클론 항체 mAbB128을 사용하여 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 분석한 결과를 나타낸다.

도 5는 아포지단백질 B-100의 농도를 분석하기 위한 본 발명 단일클론 항체 mAbB55및 mAbB128 항체의 적정곡선(titration curve)을 나타낸다.

도 6은 아포지단백질 B-100 의 농도를 분석하기 위한 본 발명 단일클론 항체 mAbB55 및 mAbB128 항체의 표준곡선(standard curve)을 나타낸다.

본 발명은 면역주사원으로 사용될 인간 아포지단백질 B-100 항원을 순수분리한 후 보조약과 함께 생쥐에 주사하여 생쥐를 아포지단백질 B-100 항원으로 면역화시키는 단계; 면역화된 생쥐의 췌장세포를 폴리에틸렌글리콜 존재하에 골수종세포와 융합하고 배양하여 하이브리도마 세포주를 얻고 이들 하이브리도마 세포주 중에서 IgG-형의 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128을 생성하는 2개의 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계; 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128의 항원-결합특이도를 웨스턴 블럿팅 방법으로 검정하는 단계; 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128에 각각 특이한 2차 항체들을 이용한 특이 항원-의존적인 효소면역 분석법으로 상기 단일클론항체 각각의 이소타입을 분석하는 단계; LDL(low density lipoprotein)-아포지단백질 B 표준물과 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128를 반응시키고 2차항체를 결합시킨 후 엘리자 판독기를 이용해 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128의 역가를 측정하는 단계; 여러농도의 LDL-아포지단백질 B 표준물과 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128을 반응시키고 2차 항체를 결합시킨 후 엘리자 판독기를 이용해 아포지단백질 B-100의 농도를 측정하는 단계로 구성된다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시에를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 하이브리도마 세포주 제조

실험예 1: 생쥐의 면역화

인간 혈액으로부터 본 발명의 단일클론성 항체 생산을 위한 면역 주사에 사용할 아포지단백질 항원을 기존의 방법(참고문헌: Methods Enzym. 128, Section II & III)에 따라 일정 밀도의 KBr 용액에서 순차적 원심분리 방법(15oC, 45,000 rpm, Beckman Ti70, 각 24시간)으로 밀도 구배(1.03<d<1.05)하여 저밀도 지단백질을 분리하고, 유기 용매(50% 이소프로판올)하의 지방분 제거 및 전기영동에 의한 젤 회수 분리 방법 등으로 순수 분리하였다. 분리한 항원 아포지단백질 B-100 20㎍을 동량의 보조약(Freund's complete adjuvant) 및 죽은 살모넬라 균체와 잘 혼합하여생쥐 Balb/c 암컷에 복강주사하고 20일 후 동량의 아포지단백질 B-100을 보조약(Freund's incomplete adjuvant)과 혼합하여 추가 주사한 후 생쥐에서 채취한 실험혈청이 아포지단백질 B-100에 우수한 양성반응을 보일 때까지 PBS 완충액(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.2)에 녹인 아포지단백질 B-100 20㎍을 10 일 간격으로 추가 주사하였으며 마지막 주사는 정맥주사로 실시하였다.

실험예 2: 세포융합

상기 실험예 1에서 마지막 정맥주사 후 3 일째에 쥐를 개복하여 췌장을 꺼내

마쇄하였다. 마쇄한 췌장세포를 공지 방법(Galfre G. et al., Nature 266, 550-552(1977))에 따라 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재하에서 췌장세포수의 1/10 만큼인 생쥐 골수종(myeloma) 세포(Sp2/0)와 융합 반응시킨 후 HAT(Hypoxanthine, Aminopterine, Thymidine) 선택 배지(Gibco 사, 제품번호 31062-037)에서 일주일동안 배양하였다. 융합반응 전 면역주사된 생쥐의 눈에서 샘플 혈청을 채취하여 효소면역 분석방법(ELISA)으로 혈청 중 항체 생성을 확인하였다. 실험결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 생쥐의 혈청 중에 인간 혈장 아포지단백질 B-100에 대한 항체가 잘 생성되었음을 확인하였고 융합반응 후, 사용한 미적정판 270개의 모든 배양공에서 세포 성장을 관찰할 수 있었으며 이들은 비교적 둥근 모양을 가진 림프구 세포들이 식이세포(macrophage)와 융합되지 않은 림포사이트 및 죽은 세포 잔유물들이었다(도 2a). 이들 중 융합반응이 되지 않은 세포들을 HAT(Hypoxanthine, Aminopterine, Thymidine) 선택배지를 가하여 그 성장을 저해시켰다. 배양액에 대하여 아포지단백질 B-100 항원에 대한 항체의 생성을 효소면역법으로 분석하고 양성 반응을 보이는 배양공의 세포들을 새 적정판에 옮겨 제한 희석(limiting dilution)으로 연대 배양시켜 12개의 안정한 하이브리도마 세포주를 얻었고(도 2b), 이들 중 IgG-형의 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128 을 생성하는 2 개의 하이브리도마 세포주 H-mAbB55와 H-mAbB128을 선별하였고 이들 세포주를 한국 과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자은행에 1998년 3월 3일 기탁번호 KCTC 0439BP 및 KCTC 0440BP로 각각 기탁하였다.

실시예 2: 단일클론항체의 특이도 분석

상기 실시예 1에서 얻은 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128의 항원-결합 특이도를 검정하기 위하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 즉, 약 0.5㎍의 혈장 단백질들을

램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680 (1970))에 따라 SDS의 존재하에서 4 내지 15%의 구배로 폴리아크릴아미드 젤에서 전기 영동하여 분리하였다. 도 3a는 mAbB55를 전기영동한 결과이고 도 4a는 mAbB128을 전기영동한 결과이다. 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354(1979))에 따라 니트로셀룰로오스막(Millipore 사 제품, 구멍 크기 0.45㎖)에 옮겼다. 이 필터를 0.5% 우형 혈청 알부민(BSA)이 포함된 용액에 반응시켜 비특이적 결합을 차폐시킨 후, 단일클론항체 mAbB55 또는 mAbB128을 0.05% 트윈(Tween) 20이 포함된 PBS 완충액에 첨가하여 반응시킨 다음, 필터를 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS 완충액으로 15분씩 2회 세척하고 이 필터에 2차항체[양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 염소의 항-생쥐 면역 글로블린 G]를 넣어 반응시키고 다시 상기의 PBS 완충액으로 세척하고 끝으로, 기질로서 과산화수소와 ο-페닐렌 다이아민을 가하여 필터를 발색시켰다. 실험결과, 도 3b와 도 4b에서 보는 바와 같이 단일클론 항체 mAbB55와 mAbB128은 인간 혈장 단백질중 아포지단백질 B에 특이적으로 결합하고 고밀도 지단백질(HDL)이나 지단백질-결여 혈청(LPDS)중의 다른 단백질들과는 결합하지 않는 우수한 특이성을 보여 주었다.

실시예 3: 단일클론항체의 이소타입(isotype) 분석

단일클론항체 mAbB55와 mAbB128의 항체분자 중 H-사슬 및 L-사슬 이소타입형(isotype)을 조사하기 위하여 각 형들에 특이한 2차 항체들을 이용하여 특이적인 항원-의존적 방법으로 효소면역 분석법을 실시하였다. 즉, 저밀도 지단백질(LDL) 1㎍을 피복한 미적정판에 단일클론 항체 mAbB55 또는 mAbB128 을 넣고 토끼에서 분리한 생쥐 항체의 각 이소타입에 특이한 항혈청들 중 하나를 첨가하므로써 효소면역 분석방법(ELISA)에 따라 양고추냉이 과산화효소가 결합된 2차항체로 염소에서 분리한 항-토끼 면역글로블린을 사용하여 분석을 수행하였고 그 발색된 정도를 650nm에서의 흡광도 측정치로 표시하였다. 이때 상기 이소타입에 특이한 항혈청들은 정규의 토끼 혈청 (N), 토끼에서 분리한 항-생쥐 IgG1(G1), IgG2a(G2a), IgG2b(G2b), IgG3(G3), IgM(M), IgA(A), 카파 L-사슬(K) 또는 람다 L-사슬(L)에 대한 항혈청들을 사용하였다. 실험결과, 단일클론 항체 mAbB55는 H-사슬로서 IgG2a 형을, L-사슬로서형을, 그리고 단일클론 항체 mAbB128은 H-사슬로서 IgG2b형을, L-사슬로서형을 가지고 있음이 판명되었다. 이를 표 1에 정리하였다.

본 발명의 단일클론 항체 mAbB55와 mAbB128 의 이소타입 분석결과

	N	G1	G2a	G2b	G3	A	M	K	L
mAbB55	0.08	0.08	1.1	0.1	0.1	0.08	0.09	0.8	0.
mAbB128	0.08	0.08	0.08	1.1	0.1	0.08	0.09	0.8	0.2

실시예 4: 단일클론항체의 역가(titer) 결정

단일클론항체 mAbB55와 mAbB128의 역가(titer)를 결정하기 위하여 효소 면역분석방법을 실시하였다. 즉, 96-공 미적정판에 1㎍의 LDL-아포지단백질 B 표준물이 포함된 PBS 완충액 100㎕를 넣어 4℃에서 하룻밤 흡착시키고, 0.05% 우형 혈청 알부민(BSA)과 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS 완충액으로 흡착되지 않고 남은 지단백질을 세척한 후 비특이결합을 막기 위하여 3% 우형 혈청 알부민이 포함된 PBS 완충액을 넣어 상온에서 1 시간동안 부드럽게 흔들어 반응시키고 다시 PBS 완충액으로 세척하였다. 여기에 단일클론항체 mAbB55 또는 mAbB128 배양액을 연차적으로 희석시킨 것을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 세척하고, 양고추냉이 과산화효소가 결합된 2차 항체(염소의 항-생쥐 IgG)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 과산화효소의 기질을 넣어 발색되는 정도를 엘리자(ELISA) 판독기로 사용해 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 아포지단백질 B-100에 대한 단일클론 항체 mAbB55와 mAbB128의 결정된 역가(T60%)는 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 각각 1000배, 1250 배의 희석배율로 판명되었다.

실시예 5: 단일클론항체를 사용한 아포지단백질 B-100 의 농도측정

단일클론항체 mAbB55 또는 mAbB128을 혈중 아포지단백질 B-100 농도측정에 이용하기 위해 효소 면역분석방법을 실시하였다. 즉, 96-공 미적정판에 연차적으로 희석한 여러 농도의 LDL(low density lipoprotein)-아포지단백질 B 표준물이 포함된PBS 완충액 100㎕를 넣어 4℃에서 하룻밤 흡착시키고, 0.05% 우형 혈청 알부민(BSA)과 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS 완충액으로 흡착되지 않고 남은 지단백질을 세척한 후 비특이결합을 막기 위하여 3% 우형 혈청 알부민이 포함된 PBS 완충액을 넣어 상온에서 1시간동안 부드럽게 흔들어 반응시킨 후 다시 PBS 완충액으로 세척하였다. 여기에 단일클론항체 mAbB55 또는 mAbB128 용액을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 세척하고, 양고추냉이 과산화효소가 결합된 2차 항체(염소의 항-생쥐 IgG)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응 후 과산화효소의 기질을 넣어 발색되는 정도를 엘리사(ELISA) 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 도 6에서 보는 바와 같이 18-300ng의 아포 B-100 농도범위에서 각각 아포 B-100의 log 농도치와 측정 흡광도사이에 상관계수(correlation coefficient)가 각각 0.95, 0.97의 우수한 일차 선형적 함수관계를 나타냈으며 이는 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128이 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도측정을 위한 효소면역분석법에 임상적으로 유용함을 나타낸다.

본 발명은 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 인간 아포지단백질 B-100 항원으로 면역화된 생쥐의 췌장세포를 골수종 세포와 융합하여 제조한 하이브리도마 세포주들 중 IgG-형의 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128을 생산하는 하이브리도마 세포주 H-mAbB55와 H-mAbB128을 선별하였으며 이 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체 mAbB55와 mAbB128는 각각 H-사슬이 IgG2a이고 L-사슬이인 구조와 H-사슬이 IgG2b이고 L-사슬이인 구조를 가지며 인간 아포지단백질 B에 특이적으로 결합하는 우수한 특이성을 나타내고 역가가 대단히 높아 인간 혈중 아포지단백질 B-100의 농도 측정에 유용하므로 인간 혈액순환기 질병을 진단하는 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

KCTC 기탁번호가 0439BP인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고, 인간 혈중 아포지단백질 B-100에 특이적으로 반응하고, H-사슬이 IgG2a이고, L-사슬이 κ인 구조의 단일클론 항체 mAbB55.
KCTC 기탁번호가 0440BP인 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고, 인간 혈중 아포지단백질 B-100에 특이적으로 반응하고, H-사슬이 IgG2b이고, L-사슬이 κ인 구조의 단일클론 항체 mAbB128.
제 1항 기재의 단일클론항체 mAbB55를 생산하는 하이브리도마 세포주 H-mAbB55(KCTC 0439BP).
제 2항 기재의 단일클론항체 mAbB128을 생산하는 하이브리도마 세포주 H-mAbB128(KCTC 0440BP).