JPH0226959B2

JPH0226959B2 -

Info

Publication number: JPH0226959B2
Application number: JP59049598A
Authority: JP
Inventors: Tatsuhiko Kodama; Hiroshige Itakura; Makoto Oonishi; Hiroyuki Yuya
Original assignee: TOKYO DAIGAKU
Current assignee: TOKYO DAIGAKU
Priority date: 1984-03-15
Filing date: 1984-03-15
Publication date: 1990-06-13
Also published as: JPS60193926A

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野本発明は単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質
B100抗体に関するものである。従来技術アポリポ蛋白質Ｂは、ヒト血漿トリグリセリド
リツチリポ蛋白質の合成および分泌に重要な役割
をもつている蛋白質である。このアポリポ蛋白質
Ｂには、肝で産生されVLDL（超低比重リポ蛋白
質）の合成に関与するアポリポ蛋白質B100（以
下、アポB100と略称する）と、小腸で産生され
カイロミクロン合成に関与するアポリポ蛋白質
B48（以下、アポB48と略称する）がある。アポ
リポ蛋白質Ｂの遺伝的欠損による疾患である無β
リポ蛋白血症には、アポB100とアポB48が共に
欠損する無βリポ蛋白血症古典型と、アポB100
のみの欠損するトリグリセリド正常型無βリポ蛋
白血症がある。そのいずれもが、赤血球異常、精
神神経症状など重篤な症状を呈するが、トリグリ
セリド正常型無βリポ蛋白血症ではカイロミクロ
ンが合成されうる。またアポリポ蛋白質Ｂを含む
リポ蛋白質は動脈硬化を惹起する性質を有すると
考えられ、アポB100とアポB48が異なる代謝経
路を有するため、動脈硬化の発症機序を知る上で
も両者の分別は重要である。上記の如く、アポリポ蛋白質Ｂは、様々な機能
を有するにもかかわらず、難溶性であり、分解し
やすい高分子蛋白質から成るため、その研究は未
だ詳細になされていない。この研究のためには、
アポリポ蛋白質Ｂの各構成部分を特異的に認識す
る必要がある。従来、我々は抗ヒトLDL（正常者
血中低比重リポ蛋白質）単クローン性抗体を作成
してきた。しかし、この場合、アポB100と脂質
の複合体を見ており、また、アポB100以外のア
ポリポ蛋白質も混入しており、最近、アポB100
とその他のアポリポ蛋白質との特定の複合体を認
識したという報告もある。発明の目的本発明の目的はこのようなアポリポ蛋白質Ｂの
各構成部分を特異的に認識する特に抗ヒトアポリ
ポ蛋白質B100の単クローン性抗体（以下、抗ア
ポB100−Ｉと略称する）を得ることにある。発明の構成本発明の抗アポB100−Ｉを産生するハイブリ
ドーマは、アポB100で予め免疫されたマウスの
脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインからの細胞
との融合によつて形成される。このような本発明
の抗アポB100−Ｉおよびこの抗体を産生するハ
イブリドーマは、例えば次の４行程によつて作成
することができる。 (1) アポB100の精製 (2) 免疫 (3) 細胞融合 (4) ハイブリドーマの選択および単クローン化。このようにして作成された本発明の抗アポ
B100−Ｉは、２元拡散法の結果、IgG1aサブク
ラスに属することがわかつた。SDSポリアクリル
アミド・グラジエント電気泳動法を用いて正常者
血中のアポリポ蛋白質Ｂをその亜種に分け、それ
をトランス・ブロツテイング法にてニトロセルロ
ース用紙に転移させ、抗アポB100−Ｉとの結合
を見た。その結果、抗アポB100−ＩはアポB100
と結合するが、アルブミンやアポリポ蛋白質Ａ−
Ｉなどの蛋白質とは結合しない。同じ方法で、ア
ポB100、アポB48およびアポB100の分解産物と
の結合を調べると、抗アポB100−ＩはLDLおよ
びVLDLのアポB100と結合するがカイロミクロ
ンのアポB48とは結合できない。更に、アポB48
と類似した分子量（約20万）を有するアポB100
の分解産物とは結合する。即ち、この抗体はアポ
B100の分解産物とアポB48を織別しうる特長を
有する。更に、この抗アポB100−Ｉを用いて免疫酵素
抗体の測定法を開発した。この方法として、測定
したいサンプルをポリスチレン96穴プレートへ付
着させる間接法と、プレートにあらかじめウサギ
抗アポＢポリクローナル抗体を付着させておき、
これにサンプルを結合させるサンドイツチ法を用
いた。本発明の抗アポB100−Ｉを用いると、比
較的よい精度で、ヒトLDLの定量が可能である。前に述べた無βリポ蛋白血症の患者には、本邦
ではアポB100の単独欠損であるトリグリセリド
正常型（名古屋家系）と、アポB100とアポB48
が共に欠損する古典型（神奈川家系）とが知られ
ている。この両家系患者のリポ蛋白質中アポリポ
蛋白質は、トランスブロツテイング法および免疫
酵素抗体法のいずれを用いても、本発明の抗アポ
B100−Ｉと結合できなかつた。このことはこの
抗体がアポB100以外のいかなるアポリポ蛋白質
とも結合できないことを支持している。以上まとめると、本発明の抗アポB100−Ｉは、
(1)正常者人血中、アポB100と反応するが、アポ
B48とは反応しない、(2)TG正常型無βリポ蛋白
血症患者の血中リポ蛋白質とは反応しない、(3)正
常者人血中のLDLおよびVLDLと反応する各性
質を有することがわかつた。次に、本発明の抗アポB100−Ｉおよびこの抗
体を産生するハイブリドーマを作成するための好
適例を説明する。まず、アポB100みを精製するために、正常者
から採血した血漿を速やかに超遠心法にて分離し
てLDL分画を採取し、その後ウオータージヤケ
ツトで加温したセフアロース4B・CLカラムを用
いて、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶
液でゲル過する。この工程を２日以内に終える
場合、アポB100の分解は極めて少なく、ほぼ完
全なアポB100分画を得ることができる。この方
法によると、アポB48やアポリポ蛋白質Ｅ、アポ
リポ蛋白質Ａ−Ｉの混入が妨げられる。また、脱
脂は99％行われ、SDSとのミセルに置き換わる。
これによりアポB100のみのミセルが得られる。このようにして精製したアポB100をマウスに
投与し、免疫されたマウスの脾細胞を取り出す。
このマウスの脾細胞とマウスの骨髄腫細胞ライン
からの細胞とを融合させてハイブリドーマを得
る。このハイブリドーマの作成は、例えばオーイ
らの方法を用いることができる（SELECTED
METHODS IN CELLULAR
IMMUNOLOGY.351−372、Freeman 1980）。得られたハイブリドーマから本発明の抗アポ
B100−Ｉを作成するには、例えば次の２方法を
用いることができる。１の方法は、ハイブリドーマを適当な培養液中
（in vitro）で培養し、その上澄みに生成された
抗体を回収する方法である。他の方法は、ハイブ
リドーマをマウスに注射し（in vivo）生体内で
培養し、マウスの腹水中に生成された抗体を回収
する方法である。前者の方法では、抗体価が低い
が純度の良いものが得られるが、後者の方法では
純度はやや劣るが非常に抗体価の高いものが得ら
れる。どちらの方法を選択するかは目的によつて
使いわけられる。以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説
明する。実施例１この実施例では、本発明の抗アポB100−Ｉ、
およびそれを産生するためのハイブリドーマを作
成した。 (1) アポB100の精製正常者から採血したヒト血漿約200mlを超遠
心法にて分離し、比重1.030〜1.050の純粋な
LDL分画を採取する。その約３c.c.を１c.c.の10
％SDSおよび１％２−メルカプトエタノール溶
液と混合し、50℃で10分間培養する。この混合
液を２cm×100cmの50℃にウオータージヤケツ
トしたセフアロース4B・CLカラムに通してゲ
ル過する。その際に、流出液として0.5％
SDSおよび0.01MトリスHClを0.15M NaClで
PH7.2に調整した緩衝液を流速20ml／時で使用
した。その結果、ほぼ純粋なアポB100が得ら
れる。脱脂は99％以上完全である。 (2) 免疫精製したSDS溶液中のアポB100を100μｇ、
フロインド完全アジユバンドと共に雄のバル
ブ／ｃマウス（６週令）に皮下注射した。３週
後に再度、前記アポB100の10μｇを前記アジユ
バンドと共に腹腔内へ注射した。 (3) 細胞融合２回目の免疫から３日後に、マウスの脾臓を
取り出し、脾細胞の懸濁液とする。この脾細胞
１×10⁸個を、３×10⁷個の８−アザグアニン耐
性骨髄細胞腫NS−１とポリエチレングライコ
ール＃4000を用いて融合した。細胞は96穴マイ
クロ培養プレート５枚に分配した。 24時間後、上澄みの半分をHAT培地（ヒポ
キサンチン１×10^-4M、アミノプテリン４×
10^-7M、チミジン1.6×10^-3M）に置きかえた。
HAT耐性細胞（ハイブリドーマ）が２〜３週
間後に大半の培地に増殖するのが観察される。 (4) ハイブリドーマの選択および単クローン化マイクロプレート中の培養液上澄み100μ
をLDLをコートしたアツセイ用プレートに入
れ、室温で１時間放置後、３回洗浄する。そこ
へ、1000倍に希釈した抗マウスIgG・パーオキ
シデース標識を加え、また１時間室温で反応さ
せ、さらに３回洗浄後、発色液を加え、光度計
で比色した。 HDL（α−リポ蛋白質）や1.21ボトム分画と
反応せず、LDLと強く反応する抗体を分泌す
るハイブリドーマを選択した。単クローン化は、この選択したハイブリドー
マを、フイーダー細胞にマウス胸腺細胞を用
い、限界希釈法に２度かけることによつて行つ
た。 (5) 抗アポB100−Ｉの作成 (a) インビトロ法前記工程で得られたハイブリドーマは、適
当な培養液（例えば、牛胎児血清10％を含む
RPMI1640培地）で培養し、その培養上澄み
を回収した。上澄み中に分泌された抗体は、
精製せずそのまま使用できる純度の高いもの
が得られた。 (b) インビボ法ハイブリドーマを注射するマウスにあらか
じめ（４日前）、２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカンを腹腔内に注射しておく。次に抗体を産生するハイブリドーマをマウ
ス１匹あたり５×10⁶個、腹腔内に注射する。
注射後４〜10日で、マウス腹腔内に高濃度の
抗体を有する腹水が生成してくる。この腹水
は抗体としてそのまま使用できる。実施例２この実施例では本発明の抗アポB100−Ｉの特
異性を調べた。抗アポB100−Ｉと各種リポ蛋白質との結合は
免疫酵素抗体法を用い、また各種アポリポ蛋白質
との結合はトランスブロツテイング法を用いて行
つた。第１表に各種リポ蛋白質と本発明抗体との反応
性を示す。

【表】測定は次のように行つた。 96穴マイクロプレートに、ウサギのポリクロー
ナル抗アポＢ血清を固定化しておく。そこに測定
したいリポ蛋白試料100μを入れ、室温１時間
放置後３回洗浄する。洗浄後、抗アポB100−Ｉ
（腹水の場合は約1000倍に希釈）を100μ入れ
て、１時間室温で反応させた後、３回洗浄する。
その後、各ウエルに抗マウスIgG・パーオキシデ
ース標識を入れ、発色液を加え、吸光度を測定す
る（サンドイツチ法）。この結果をみると、抗アポB100−Ｉはアポ
B100を含むVLDL、LDLと結合するが、アポ
B48のみを含むカイロミクロンとは結合できな
い。次に、各種アポリポ蛋白質と抗アポB100−Ｉ
との結合性をトランスブロツテイング法により検
討した。その結果を第２表に示す。

【表】

【表】各種リポ蛋白質から調製されたアポ蛋白質は、
油谷らの方法（J.Biochem、94 1241−1245、
1983）によつて、SDS−ポリアクリルアミドグラ
ジエントゲル電気泳動により分離される。このゲ
ル中の蛋白質はトウビンらの方法（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、76 4350−4354、1979）によ
り、セルロースニトレート紙にうつされる。この
セルロースニトレート紙は、本発明の抗体溶液中
で、１時間室温で反応させた後、洗浄する。セル
ロースニトレート紙に付着した抗体は、 ¹²⁵Iプ
ロテインＡを用い、オートラジオグラフイーで検
出するか、ツアングらの方法（Methods in
Enzymology、92 377−390、Academic Pres、
New York、1983）にて、パーオキシデース標
識抗マウスIgGと発色液を用いて検出される。このトランスブロツテイング法による検討で
も、本発明の抗アポB100−ＩはアポB100および
その分解産物とは反応しうるが、アポB48とは反
応し得ないことがわかつた。また、TG正常型無
βリポ蛋白血症患者血中のアポB48とは結合する
ことができなかつた。以上、本発明の単クローン性抗体は各種リポ蛋
白質およびアポリポ蛋白質を特異的に認識するこ
とができるので、血液の清浄、定量または定性、
あるいは臨床上の治療や病気の診断等に利用する
ことが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒトアポリポ蛋白質B100で予め免疫された
マウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインか
らの細胞との融合によつて形成されたハイブリド
ーマによつて産生され、 (1) 正常者人血中、アポリポ蛋白質B100と反応
し、アポリポ蛋白質B48とは反応しない、 (2) TG正常型無βリポ蛋白血症患者の血中リポ
蛋白質とは反応しない、 (3) 正常者人血中低比重リポ蛋白質（LDL）お
よび超低比重リポ蛋白質（VLDL）と反応する
各性質を有する単クローン性抗ヒトアポリポ蛋
白質B100抗体。