JPH03502523A

JPH03502523A - ヒト顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子の免疫化学的アッセイ

Info

Publication number: JPH03502523A
Application number: JP1506351A
Authority: JP
Inventors: アブラムス，ジョン・エス; ヴァン・ダイク，ロバート・イー
Original assignee: シェリング・バイオテック・コーポレーション
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1989-05-23
Publication date: 1991-06-13
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPH0768277B2; GR3007000T3; EP0344957B1; US5070013A; EP0422037A1; DE68903882T2; ES2052913T3; WO1989012108A1; DE68903882D1; AU3744289A; ATE83490T1; EP0344957A1; HK6196A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の免疫化学的アッセイｌユ旦立互本発明は一般にモノクローナル抗体およびそれに関連するハイブリドーマ、特にヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に関するものである。

１１１血循環している血液細胞は常に新しく産生された細胞によ、っておきかわっている。置換される血液細胞は造血と□呼ばれる過程でつくられ、ここでは２つの主な系列の少なくとも８種の成熟血液細胞系列、即ち、（１）赤血球、マクロファージ（単球）、好酸球、巨核球（血小板）、好中球、好塩基球（肥満細胞）を含む骨髄性の系列および、（２）１９２８球およびＢリンパ球を含むリンパ性の系列が生産される：バーゲスおよびニコラ（Ｂｕｒｇｅｓｓａｎｄ　　Ｎ１ｃｏｌａ）、成長因子と幹細胞（Ｇｒ。

ｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒｓ　　ａｎｄ　　Ｓｔｅｍ　　Ｃｅ１ｌＳ　（アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８３）。

血球細胞産生の調節の多くはコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆいる。これらの糖蛋白質は、それらの存在を検出するために用いられている、生体内および試験管内のアッセイ法から、このように命名されている。半固体培地における造血細胞のクローン培養技術は、試験管内アッセイ法の開発において特に重要である。このような培養中では、個々の前駆細胞（即ち発生的にある一つの系列に分化を開始しているが、依然として増殖能を持つ細胞）は、生体内において対応する過程と本質的に同一と信じられている過程によって増殖し、成熟子孫細胞のコロニーを形成することができる。造血におけるＣ８Ｆの役割は、最近多くの総説の１−マとなっている。例えば：メトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、造血）０ニー刺激因子（Ｔｈｅ　　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　　Ｃｏ１ｏｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　Ｆａｃｔｏｒｓ）（エルセビイア、ニューヨーク、１９８４）、メトカルフ、５ｃｉｅｎｃｅ１２２９巻、１６−２２頁（１９８５）：ニコラら、■ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　Ｔｏｄａｙ、５巻、７６−８０頁（１９８４）、ウェットン（ｗｈｅｔｔｏｎ）ら、ＴｌＢ５，１１巻、２０７−２１１頁（１９８６）；クラークおよびカメン（Ｃ１ａｒｋ　　ａｎｄ　　Ｋａｍｅｎ）。

５ｃｉｅｎｃｅ、２３６巻、１２２９−１２３７頁（１９８７）；ザックス（Ｓａｃｋｓ）、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３８巻、１３７４．−１３７９頁（１９８７）。

これらの因子の検出、抽出および精製は、それらが典型的に含まれている生体液の性質によって、またこれらの因子が非常に低濃度で存在するために、非常に複雑で困難である。

主として遺伝子クローニングによって、次第にＣ８Ｆが入手可能になるにつれ、こられの臨床応用法の検索に関心が集まっている。ホルモンとの生理的類似性（例えば、可溶性因子であること、成長を媒介すること、細胞のりセブターを介して機能すること等）のため、Ｃ８Ｆ使用の可能性は、現在のホルモンの使用法になぞらえられている：例えばデキスタ−（Ｄｅｘｔｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、１９８頁（１９８６）。これらの因子の使用は、腫瘍の化学療法あるいは放射線療法後の（血液細胞の）回復のための治療、骨髄形成不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移植後の造血系再生を促進するための治療、およびすでに成立した感染に対する宿主の抵抗性を増すための治療（例えば、デキスター（上述）、メトカルフ、５ｃｉｅｎｃｅ　（上述）、クラークおよびカーメン（上述））など、血液細胞産生の刺激が必要となるようないくつかの臨床場面で示唆されている。

最近、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ組換え体が、重度に白血球が減少したエイズ患者の循環血中の白血球数を、投与量依存的に増加させることが示されたニゲループマン（Ｇｒ。

ｏｐｍａｎ）、Ｃｅ　１１，５０巻、５−６頁（１９８７）。

Ｃ８Ｆはまた骨髄性白血病の発生および進行に一役を担っていると思われる。骨髄性白血病は顆粒球−マクロファージ前駆細胞のクローン新生物で、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の二つの主要なグループにわけられる。膵臓および血液内の造血集団の広範囲に及ぶ増大に伴う、成熟の全ての段階において、顆粒球−単球集団の骨髄での増加により、ＣＭＬは特徴づけられる。化学療法は白血病細胞集団の過剰なサイズを減少させることには成功しているものの、伝統的な療法は進行するにつれより多くの細胞が未成熟あるいは異常な形態になる末期の急性形質転換を防止したり、患者の寿命を延長することには成功し２ていない（メトカルフ、」二連、：Ｖ９Ｓ４）。

Ａ　Ｍ　Ｌは、しばしば、成熟顆粒球−単球細胞の形跡が殆どあるいは全く認められず、未成熟の顆粒球−単球芽細胞が蓄積することで特徴づけられる。疾患は主に骨髄におこり、通常は膵臓の肥大はごく僅かである。全体の有核血球は増加したりしなかったりするが、比較的少数の成熟細胞に結合して高い比率で未成熱井細胞が存在する。通常、関連した貧血、血小板減少症があったり、成熟した顆粒球や単球が、扉や末梢血に比較的欠如したりする。通常、制御不能の出血や抵坑できないほどの感染により死に至る（メトカルフ、上述、１９８４）。

白血病の両形態は共に、コロニー刺激因子、特にＧＭ−Ｃ３Ｆの生産あるいは反応性の異常により起こると思われる。特に、何人かのＡＭＬ患者からの白血病細胞は、ＧＭ−Ｃ８Ｆを構成的に発現しているので、自律的なイン・ビトロ増殖ができることおよび、そのような自律的増殖がＧ　Ｍ−Ｃ８Ｆを中和する抗血清を加えることで阻害されることが示されている；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、ＢＩｏｏｄ、、６８巻、１１７８−１１８１頁（１９８６）。

骨髄性白血病は、特にＡＭＬでは、ＧＭ−Ｃ８Ｆの細胞成長を刺激する能力をブロックすることにより治療できると考えられる。ブロック試薬は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なモノクローナル抗体から得られる。

このようなモノクローナル抗体は、ＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、定量、精製を含む他の用途も有する。薬剤を用いたどのような療法についても、重要な観点は、患者の血液や他の体液中の濃度レベルを予測および／または監視できることである。モノクローナル抗体はこの目的に広く用いられている；例えば、スブリンガ−（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）編、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉ　ｎ　　ｔ　ｈ　ｅ　　Ｂ　ｉ　ｏ　ｓ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ　ｓ　　ａ　ｎ　ｄ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（プレナムプレス、ニューヨーク、１９８５）および米国特許４，５６２，００３；４，４８６．５３０および４，２２５，３２９号を参照。

ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆのような遺伝子設計された蛋白質の生産では、発現された蛋白質を形質転換した宿主細胞および／またはその培養上清から分離することが重要な課題である。分離手段は、しばしば原料を１度もしくはそれ以上免疫吸着カラムに通すことを含む。精製すべき蛋白質ＩＪ特異的モノクローナル抗体はそのようなカラムの重要な要素である。そうしたモノクローナル抗体は、また、ある特別な方法（例えばウェスタンプロット分析（バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、、１１２巻、１９５−２０３頁、１９８１））によって、到達した精製度の測定にも用いられる。

以上の説明から、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なモノクローナル抗体の入手可能性は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、精製、定量のための生物活性測定法に置き代わり得る方法を提供して、医学および獣医学への応用を可能にすることも明らかである。

主里亘監１本発明は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、定量に用いる化合物、組成物およびキットを提供する。化合物および組成物は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから得られる。本発明の化合物および組成物は、ハイブリドーマ自体、その派生細胞および親ハイブリドーマ、ハイブリドーマが作るモノクローナル抗体およびその重鎮、軽鎖の可変部ポリペプチド、および他のフラグメント、例えば自然のジスルフィド結合により重鎮に結合した軽鎖からなる半分子、Ｆａｂフラグメント、Ｆ　（ａｂ）２フラグメントおよびＦｖフラグメント等、ならびに例えば酵素−抗体複合体などのモノクローナル抗体やそのフラグメントの有用な複合体等を包含する。本発明はまた、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、精製、濃度測定のために上記化合物や組成物を用いる方法およびその方法を実施するためのキットも包含する。特に本発明は、バイブリド−７ＢＶＤ２−５Ａ２，４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢｖＤ２−２１Ｃ１１，３およびその派生株ならびに親ハイブリドーマ１、そ【７て、各々が生産するモノクローナル抗体並びにその産物も包含する。これらのハイブリドーマは、それぞれＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９の寄託番号で、メリーランド、ロックビルのアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

本発明の組成物はまた、ハイブリドーマＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．１ｊよびＢＶＤ２−２１Ｃ１１，３から抽出したメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をも包含する。そのようなｍＲＮＡは、バクテリア、酵母およびその他の宿主で各抗体のフラグメントをクローニングしたり発現させるために有用である。

抗体は、ジスルフィド架橋により結合したポリペプチド鎖の集合体を構成する。

軽鎖および重鎮と呼ばれる２つの主要なポリペプチド鎖が、全ての主要なりラス（アイソタイプ）の抗体の構造を構成する。重鎮および軽鎖は共に、可変部および不変部と呼ばれる副領域にさらに分かれている。重鎮は一つの可変部と三つあるいはそれ以上の異なる不変部からなり、軽鎖は一つの可変部（重鎮のものとは異なる）および一つの不変部（重鎮のものとは異なる）からなる。重鎮と軽鎖の可変部は、抗体の結合特異性に対して主要な関係を持つ。

本明細書中で用られる「重鎮可変部」という語は、（１）１１０〜１２５アミノ酸の長さを持ち、（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の重鎮のＮ末端から開始するそれに一致するポリペプチドを意味する。同様に「軽鎖可変部」の語は、（１）　９５〜１１５アミノ酸の長さを持ち、（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の軽鎖のＮ末端から開始するそれに一致するポリペプチドを意味する。

Ｆａｂ、Ｆ　８％　Ｆ＜ｍｂ＞ｚ　、Ｆｖの語は、その標準的な免疫学的意味で用いられている；例えばクライン（Ｋ　１　ｅｉｎ）、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌｏｇｙ　（ジョンワイリー、ニューヨーク、１９８２）またはバーラム（Ｐａｒｌａｍ）、１４章、ワイア（Ｗｅｉｒ）編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版（ブラックウェル　サイエンティフィック　バブリシャーズ、オ・ツクスフオード、１９８６）。

本明細書中で用られる「モノクローナル抗体」の語は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的に結合することができる免疫グロブリンのホモジニアスな集団を意味する。

本明細書中で用られる「結合組成物」とは、（１）機能的に結合させたとき、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに対して高０結合親和性を持つ構造を帯びた、（２）ヒトＧＭ− Ｃ３Ｆ特異的モノクローナル抗体を産生ずるノ１イブリドーマから得られる、二つのペプチド鎖からなる混合物を意味する。「機能的に結合させた」という語は、Ｆ、５やＦｖのようＩｊ天然の抗体フラグメントとの結合を含めて、種々の手段で、あるいは遺伝子操作でカルボキシ末端にシスティンを含むペプチドリンカ −を繋ぐ方法で結合するよう、互いに関連しあった位置づけを二つのポリペプチド鎖に生じさせることを意味する。通常、二つのポリペプチド鎖は、ヒトＧＭ− Ｃ８Ｆ特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変部および重鎮可変部に相当する。

皿皿亘墨員星聚豆図１は種々の濃度のヒトＧＭ−ＣＳＦのいくつかのＥＬＩＳＡアッセイのデータを示す。

日の　　な９日本発明のハイブリドーマは標準的技法により製造された。標準プロトコールを用いて、糖鎖を含まないヒトＧＭ−Ｃ８Ｆで腹膜組織内に免疫処理した雄のルイスラット（Ｌｅｗｓ　　ｒａｔ）から膵臓細胞を採取した。単離した胛臓細胞を１：１の比率でポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３ −Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５８０）と融合させた。本発明のハイブリドーマは、間接ＥＬＩＳＡ、バイオアツセイテのＧＭ−Ｃ’ＳＦの阻害および放射線標識されたＧＭ−Ｃ８Ｆを免疫沈澱出来る能力により選択された。／ ’％イブリドーマは限界希釈法によりクローン化した。

ハイブリドーマを保存しく例えば１０％ＤＭＳＯ入り培養液中で一７０℃）、標準的な哺乳類細胞培養技術を用いて培養した（例えば、３．０％胎児ウシ血清を含み、１ｍＭグルタミンおよび５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを加えたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　　１６４０　）。抗体は標準的な蛋白質精製法を用いて、ハイブリドーマ培養液から得られた（例えばティジャン（Ｔｉ　ｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔ　ｉｃｅ　　　ａ、ｎｄ　　　Ｔｈｅｏｒｙ　　　ｏｆ　　　Ｅｎｚｙｍｅ　　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　（エルセビイア、アムステルダム、１９８５）。上記の技法のいずれを応用するためにも多くの文献が参考のために入手可能である：例えばコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）　　ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　（コールトスプリングツ１−）く−ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０）；ティジャン、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセビイアーアムステルダム、１９８４）：／’−レル（Ｈｕｒｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　　（ＣＲＣブレス、ボカラートン。

ＦＬ、１９８２）。

抗体のフラグメントの利用および生産もよく知られている；例えばＦ、フラグメントについては、ティジャン　。

、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　（エルセビイア、アムステルダム、１９８５）：Ｆｖフラグメントについては、ホーホマン（Ｈｏｃｈｍａｎ）ら、Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻、１１３０−１１３５　（１９７３）：シャロン（Ｓｈａ、ｒｏｎ）ら、Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓ：ｔｒｙ、１５巻、１５９１−１５９４頁（１９７６）およびエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）ら、米国特許４゜３５５．０２３号；抗体半分子については、オーディター−ハーグリーブス（Ａｕｄｉｔｏｒｅ −Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）、、米国特許４，４７０，９２５号を参照。さらに本発明のような化合物および組成物は、既知の技法により、二価特異的な抗体を組み立てるために用いることもできる；そのような技法には、例えばハイブリドーマのさらなる融合（即ち、いわゆるクワドローマを形成する）：リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）、米国特許４．４７４，４９３号；もしくは半分子の化学的再結合：ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８５−８３頁（１９８５）がある。従って、これらの参照文献の内容は本明細書に含まれる。

本発明のハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体フラグメントを、メツセンジャーＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの構築、抗体分子のセグメントをコードするクローンの選択による組換え手法により、生産することもできる。：例えばウオール（Ｗａｌｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｔｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５巻、３１１３−３１２８頁（１９７８）；ザルサット（Ｚａｌｓｕｔ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８巻、３５９１−３６０１頁（１９８０）；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８１巻、３２７３−３２７７頁（１９８４）；ボス（Ｂｏｓｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３７９１−３８０６頁（１９８４）；アムスター（Ａｍｓ　ｔ　ｅ　ｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８巻、２０５５−２０６５頁（１９８０）；ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、米国特許４，６４２，３３４号。特にそうした技法は、異種間モノクローナル抗体を作成するのに用いることができ、そのような抗体ではある動物種の結合領域が別の動物種の抗体の非結合領域と組み合わされている；例えばリウ（■、ｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ、ｔ　１．Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、８４巻、３４３９−３４４３頁（１９８７）。

よって米国特許４，６４Ｌ　　３３４号は、参照によって本明細書に含まれる。

精製や定量の／；めにモノクローナル抗体を利用する方法はよく知られている；例として、アフィニティークロマトグラフ（−＋Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　Ｃｈｒｏｍａｔ。

ｙｙｒａｐｈｙ：Ｐｒ１ｎｃｆｐｌｅｓ　　ａｎｄ　　Ｍｅｔｈ、ｏｄｓ（ファルマシア、オレブロ、スウエーｆン、１９７９）、ゼッヒャ−（Ｓｅｃｈｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８．５巻、４４６−５５０頁（１９８０）および米国特許４，４２３．！４７号；ヨーロッパ特許出願０１９０’７１１　（１９８６年８月１３日）；免疫ア”ツセイ法、ティジャン（上述）；米国特許４．．４８６，５３０号；バーネット（上述）。°ｒフィニティークロマトグラフィーは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターで形質転換あるいはトランスフェクトされた細胞の培養上清のような試料から抽出することにより、ヒトＧＭＣＳＦを精製するだめに用られる。そうした精製過程をここでは免疫精製過程と呼んでいる。典型的には、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ特異的モノクローナル抗体を試料が通過するカラムやチャンバーにつめた固相支持体（ここでは「免疫吸着剤」と呼ぶ）に共有結合で結合させることを必要とする。試料からのＧＭ−Ｃ８Ｆは、結合したモノクローナル抗体の結合サイトに選択的に結合する一方、試料の残りの物質はカラムやチャンバーから洗い流される。ヒトＧ　Ｍ　−Ｃ８Ｆは、その後標準的技法（例えば、低いｐＨ，高塩濃度等）により免疫吸着剤から溶出される。

「２サイｌ−Ｊもしくは「サンドイッチ」免疫アッセイが、本発明で好まシ、＜用られる免疫アッセイである；例としては米国特許４，４８６，５３０号に開示されている。よって、この特許明細書は参照によって本明細書に含まれる。このようなアッセイは、二つの異なるセットの抗ＧＭ−Ｃ８Ｆ抗体を用いなければならないが、少なくともその一つは本発明のモノクローナル抗体からなる。二つのセットのうち一方の抗体を固相支持体の表面に結合させる。結合した抗体を、次にヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを含むと推定される試料に曝す。ＧＭ−Ｃ８Ｆ分子は結合抗体に結合する。次に第二のセットの抗体を、結合したＧＭ−Ｃ８Ｆに適用すると、この抗体は第一のセットの抗体が結合しているのとは別の抗原決定基に結合する。

そののち、抗体の第二セットに関連させた間接的あるいは直接的シグナル発生手段により、ＧＭ−Ｃ８Ｆを検出する。例えば、抗体を、酵素や稀土類キレート成分や有機色素のようなシグナル発生成分に直接結合させることもできるし、あるいは付加的な抗体や、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン複合体のような高親和性複合体を用いた１つあるいはそれ以上のシグナル発生成分に間接的に抗体を結合させることもできる。ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ濃度の定量は、サンプルから得られるシグナルを、既知の濃度のヒトＧＭ−ＣＳＦを含むヒトＧＭ− Ｃ８Ｆ標品から得られるシグナルと比較することによりなされる。

本発明は免疫アッセイ、特にサンドイッチ免疫アッセイに用いる試薬キットも包含する。そのようなキットは（１）固相支持体、（２）ヒ）ＧＭ−Ｃ８Ｆの第一抗原決定基に結合することのできるモノクローナルな第一抗体、（３）ヒ）ＧＭ −Ｃ８Ｆの第二抗原決定基に結合することのできるモノクローナル抗体およびヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ特異的ポリクローナル抗体（本明細書中では「ポリクローナル抗体組成物」と呼ぶ）からなるグループから選択された第二抗体、（４＞上記３種の抗体の一つと関連させたシグナル発生手段、を含んでいる。特定の態様に応じて、キットは３種の抗ＧＭ−Ｃ８Ｆ抗体のタイプから２つを選択してよく、その選択は第一抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体と第二抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体の選択、または第一もしくは第二抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体とポリクローナル抗体組成物との選択である。抗体は溶液の形でも凍結乾燥の形でもよい。抗体セットの一方は固体支持体に予め結合されていてもよく、キットを使用するとき固体支持体の表面に適用されてもよい。シグナル発生手段は、二つの抗体タイプの一方に予め関連されていてもよく、あるいは使用前に例えば緩衝液、抗体−酵素複合体、酵素基質等の１つあるいはそれ以上の成分と組み合わせるようにされていてもよい。シグナル発生手段は多くの方法が利用可能であり、キットの１つもしくはそれ以上の要素を構成することができる。種々のシグナル発生手段はティジャンにより報告されている（上述）。本発明のキットはまた付加的試薬を含んでもよい；例えば固相表面への非特異的結合を減少させるためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質等。固相表面は、ポリ塩化ビニルやポリスチレンなどの蛋白質を固定化するために適した物質からなるマイクロタイタープレートやマイクロスヤエア等の形であってよい。

固相表面をもつこのような材料を本明細書中で「支持手段」と呼ぶ。シグナル発生手段の要素としては、蛍光性または呈色反応生成物の形成を触媒する酵素であることが好ましい。さらにそのような酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択されることが好ましい。こられの酵素に対する基質や反応条件は技術上よく知られている（例えば上述のティジャン）。

ス」１匹以下の実施例は、具体例によって本発明を説明するためのものである。個々の試薬、濃度、温度およびそのたの可変条件や材料は、本発明の応用の例示のためであり、発明の限定のためのものではない。

実施例Ｉ　酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）により製造されたヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの検出酵母内でヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを生産する方法は、ミャジｖ　（Ｍｉ　ｙａ　ｊ　ｉｍａ）ら、ＥＭＢＯＪ、５巻、１１９３−１１９７頁（１９８６）に記載されている。ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの発現プラスミドを持ったＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅの定常期培養の培地を、セントリコン１０濃縮器（アミコン社、ダンバース、ＭＡ）を用いて約４０倍に濃縮した。回収したサンプルを０．０６２５Ｍ　　トリス塩酸、ｐＨ６，８，２％ＳＤＳ、１０％グリセリンおよび５％β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプル緩衝液で１：１に希釈し、５分間煮沸した。サンプルを不連続バッファー系のＳＤＳ　　５−１５％連続勾配ポリアクリルアミドゲル；レムリ−（Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻１６８０−６８５頁（１９７０）に載せた。電気泳動後、２０ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭグリシンを含む２０％メタノール中で、０．２アンペア、４℃で一晩のトランスファーにより、電気泳動的に蛋白質をニトロセルロース膜（ＢＡ８５．　　シュライヒャーアンドシュエル（Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　５ｃｈｕｅｌｌ）、　　キーン、　　ＮＨ）に移した。

ニトロセルロースに固定した蛋白質のイムノブロッティングは次のように行った；全でのインキュベーションおよび洗浄操作は４℃で行った。膜を１００ｍ１の０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中でブロッキングを行った。一時抗体はラットの抗ＧＭ−Ｃ８Ｆハイブリドーマ上清を０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％ツイン２０を含むＰＢＳで希釈したものである。膜をこられの溶液１０ｍ１中で２時間インキュベートした。次に膜を１００ｍ１のＰＢＳ−ＢＳＡ −ツイン緩衝液中で２０分間づつ３回洗浄した。５０ｍ１のＰＢＳ−ＢＳＡ−ツイン緩衝液中の５０μｍ容の１２５１標識ヒツジ抗ラットＩｇを二次標識抗体として用いた。膜を２時間インキユベートシ、上述のように洗浄操作を行った。次に膜を短時間乾燥させ、Ｘ線フィルム（ＮＩＦ　　Ｎｅｗ　　ＲＦＸ。

富士フィルム、日本）に露光させた。

実施例■　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）で生産された組換えヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの２− サイトサンドイッチ検出法リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で濃度を１０μｇ／Ｅｌ１１とした、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４から得たモノクローナル抗体１００μ ｌを用い、３７℃２時間のインキュベーションによりマイクロタイタープレートをコーティングした。マイクロタイタープレートを０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳで洗浄し、一連の希釈を行った精製組換えヒトＧＭ　−ＣＳ　Ｆ　（０〜１２５０μｇ／ｍｌ）を加え、プレートを室温で２時間置き、その後０．０５％ツインを含むＰＢＳで洗浄した。結合したヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの検出は、最初にニトロヨードフェニル（Ｎ　Ｉ　Ｐ）修飾を施したＢＶＤ２−２１Ｃ１１，３由来モノクロ一ナル抗体（１００μｇ　／ｍ１　１００μｍ　　３７℃で２時間インキュベート）をマイクロタイタープレートに加え、洗浄し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたう・ソト抗ＮＩＰモノクローナル抗体を加えた。シグナルは２．２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）がペルオキシダーゼにより酸化され発色性の産物が出来ることより生じた。ＮＩＰ修飾抗体は、最初に標準的な技術（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、　　ａｎｄ　　Ｃａｔａｌｏｇ、１９８５−１９８６）を用いて、ＮＩＰ−スクシニミドエステルを形成し、次に例えばＰＢＳ中ｐＨ７，２でＮＩＰ−スクシニミドエステルを抗体と反応させて得られた。検出はアビジン−ビオチンまたはストレプトアビジン −ビオチンのシグナル形成システムを用いても容易に行うことができた。

図１はＢＶＤ２−２１Ｃ１１，３およびＢＶＤ２−２３Ｂ６．４により産生されたモノクローナル抗体を用いて、ヒ）−ＧＭ−Ｃ３Ｆに対して免疫酵素測定法による２サイトサンドイツチ検出法を行った結果を示す。ここに具体化されたデータに示されるように、本発明はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを２０μｇ／ｍｌまたはそれ以下のレベルで検出できる（挿入図はゼロ付近の拡大図である）。

以上の発明の具体例は、実例を示し発明を説明するためのものである。これらは網羅的なものあるいは発明を開示された形に制限しようとするものではなく、以上の記載に照らして明らかな多くの修飾や変形が可能である。具体例は本発明の原理およびその実際的応用を最も良く説明するように選択され記載されており、これにより他の人々は特定の応用を意図する際に種々の態様および多様な修飾を施して本発明を最も効果的に利用することができる。本発明の範囲は、請求の範囲により規定される。

出願人はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシＥｌ　ン（ＡＴＣＣ）、ｏッ’）　ビル、ＭＤ、米国に、ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１，３のハイブリドーマをそれぞれ、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９として寄託した。これらの寄託はＡＴＣＣの特許の目的のための培養物の寄託に関する合意により提供された条件の下になされた。これらの寄託物は３５ＵＳＣ１２２および３７ＣＦＲ１，１４に従い、米国特許庁長官による入手可能性およびまた、寄託の維持を要求する米国特許の発行時から公衆による入手可能性も保証する。寄託株が入手可能であることは、ある国の特許法に基づいてその政府の権限の下で与えられる権利に違反して発明を実施する承諾であると解釈されるべきではない。

上記寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条件に適合するように修正された。

ヒト　ＣｒＭ−Ｃ５Ｆ　　免ジ艷耐１（アジ。イｗ／、ｚ３ｇｇ＝＋−デ４ングＡ、ズ゛２／ｃ＋／／：ＮＩＰ＄Ｂ／＃　Ｍａｂｓｏ　　　　　　　　　　　５００　　　　　　　　　１０００　　　　　　　　　１５００ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（ｐ９／ｍ［）某１図補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　２年１１月３０日 ′・さ許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿　　　　　　　　　　　　　　１引１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１５３２、発明の名称ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の免疫化学的ア・ソセイ３、特許出願人名　称　　シェリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新人手町ビル　２０６区ワ、補正書の提出日平成２年　４月１０日白血病の両形態は共に、コロニー刺激因子、特にＧＭ−Ｃ８Ｆの生産あるいは反応性の異常により起こると思われる。特に、何人かのＡＭＬ患者からの白血病細胞は、ＧＭ−Ｃ８Ｆを構成的に発現しているので、自律的なインビトロ増殖ができること、およびそのような自律的増殖がＧＭ−Ｃ３Ｆを中和する抗血清を加えることで阻害されることが示されている：ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、Ｂｌｏｏｄ、６８巻、１１７８−１１８１頁（１９８６）。

骨髄性白血病は、特にＡＭＬでは、ＧＭ−ＣＳＦの細胞成長を刺激する能力をブロックすることにより治療できると考えられる。ブロック試薬は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なモノクローナル抗体から得られる。

このようなモノクローナル抗体は、ＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、定量、精製を含む他の用途も有する。薬剤を用いたどのような療法についても、重要な観点は、患者の血液や他の体液中の濃度レベルを予測および／または監視できることである。モノクローナル抗体はこの目的に広く用いられている：例えば、スブリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）編、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎ　　ｔｈｅ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　　ａｎｄ　　Ｍｅｄｉｅｉｒｌｅ（ブレナムプレス、　、Ｌ−ユ、−ヨーク、１９８５）および米国特許４，５６２，００３；４，４８６．５３０および４，２２５，３２９号を参照。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのような遺伝子設計された蛋白質の生産では、発現された蛋白質を形質転換した宿主細胞および／またはその培養上清から分離することが重要な課題である。分離手段は、しばしば原料を１度もしくはそれ以上免疫吸着カラムに通すことを含む。精製すべき蛋白質に特異的モノクローナル抗体はそのようなカラムの重要な要素である。そうしたモノクローナル抗体は、また、ある特別な方法（例、えばウェスタンプロット分析（バーネット（ＢｕｒｎＰｔｔｅ）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｅｈｅｒｒｘ、、１１２巻、１９５−２０３頁、１９８１））によっ゛Ｃユ到達した精製度の測定にも用いられる。

以上の説明から、ヒｌ−ＧＭ−Ｃ５Ｆに特異的なモノクローナル抗体の入手可能性は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの検出、精製、定量のための生物活性測定法に置ぎ代わり得る方法を提供して、医学および獣医学への応用を可能にすることも明らかである。

、泣Ｍ、！！２（Ｉ一本発明は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの検出、定量に用いる化合物、組成物およびキットを提供する。化合物および組成物は、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから得られる。本発明の化合物および組成物は、ハイブリドーマ自体、その子孫や変異細胞および突然変異体を含む元のハイブリドーマのモノクローナル抗体生産能力を有する全ての子孫、ハイブリドーマが作るモノクローナル抗体およびその重鎮、軽鎖の可変部ポリペプチド、および他のフラグメント、例えば自然のジスルフィド結合により重鎮に結合した軽鎖からなる半分子、Ｆａｌ、フラグメンＩ’　、Ｆ　（ａｂ）！フラグメントおよびＦｖフラグメント等、ならびに例えば酵素−抗体複合体などのモノクローナル抗体やそのフラグメントの有用な複合体等を包含する。本発明はまた１、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの検出、精製、濃度測定のために上記化合物や組成物を用いる方法およびその方法を実施するためのキ・７　トも包含する。特に本発明は、ハイブリドーマＢＶＤ２、−５Ａ２，４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１，３およびその子孫や変異細胞および突然変異体を含む元のハイブリドーマのモノクローナル抗体生産能力を有する全ての子孫、そして、各々が生産するモノクローナル抗体ならびにその産物も包含する。これらのハイブリドーマは、それぞれＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＩＥＩ　９５６９の寄託番号で、メリーランド１　ロックビルのアメリカン　クイブ　カルチャー　コ１／クション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

（請求の範囲全文の差替え）請求の範囲１、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって下記モノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマにより生産された、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に特異的なモノクローナル抗体。

２、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマ。

３、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域からなるポリペプチド。

４、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域からなるポリペプチド。

５、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域を含む、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に特異的な結合組成物。

６、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを含むことが予測される試料中のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの存在を検出する方法であって、以下の工程：寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産された、ヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体を用意すること；ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆに特異的なポリクローナル抗体組成物および寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産された、第一抗原決定基とは異なるヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体よりなる抗体の群から選択される第二抗体を用意すること；第一モノクローナル抗体または第二抗体に機能的に関連してシグナルを発生することができ、且つ該シグナルの強さがそれぞれ第一モノクローナル抗体または第二抗体に相関するシグナル発生手段を用意すること；抗体−支持体結合物を形成させるために、第一モノクロルナル抗体または第二抗体を支持手段に結合させること；試料中のヒトＧＭ−ＣＳＦが抗体−支持体結合物に結合するように、試料を抗体 −支持体結合物と接触させること；抗体−支持体結合物が第二抗体を含む場合は、シグナル発生手段と機能的に関連する第一モノクローナル抗体ど抗体−支持体結合物に結合し、たヒトＧＭ−Ｃ５Ｆとを接触させ、あるいは抗体−支持体結合物が第一モノクローナル抗体を含む場合は、シグナル発生手段と機能的に関連する第二抗体と抗体−支持体結合物に結合したヒト・ＧＭ−ＣＳＦとを接触させること；およびシグナル発生手段によって生じたシグナルを測定すること；からなる、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを含むと予測される試料中のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの存在を検出する方法。

７、抗体−支持体結合物が第一モノクローナル抗体を含みそして第二抗体がヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なポリクローナル抗体組成物である、請求項６記載の方法。

８、抗体−支持体結合物が第二抗体を含みそして該第二抗体がヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なポリクローナル抗体組成物である、請求項６記載の方法。

９、以下の要素：寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産された、ヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体：ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆに特異的なポリクローナル抗体組成物および寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクロ・−ナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマによって生産された、第一抗原決定基とは異なるヒトＧＭ−ＣＳＦの第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体よりなる抗体の群から選択される第二抗体；支持手段；およびシグナル発生手段；を含んでなる、ヒトＧＭ−ＣＳＦを含むと予測される試料中のヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの存在を検出するキット。

１０、　　シグナル発生手段が第一モノクローナル抗体と機能的に関連した酵素を含む請求項９記載のキット。

１１、上記酵素が、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項１０記載のキット。

１２、シグナル発生手段が、複数の酵素または一つの蛍光性の有機分子と機能的に関連するビオチンおよびストレプトアビジンもしくはアビジンで修飾された、第一モノクローナル抗体である、請求項９記載のキット。

１３、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを含む試料からヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを抽出するための免疫精製方法であって、寄託番号ＨＢ９５６７、ＨＢ９５６８およびＨＢ９５６９でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマおよびその子孫、派生体および変異体を含む子孫であって請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマにより生産されたモノクロ・−ナル抗体を含む免疫吸着カラムに前記試料を通過させることからなる方法。

手続補正書（方式）平成　３年３月−を日特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿１、事件の表示　　　　　　　　　　　　　　　　　　−９Ｐ、ＣＴ／ＵＳ８９１０２１５３　。

２、発明の名称ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の免疫化学的アッセイ３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　ジェリング・バイオデック・コーポレーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区６、補正の対象国際調査報り一国際ｖ４ｉｔ、報告　ＰＣＴ、’ＵＳ　８９１０２１．５：１国際調査報告今衆国カリフォルニア州９４０１４．ダリー・シティ、キャニライブ　２５６

Claims

【特許請求の範囲】１．ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産された、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に特異的なモノクローナル抗体。２．ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマ。３．ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域からなるポリペプチド。４．ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域からなるポリペプチド。５．ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたモノクローナル抗体に由来するＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を含む、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に特異的に結合する組成物。６．以下の工程：ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体を用意すること；ヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的なポリクローナル抗体組成物およびＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体からなる抗体群から選択された第二抗体を用意すること；第一モノクローナル抗体または第二抗体に機能的に関連してシグナルを発生することができ、且つ該シグナルの強さが第一モノクローナル抗体または第二抗体に相関するシグナル発生手段を用意すること；抗体−支持体結合物を形成させるために、第一モノクローナル抗体または第二抗体を支持手段に結合させること；試料中のヒトＧＭ−ＣＳＦが抗体−支持体結合物に結合するように、試料を抗体 −支持体結合物と接触させること；抗体−支持体結合物が第二抗体を含む場合は、シグナル発生手段と機能的に関連する第一モノクローナル抗体と抗体−支持体結合物に結合したヒトＧＭ−ＣＳＦとを接触させ、あるいは抗体−支持体結合物が第一モノクローナル抗体を含む場合は、シグナル発生手段と機能的に関連する第二抗体と抗体−支持体結合物に結合したヒトＧＭ−ＣＳＦとを接触させること；およびシグナル発生手段によって生じたシグナルを測定すること；からなる、ヒトＧＭ−ＣＳＦを含むと予測される試料中のヒトＧＭ−ＣＳＦの存在を検出する方法。７．抗体−支持体結合物が第一モノクローナル抗体を含みそして第二抗体がヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的なポリクローナル抗体組成物である、請求項６記載の方法。８．抗体−支持体結合物が第二抗体を含みそして該第二抗体がヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的なポリクローナル抗体組成物である、請求項６記載の方法。９．次の要素：ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体；ヒトＧＭ−ＯＳＦに特異的なポリクローナル抗体組成物およびＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたヒトＧＭ−ＣＳＦの第一抗原決定基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体からなる抗体群から選択された第二抗体；支持手段；およびシグナル発生手段；を含んでなるヒトＧＭ−ＣＳＦを含むと予測される試料中のヒトＧＭ−ＣＳＦの存在を検出するためのキット。１０．シグナル発生手段が第一モノクローナル抗体と機能的に関連した酵素を含む請求項９記載のキット。１１．上記酵素が、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項１０記載のキット。１２．シグナル発生手段が、複数の酵素または一つの蛍光性の有機分子と機能的に関連するビオチンおよびストレプトアビジンもしくはアビジンで修飾された、第一モノクローナル抗体である、請求項９記載のキット。１３．ヒトＧＭ−ＣＳＦを含む試料からヒトＧＭ−ＣＳＦを抽出するための免疫精製方法であって、ＢＶＤ２−５Ａ２．４、ＢＶＤ２−２３Ｂ６．４およびＢＶＤ２−２１Ｃ１１．３並びにそれらから派生したまたはそれらの親のハイプリドーマからなる群から選択されたハイプリドーマにより生産されたモノクローナル抗体を含む免疫吸着カラムに前記試料を通過させることからなる方法。