DE68903882T2

DE68903882T2 - Immunochemisches testverfahren fuer humanen granulozyten-makrophagen-kolonie stimulierenden faktor.

Info

Publication number: DE68903882T2
Application number: DE8989305175T
Authority: DE
Inventors: John S Abrams; Dyke Robert E Van
Original assignee: Schering Biotech Corp
Current assignee: Schering Biotech Corp
Priority date: 1988-05-31
Filing date: 1989-05-23
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2009-05-24
Also published as: GR3007000T3; US5070013A; HK6196A; JPH0768277B2; JPH03502523A; AU3744289A; EP0344957A1; ATE83490T1; DE68903882D1; EP0422037A1; EP0344957B1; ES2052913T3; WO1989012108A1

Description

Das Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf monoclonale Antikörper und ihre zugehörigen Hybridome; und ganz besonders auf monoclonale Antikörper, die für den humanen Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) spezifisch sind.

Hintergrund

Zirkulierende Blutzellen werden regelmäßig durch neu entwikkelte Zellen ersetzt. Die Ersatzblutzellen werden in einem Prozeß, der Hämatopoese heißt, gebildet, der mit der Produktion von wenigstens acht reifen Blutzelltypen innerhalb zweier Hauptlinien verbunden ist: (1) Myeloische, die die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) einschließen, Makrophagen (Monozyten), eosinophile Granulozyten, Megakaryozyten (Plättchen), neutrophile Granulozyten, basophile Granulozyten (Mastzellen); und (2) lymphoide, die T-Lymphozyten und B-Lymphozyten einschließen; Burgess und Nicola, Groth Factors and Stern Cells (Academic Press, New York, 1983). Vieles bei der Steuerung der Blutzellenbildung wird durch eine Gruppe von wechselseitig einwirkenden Glycoproteinen vermittelt, die Kolonie stimulierende Faktoren (CSFs) genannt werden. Diese Glycoproteine werden so genannt, wegen der in vivo und in vitro Testverfahren, die zur Ermittlung ihrer Gegenwart verwendet werden. Die Techniken für die Kultur von Klonen hämatopoetischer Zellen in halbfesten Kulturmedien sind für die Entwicklung der in vitro Testverfahren besonders wichtig gewesen. In solchen Kulturen sind einzelne Zellnachkommen (beispielsweise Zellen, die entwicklungsmäßig an bestimmte Linien gebunden sind, aber noch proliferieren können) in der Lage zu proliferieren und eine Kolonie reifender Nachkommen in der Art zu bilden, die man für im wesentlichen identisch mit dem vergleichbaren in vivo Prozeß hält. Die Rolle der CSFs in der Hämatopoese ist Gegenstand vieler neuer Untersuchungen; beispielweise Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, New York, 1984); Metcalf, Science, Bd. 229, S.16-22 (1985); Nicola et al., Immunology Today, Bd. 5, S 76-80 (1984); Whetton et al., TIBS, Bd. 11, S. 207-211 (1986), Clark and Kamen, Science, Bd. 236, S. 1229-1237 (1987) und Sachs, Science, Bd. 238, S. 1374-1379 (1987)
Der Nachweis, die Isolierung und Reinigung dieser Faktoren ist äußerst schwierig, denn häufig wird sie durch die Natur der biologischen Flüssigkeiten, in denen die Faktoren typischerweise vorkommen, und durch ihre sehr niedrigen Konzentrationen erschwert. Als mehr CSFs verfügbar wurden, in erster Linie durch molekulares Klonen, ist das Interesse gestiegen, klinische Anwendungen für sie zu finden. Wegen der physiologischen Ähnlichkeiten mit Hormonen (beispielsweise, lösliche Faktoren, Wachstumsvermittler, Aktion durch Zellrezeptoren), ergaben sich wirkungsvolle Verwendungen der CSFs in Analogie zu den geläufigen Verwendungen der Hormone; beispielsweise Dexter, Nature, Bd. 321, S. 198 (1986). Ihre Verwendung ist für etliche klinische Situationen vorgeschlagen worden, bei denen die Stimulation von Blutzellgenerationen wünschenswert wäre, wie bei der Rehabilitationstherapie nach Chemotherapie oder Strahlentherapie von Tumoren, der Behandlung der myeloischen Hyopoplasie, der Behandlung von Neutrophilenmangel, der Behandlung zur Steigerung hämatopoetischer Regeneration nach einer Knochenmarkstransplantation und die Behandlung der Steigerung der Wirts-Resistenz gegen ausgebildete Infektionen; beispielsweise Dexter (oben zitiert), Metcalf, Science, (oben zitiert) und Clark and Kamen (oben zitiert). Kürzlich konnte gezeigt werden, daß rekombinanter Human GM-CSF Dosis-abhängige Zunahme bei zirkulierender Leukozytenzählung bei ernstlich leukopenischen AIDS Patienten bewirkt: Groopman, Cell,Bd. 50, S. 5-6 (1987).
CSFs scheinen auch eine Rolle in der Entwicklung und dem Fortschreiten myeloischer Leukemien zu spielen. Myeloische Leukemien sind klonale Neoplasmen von Granulozyten-Makrophagen-Vorläufer-Zellen, die in zwei hauptsächliche Gruppen eingeteilt werden: Chronische inyeloische Leukemie (CML) und akute myeloische Leukemie (AML). CML ist durch die Ausbreitung im Innern der Granulozyten-Monozyten Population in allen Reifestadien gekennzeichnet, mit massiver Vergrößerung der hämatopoetischen Populationen in Milz und Blut. Wo Chemotherapie erfolgreich die übermäßige Größe der Leukemiezellpopulationen verringert, gelang es konventionellen Maßnahmen nicht, die letzte akute Umwandlung (von fortschreitend höheren Zellanteilen in unreife und abnorme Formen) zu verhindern, oder die Lebensspanne betroffener Patienten auszudehnen (siehe Metcalf, oben zitiert, 1984).
AML wird durch eine Anhäufung unreifer Granulozyten-Monozyten-Blasten-Zellen gekennzeichnet, mit oft wenig oder gar keinem Erscheinen von reifenden Granulozyten-Monozyten-Zellen. Die Krankheit betrifft in erster Linie das Knochenmark, und eine Milzvergrößerung ist für gewöhnlich nur gering. Die gesamten kernhaltigen Blutzellen können erhöht sein oder nicht, aber es gibt einen hohen Anteil an unreifen Erythroblasten mit verhältnismäßig wenigen reifen Zellen. Dies ist für gewöhnlich von Anämie, Thrombozytopenie und einem relativen Mangel im Mark und peripheren Blut an natürlichen Granulozyten und Monozyten begleitet. Gewöhnlich tritt der Tod als Folge von unkontrollierbaren Blutungen oder unbeherrschbaren Infektionen ein (siehe Metcalf, oben zitiert, 1984)
Man glaubt, daß beide Formen der Leukemie durch abnormale Bildung von, oder Empfänglichkeit für, Kolonie stimulierender Faktoren , besonders GM-CSF, hervorgerufen werden. Insbesondere wurde gezeigt, daß Leukemiezellen von einigen AML Patienten zu autonomer in vitro Proliferation fähig sind, da sie im wesentlichen GM-CSF zeigen und daß solch autonome Proliferation durch Zugabe von GM-CSF neutralisierendem Antiserum gehemrnt werden kann; Young et al., Blood, Bd. 68, S. 1178-1181 (1986).
Man glaubt, daß myeloische Leukemien, insbesondere AML, durch Blockieren der Fähigkeit von GM-CSF zur Zellwachstumsstimulation behandelt werden können. Blockierungsmittel können von monoklonalen Antikörpern, spezifisch für Human GM-CSF, gewonnen werden.
Solche monoklonalen Antikörper haben weitere Verwendungen, einschließlich Erkennen, Messen und Reinigen von GM-CSF. Ein bedeutender Gesichtspunkt irgendeiner Drogen einsetzenden Therapie, ist die Fähigkeit, Konzentrationsspiegel im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten des Patienten, vorherzusagen und/oder zu überwachen. Zu diesem Zweck werden monoklonale Antikörper weit verbreitet angewandt; beispielweise Springer Ed., Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine (Plenum Press, New York, 1985), und US-Patente 4 562 003, 4 486 530 und 4 255 329.
Bei der Herstellung gentechnischer Proteine, wie Human GM-CSF, stellt die Trennung exprimierter Proteine von den transformierten Wirtszellen und/oder von dem Überstand der Kulturen das hauptsächliche Problem dar. Die Trennungsprozesse enthalten häufig einen oder mehrere Durchgänge des Rohmaterials durch immunoabsorbierende Säulen. Monoklonale Antikörper, die spezifisch sind für das Protein, das gereinigt werden muß, sind die entscheidenden Elemente solcher Säulen. Solche monoklonalen Antikörper können auch verwendet werden, den Grad der Reinigung, der bei einem besonderen Vorgang erreicht wurde, beispielsweise durch "Western" Blot-Analyse (siehe Burnette, Anal. Biochem., Bd. 112, S. 195-203, 1981), zu messen.
Aus dem vorhergehenden Text ist ersichtlich, daß die Verfügbarkeit monoklonaler Antikörper, spezifisch für Human GM-CSF, auch medizinische und veterinärmedizinische Anwendungen von GM-CSF dadurch erleichtern können, daß alternative Meßmethoden der Bioaktivität geliefert werden, für seine Erkennung, Reinigung und Messung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt Verbindungen, Zusammenstellungen und Kits, die zur Erkennung und Messung des Human GM-CSF nützlich sind zur Verfügung. Die Verbindungen und Zusammensetzungen leiten sich von Hybridomen ab, die monoklonale Antikörper, spezifisch für Human GM-CSF, produzieren. Die Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung schließen die Hybridome selbst ein, die hiervon abstammenden und die ursprünglichen Hybridome, die von den Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper, schwere und leichte Ketten der variablen Region ihrer Polypeptide und andere Fragmente hiervon, wie Halbmoleküle, umfassend eine leichte Kette, die an eine schwere Kette über natürliche Disulfidbindungen gebunden ist, Fab Fragmente, F(ab)&sub2; Fragmente, Fv Fragmente und ähnliche und nützliche Konjugate solcher monoklonaler Antikörper und Fragmente, beispielsweise Enzym-Antikörper Konjugate und ähnliches. Die Erfindung schließt auch Verfahren ein, die die obigen Verbindungen und Zusammensetzungen nutzen, um den Human GM-CSF zu erkennen, zu reinigen und die Konzentration zu messen und Kits zur Durchführung solcher Verfahren. Insbesondere schließt die Verbindung die Hybridome BVD2-5A2.4, BVD2-23B6.4 und BVD2-21C11.3 ein, ihre Derivate und ursprünglichen Hybridome und ihre jeweiligen monoklonalen Antikörper und die hiervon abgeleiteten Produkte. Diese Hybridome sind bei American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland hinterlegt, unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568, bzw. HB9569.
Zusammensetzungen der Erfindung schließen auch messenger-RNA (mRNA) ein, die aus den Hybridomen BVD2-5A2.4, BVD2-23B6.4 und BVD2-21C11.3 extrahiert wurde. Solche mRNAs sind nützlich beim Clonen und Exprimieren von Fragmenten der jeweiligen Antikörper in Bakterien, Hefen oder anderen Wirtszellen.
Antikörper umfassen eine Ansammlung von Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Zwei hauptsächliche Polypeptidketten, die als leichte und schwere Kette bezeichnet werden, bilden alle wichtigen Strukturklassen (Isotypen) der Antikörper. Sowohl die leichten, als auch die schweren Ketten sind weiterhin in Subregionen unterteilt, die mit variable Regionen und konstante Regionen bezeichnet werden. Schwere Ketten umfassen eine einzige variable Region und drei oder mehr verschiedene konstante Regionen, und leichte Ketten umfassen eine einzige variable Region (unterschiedlich zu der der schweren Kette) und einer einzigen konstanten Region (unterschiedlich zu denen der schweren Kette). Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten sind in erster Linie für die Bindungsspezifität des Antikörpers verantwortlich.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "variable Region der schweren Kette" ein Polypeptid (1), das eine Länge von 110 bis 125 Aminosäuren hat und (2), dessen Aminosäuresequenz der einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend an der N-terminalen Aminosäure der schweren Kette. Ähnlich, bedeutet der Ausdruck "variable Region der leichten Kette" ein Polypeptid (1), das eine Länge von 95 bis 115 Aminosäuren hat, und (2) dessen Aminosäuresequenz einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend an der N-terminalen Aminosäure der leichten Kette.
Die Ausdrücke Fab, Fc, F(ab)&sub2; und Fv werden in ihrer immunologischen Standardbedeutung verwendet, beispielsweise Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982), oder Parham, Kap. 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4.Aufl. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986).
Wie hier gebraucht, bezieht sich der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" auf eine homogene Population von Immunglobulinen, die fähig sind, spezifisch an Human GM-CSF zu binden.
Wie hier gebraucht, bedeutet der Ausdruck "bindende Zusammensetzung" eine Zusammensetzung umfassend zwei Polypeptidketten (1), die, wenn sie arbeitsmäßig in Verbindung stehen, eine Konformation mit hoher Bindungsaffinität für Human GM-CSF bekommen und (2) die sich von einem Hybridom ableiten, das monoklonale Antikörper spezifisch für Human GM-CSF bildet. Der Ausdruck "arbeitsmäßig in Verbindung stehen" soll anzeigen, daß die zwei Polypeptidketten entsprechend aneinander gelegt werden können, um auf vielfache Weise zu binden, einschließlich des Zusammenfügens zu einem ursprünglichen Antikörperfragment, wie Fab oder Fv, oder durch gentechnische cysteinhaltige Peptidlinker an den Carboxylenden. Normalerweise entsprechen die beiden Polypeptidketten der variablen Region der leichten Kette und der variablen Region der schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers, spezifisch für Human GM-CSF.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Figur 1 stellt die Werte von einigen ELISA-Assays des Human GM-CSF dar, bei verschiedenen Konzentrationen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Hybridome der Erfindung wurden mit Standardtechniken hergestellt. Milzzellen wurden von einer männlichen Lewis- Ratte entnommen, die intraperitoneal mit unglycosyliertem Human GM-CSF immunisiert worden war, unter Verwendung von Standardprotokollen. Die isolierten Milzzellen wurden mit Maus-Myelom-Zellen P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), in einem Verhältnis 1:1 unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert. Die Hybridome der Erfindung wurden ausgesondert durch einen indirekten ELISA, Hemmung des GM-CSF in einem Bioassay und die Fähigkeit, radioaktiv markierten GM-CSF als Immunpräzipitat zu erhalten. Die Hybridome wurden durch einschränkende Verdünnung geklont.
Die Hybridome wurden aufbewahrt (beispielsweise bei -70 ºC in einem Kulturmedium mit 10% DMSO) und unter Verwendung standardisierter Säugerzellkultur-Techniken (beispielsweise RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum, ergänzt mit 1 mM Glutamin und 50 mM 2-Mercaptoethanol) kultiviert. Die Antikörper wurden aus dem Hybridomkulturmedium zurückgewonnen, unter Verwendung von Standardtechniken zur Proteinreinigung, beispielsweise Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Zahlreiche Schriften zur Anleitung für die Anwendung irgendeiner der oben genannten Techniken sind verfügbar: beispielsweise Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam 1984); und Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982).
Die Verwendung und Erzeugung von Antikörperfragmenten ist ebenfalls wohl bekannt; beispielsweise Fab Fragmente: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); und Fv Fragmente : Hochman et al., Biochemistry, Bd. 12, S. 1130-1135 (1973), Sharon et al., Biochemistry, Bd. 15, S. 1591-1594 (1976) und Ehrlich et al., US-Patent 4 355 023; und Antikörper Halbmoleküle: Auditore-Hargreaves, US-Patent 4 470 925. Weiterhin können solche Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, um bi-spezifische Antikörper mit bekannten Techniken zu konstruieren, beispielsweise durch weitere Fusionen von Hybridomen (beispielsweise zur Bildung sog. Quadrome): Reading, US-Patent 4 474 493; oder durch chemische Wiedervereinigung von Halbmolekülen: Brennan et al., Science, Bd. 229, S. 81-83 (1985). Dementsprechend wird auf diese Literaturstellen besonders Bezug genommen.
Antikörper und Antikörperfragmente, die für die Hybridome der Erfindung kennzeichnend sind, können auch durch rekombinante Mittel hergestellt werden, indem messenger-RNA extrahiert wird, eine cDNA Bibliothek konstruiert wird und Klone selektiert werden, die Segmente des Antikörpermoleküls kodieren: beispielsweise Wall et al., Nucleic Acids Research, Bd. 5 S. 3113-3128 (1978); Zalsut et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8 S. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd.81, S. 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12 S. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8 S. 2055-2065 (1980); und Moore et al., US-Patent 4 642 334. Insbesondere können solche Techniken genutzt werden, um interspezifische monoklonale Antikörper herzustellen, worin die Bindungsregion einer Art mit der nicht-bindenden Region des Antikörpers einer anderen Art kombiniert wird; beispielsweise Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 84, S. 3439-3443 (1987). Entsprechend ist auf US-Patent 4 642 334 Bezug genommen.
Die Anwendungen monoklonaler Antikörper zur Reinigung und Messung sind wohl bekannt; beispielsweise in der Affinitäts- Chromatographie: Affinity Chromatography: Principles and Methods (Pharmacia, Orebro, Schweden, 1979); Secher et al., Nature, Bd. 285, S. 446-450 (1980), und US-Patent 4 423 147; und Europäische Patentanmeldung 0190711 (13.August 1986); und Immunoassay-Techniken: Tijssen (oben zitiert); US-Patent 4 486 530; und Burnette (oben zitiert). Affinitäts-Chromatographie kann zur Reinigung von Human GM-CSF eingesetzt werden, indem er aus einer Probe extrahiert wird, wie einem Überstand einer Zellkultur, die transformiert oder mit einem Human GM-CSF Expressionsvektor transfiziert wurde. Ein solcher Reinigungsprozeß wird hier als Immunoreinigungsprozeß bezeichtet. Typischerweise ist damit eine kovalente Bindung eines für Human GM-CSF spezifischen monoklonalen Antikörpers an einen Festphasenträger verbunden (hier als "Immunoadsorbent" bezeichnet), der in eine Säule oder Kammer gebracht wird, durch die die Probe hindurchgeleitet wird. Human GM-CSF der Probe bindet vorzugsweise an den Bindungsstellen des anhaftenden monoklonalen Antikörpers, während der Rest des Probenmaterials von der Säule oder aus der Kammer ausgewaschen wird. Der Human GM-CSF wird dann von dem Immunoadsorbent nach Standardtechniken eluiert, beispielsweise mit niedrigem pH, hoher Salzkonzentration oder ähnlichem.
"Doppelbindige" oder "Sandwich" Immmunoassays sind die bevorzugten Immunoassay der Erfindung, z.B. wie im US-Patent 4 486 530 offenbart. Dementsprechend wird auf dieses Patent ausdrücklich Bezug genommen. Solche Assays umfassen die Verwendung von zwei verschiedenen Sätzen von Anti GM-CSF Antikörpern, von denen wenigstens einer aus einem monoklonalen Antikörper der Erfindung besteht. Antikörper von einem der beiden Sätze haften an der Oberfläche des Festphasenträgers. Die gebundenen Antikörper werden dann einer Probe, in der Human GM-CSF vermutet wird, ausgesetzt. Die GM-CSF-Moleküle binden an die anhaftenden Antikörper. Als nächstes wird der zweite Satz von Antikörpern auf den gebundenen GM-CSF aufgebracht und die Antikörper binden an eine oder mehrere antigene Determinanten, die sich von der oder denen, an die der erste Satz Antikörper gebunden ist oder sind, unterscheiden. Der GM-CSF wird dann mit einem indirekten oder direkten Signal erzeugenden Mittel erfaßt, das mit dem zweiten Antikörpersatz verbunden ist. Z.B. können die Antikörper direkt mit einem Signal erzeugenden Mittel konjugiert sein, wie ein Enzym, seltene-Erden-Chelatbildner oder einem organischen Farbstoff; oder sie können indirekt an ein oder mehrere Signale erzeugende Mittel durch zusätzliche Antikörper gebunden sein, oder Komplexe mit hoher Affinität, wie Avidin-Biotin oder Streptavidin- Biotin-Komplexe. Quantitative Messungen der Human GM-CSF Konzentration werden durch Vergleichen des durch die Probe erzeugten Signals mit Signalen, die durch Human GM-CSF Standards mit bekannten Konzentrationen an Human GM-CSF, erzeugt wurden.
Die Erfindung schließt Reagenzienkits zur Verwendung in Immunoassays, besonders Sandwich Immunoassasy ein. Solche Kits schließen ein
(1) einen Festphasenträger,
(2) einen ersten Antikörper, der monoklonal ist und der an eine erste antigene Determinante des Human GM-CSF binden kann,
(3) einen zweiten Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem monoklonalen Antikörper besteht, der an eine zweite antigene Determinante des Human GM-CSF binden kann, und einem polyklonalen Antikörper, spezifisch für Human GM-CSF (hier als eine "polyklonalen Antikörperzusammensetzung" bezeichnet), und
(4) ein Signal erzeugendes Mittel, mit einem der drei Antikörper in Verbindung stehend.
In Abhängigkeit von der besonderen Form, können die Kits eine Auswahl von zwei der drei Anti-GM-CSF Antikörper Typen einschließen, entweder einen monoklonalen Antikörper, der für die erste antigene Determinante spezifisch ist und einen monoklonalen Antikörper, der für die zweite antigene Determinante spezifisch ist, oder einen monoklonalen Antikörper, der für eine erste oder zweite antigene Determinante spezifisch ist und eine polyklonale Antikörperzusammensetzung. Die Antikörper können in Lösung oder in lyophilisierter Form vorliegen. Einer der Antikörpersätze kann an den festen Träger vor-gebunden sein oder kann an der Oberfläche des festen Trägers angebracht werden, wenn der Kit verwendet wird. Das Signal erzeugende Mittel kann mit einem der beiden Antikörpertypen vor-assoziiert sein oder kann die Kombination mit einer oder mehreren Verbindungen erfordern, beispielsweise Puffern, Antikörper-Enzym-Konjugaten, Enzymsubstraten, oder ähnlichem, vor der Verwendung. Viele Typen Signal erzeugender Mittel sind verfügbar und könnten eine oder mehrere Bestandteile eines Kits bilden. Verschiedene Signal erzeugende Mittel wurden von Tijssen (oben zitiert) angegeben. Die Kits der Erfindung können auch zusätzliche Reagenzien einschließen, beispielsweise Blocker, um die unspezifische Bindung an die Festphasenoberfläche zu reduzieren, Waschlösungen, Enzymsubstrate und ähnliches. Die Festphasenoberfläche kann in Form von Mikrotiterplatten, Mikrokugeln oder ähnlichem vorliegen, zusammengesetzt aus Polyvinylchlorid, Polystyrol, oder ähnlichen Materialien, die sich zur Immobilisierung von Proteinen eignen. Solche Materialien mit Festphasenoberflächen werden hier als "Trägermittel" bezeichnet. Vorzugsweise ist ein Enzym, das die Bildung eines fluoreszierenden oder farbigen Produktes katalysiert, ein Bestandteil des Signal erzeugenden Mittels. Stärker bevorzugt wird das Enzym aus der Gruppe, bestehend aus Peroxidase, alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase, ausgewählt. Substrate und Reaktionsbedingungen für diese Enzyme sind in der Fachwelt wohl bekannt (beispielsweise, Tijssen, oben zitiert).

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Die Auswahl besonderer Reagentien, Konzentrationen, Temperaturen und Werte anderer Variabler und Materialen dienen nur dazu, die Anwendung der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen und dürfen nicht als Einschränkung davon angesehen werden.

Beispiel I. Erkennen des Human GM-CSF, hergestellt aus Saccharomyces cerevisiae.

Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Human GM-CSF in Hefe werden von Miyajima et al., EMBO J. Bd. 5, S. 1193-1197 (1986) beschrieben. Das Medium von Kulturen stationärer Phase von Saccharomyces cerevisiae, die ein Expressionsplasmid für Human GM-CSF beherbergen, wird ungefähr 40-fach konzentriert unter Verwendung eines Centricon 10 Konzentrators (Amicon Corp., Danvers, MA). Die gewonnenen Proben werden 1:1 mit SDS Probenpuffer verdünnt, der 0,0625M Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin und 5% beta-Mercaptoethanol enthält, und 5 Minuten gekocht. Die Proben werden auf ein SDS 5-15% kontunuierliches Gradienten-Polyacrylamidgel mit einem diskontinuierlichen Puffersystem geladen; Laemmli, Nature, Bd. 227, S. 680-685 (1970). Nach Elektrophorese wird das Protein elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen (BA 85, Schleicher und Schuell, Keene, NH) überführt durch Übernacht Übertragung bei 0,2 Amp. in 20 mM Trisbase, 150 mM Glycin, in 20% Methanol bei 4 ºC.
Das Immunoblotting von Nitrocellulose-immobilisiertem Protein wird folgendermaßen ausgeführt; alle Inkubations- und Waschschritte werden bei 4 ºC ausgeführt. Die Membranen werden in 100 ml von 0,5%-igem Rinderserumalbumin in PBS blockiert. Die Antikörper der ersten Phase sind Verdünnungen des Ratten Anti-GM-CSF Hybridom-Überstands in PBS, der 0,1% Rinderserumalbumin und 0,5% Tween 20 enthält. Die Membranen werden in 10 ml dieser Lösungen 2 Stunden inkubiert. Die Membranen werden in 3 Portionen von 100 ml des PBS-BSA-Tween Puffers jeweils 20 Minuten gewaschen. Ein 50 µl Vol eines ¹²&sup5;J-markierten Schaf Anti-Ratten Ig, in 50 ml PBS-BSA-Tween wird als markierter Antikörper der zweiten Phase verwendet. Die Blots werden 2 Stunden inkubiert, gefolgt von einem weiteren Waschschritt, wie oben beschrieben. Sie werden dann kurz getrocknet und einem Röntgenfilm (NIF New RFX, Fuji Photo Film Co., Japan) ausgesetzt.

Beispiel II. Doppelbindiger Sandwich Assay des recombinanten Human GM-CSF, aus Escherichia coli.

Mikrotiterplatten wurden mit 100 µl des monoklonalen Antikörpers aus BVD2-23B6.4 bei einer Konzentration von 10 µg/ml in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch 2 Stunden Inkubation bei 37 ºC beschichtet. Die Mikrotiterplatten wurden mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt und Reihenverdünnungen des gereinigten rekombinanten Human GM-CSF (0-1250 pg/ml) wurden zugegeben, und die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, danach wurden die Platten mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween enthielt. Das gebundene Human GM-CSF wurde ermittelt, indem zuerst Nitrojodphenyl (NIP)-derivatisierte monoklonale Antikörper aus BVD2-21C11.3 zu der Mikrotiterplatte zugegeben wurden (100 µl auf 100 µg/ml, 2 Stunden inkubiert bei 37 ºC), gewaschen und dann ein Ratten Anti-NIP monoklonaler Antikörper, mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert, zugegeben wurde. Ein Signal wurde durch die Peroxidase-Oxidation von 2,2'-Azino-bis(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) erzeugt, das ein chromogenes Produkt ergibt. Die NIP-derivatisierten Antikörper wurden dadurch erhalten, daß zuerst ein NIP-succinimidester gebildet wurde unter Verwendung von Standard-Techniken (beispielsweise Pierce Chemical Company Handbook and Catalog, 1985-1986), und dann der NIP-succinimidester mit den Antikörpern zur Reaktion gebracht wurde, z.B. in PBS bei pH 7,2. Der Assay könnte auch leicht durchgeführt werden, unter Verwendung eines Avidin-Biotin oder Streptavidin-Biotin signalerzeugendem Systems.
Figur 1 veranschaulicht die Werte von dem immunoenzymetrischen doppelbindigen Sandwich Assay für Human GM-CSF unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die von BVD2-21C11.3 und BVD2-23B6.4 gebildet worden sind. Wie aus den Werten ersichtlich, ist diese Ausführungsform der Erfindung befähigt, Human GM-CSF mit Spiegeln von 20 pg/ml oder weniger zu bestimmen. (Der Einsatz ist eine Vergrößerung des Bereichs nahe Null.)
Die Beschreibungen der vorangehenden Ausführungsformen der Erfindung sind zur Veranschaulichung und Beschreibung gemacht worden. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die präzisen offenbarten Formen, beschränken, offensichtlich sind viele Abwandlungen und Variationen im Licht der obigen Lehre möglich. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prizipien der Erfindung und ihrer praktischen Anwendung am besten zu erklären, um dadurch andere Fachleute zu befähigen, den größt möglichen Nutzen aus der Erfindung zu ziehen, in unterschiedlichen Ausführungsformen und mit unterschiedlichen Abwandlungen, wie sie für die ins Auge gefaßte besondere Verwendung angemessen sind. Es ist vorgesehen, daß der Umfang der Erfindung durch die Ansprüche im Anhang definiert wird.
Die Anmelder haben die Hybridome BVD2-5A2.4, BVD2-23B6.4 und BVD2-21C11.3 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 beziehungsweise HB9569 hinterlegt. Diese Hinterlegunden wurden unter den Bedingungen gemacht, wie sie von ATCC für die Hinterlegung von Kulturen für Patentzwecke vorgesehen sind, wodurch sichergestellt ist, daß die Hinterlegungen dem Präsident des US-Patent- und Warenzeichenamtes zugänglich gemacht werden, gemäß 35 USC 122 und 37 CSR 1,14, und daß sie der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden, bei der Erteilung eines US-Patents, das die Aufrechterhaltung der Hinterlegungen fordert. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Arten darf nicht als eine Lizenz angesehen werden, die Erfindung in Zuwiderhandlung der unter der Autorität irgendeiner Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentrechten gewährten Rechte zu gebrauchen.
Die Hinterlegung ist abgeändert worden, um mit den Forderungen des Budapester Vertrags über die Hinterlegung von Mikroorganismen übereinzustimmen.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der für den Granulocyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor spezifisch ist, wobei der monoklonale Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, das aus denjenigen ausgewählt ist, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind.

2. Hybridom, ausgewählt aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs- Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, und dessen Nachkommen, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren.

3. Polypeptid, umfassend eine variable Region der leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert ist, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs- Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist.

4. Polypeptid, umfassend eine variable Region der schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert ist, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs- Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist.

5. Bindende Zusammensetzung, die für den Human-Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor spezifisch ist, umfassend eine variable Region der schweren Kette und eine variable Region der leichten Kette aus einem monoklonalen Antikörper, der durch ein Hybridom produziert ist, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist.

6. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Human-GM-CSF in einer Probe, bei der vermutet wird, daß sie Human- GM-CSF enthält, umfassend die Schritte

des Bereitstellens eines ersten monoklonalen Antikörpers, der für eine erste antigene Determinante auf Human-GM-CSF spezifisch ist, wobei der erste monoklonale Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist;

des Bereitstellens eines zweiten Antikörpers, der aus der aus einer polyklonalen Antikörper-Zusammensetzung, die für Human-GM-CSF spezifisch ist, und einem zweiten monoklonalen Antikörper, der für eine zweite antigene Determinante auf Human-GM-CSF spezifisch ist, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die zweite antigene Determinante von der ersten antigenen Determinante verschieden ist und der zweite monoklonale Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist;

des Bereitstellens eines signalerzeugenden Mittels, das in seiner Arbeitsweise entweder mit dem ersten monoklonalen Antikörper oder mit dem zweiten Antikörper in Verbindung steht, um ein Signal zu erzeugen, dessen Intensität mit der Menge entweder des ersten monoklonalen Antikörpers oder der des zweiten Antikörpers in Beziehung steht;

des Bindens entweder des ersten monoklonalen Antikörpers oder des zweiten Antikörpers an ein Träger-Mittel zur Bildung eines Antikörper-Träger-Konjugats;

des In-Berührung-Bringens der Probe mit dem Antikörper- Träger-Konjugat, so daß Human-GM-CSF in der Probe sich an das Antikörper-Träger-Konjugat bindet;

ENTWEDER des In-Berührung-Bringens des ersten monoklonalen Antikörpers, der arbeitsmäßig mit dem signalerzeugenden Mittel in Verbindung steht, mit dem an das Antikörper-Träger-Konjugat gebundenen Human-GM-CSF, unter der Voraussetzung, daß das Antikörper-Träger-Konjugat den zweiten Antikörper umfaßt;

ODER des In-Berührung-Bringens des zweiten Antikörpers, der arbeitsmäßig mit dem signalerzeugenden Mittel in Verbindung steht, mit dem an das Antikörper-Träger-Konjugat gebundenen Human-GM-CSF, unter der Voraussetzung, daß das Antikörper-Träger-Konjugat den ersten monoklonalen Antikörper umfaßt;

und des Messens des von dem signalerzeugenden Mittel erzeugten Signals.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Antikörper-Träger- Konjugat den ersten monoklonalen Antikörper umfaßt und der zweite Antikörper die für Human-GM-CSF spezifische polyklonale Antikörper-Zusammensetzung ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Antikörper-Träger- Konjugat den zweiten Antikörper umfaßt und der zweite Antikörper die für Human-GM-CSF spezifische polyklonale Antikörper-Zusammensetzung ist.

9. Kit zum Nachweis der Anwesenheit von Human-GM-CSF in einer Probe, bei der vermutet wird, daß sie Human-GM-CSF enthält, umfassend

einen ersten monoklonalen Antikörper, der für eine erste antigene Determinante auf Human-GM-CSF spezifisch ist, wobei der erste monoklonale Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs- Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist;

einen zweiten Antikörper, der aus der aus einer polyklonalen Antikörper-Zusammensetzung, die für Human-GM- CSF spezifisch ist, und einem zweiten monoklonalen Antikörper, der für eine zweite antigene Determinante auf Human-GM-CSF spezifisch ist, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die zweite antigene Determinante von der ersten antigenen Determinante verschieden ist und der zweite monoklonale Antikörper durch ein Hybridom produziert wird, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs- Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist;

ein Träger-Mittel; und

ein signalerzeugendes Mittel.

10. Kit nach Anspruch 9, worin das signalerzeugende Mittel ein Enzym umfaßt, das arbeitsmäßig mit dem ersten monoklonalen Antikörper in Verbindung steht.

11. Kit nach Anspruch 10, worin das Enzym aus der aus Peroxidase, β-Galactosidase und alkalischer Phosphatase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

12. Kit nach Anspruch 9, worin das signalerzeugende Mittel einen ersten monoklonalen Antikörper umfaßt, der mit Biotin und Streptavidin oder Avidin derivatisiert ist und mit einer Mehrzahl von Enzymen oder einem fluoreszierenden organischen Molekül arbeitsmäßig in Verbindung steht.

13. Immunreinigungs-Verfahren zur Extraktion von Human-GM- CSF aus einer Human-GM-CSF enthaltenden Probe, wobei die Probe durch eine Immunoadsorbens-Säule hindurchgeleitet wird, die einen monoklonalen Antikörper umfaßt, der durch ein Hybridom produziert ist, das aus denjenigen, die bei der American Type Culture Collection unter den Zugangs-Nummern HB9567, HB9568 und HB9569 hinterlegt worden sind, einschließlich der Abkömmlinge, Varianten und Mutanten desselben, die befähigt sind, die monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 zu produzieren, ausgewählt ist.