DE69114361T2 - Monoklonaler Antikörper, der Membran-Phopholipase A2 erkennt und Immuntest für Membran-Phospholipase A2. - Google Patents
Monoklonaler Antikörper, der Membran-Phopholipase A2 erkennt und Immuntest für Membran-Phospholipase A2.Info
- Publication number
- DE69114361T2 DE69114361T2 DE69114361T DE69114361T DE69114361T2 DE 69114361 T2 DE69114361 T2 DE 69114361T2 DE 69114361 T DE69114361 T DE 69114361T DE 69114361 T DE69114361 T DE 69114361T DE 69114361 T2 DE69114361 T2 DE 69114361T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- pla2m
- immunoassay
- ferm
- membrane phospholipase
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- -1 fatty acid acyl ester Chemical class 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 206010037575 Pustular psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical group 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000000954 inflammatory inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002311 liver mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, die Membran-Phospholipase A&sub2; erkennen, Hybridome, die diese monoclonalen Antikörper produzieren, ein Verfahren zur Herstellung der monoclonalen Antikörper und Immuntests, unter Verwendung dieser monoclonalen Antikörper.
- Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) (EC 3.1.1.4) ist ein Enzym, das den Fettsäureacylester hydrolysieren kann, der an der sn-2- Position von Glycerophospholipiden gebunden ist. Es ist bekannt, daß das Enzym in der Bauchspeicheldrüse oder in Schlangengift vorkommt, und es wurde beobachtet, daß die Menge der pankreatischen PLA&sub2; im Blut von Patienten ansteigt, die an Bauchspeicheldrüsenentzündung leiden (Ogawa et al., Gendai Iryou 20 (1988), 3013-3017). PLA&sub2; komme jedoch nicht nur im externen Sekretionssystem vor, sondern wurde in fast allen Zellen des lebenden Körpers gefunden, obwohl die Menge davon sehr klein ist (Van den Bosch H. in Phospholipids (1982), 313- 357 (Hawthrone J.N. und Ansell G.B., Hrsg.), Elsevier/North- Holland Biomedical Press, Amsterdam) . Es wird angenommen, daß das Enzym eine wichtige Rolle bei der metabolischen Regulation der Membranphospholipide und bei der Eicosanoid-Biosynthese über Arachidonsäure spielt (Van den Bosch H., Biochim. Biophys. Acta 604 (1980), 191-246), und daß es entweder durch direkte Wirkung oder über seine Metabolite, wie Lysophospholipide, Leukotriene, Blutplättchen-Aktivierungsfaktor und Lipidperoxide, mit einer Entzündung bzw. Zellverletzung in Beziehung steht (Vadas P. et al., Lab Invest. 55 (1986), 391- 404).
- Durch Analyse der Proteinprimärstruktur wurde festgestellt, daß die aus einer Membranfraktion der menschlichen Milz isolierte Membran-PLA&sub2; (PLA&sub2;M) ein PLA&sub2;-Typ ist, der sich von der pankreatischen PLA&sub2; unterscheidet (Kanda A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163 (1989), 42-48), und es wurde ebenfalls festgestellt, daß PLA&sub2;M durch einen Entzündungsvermittler, wie IL-1 und INF, induziert und aus den Zellen sezerniert wurde (Nakano T. et al., FEBS Lett. 261 (1990), 171-174) . Außerdem ergab ein Vergleich zwischen PLA&sub2;M und PLA&sub2;, die aus synovialer Flüssigkeit bei rheumatoider Arthritis gereinigt wurden, daß sie hinsichtlich ihrer Struktur und Reaktivität identisch sind (Kramer R.M. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 5768-5775).
- Dejong et al. beschreiben in European J. Biochem. 164 (1987), 129-135, monoclonale Antikörper, die gegen membrangebundene Phospholipase A&sub2; aus Rattenleber-Mitochondrien gebildet wurden. Die monoclonalen Antikörper zeigen Kreuzreaktivität mit cytosolischer Phospholipase A&sub2; der Rattenleber und mit solubilisierter Phospholipase A&sub2; aus Blutplättchen von Ratten.
- Von einem klinischen Gesichtspunkt wurde im Blut von Patienten mit einer infektiöse Erkrankung, wie Blutvergiftung, Psoriasis pustulosa, Crohn-Krankheit und rheumatoide Arthritis, ein Anstieg der PLA&sub2;-Enzymaktivität festgestellt. Ferner wurde festgestellt, daß die PLA&sub2;-Enzymaktivität durch intrakutane Injektion von Bakterien, Viren oder anderen entzündlichen Induktoren in ein Tier induziert wird (Vadas P. et al., a.a.O.).
- Bis jetzt erschien kein Bericht, der die Analyse von PLA&sub2;M betrifft, und es wurde noch nicht gezeigt, ob ein Anstieg der PLA&sub2;-Enzymaktivität, der die vorstehend erwähnten Erkrankungen begleitet, durch PLA&sub2;M verursacht wird oder nicht.
- Da die PLA&sub2;-Enzymaktivität, wie vorstehend beschrieben, im Blut von Patienten erhöht ist, die an Rheuma, Blutvergiftung, Psoriasis pustulosa, Crohn-Krankheit und ähnlichem leiden, wurde erwartet, daß die Diagnose dieser Erkrankungen durch die Messung von PLA&sub2;M erfolgen kann, und ein Test auf PLA&sub2;M wurde gewünscht.
- Deshalb ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, monoclonale Antikörper bereitzustellen, die in einem Immuntest auf Membran-Phospholipase A&sub2; verwendet werden können.
- Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von monoclonalen Antikörpern gelöst, die Membran-Phospholipase A&sub2; erkennen, nämlich die monoclonalen Antikörper PL-49, PL-71, PL-76 und PL-78. Die Membran-Phospholipase A&sub2; stammt vorzugsweise aus der menschlichen Milz. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Hybridome bereit, die die monoclonalen Antikörper produzieren. Die monoclonalen Antikörper können durch Züchten der Hybridome in der Bauchhöhle der Maus und durch Abtrennen der monoclonalen Antikörper aus der sich in der Bauchhöhle ansammelnden Ascitesflüssigkeit hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Immuntest auf Membran- Phospholipase A&sub2; bereit, wobei man die monoclonalen Antikörper verwendet. Der bevorzugte Immuntest ist ein Radioimmuntest. Bei einem Sandwich-Immuntest wird ein Enzymimmuntest bevorzugt.
- Der Immuntest auf PLA&sub2;M unter Verwendung der monoclonalen Antikörper ist nicht nur zur Diagnose von Gelenkrheumatismus nützlich, sondern auch zur Diagnose von Krebserkrankungen und einer Vielzahl von entzündlichen Zuständen, einschließlich einer äußerlichen Wunde.
- Figur 1 zeigt eine Kalibrierungskurve für PLA&sub2;M im Sandwich-Test, wobei ein PL-78- und PL-71-Peroxidasekonjugat verwendet wurde.
- Figur 2 zeigt ein Chromatogramm, das bei der Gelfiltration einer ¹²&sup5;I-markierten Lösung von PLA&sub2;M erhalten wurde.
- Figur 3 zeigt eine Standardkurve im RIA von PLA&sub2;M.
- Figur 4 zeigt eine Verdünnungskurve für menschliche Seren.
- Figur 5 stellt die Ergebnisse der Ionenaustauschchromatographie von Standard-PLA&sub2;M und Seren aus Patienten mit Gelenkrheumatismus dar.
- Figur 6 zeigt die Konzentrationen von PLA&sub2;M in Seren aus normalen Individuen, Patienten mit Gelenkrheumatismus, Patienten mit Krebs und aus Patienten mit einer äußerlichen Wunde.
- Die vorliegende Erfindung stellt monoclonale Antikörper bereit, die Membran-Phospholipase A&sub2; erkennen. Die Membran- Phospholipase A&sub2; stammt vorzugsweise aus der menschlichen Milz, wie in Biochem. Biophys. Res. Commun. Bd. 163, Nr. 1 (1989), 42-48, beschrieben Bei der vorliegenden Erfindung wurden der monoclonale Antikörper PL-49, der monoclonale Antikörper PL-71, der monoclonale Antikörper PL-76 und der monoclonale Antikörper PL-78, wie nachstehend ausführlich in Beispielen beschrieben, erhalten.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner Hybridome bereit, die die entsprechenden, vorstehend beschriebenen, monoclonalen Antikörper produzieren. Die Hybridome PL-49, PL-71, PL-76 und PL-78 können jeweils die monoclonalen Aftikörper PL-49, PL-71, PL-76 und PL-78 produzieren. Hybridom PL-49, Hybridom PL-71, Hybridom PL-76 und Hybridom PL-78 wurden am 9. Mai 1990 gemäß dem Budapester Vertrag im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305 Japan, hinterlegt, und jeweils bezeichnet als Maushybridom PL-49 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2891, Maushybridom PL-71 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2892, Maushybridom PL-76 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2889 und Maushybridom PL-78 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2890.
- Die vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper können durch Züchten der entsprechenden, vorstehend beschriebenen, Hybridome in der Bauchhöhle der Maus und durch Abtrennen der monoclonalen Antikörper aus der sich in der Bauchhöhle ansammelnden Ascitesflüssigkeit hergestellt werden
- Die vorstehende Erfindung stellt auch einen Immuntest auf Membran-Phospholipase A&sub2; bereit, wobei man die vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper verwendet. Der bevorzugte Immuntest ist ein Radioimmuntest. Für einen Immuntest, bei dem die Membran-Phospholipase A&sub2; im Sandwich-Verfahren von zwei verschiedenen Arten der vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper gebunden wird, wird ein Enzymimmuntest bevorzugt.
- Herstellung monoclonaler Antikörper gegen Membran-PLA&sub2; (PLA&sub2;M)
- Das Verfahren zur Produktion von PLA&sub2;M, das bei der Immunisierung und der Analyse der Antikörper verwendet wird, entsprach der Beschreibung in Biochem. Biophys. Res. Commun. Bd. 163, Nr. 1 (1989), 42-48.
- Eine Lösung von PLA&sub2;M in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde mit vollständigem Freundschen Adjuvans (FCA) gemischt, wobei eine Emulsion im Verhältnis von 1:1 erzeugt wurde. Die Emulsion wurde acht Mäusen (Balb/C, weiblich, 12 Wochen alt) subkutan in einer Dosis verabreicht, die 2 ug Protein pro Maus entsprach.
- Sie wurde 23 Tage nach der ersten Immunisierung auf die gleiche Weise wie die erste Immunisierung durchgeführt.
- Sie wurde 44 Tage nach der zweiten Immunisierung auf die gleiche Weise wie die erste Immunisierung durchgeführt.
- Sie wurde 81 Tage nach der dritten Immunisierung auf die gleiche Weise wie die erste Immunisierung durchgeführt.
- Die Menge des anti-PLA&sub2;M-Antikörpers im Blut der immunisierten Tiere wurde mit einem ELISA-Test bestimmt. Dabei wurden jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte 0,5 ng PLA&sub2;M in 0,1 ml 0,1 M NaHCO&sub3; zugegeben und man ließ die Platte bei 4ºC über Nacht zum Beschichten stehen. Danach wurden 0,3 ml 1%iges Rinderserumalbumin (BSA) in PBS da zugegeben und das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert, um die freien Bindungsstellen der Platte zu blockieren. Dann wurden 0,05 ml einer Probe zugegeben und man ließ die Reaktion bei 37ºC eine Stunde ablaufen, gefolgt von einem Test mit einem Vectastain -ABC-Kit(Maus-IgG-Kit, Vector Laboratories, Inc.), gemäß dem Protokoll. Als Farbbildner wurde 1 mg/ml ortho-Phenylendiamin (OPD) verwendet und die Absorptionsunterschiede bei 492 nm und bei 600 nm wurden mit einem Corona-Mikroplatten-Photometer MIP-22 bestimmt. Zur Hybridomherstellung wurden Mäuse verwendet, die einen hohen PLA&sub2;M-Antikörpertiter zeigten.
- Einunddreißig Tage nach der vierten Immunisierung wurde eine fünfte Immunisierung durchgeführt. Vier Mikrogramm PLA&sub2;M wurden in 0,2 ml PBS gelöst und die erhaltene Lösung wurde den Mäusen intraperitoneal verabreicht. Drei Tage nach der fünften Immunisierung wurde eine Zellfusion durchgeführt. Das Verfahren für die Zellfusion entsprach im wesentlichen dem Verfahren von Galfre und Milstein (Methods Enzymol. 73 (1981), 46) . Dabei wurden Maus-Myelomzellen (P3X63-Ag8.653) in einem RPMI- 1640-Medium (90% RPMI-1640, 10% foetales Kälberserum, 0,15 mg/ml Natriumpyruvat, 0,15 mg/ml Oxalessigsäure und 0,1 mg/ml Kanamycin) gezüchtet. Von der erhaltenen Kultur wurden 4,67 x 10&sup7; Maus-Myelomzellen geerntet und mit 9,33 x 10&sup7; Milzzellen der immunisierten Mäuse gemischt, und die vereinigten Zellen wurden durch Zentrifugation in einem Zentrifugenröhrchen pelletiert und 1 ml einer 48%igen Polyethylenglykol 400-Lösung wurde innerhalb 1 Minute zugetropft. Das Gemisch wurde dann 1,5 Minuten gerührt, gefolgt von der langsamen, tropfenweise Zugabe eines serumfreien RPMI-1640-Mediums in einer Menge von 2 ml in einem Zeitraum von 2 Minuten, 2 ml in 1 Minute und 6 ml in 2 Minuten unter Rühren. Schließlich wurden 15 ml des gleichen Mediums vorsichtig zugegeben und das Gemisch wurde durch Zentrifugation pelletiert. Die erhaltenen Pellets wurden in HAT-Medium (70% RPMI-1640, 10% NCTC109, 20% foetales Kälberserum, 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 x 10&supmin;&sup7; Aminopterin, 1,6 x 10&supmin;&sup5; Thymidin, 0,15 mg/ml Natriumpyruvat, 0,15 mg/ml Oxalessigsäure, 0,2 IU/ml Insulin, 2,5 x 10&supmin;&sup4; M 2-Mercaptoethanol, 5 x 10&supmin;³ M HEPES, 0,1 mg/ml Kanamycin und nichtessentielle Aminosäuren) suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Konzentration von 0,75 x 10&sup6; Milzzellen pro Milliliter eingestellt und dann in Portionen von 0,2 ml in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Die Platten wurden in 95% Luft und 5% CO&sub2; bei einer Temperatur von 37ºC und einer Feuchtigkeit von 95% oder mehr inkubiert, und das Medium wurde, wenn notwendig, zur Hälfte durch frisches HAT-Medium ersetzt.
- Fünfunddreißig Tage nach der vierten Immunisierung wurde auf die gleiche Weise wie in Experiment 1 eine fünfte Immunisierung durchgeführt. Drei Tage nach der fünften Immunisierung wurde eine Zellfusion durchgeführt. Als Maus-Myelomzellstamm wurden P3X63-Ag.8653-Zellen in einer Konzentration von 8,89 x 10&sup7; auf die gleiche Weise wie in Experiment 1 für die Zellfusion mit 1,7 x 10&sup8; Milzzellen verwendet. Die der Zellfusion unterzogenen Zellen wurden in HAT-Medium suspendiert, um eine Konzentration von 0,63 x 10&sup5; Zellen/ml zu erhalten. Die Suspension wurde in Portionen von 0,2 ml in jede Vertiefung der Platten min 96 Vertiefungen aufgeteilt, gefolgt von einer Inkubation wie in Experiment 1.
- Nach etwa zwei Wochen wurde der Kulturüberstand der gezüchteten Hybridome auf die Produktion von anti-PLA&sub2;M-Antikörpern untersucht. Der Test wurde auf die gleiche Weise wie under Punkt (2) durchgeführt. Durch das Screening wurden vier Hybridome (PL-49, PL-71, PL-76 und PL-78) erhalten, wobei jedes stabil einen Antikörper mit einer spezifischen Reaktivität mit PLA&sub2;M produzierte.
- Die vorstehend erwähnten vier Hybridomzellen wurden durch ein Grenzverdünnungsverfahren cloniert. Dabei wurde jedes Hybridom in RPMI-1640-Medium suspendiert und die Suspension wurde jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 0,3 Zellen in 0,2 ml zugegeben, gefolgt von einer Inkubation. Der anti-PLA&sub2;M-Antikörpertiter des Kulturüberstandes wurde auf die gleiche Weise wie unter Punkt (4) bestimmt. Die anti-PLA&sub2;M-Antikörper-produzierenden Hybridome wurden selektiert und gezüchtet, danach wurden sie durch Einfrieren in einer Gefrierlösung (90% foetales Kälberserum und 10% Dimethylsulfoxid) gelagert.
- Jeder Gruppe von Mäusen (Balb/C, weiblich, 10-15 Wochen alt), denen 7 bis 10 Tage vorher intraperitoneal 0,5 ml Pristan verabreicht worden war, wurde intraperitoneal eine Suspension jeder der Hybridomzellen in PBS (2-5 x 10&sup5; Zellen/ml) in einer Dosis von 0,5 ml pro Maus verabreicht. Nach etwa einer Woche sammelte sich in den jeweiligen Mäusen Ascitesflüssigkeit an, die durch ein Punktionsverfahren gesammelt wurde. Aus der gesammelten Ascitesflüssigkeit wurden vorhandene Präzipitate durch Zentrifugation unter Verwendung eines Separapid-Röhrchens (SEKISUI KAGAKU) entfernt. Die so behandelte Ascitesflüssigkeit wurde aufgeteilt und durch Einfrieren gelagert.
- Die Immunglobulinklasse und -unterklasse der durch die jeweiligen Hybridome produzierten monoclonalen Antikörper wurde durch ELISA bestimmt. Für die Bestimmung wurde ein Maus- MonoAb-ID-EIA-Kit (Zymed Co., Ltd.) verwendet. Bei allen vier Hybridomen, PL-49, PL-71, PL-76 und PL-78, wurden die auf diese Weise produzierten Immunglobuline als IgG&sub1; (γl, κ) identifiziert.
- Die monoclonalen Antikörper wurden unter Verwendung eines Affigel -Protein-A-MAPS-II-Kits (Bio-Rad Co., Ltd.) gemäß dem Protokoll aus der Ascitesflüssigkeit gereinigt.
- Gemäß dem Verfahren von Nakane et al. (J. Histochem. Cytochem. 22 (1974), 1084) wurde eine Konjugat von PL-71 mit Meerrettichperoxidase hergestellt. Zuerst wurde 0,1 ml 0,1 M NaIO&sub4; mit Peroxidase (2 mg/0,5 ml in Wasser) gemischt und das Gemisch ließ man bei Raumtemperatur 20 Minuten reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4ºC über Nacht gegen 1 mM Natriumacetatpuffer dialysiert und dann mit 0,2 M Na&sub2;CO&sub3; auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt, gefolgt von der Zugabe von PL-71 (4 mg/ml in 0,01 M NaHCO&sub3;) . Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und 50 ul NaBH&sub4; (4 mg/ml in Wasser) wurden dazu gegeben. Das Gemisch wurde ebenfalls 2 Stunden bei 4ºC gerührt und bei 4ºC über Nacht gegen PBS dialysiert, wobei das gewünschte Konjugat gewonnen wurde.
- Jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurde eine Lösung des monoclonalen Antikörpers (PL-78) zugegeben (für jede Vertiefung in einer Konzentration von 0,1 ug in 0,1 ml NaHCO&sub3;). Nachdem man die Platte über Nacht bei 4ºC stehen ließ, wurden der Platte 0,3 ml PBS, das 1% BSA enthielt, zugegeben, die dann 1 Stunde bei 37ºC inkubiert wurde, wodurch die freien Bindungsstellen der Platte blockiert wurden. Danach wurden der Platte 0,05 ml PLA&sub2;M-Lösung (1% BSA in PBS) zugeben und man ließ die Reaktion 1 Stunde bei 37ºC ablaufen. Dann wurden der Platte 0,05 ml einer 1000fachen Verdünnung des Peroxidase-Konjugats mit dem monoclonalen Antikörper PL-71 zugegeben und man ließ die Reaktion 2 Stunden bei 37ºC ablaufen. Danach wurde der Platte ortho-Phenylendiamin (in einer Konzentration von 1 mg in 0,1 ml 0,1 M Citratpuffer, pH 4,2) und H&sub2;O&sub2; (in einer Endkonzentration von 0,03%) zugeben und man ließ die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Schließlich wurde die Reaktion durch die Zugabe von 0,1 ml 1 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt und die Absorptionsunterschiede bei 492 nm und bei 660 nm wurden gemessen. Figur 1 zeigt eine Kalibrierungskurve von PLA&sub2;M im Sandwich-Test, wobei PL-78 und das Peroxidase-Konjugats mit PL-71 verwendet wurden. Die Empfindlichkeit für den Nachweis von PLA&sub2;M durch das vorliegende Verfahren betrug etwa 0,01 ng/Vertiefung (vgl. Figur 1).
- Radioimmuntest (RIA) auf Membran-Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;M)
- ¹²&sup5;I-markierte PLA&sub2;M wurde mit einem Chloramin-T-Verfahren gemäß dem Hunter-Greenwood-Verfahren (Nature 194 (1962), 495-496) erhalten.
- PLA&sub2;M-Lösung: 111 ug/ml in 0,5 M Phosphatpuffer (PB) (pH 7,4);
- Na¹²&sup5;I-Lösung: 3,7 GBq/ml in verdünnter NaOH-Lösung (pH 7-11);
- Chloramin-T-Lösung: 2 mg/ml in 0,5 M PB (pH 7,4);
- Natriumpyrosulfit-Lösung: 2,5 mg/ml in 0,1 ml PB (pH 7,4); und BSA: 10 mg/ml in 0,1 M PB (pH 7,4).
- Zuerst wurden 25 ul 0,5 M PB (pH 7,4) und 22,5 ul der PbA&sub2;M-Lösung in ein Polypropylenröhrchen gefüllt, danach wurden 2,5 ul der Na ¹²&sup5;I-Lösung hinzugefügt und die Inhalte wurden gut miteinander vermischt. Dann wurden auch 2,5 ul der Chloramin-T-Lösung zugeben und die Inhalte wurden 50 Sekunden bei Raumtemperatur gerührt. Diesem Röhrchen wurden ferner 12,5 ul der Natriumpyrosulfit-Lösung hinzugefügt und die Inhalte wurden gerührt, danach wurden 2,5 ul BSA und 2,5 ul der Kaliumiodidlösung zugegeben, und die Inhalte wurden gut miteinander vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde dann einer Gelfiltration unterzogen (die Säule war PD-10 (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.); der Eluent war 0,1 M PB (pH 7,5), das 0,5 M Natriumchlorid, 0,5% BSA und 0,05% Natriumazid enthielt) und 1 ml-Fraktionen des Eluats wurden gesammelt Die Radioaktivität jeder Fraktion wurde mit Hilfe eines Vertiefungs-Szintiallationszähler gemessen. Die erhaltenen Chromatogramme sind in Figur 2 dargestellt. Fraktion Nr. 4 in dieser Figur wurde identifiziert als ¹²&sup5;I-markierte PLA&sub2;M.
- PLA&sub2;M-Standardlösung: 0,2-200 ng/ml Testpuffer;
- Ascitesverdünnungen: 680,000-, 470,000-, 860,000- und 2300,000-fache Verdünnungen von PL-49, PL-71, PL-76 bzw. PL-78 mit dem Testpuffer;
- ¹²&sup5;I-markierte PLA&sub2;M-Lösung: eine Verdünnung der unter Punkt (1) beschriebenen markierten Lösung mit dem Testpuffer (2 x 10&sup6; cpm/ml);
- Immunobead-Flüssigkeit: eine Suspension des Kaninchen-anti- Maus-Immunglobulin-gebundenen Polyacrylamidgels (hergestellt von Bio-Rad Co., Ltd.) im Testpuffer (1 mg/ml); und
- Testpuffer: 0,1 M PB (pH 7,5) mit 0,5 M Natriumchlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,5% BSA und 0,02% Natriumazid.
- Zuerst wurden 100 ul der PLA&sub2;M-Standardlösung oder einer Serumprobe in ein Polypropylenröhrchen gefüllt, danach wurden 275 ul des Testpuffers und 25 ul der ¹²&sup5;I-markierten PLA&sub2;M-Lösung zugegeben, und die Inhalte wurden gut miteinander vermischt. Dann wurden auch 100 ul der Verdünnung der Ascitesflüssigkeit zugegeben und die Inhalte wurden 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Zu diesem Röhrchen wurden ferner 100 ul der Immunobead-Flüssigkeit gegeben und die Inhalte wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Zentrifugation (2000 x g, 10 Min.) . Nach dem Entfernen des Überstandes durch Absaugen wurde die Radioaktivität des Präzipitates mit Hilfe eines Vertiefungs-Szintillationszähler gemessen. Die Konzentration von PLA&sub2;M in der Serumprobe wurde bezogen auf die Ablesungen aus einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung der PLA&sub2;M-Standardlösung erhalten wurde.
- Figur 3 zeigt eine Standardkurve, die im RIA erhalten wurde, wenn PL-49 als Ascitesflüssigkeit verwendet wurde. Andere Ascitesflüssigkeiten ergaben ähnliche Kompetitionskurven. Die Empfindlichkeit (d.h. die Konzentration, um eine Hemmung von 90% zu erreichen) betrug für PL-49 0,3 ng/ml, für PL-71 1,1 ng/ml, für PL-76 0,9 ng/ml und für PL-78 0,2 ng/ml, wobei alle Werce als höchst empfindlich angesehen wurden.
- Wie in Figur 4 dargestellt, zeigen alle Verdünnungskurven, die mit dem vorliegenden Verfahren für menschliche Seren erhalten wurden, eine gute lineare Regression und die Seren scheinen keinen Einfluß auf die Kurven zu haben.
- Außerdem wurde bei dem vorliegenden Verfahren keine Kreuzreaktion der menschlichen Pankreas-PLA&sub2; beobachtet.
- Ergänzend hierzu wurden Standard-PLA&sub2;M und Seren aus Patienten mit Gelenkrheumatismus einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen (Säule war S-Sepharose -Fast-Flow-Typ (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.); Eluent war 50 mM Tris- Puffer (pH 7,0) min einem linearen Gradienten, der 0,2 bis 1 M Nacriumchlorid und 0,1% CHAPS (hergestellt von Dotite Co., Ltd.) enthielt). Das Eluat wurde fraktioniert und die in jeder Fraktion vorliegende PLA&sub2;M wurde mit dem vorliegenden Verfahren gemessen. Die Ergebnisse ergaben ein Chromatogramm, wie in Figur 5 dargestellt, das zeigt, daß das Muster des mit Standard-PLA&sub2;M erhaltenen Chromatogramms eine gute Übereinstimmung mit dem Chromatogramm aufweist, das mit Seren aus Patienten erhalten wurde.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das vorliegende Verfahren in einem spezifischen Test auf in menschlichen Seren vorhandene PLA&sub2;M anwendbar ist.
- Erfindungsgemäß wurden verschiedene Seren aus normalen Individuen, Patienten mit Gelenkrheumatismus, Patienten mit Krebs und aus Patienten mit einer äußerlichen Wunde, in einer unverdünnten oder geeignet mit Testpuffer verdünnten Form, dem Test auf PLA&sub2;M unterzogen. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, zeigten viele der Serumproben aus Patienten mit Gelenkrheumatismus, Patienten mit Krebs und aus Patienten mit einer äußerlichen Wunde eine höhere Menge von PLA&sub2;M als Serumproben aus normalen Individuen. Dies zeigt, daß die vorliegende Erfindung zur Diagnose von Gelenkrheumatismus und Krebserkrankungen nützlich ist.
Claims (9)
1. Monoclonale Antikörper, die Membran-Phospholipase A&sub2;
erkennen und aus den Hybridomzellinien mit den
Hinterlegungsnummern FERM BP-2891, FERM BP-2892, FERM BP-2889
oder FERM BP-2890 erhältlich sind.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei die
Membran-Phospholipase A&sub2; aus menschlicher Milz stammt.
3. Hybridomzellinien, die die monoclonalen Antikörper nach
Anspruch 1 oder 2 produzieren und die
Hinterlegungsnummern FERM BP-2891, FERM BP-2892, FERM BP-2889 oder FERM
BP-2890 aufweisen.
4. Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers
nach Anspruch 1 oder 2, wobei man ein Hybridom nach
Anspruch 3 in der Bauchhöhle der Maus züchtet; und
den monoclonalen Antikörper von der sich in der
Bauchhöhle ansammelnden Ascitesflüssigkeit abtrennt.
5. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzellinie, die
einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2
produziert, wobei man Mäuse mit Membran-Phospholipase A&sub2;
immunisiert, Zellen, die Antikörper produzieren können
und aus den immunisierten Mäusen erhalten werden, mit
Myelomzellen fusioniert und die so erhaltenen
Hybridomzellen auf die Produktion eines derartigen Antikörpers
testet.
6. Immuntest auf Membran-Phospholipase A&sub2;, wobei man einen
monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2
verwendet.
7. Immuntest nach Anspruch 6, der ein Radioimmuntest ist.
8. Immuntest nach Anspruch 6, wobei die
Memhran-Phospholipase A&sub2; im Sandwich-Verfahren von zwei verschiedenen
Arten der monoclonalen Antikörper gebunden wird.
9. Immuntest nach Anspruch 8, der ein Enzymimmuntest ist.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2142462A JP2984029B2 (ja) | 1990-05-30 | 1990-05-30 | 膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼を認識するモノクローナル抗体および膜型ホスホリパーゼａ▲下２▼の免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69114361D1 DE69114361D1 (de) | 1995-12-14 |
| DE69114361T2 true DE69114361T2 (de) | 1996-04-18 |
Family
ID=15315881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69114361T Expired - Fee Related DE69114361T2 (de) | 1990-05-30 | 1991-05-29 | Monoklonaler Antikörper, der Membran-Phopholipase A2 erkennt und Immuntest für Membran-Phospholipase A2. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5358849A (de) |
| EP (1) | EP0459450B1 (de) |
| JP (1) | JP2984029B2 (de) |
| KR (1) | KR100188816B1 (de) |
| AT (1) | ATE130037T1 (de) |
| DE (1) | DE69114361T2 (de) |
| DK (1) | DK0459450T3 (de) |
| ES (1) | ES2082040T3 (de) |
| GR (1) | GR3018780T3 (de) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4142552A1 (de) * | 1991-12-21 | 1993-06-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper gegen die typ i phospholipase a(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) als entzuendungshemmendes therapeutikum |
| US5767249A (en) * | 1994-06-20 | 1998-06-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoclonal antibodies against type I phospholipase A2 as a diagnostic and anti-inflammatory therapeutic agent |
| NZ298145A (en) * | 1994-12-29 | 1998-08-26 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | Monoclonal antibodies having inhibitory effect on type ii phospholipase a2, proteins forming part thereof, cells producing them, dna encoding them, recombinant vector comprising the dna and medicament |
| US20030175277A1 (en) * | 1996-09-11 | 2003-09-18 | Elizabeth Shanahan-Prendergast | Therapeutic formulations containing venom or venom anti-serum either alone or in combination for the therapeutic prophylaxis and therapy of neoplasms |
| JP2006517188A (ja) * | 2002-12-02 | 2006-07-20 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | ホスホリパーゼａ２に対する抗体及びその使用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02286081A (ja) * | 1989-04-27 | 1990-11-26 | Shionogi & Co Ltd | ヒト脾臓由来膜結合型ホスホリパーゼａ↓２ |
-
1990
- 1990-05-30 JP JP2142462A patent/JP2984029B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-29 DE DE69114361T patent/DE69114361T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-29 DK DK91108806.0T patent/DK0459450T3/da active
- 1991-05-29 ES ES91108806T patent/ES2082040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-29 AT AT91108806T patent/ATE130037T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-29 EP EP91108806A patent/EP0459450B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 KR KR1019910008931A patent/KR100188816B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-04-28 US US08/053,350 patent/US5358849A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-01-24 GR GR960400179T patent/GR3018780T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3018780T3 (en) | 1996-04-30 |
| EP0459450A3 (de) | 1991-12-11 |
| KR100188816B1 (ko) | 1999-06-01 |
| JP2984029B2 (ja) | 1999-11-29 |
| DE69114361D1 (de) | 1995-12-14 |
| KR910020035A (ko) | 1991-12-19 |
| ATE130037T1 (de) | 1995-11-15 |
| US5358849A (en) | 1994-10-25 |
| ES2082040T3 (es) | 1996-03-16 |
| EP0459450A2 (de) | 1991-12-04 |
| JPH0436193A (ja) | 1992-02-06 |
| DK0459450T3 (da) | 1995-12-11 |
| EP0459450B1 (de) | 1995-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3854194T2 (de) | Monoklonale antikörper gegen glykosyliertes albumin, hybride zellinien, die diese antikörper produzieren, sowie deren verwendung. | |
| EP0158599B1 (de) | Neue monoklonale Antikörper und Hybridoma-Zellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendungen | |
| DE3888224T2 (de) | Bestimmung vom Tumornekrosefaktor; monoklonaler Antikörper und Zusammensetzung. | |
| DE3887675T2 (de) | Antikörper. | |
| DE3783015T2 (de) | Hybridomen und monoklonale paratopische molekuele gegen apolipoprotein ai. | |
| DE3783991T2 (de) | Testverfahren und diagnostisches system zur bestimmung des abnormalen fettstoffwechsels. | |
| DE69127947T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen menschliches IgE | |
| EP0162812B1 (de) | Lymphokin in reiner Form, neue monoklonale Antikörper, Hydridoma-Zellinien, Verfahren und Anwendungen | |
| DE3751182T2 (de) | Monoklonale Antikörper, B-spezifisch für Apolipoprotein, die von zwei Hybridomen erzeugt werden. | |
| WO1999015691A1 (fr) | Procede permettant de diagnostiquer un dysfonctionnement du metabolisme osseux | |
| DE69018968T2 (de) | BLUTGERINNUNGSFAKTOR BETA XIIa MONOKLONALE ANTIKÖRPER UND IMMUNANALYSE. | |
| DE68921374T2 (de) | Monoklonaler Antikörper gegen menschliche Mangan-Superoxiddismutase, Verfahren zu dessen Herstellung, Testreagens, Kit und Testmethode unter Verwendung desselben, Verfahren zur Diagnose von menschlichem Eierstockkrebs und von Herzinfarkt. | |
| DE69112225T2 (de) | Immunodiagnostische probe für gelenkrheumatismus. | |
| DE69114361T2 (de) | Monoklonaler Antikörper, der Membran-Phopholipase A2 erkennt und Immuntest für Membran-Phospholipase A2. | |
| DE3850993T2 (de) | Monoklonaler Antikörper spezifisch gegen humane Pankreas-Phospholipase-A2. | |
| DE3686766T2 (de) | Monoklonaler antikoerper gegen glutathion s-transferase und dessen verwendung zur diagnose von krebs. | |
| EP1942116B1 (de) | Monoklonale Antikörper zur selektiven immunologischen Bestimmung von hochmolekularen, intakten Lamininformen in Körperflüssigkeiten | |
| DE3851855T2 (de) | Gegen die Gamma-Kette des T-Zell-Rezeptors gerichteter monoklonaler Antikörper. | |
| DE3743402C2 (de) | Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen | |
| DE68914345T2 (de) | Gamma-atriales, natriuretisches Polypeptid erkennende monoklonale Antikörper, solche Antikörper produzierende Hybridome und deren Herstellung und Verwendung. | |
| DE68911574T2 (de) | Reagenzsystem zur Bestimmung des Komplexes des menschlichen Plasminogenaktivator-Inhibitors und des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators und Testsatz dafür. | |
| EP0411306A1 (de) | Verfahren zum Nachweis und/oder der quantitativen Bestimmung von Komplementpeptid C5a und/oder C5adesarg | |
| EP0575906A2 (de) | Sandwich-Immunoassay für beta-N-Acetylglukosaminidase und monoklonaler Antikörper dafür | |
| DE3686068T2 (de) | Verfahren zur bestimmung von menschlicher prolyl-4-hydroxylase durch immunotest. | |
| DE60014616T2 (de) | Antikörper gegen plazentaprotein 13 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |