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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
menschlicher Prolyl-4-hydroxylase, das für die einfache
Diagnose von Lebererkrankungen nützlich ist.
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Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur
Bestimmung von menschlicher Prolyl-4-hydroxylase durch
Enzymimmuntest oder Radioimmuntest gemäß der Sandwich-Technik unter
Verwendung eines spezifischen monoclonalen Antikörpers
und/oder eines polyclonalen Antikörpers.
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Zu den bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung
menschlicher Prolyl-4-hydroxylase (nachstehend einfach als hPH
bezeichnet) im menschlichen Blut zählt ein Verfahren, wobei 4-L-
Prolin in Protokollagen, markiert mit ³H, als Substrat
verwendet, das resultierende ³H-markierte Wasser durch
Vakuumdestillation aufgefangen und dessen Radioaktivität bestimmt wird
(Hutton et al., Anal. Biochem., 16, 384-394, 1966). In anderen
bekannten Verfahren wird beispielsweise das mit ¹&sup4;C-Prolin
markierte Protokollagen als Substrat verwendet und
anschließend die Radioaktivität des resultierenden
4-hydroxylierten ¹&sup4;C-Prolin gemessen (Juva et al., Anal. Biochem. 15,
77-83, 1966); oder (Pro-Pro-Gly)&sub5; oder (Pro-Pro-Gly)&sub1;&sub0; als
Substrat verwendet und anschließend das aus
2-Oxo(1-¹&sup4;C)-glutarsäure freigesetzte ¹&sup4;CO&sub2; aufgefangen und gemessen (Berg et
al., J. Biol. Chem., 248, 1175-1182, 1973). Jedes dieser
Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß komplizierte, sehr
umfangreiche Arbeitsabläufe und zeitaufwendige Messungen
erforderlich sind. Außerdem gibt eine einfache Messung der
hPH-Aktivität im Blut nicht den wirklichen hPH-Spiegel wieder, da der
größte Teil von hPH im Blut in enzymatisch inaktiviertem
Zustand vorliegt.
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Ein bekannter Immuntest ist der von Tuderman et al. in
Eur. J. Biochem., 60, 399-405 (1975), beschriebene
Radioimmuntest, wobei hPH bestimmt wird, indem ein markiertes Antigen
für eine kompetitive Antikörper-Reaktion zwischen markierten
und nichtmarkierten Antigenen verwendet und sodann ein zweiter
Antikörper für die nachfolgende Reaktion eingesetzt wird. Da
der in dieser kompetitiven Reaktion verwendete Antikörper ein
Kaninchen-Antiserum, d.h. ein polyclonaler Antikörper gegen
hPH, ist, der weniger spezifisch ist und eine niedrige
Empfindlichkeit für hPH von 5-10 ng aufweist, ist dieses
Verfahren nicht einfach durchzuführen, wobei ein
Zentrifugationsschritt für die Abtrennung des Antigen-Antikörper-
Komplexes vom ungebundenen Antigen erforderlich ist, und daher
ist dieses Verfahren vom praktischen Standpunkt her nicht
befriedigend.
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In Chemical Abstracts, 101:70721p wird die Herstellung
von monoclonalen Antikörpern gegen die α-Untereinheit und die
β-Untereinheit von hPH beschrieben. Alle Antikörper reagierten
mit der Tetramer-Form des Enzyms.
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Unter den vorstehend beschriebenen Umständen war es
schlecht möglich, die Menge hPH auf einfache Art und Weise
mittels eines Verfahrens zur Messung der enzymatischen
Aktivität oder der Radioaktivität genau zu messen. Folglich besteht,
insbesondere auf dem Gebiet der Diagnose von
Lebererkrankungen, ein großer Bedarf an der Entwicklung eines neuen
Verfahrens zur wirksamen und genauen Bestimmung von hPH auf einfache
Art und Weise anstelle der üblichen Verfahren, die
verschiedene Nachteile aufweisen.
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Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die
Bereitstellung eines Verfahrens des Enzymimmuntests oder
Radioimmuntests von hPH, das zur Diagnose von Lebererkrankungen
anwendbar ist.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von hPH durch
Enzymimmuntest oder Radioimmuntest gemäß der Sandwich-Technik
unter Verwendung eines spezifischen monoclonalen und/oder
eines
polyclonalen Antikörpers gegen hPH ohne die damit
verbundenen Nachteile, wie sie bei den üblichen Verfahren auftreten.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von hPH durch
Enzymimmuntest oder Radioimmuntest gemäß der Sandwich-Technik
mit einer kleineren Menge Proben in einem einfachen
Arbeitsablauf.
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Als ein Ergebnis von intensiven Nachforschungen der
Erfinder zur Entwicklung eines einfachen Verfahrens zur
Bestimmung von hPH in einer direkteren und spezifischeren Art und
Weise ist jetzt gefunden worden, daß eine genaue und schnelle
Bestimmung von hPH mit einer kleineren Menge Proben nach einem
Verfahren durchgeführt werden kann, wobei ein Enzymimmuntest
(EIA) oder ein Radioimmuntest (RIA) gemäß der Sandwich-Technik
unter Verwendung eines monoclonalen und/oder polyclonalen
Antikörpers gegen hPH verwendet wird.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung von
menschlicher Prolyl-4-hydroxylase durch Enzymimmuntest oder
Radioimmuntest gemäß der Sandwich-Technik unter Verwendung
eines monoclonalen Antikörpers und eines polyclonalen
Antikörpers jeweils gegen menschliche Prolyl-4-hydroxylase
bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß der für die β-Untereinheit
der menschlichen Prolyl-4-hydroxylase spezifische monoclonale
Antikörper als Schicht auf eine Festphase aufgebracht und der
polyclonale Antikörper enzym- oder radiomarkiert wird, mit der
Maßgabe, daß im Falle eines Enzymimmuntests der polyclonale
Antikörper ein Fab'-Fragment ist.
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Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete
spezifische monoclonale Antikörper ist ein
Anti-Mensch-Prolyl-4-hydroxylase-Antikörper der IgG-Klasse, der erhalten wird, indem
ein Tier, wie z.B. eine Maus, mit hPH immunisiert wird, um ein
Hybridom aus
Anti-Mensch-Prolyl-4-hydroxylase-Antikörper-produzierenden Zellen des Tieres und Myelomzellen zu bilden, das
Hybridom cloniert wird und danach Clone, die in der Lage sind,
Anti-Mensch-Prolyl-4-hydroxylase-Antikörper herzustellen, die
eine Reaktionsfähigkeit gegen die β-Untereinheit von hPH
aufweisen, selektiert und gezüchtet werden.
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Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete
polyclonale Antikörper wird durch Immunisierung eines Tieres, z.B.
eines Kaninchens, mit hPH, Blutabnahme von dem immunisierten
Tier und Reinigung des resultierenden Antiserums erhalten.
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Als Antikörper, der mit einem Enzym oder einem
Radioisotop markiert werden soll, wird in dem erfindungsgemäßen
Verfahren eine IgG-Fraktion verwendet, die durch die
Fraktionierung eines Materials, das Antikörper enthält, mit
Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat und die anschließende Reinigung auf
einer DEAE-Zellulosesäule erhalten werden kann. Im Falle des
polyclonalen Antikörpers wird vorzugsweise eine weitere
Reinigung auf einer Sepharose -4B-Affinitätssäule durchgeführt, da
auf diese Weise die Spezifität erhöht wird. Außerdem besteht
die Möglichkeit, F(ab')&sub2;, das durch Spaltung mit Pepsin
erhalten werden kann, oder sein reduziertes Produkt Fab' zu
verwenden. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher eine solche
Ausführungsform, wobei die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten monoclonalen und polyclonalen Antikörper die
spezifischen Bindungsstellen F(ab')&sub2; oder Fab' an sich sein können.
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Die Markierung der Antikörper mit einem Isotop kann durch
bekannte Verfahren zur Markierung von Proteinen ausgeführt
werden. Isotope, die für diese Markierung verwendet werden
können, sind beispielsweise ¹²&sup5;I und ³H. Die Verwendung von
[¹²&sup5;I] als Radionuclid wird in dieser Erfindung bevorzugt. Zur
Markierung des Antikörpers mit diesem Radionuclid wird
vorzugsweise eine Iodierung mit einer Lactoperoxidase
durchgeführt, wie es von Thorell et al. in Immunochemistry 11, 203-
206 (1974), beschrieben wird. Außerdem kann für diesen Zweck
Galactosidase oder ähnliches präparativ verfügbares Material
verwendet werden.
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Die Festphase, die mit dem monoclonalen Antikörper
beschichtet werden soll, sollte normalerweise zu allen für die
Antigen-Antikörper-Reaktion verwendeten Substanzen, umfassend
einem flüssigen Träger, inert sein und wird aus vielen
verschiedenen anorganischen oder organischen inerten
Trägerstoffen, wie z.B. Glas, Keramik und Harzsubstanzen in Form von
Platten oder Kugeln, ausgewählt. Eine solche Festphase sollte
in der Qualität homogen und in der Größe identisch sein,
ansonsten schwankt die Menge des auf die jeweilige Festphase als
Schicht aufgebrachten Antikörpers, was zu einem ungenauen
Meßergebnis führt. Wegen der einfachen Handhabung werden
vorzugsweise organische Harzsubstanzen, wie z.B. Polystyrol,
Polyvinylharz, Polyamidharz in Form von Platten oder Kugeln
verwendet, wobei Polystyrolkugeln und Polyvinylchloridplatten am
stärksten bevorzugt werden.
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Verschiedene Arten von Pufferlösungen können für den
erfindungsgemäßen Immuntest verwendet werden, um einen
bestimmten, für das System wünschenswerten pH-Wert
bereitzustellen. Eine für diesen Zweck verwendete Puffersubstanz wird
aus verschiedenen bekannten Verbindungen mit Pufferwirkung
gemäß den im System erforderlichen Bedingungen ausgewählt.
Bevorzugte Beispiele der Puffersubstanzen umfassen Phosphate,
Tris-HCl, Acetate und Aminosäuren. Diese Substanzen werden
zusammen mit einer Säure oder Natriumchlorid in einer im System
erwünschten Konzentration verwendet. Die Verfahren zur
Immunisierung, Chromatographie, Equilibrierung, Fraktionierung,
Fluorimetrie und Spektrophotometrie können in dem
erfindungsgemäßen Verfahren nach üblicherweise für diesen Zweck
angewendeten Verfahren durchgeführt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise so
durchgeführt, daß der Antikörper, der als Schicht auf die
Festphase aufgebracht wird, insbesondere ein für die
β-Untereinheit spezifischer monoclonaler Antikörper gegen hPH ist.
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Unsere kürzlichen immunologischen Tests haben gezeigt,
daß ein signifikanter Anstieg des hPH-Spiegels im Gewebe oder
im Blut von Patienten beobachtet wird, die an einer durch
Lebererkrankungen, wie z.B. chronische Hepatitis, Leberzirrhose
und alkoholische Leberstörungen, verursachten Leberfibrose
leiden.
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Wie in den nachstehenden Tabellen 5A und 5B gezeigt wird,
sind die mit den erfindungsgemäßen Verfahren gemessenen hPH-
Spiegel in Sera von Patienten mit Leberzirrhose signifikant
höher als diejenigen in Sera von Gesunden. Erfindungsgemäß
ermöglicht die Messung von hPH-Spiegeln im Blut auf einfache Art
und Weise die Erkennung von Lebererkrankungen, insbesondere
Leberfibrose, ohne auf eine für die Patienten belastende
Biopsie
zurückgreifen zu müssen. Wir haben festgestellt, daß eine
Fibrose von Lebergewebe nicht durch die üblichen
Leberfunktionstests bestimmt werden kann, die auf der Messung der
Aktivität von GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase), GPT
(Glutamat-Pyruvat-Transaminase), LDH (Lactat-Dehydrogenase),
γ-GTP (γ-Glutamyl-Transpeptidase) usw. beruhen. Die
vorliegende Erfindung ist auf dem Gebiet der Diagnose von
Lebererkrankungen sehr nützlich, da erwartet werden kann, daß
Erkrankungen dieser Art in einem frühen Stadium durch die Messung
von hPH-Spiegeln im Blut nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
nachgewiesen werden können, und da die Diagnose von Fibrose
von Lebergewebe nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das zur
Messung von hPH in der Lage ist, durchgeführt werden kann.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren selbst im
Vergleich zu den üblichen Verfahren einfach und ein durch das
erfindungsgemäße Verfahren erhaltenes Ergebnis genau und
glaubwürdig. Daher erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren in
wirtschaftlicher Hinsicht gegenüber den üblichen Verfahren als
vorteilhaft.
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Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der
nachstehenden Beispiele ausführlicher erläutert, diese spezifischen
Beispiele sollen jedoch den Umfang der Patentansprüche in keiner
Weise einschränken.
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Im nachstehenden Beispiel 3 sollen die Konfigurationen im
Enzymimmuntest und die Ergebnisse davon, die sich auf andere
als auf die für die β-Untereinheit von hPH spezifischen
monoclonalen Antikörpern beziehen, wie der immobilisierte erste
Antikörper, und diejenigen, die sich auf polyclonale
Antikörper des zweiten Antikörper/Enzym-Konjugats beziehen, nur
zur Erläuterung des allgemeinen Verfahrens dienen, nicht aber
einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden.
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Sepharose , Sephacel , Sephadex und Sephacryl sind
eingetragene Warenzeichen von Pharmacia Fine Chemical Co.. Bio-
Gel ist ein eingetragenes Warenzeichen von Bio-Rad
Laboratories. Ultrogel ist ein eingetragenes Warenzeichen von LKB
Produkter AB.
Beispiel 1
Herstellung von monoclonalen Anti-hPH-Antikörpern der Maus
(a) Herstellung von Antigen hPH (EC 1.14.11.2)
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Das hPH wurde unter Verwendung von menschlicher Placenta
als Material durch Affinitätschromatographie auf einer mit
Poly-L-prolin gekoppelten Sepharose 4B-Säule nach einem
Verfahren von Tuderman et al., beschrieben in Eur. J. Biochem.
52, 9-16 (1975), und anschließend mit einer Bio-Gel A-1,5 m
(Bio-Rad)-Säule gereinigt. Das erhaltene hPH-Präparat wurde
mittels Elektrophorese mit
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) nach einem Verfahren von Baum et al.,
beschrieben in J. Virol 10, 211-219 (1972), auf Reinheit untersucht,
wobei die Reinheit etwa 90% betrug.
(b) Herstellung von Antikörper-produzierenden Zellen
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Drei weibliche Balb/C-Mäuse im Alter von 8 Wochen wurden
einer ersten Immunisierung mit dem im vorstehenden Abschnitt
(a) gereinigten hPH in vollständigem Freund-Adjuvans
unterzogen. 50 ug hPH wurden in 0,5 ml Lösung jeder Maus
intraperitoneal verabreicht. Ferner wurden die Mäuse am 30. und am
60. Tag einer Booster-Immunisierung mit derselben Menge hPH,
das in physiologischer Kochsalzlösung gelöst war, unterzogen.
Als Endimmunisierung erhielten die Mäuse am 90. Tag mittels
intravenöser Verabreichung eine ergänzende Immunisierung (50
ug/100 ul physiologischer Kochsalzlösung). Nach drei Tagen
wurden die Mäuse getötet, ihre Milzen entnommen und die
Splenocyten geerntet.
(c) Zellfusionen
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Die folgenden Substanzen und Verfahren wurden verwendet:
RPMI-1640-Kulturmedium wurde hergestellt, indem RPMI Nr. 1640
(Difco Laboratories) mit Natriumbicarbonat (12 mM),
Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Penicillin G-Kalium
(50 E/ml), Streptomycinsulfat (50 ug/ml) und Amikacinsulfat
(100 ug/ml) versetzt, der pH-Wert mit Trockeneis auf 7,2
eingestellt und das Gemisch durch Filtration mit einem 0,2 um-
Membranfilter (Toyo) sterilisiert wurde.
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NS-1-Kulturmedium wurde hergestellt, indem fetales
Rinderserum (Granite Diagnostic, Inc.), das durch Filtration
sterilisiert worden war, zu dem vorstehenden
RPMI-1640-Kulturmedium
in einer Konzentration von 15% (Vol./Vol.) hinzugefügt
wurde.
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Das HAT-Selektionsmedium bestand aus dem
NS-1-Kulturmedium, das ferner Hypoxanthin (100 uM), Aminopterin (0,4 uM)
und Thymidin (16 uM) enthielt.
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Das HT-Kulturmedium wies dieselbe Zusammensetzung auf wie
das HAT-Selektionsmedium, mit der Ausnahme, daß das
Aminopterin daraus entfernt worden war. Die PEG 4000-Lösung wurde
hergestellt, indem Polyethylenglycol 4000 (PEG 4000, Merck & Co.,
Inc.) im RPMI-1640-Kulturmedium gelöst wurde, so daß eine
50%-ige (Gew./Gew.) nichtserumhaltige Lösung erhalten wurde.
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Die Fusion mit 8-Azaguanin-resistenten Myelomzellinien,
NS-1 (P3-NS 1-1), wurde durchgeführt, indem das Verfahren von
Oi et al., beschrieben in Selected Method in Cellular
Immunology (Hrsg. B. B. Mishell und S. M. Shiigi), W. H. Freeman and
Company (1980), 351-372, etwas modifiziert wurde. 1,5 x 10&sup8;
Kernsplenocyten (Lebensfähigkeit der Zellen: 95%) wurden mit
2,8 x 10&sup7; NS-1-Myelomzellen (Lebensfähigkeit der Zellen: 95%)
fusioniert. Die Kernsplenocyten und die Myelomzellen wurden
getrennt voneinander mit dem vorstehend beschriebenen RPMI-
1640-Kulturmedium gewaschen. Sie wurden in demselben
Kulturmedium suspendiert, wobei sie in dem vorstehend für die Fusion
beschriebenen Verhältnis gemischt wurden. Unter Verwendung
eines aus Styrolharz hergestellten konischen 50-ml-Teströhrchens
(Corning Glass Works) wurde das Gemisch in 40 ml RPMI-1640-
Kulturmedium 10 Minuten bei 400 x g zentrifugiert und der
Überstand durch Absaugen vollständig entfernt. Die Zellen im
Bodensatz wurden tropfenweise unter leichter Bewegung in einer
Minute mit 1 ml der auf 37ºC erwärmten PEG 4000-Lösung
versetzt. Die Lösung wurde eine Minute weiter leicht bewegt, um
die Zellen für die Dispersion zu resuspendieren. Danach wurde
1 ml des auf 37ºC erwärmten RPMI-1640-Kulturmediums
tropfenweise innerhalb einer Minute hinzugefügt. Nach einmaliger
Wiederholung dieser Vorgehensweise wurden 7 ml desselben
Kulturmediums innerhalb von 2 bis 3 Minuten unter fortgesetzter
Bewegung tropfenweise hinzugefügt, um die Dispersion der Zellen
zu erreichen. Dieses Gemisch wurde durch 10-minütige
Zentrifugation bei 400 x g getrennt und der Überstand vollständig
abgesaugt.
Die Zellen im Bodensatz wurden sofort mit 10 ml des
auf 37ºC erwärmten NS-1-Kulturmediums versetzt und große
Zellklumpen zur Dispersion vorsichtig mit einer 10 ml-Pipette
pipettiert. Weitere 20 ml desselben Kulturmediums wurden zur
Verdünnung der Dispersion hinzugefügt und diese in einer aus
Polystyrol hergestellten Mikroplatte mit 96 Vertiefungen
(Corning Glass Works) verteilt, so daß in jeder Vertiefung 5,9 x
10&sup5; Zellen/0,1 ml des Kulturmediums vorlagen. Die zu
verwendende Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurde vorbehandelt,
indem 0,2 ml NS-1-Kulturmedium hinzugefügt wurden, die
Mikroplatte über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator (37ºC)
gewärmt und das Kulturmedium direkt vor Verwendung abgesaugt
wurde. Die Mikrotiterplatten, bei denen die Zellfusion
stattgefunden hatte, wurden bei einer Temperatur von 37ºC und einer
Luftfeuchtigkeit von 100% in 7% Kohlendioxid/93% Luft
inkubiert.
(d) Selektive Kultur der Hybridomen in Selektivmedium
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Am ersten Tag der Inkubation wurden mit einer
Pasteur-Pipette zwei Tropfen (etwa 0,1 ml) des HAT-Selektivmediums
hinzugefügt. Am 2., 3., 5., 8. und 11. Tag wurde eine Hälfte des
Kulturmediums (0,1 ml) durch ein frisches HAT-Selektivmedium
ersetzt. Am 14. Tag wurde das Kulturmedium durch das
HT-Kulturmedium ersetzt und dieselbe Vorgehensweise alle 3 bis 4
Tage wiederholt. Das Wachstum von zufriedenstellenden
Hybridomzellen (Fusionsrate: 83%) wurde üblicherweise in 2 bis 3
Wochen beobachtet. Alle Vertiefungen, in denen Hybridomzellen
gewachsen waren, wurden in einem
Festphasen-Antikörper-Bindungstest (ELISA), der im nachstehenden Abschnitt (e)
beschrieben wird, getestet, ob sie positiv waren. 20 Zellen/288
Vertiefungen wurden als positiv nachgewiesen. Jede
nachgewiesene positive Zelle (20 Zellen/288 Vertiefungen) und 1 ml
eines HT-Kulturmediums, das 10&sup7; Mausthymocyten als Feeder-Zellen
enthielt, wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen aus
Polystyrol (Corning Glass Works) gebracht, wobei jeweils der
gesamte Inhalt der 20 nachgewiesenen positiven Hybridomen
übertragen wurde. Sie wurden genauso wie im vorstehenden Abschnitt
(c) bei 37ºC etwa eine Woche in Gegenwart von 7% Kohlendioxid
inkubiert. Während der Inkubation wurden in jeder Vertiefung
10,5
ml des Überstandes ein- oder zweimal durch 0,5 ml eines
frischen HT-Kulturmediums ersetzt. Sobald das Hybridom gut
gewachsen war, wurde dessen positives Ergebnis im ELISA erneut
bestätigt und jedes Hybridom einer Clonierung nach dem im
nachstehenden Abschnitt (f) beschriebenen limitierenden
Verdünnungsverfahren unterworfen. Die nach der Verwendung für
die Clonierung verbliebene Lösung wurde auf eine 25 cm²
Gewebekulturflasche aus Polystyrol (Corning Glass Works)
übertragen, auf diese Weise wurde eine Probe zur Gefrierlagerung
hergestellt.
(e) Absuchen nach einem Hybridom, das in der Lage ist, den
Anti-hPH-Antikörper zu produzieren, nach dem Festphasen-
Antikörper-Bindungstest (ELISA)
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Zur Verwendung wurde das Verfahren von Rennard et al.,
beschrieben in Anal. Biochem. 104, 205-214 (1980), etwas
modifiziert. Dieses Verfahren eignet sich zum Nachweis von
Antikörpern aus Hybridomen. Eine Mikrotiterplatte mit 96
Vertiefungen (Flow Laboratories, Inc.) wurde mit 0,5 bis 1,0 ug hPH
beschichtet und die anderen mit 1% Rinderserumalbumin (BSA)
blockiert. Ein Teil des Überstandes der jeweiligen Vertiefung,
in der das Hybridom gewachsen war, wurde hinzugefügt und die
Inkubation etwa eine Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Ein Meerettich-Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgG von der
Ziege (TAGO, Inc.) wurde als zweiter Antikörper hinzugefügt
und die weitere Inkubation etwa eine Stunde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Sodann wurden Wasserstoffperoxid und
o-Phenylendiamin als Substrat hinzugefügt und die Intensität der
resultierenden braunen Farbe entweder mit bloßem Auge qualitativ
abgeschätzt oder die Absorbanz bei 500 nm mit einem CORONA-
Doppelstrahl-Mikroplatten-Spektralphotometer (MTP-22, Corona
Denki Kabushiki Kaisha) bestimmt.
(f) Clonierung
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Da mindestens zwei Arten von Hybridomen in jeder
Vertiefung gewachsen sein konnten, wurde die Clonierung zum Erhalt
eines Hybridoms, das monoclonale Antikörper produziert, nach
dem limitierenden Verdünnungsverfahren durchgeführt. Ein
Kulturmedium für die Clonierung wurde hergestellt, das 10&sup7;
Mausthymocyten als Feeder-Zellen pro ml des NS-1-Kulturmediums
enthielt, und in 36, 36 und 24 Vertiefungen einer
Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit 5, 1 bzw. 0,5 Hybridomen pro
Vertiefung hinzugefügt. An Tag 5 und Tag 12 wurden weitere
etwa 0,1 ml NS-1-Kulturmedium hinzugefügt. Ein befriedigendes
Wachstum der Hybridome wurde 14 bis 15 Tage nach der
Clonierung beobachtet, ELISA wurde mit derjenigen Gruppe
durchgeführt, in der mehr als 50% der Vertiefungen bezüglich
Koloniebildung negativ waren. In dem Fall, daß in den getesteten
Vertiefungen nicht alle Hybridome positiv waren, wurde in den
Antikörper-positiven Vertiefungen die Kolonienzahl geprüft und
die Hybridome aus 4 bis 6 Vertiefungen aus denjenigen
Vertiefungen ausgewählt, in denen nur eine Kolonie vorlag, und
erneut einer Clonierung unterworfen. Schließlich wurden 8 Clone
erhalten.
(g) In vitro- und In vivo-Kultur des monoclonalen Antikörpers
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Der resultierende Clon wurde im NS-1-Kulturmedium oder in
einem ähnlichen geeigneten Kulturmedium inkubiert (In vitro-
Kultur), aus dem überstand des gezüchteten Mediums konnte ein
monoclonaler Antikörper erhalten werden (die Konzentration des
monoclonalen Antikörperproteins betrug 10 bis 100 ug/ml). Um
andererseits den Antikörper in größerer Menge zu erhalten,
wurde Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Aldrich
Chemical Company, Inc.), ein Beschleuniger der Tumorbildung, an
dasselbe Tier (Balb/C-Maus), das auch die Thymocyten und die
Myelomzellen bereitstellte, in einer Dosis von 0,5 ml pro Maus
interperitoneal verabreicht. Nach ein bis drei Wochen werden 1
x 10&sup7; Hybridomzellen intraperitoneal verabreicht, wodurch in
vivo nach etwa ein bis zwei Wochen ein Aszites mit einer
Konzentration von 4 bis 7 mg Protein/ml des monoclonalen
Antikörpers erhalten werden kann.
(h) Der Isotyp der schweren und der leichten Kette des
monoclonalen Antikörpers
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Jeder der resultierenden Aszites wurde zuerst an eine mit
hPH beschichtete Mikrotiterplatte nach dem vorstehend
beschriebenen ELISA gebunden. Nach Waschen wurde ein für den
Isotyp spezifischer Anti-Maus-Ig-Antikörper vom Kaninchen (Zymed
Laboratories) hinzugefügt. Nach Waschen wurde ein mit
Meerettich-Peroxidase markierter Anti-Kaninchen-IgG(H+L)-Antikörper
von der Ziege hinzugefügt und sodann mit
2,2'-Azinodi(3-ethylbenzthiazolin-sulfat-6) als Substrat und Wasserstoffperoxid
nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
zusammengestellt. Von den untersuchten Antikörpern wiesen vier
Antikörper Immunglobulin-Ketten γ1/κ, ein Antikörper γ2b/κ, zwei
Antikörper α/κ und ein Antikörper µ/κ auf.
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Ferner wurde jeder der resultierenden monoclonalen
Antikörper auf Kreuzreaktivität mit hPH-Untereinheiten nach dem
Western-Blotting-Verfahren, das von Towbin et al. in Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979) beschrieben wird,
getestet. Vier der acht resultierenden monoclonalen Antikörper
reagierten mit der α-Untereinheit mit einem Molekulargewicht
von 64 kD und die verbliebenen vier Antikörper mit der
β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 60 kD (vgl. Tabelle
1; bzgl. Untereinheiten vgl. Chen-kiang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74, 4420-4424, 1977).
(i) Reinigung des monoclonalen Antikörpers
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Jeder der im vorstehenden Abschnitt (g) erhaltenen Aszites
wurde mit Ammoniumsulfat (40% Sättigung) fraktioniert und
einer Säulenchromatographie mit DEAE-Sephacel (Pharmacia Fine
Chemicals), äquilibriert mit 40 mM Phosphatpufferlösung, pH
8,0, die 0,06 M Natriumchlorid enthielt, unterzogen, wodurch
die IgG-Klasse in einer nichtabsorbierten Fraktion erhalten
wurde. Diese IgG-Klasse wurde ferner einer Gelfiltration mit
einer mit Sephacryl S-300 Superfine (Pharmacia Fine
Chemicals) gefüllten Säule, äquilibriert mit 50 mM
Phosphatpufferlösung, pH 7,4, die 0,42 M Natriumchlorid enthielt,
unterzogen, wodurch das fetale Rinderserum im Kulturmedium und die
Mausproteine abgetrennt und entfernt wurden. Die IgA- und IgM-
Klassen wurden unter denselben Bedingungen wie die IgG-Klassen
gereinigt, mit der Ausnahme, daß sie aus einer DEAE-Sephacel
Säule mit einem Gradienten von 0,06 M bis 1,0 M Natriumchlorid
eluiert wurden.
Beispiel 2
Herstellung von Antiserum und polyclonalen
Anti-hPH-Antikörpern vom Kaninchen
(a) Immunisierung
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Ein weibliches Kaninchen wurde einer ersten Immunisierung
mit hPH, die genauso wie in Beispiel 1 (a) aus menschlicher
Placenta isoliert und gereinigt wurde, in vollständigem
Freund-Adjuvans unterzogen. Ein Gemisch aus 200 ug hPH und 1
ml Adjuvans wurde an 15 Stellen subcutan in den Rücken
verabreicht, danach wurden über einen Zeitraum von 4 Monaten alle 2
Wochen 200 ug hPH in vollständigem Freund-Adjuvans subcutan in
den Rücken des Kaninchens verabreicht, um eine
Booster-Immunisierung zu erreichen. Nach jeder Booster-Immunisierung wurde
eine Blutprobe genommen und das Antiserum nach dem von Hutton
et al. in Anal. Biochem. 16, 384-394 (1966), beschriebenen
Verfahren auf Anti-hPH-Aktivität getestet. 4 ul Antiserum
zeigte eine 56%-ige Hemmung der Aktivität. Dieses Antiserum
wurde aufgrund der Tatsache, daß es nur eine Fällungslinie
bildete, wenn es einer Ouchterlony-Immundiffusion und
-Immunelektrophorese unterworfen wurde, als spezifisch für hPH
eingestuft.
(b) Reinigung des Antiserums
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Das im vorstehenden Abschnitt (a) erhaltene
Kaninchen-Antiserum wurde mit Natriumsulfat (18% Sättigung) fraktioniert
und sodann auf Säulenchromatographie mit DEAE-Cellulose (DE52,
Whatman), die mit 17,5 mM Phosphatpufferlösung, pH 6,3,
äquilibriert worden war, aufgetragen, wodurch ein polyclonaler
Anti-hPH-Antikörper in nichtabsorbierten Fraktionen
(gereinigten IgG-Fraktionen) erhalten wurde.
Beispiel 3
Sandwich-Enzymimmuntest auf hPH
(a) Verfahren zur Herstellung von Kaninchen-Anti-hPH-IgG-
POD (Meerettich-Peroxidase)-Konjugat
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Das Kaninchen-Anti-hPH-IgG-POD-Konjugat wurde nach dem
von Ishikawa in J. Immunoassay 4, 209-327, 1983, beschriebenen
Verfahren hergestellt. Das im vorstehenden Beispiel 2(b)
erhaltene Anti-hPH-IgG vom Kaninchen wurde gegen 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,5, dialysiert. 0,3 bis 0,5 ml des
Kaninchen-Anti-hPH-IgG-Dialysats wurden mit einer 100-fachen
molaren Menge von S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, gelöst
in Dimethylformamid, versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten
bei 30ºC inkubiert. Anschließend wurden 100 ul 0,1 M Tris-HCl-
Puffer, pH 7,0, 10 ul 0,1 M EDTA-Lösung, pH 6,0, und 100 ul
1 M Hydroxylamin-Lösung, pH 7,0, hinzugefügt. Das Gemisch
wurde 5 Minuten bei 30ºC stehengelassen und sodann einer
Gelfiltration mit Sephadex G-25, äquilibriert mit 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA, unterworfen.
Auf diese Art und Weise wurde das SH-Gruppen-markierte Anti-
hPH-IgG vom Kaninchen erhalten.
-
Getrennt von dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurde
POD mit einem Maleinimid markiert. Dafür wurden 6 mg POD in
0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0, gelöst und eine 25-fache
molare Menge von N-(ε-Maleinimidocaproyloxy)succinimid, gelöst
in Dimethylformamid, zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch
wurde 30 Minuten bei 30ºC inkubiert. Anschließend wurde es
einer Gelfiltration mit Sephadex G-25, äquilibriert mit 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,0, unterworfen, wobei mit
Maleinimid markierte POD-Fraktionen gesammelt wurden.
-
Ein Mol des vorstehend hergestellten
SH-Gruppen-markierten IgG wurde mit etwa 5 Mol des vorstehend hergestellten, mit
Maleinimid markierten POD versetzt und das Gemisch 20 Stunden
bei 4ºC stehengelassen. Das Gemisch wurde sodann einer
Gelfiltration auf einer Ultrogel AcA 44 (LKB)-Säule,
äquilibriert mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,5, unterworfen, wobei
Kaninchen-Anti-hPH-IgG-POD-Konjugat-Fraktionen gesammelt
wurden. BSA und Thimerosal wurden als Stabilisator und
Konservierungsmittel in Konzentrationen von etwa 0,1% bzw. 0,005%
hinzugefügt und die Fraktionen bis zur Verwendung bei 4ºC
gelagert.
-
Dieselbe Behandlung wie vorstehend beschrieben wurde auch
bei den monoclonalen Anti-hPH-Antikörpern der Maus angewendet,
wodurch entsprechende monoclonale Antikörper-IgG-POD-Konjugate
hergestellt wurden.
(b) Verfahren zur Herstellung von Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-
POD-Konjugat
-
Das im vorstehenden Beispiel 2(b) erhaltene Anti-hPH-IgG
vom Kaninchen wurde gegen 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 4,5,
die 0,1 M Natriumchlorid enthielt, dialysiert. Das auf diese
Weise gereinigte Anti-hPH-IgG wurde 24 Stunden bei 37ºC mit
Pepsin gespalten, das in einer Konzentration von 2% (Gew./
Gew.) zu dem Antikörper hinzugefügt wurde. Die Umsetzung wurde
mit 2 M Tris-HCl-Pufferlösung, pH 8,0, beendet und das
Reaktionsgemisch einer Gelfiltration auf einer Ultrogel AcA 44-
Säule, äquilibriert mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0,
unterworfen, wobei F(ab')&sub2;-Fraktionen gesammelt wurden. Die
F(ab')&sub2;-Fraktionen wurden sodann gegen 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,0, dialysiert, wodurch eine Lösung von 0,5 bis 5
mg/450 ul hergestellt wurde. Diese Lösung wurde mit 50 ul 0,1
M Mercaptoethylamin, gelöst in 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH
6,0, die 5 mM EDTA enthielt, versetzt und das Gemisch 90
Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch zur
Sammlung der Fab'-Fraktionen einer Gelfiltration auf einer
Ultrogel AcA 44-Säule, äquilibriert mit 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,0, die 5 mM EDTA enthielt, unterworfen.
-
Da das so hergestellte Fab' labil ist, wurde es innerhalb
von 24 Stunden mit dem wie im vorstehenden Abschnitt (a)
hergestellten, mit Maleinimid markierten POD in einer dem Fab'
äquimolaren Menge versetzt. Ferner wurde 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,0, die 5 mM EDTA enthielt, hinzugefügt, so daß
die entsprechenden Endkonzentrationen von 50 bis 100 uM
vorlagen. Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden bei 4ºC oder
eine Stunde bei 30ºC stehengelassen. Die freien SH-Gruppen
wurden sodann mit N-Ethylmaleinimid in 10-facher molarer Menge
bezogen auf Fab' blockiert. Das Gemisch wurde einer
Gelfiltration auf einer Ultrogel AcA 44-Säule, äquilibriert mit 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 6,5, unterworfen, wobei die
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD-Konjugat-Fraktionen gesammelt wurden.
-
Dasselbe Verfahren wie vorstehend beschrieben wurde bei
den monoclonalen Anti-hPH-Antikörpern der Maus angewendet,
wodurch entsprechende monoclonale Antikörper-Fab'-POD-Konjugate
hergestellt wurden.
(c) Verfahren zur Bestimmung des spezifischen
Bindungsverhältnisses
-
Obwohl die in den vorstehenden Abschnitten (a) und (b)
hergestellten, mit POD markierten Antikörper üblicherweise als
solche, d.h. ohne weitere Reinigung, verwendet werden können,
ist es wünschenswert, sofern das spezifische
Bindungsverhältnis (üblicherweise 7 bis 8%) weniger als 1% beträgt, sie durch
ein spezifisches Reinigungsverfahren, das nachstehend
beschrieben wird, weiter zu reinigen.
-
100 ng Kaninchen-Anti-hPH-IgG-POD oder Kaninchen-Anti-
hPH-Fab'-POD wurden zuerst in 100 ul 10 mM
Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M Natriumchlorid und 0,1% BSA enthielt,
gelöst und die Lösung auf eine hPH-gekoppelte Sepharose 4B-
Affinitätssäule (100 ul Gel) aufgetragen. Die Säule wurde mit
3 ml 10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M
Natriumchlorid und 0,1% BSA enthielt, gewaschen. Genauso wurde mit
einer BSA-gekoppelten Sepharose 4B-Säule verfahren. Jeweils
eine Probe zu 10 ul von jedem Ausfluß wurde mit 250 ul 0,5% p-
Hydroxyphenylessigsäure (PHPA), gelöst in 50 mM
Acetatpufferlösung, pH 5,0, und 50 ul 0,01% wässeriger
Wasserstoffperoxidlösung versetzt und das Gemisch 10 Minuten bei 30ºC inkubiert.
2,5 ml 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Pufferlösung, pH 10,3,
wurden zur Beendigung der Umsetzung hinzugefügt und die
relative Intensität der Fluoreszenz des Reaktionsgemisches unter
Verwendung von Chinin (1 ug/ml 0,1 N Schwefelsäure) als
Kontrolle gemessen. Der Unterschied zwischen der gesamten
POD-Aktivität des Ausflusses aus der BSA- oder der hPH-gekoppelten
Sepharose 4B-Säule wurde zur Bestimmung des spezifischen
Bindungsverhältnisses verwendet.
(d) Verfahren für die Affinitätsreinigung
-
Anti-hPH-IgG-POD oder Anti-hPH-Fab'-POD wurde auf eine
hPH-gekoppelte Sepharose 4B-Säule (200 ul Gel), äquilibriert
mit 10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1 M
Natriumchlorid und 0,1% BSA enthielt, aufgetragen und die Säule
anschließend mit 5 ml desselben Puffers wie vorstehend
beschrieben gewaschen. Spezifischer Antikörper wurde mit 500 ul 0,1 M
Glycin-HCl-Pufferlösung, pH 2,5, eluiert und der Ausfluß
sofort mit 1,0 ml 0,5 M Tris-HCl-Pufferlösung, pH 8,0,
neutralisiert.
Der Ausfluß wurde auf 0,1 bis 0,3 ml eingeengt und das
Konzentrat einer Gelfiltration auf einer Ultrogel AcA44-
Säule, die vorher mit 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung, pH
6,5, 0,1% BSA enthielt, äquilibriert worden war,
unterworfen, wobei Antikörper-POD-Konjugat-Fraktionen gesammelt
wurden. Nach Zusatz von Thimerosal wurden die Fraktionen bis zur
Verwendung bei 4ºC gelagert.
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Bei den Antikörpern, die ein hohes spezifisches
Bindungsverhältnis aufwiesen, bestand keine Notwendigkeit zur
Anwendung dieser Affinitätsreinigung.
(e) Verfahren zur Herstellung von mit Antikörper
beschichteten Polystyrolkugeln
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Die in den Beispielen 1(i) bzw. 2(b) erhaltenen
monoclonalen Anti-hPH-Antikörper der Maus und polyclonalen Anti-hPH-
Antikörper des Kaninchens wurden jeder für sich in 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 7,5, die 0,1% Natriumazid enthielt, in
einer Konzentration von 0,1 mg/ml gelöst. Polystyrolkugeln
(Precision Plastic Ball), die mit den jeweiligen Antikörpern
beschichtet werden sollten, wurden 24 Stunden bei 4ºC in jeder
dieser Antikörperlösungen immergiert. Nach Entnahme aus der
die freien Antikörper enthaltenden Tauchlösung wurden die
Polystyrolkugeln vor Verwendung fünfmal mit "Puffer A" (10 mM
Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1% BSA, 0,1 M Natriumchlorid und
0,1% Natriumazid enthielt) gewaschen. Sofern sie eine Woche
oder länger bei 4ºC stehengelassen wurden, wurden sie bei
Verwendung erneut dreimal mit Puffer A gewaschen.
(f) Testverfahren
-
Die im vorstehenden Abschnitt (e) hergestellten
Polystyrolkugeln wurden mittels eines Fluorimetrie-Verfahrens (bei
Verwendung von Kugeln mit einem Durchmesser von 3,2 mm) und
mittels Kolorimetrie (bei Verwendung von Kugeln mit einem
Durchmesser von 6,5 mm) getestet.
1) Fluorimetrie
-
Zehn Teströhrchen (innerer Durchmesser 8 mm und Länge 75
mm) wurden in doppelter Ausführung hergestellt. Portionen zu
150 ul des Standard-hPH-Präparats, das in Beispiel 1(a)
gereinigt und auf Konzentrationen von 0, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,
3, 10, 30 und 100 ng/150 ul verdünnt worden war, wurden
einzeln
in die Röhrchen hinzugeben. 10 ul menschliches Serum und
140 ul Puffer A wurden als Probe in ein Teströhrchen
hinzugefügt und gut miteinander gemischt. Eine in Beispiel 3(e)
hergestellte, mit Antikörpern beschichtete Kugel wurde mit einer
Pinzette vorsichtig herausgegriffen, die daran hängende
Flüssigkeit mit Filterpapier entfernt und eine Kugel jeweils in
ein Teströhrchen gebracht. Jedes Teströhrchen wurde ein bis
vier Stunden bei 37ºC unter fortgesetztem Schütteln inkubiert
(erste Umsetzung; das Teströhrchen kann nach dieser Umsetzung
einen Tag bei 4ºC stehengelassen werden). Die Reaktionslösung
in jedem Teströhrchen wurde abgesaugt, 2 bis 3 ml einer
Waschlösung (10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 M Natriumchlorid
enthielt) wurden zweimal zum Waschen des jeweiligen Inhalts
hinzugefügt und die Waschlösungen abgesaugt. Unter Verwendung
anderer Teströhrchen wurden die in den Beispielen 3(a) bzw.
(b) hergestellten, mit Enzym markierten Antikörper mit 10 mM
Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1% BSA und 0,1 M
Natriumchlorid enthielt, auf eine Konzentration von 100 ng/150 ul
verdünnt. Die vorstehend beschriebenen, gewaschenen
Polystyrolkugeln wurden in diese Teströhrchen überführt (eine Kugel
pro Röhrchen). Es muß beachtet werden, daß im Falle des
spezifisch gereinigten, mit Enzym markierten Antikörpers im
vorstehenden Beispiel 3(d) eine Verdünnung von 10 ng/150 ul
verwendet wurde. Jedes Teströhrchen wurde 3 bis 4 Stunden bei 20ºC
unter fortgesetztem Schütteln inkubiert (zweite Umsetzung),
die nicht umgesetzte, mit Enzym markierte Antikörperlösung in
jedem Teströhrchen abgesaugt und der Rückstand zweimal mit 2
bis 3 ml Waschlösung gewaschen. 100 ul 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 7,0, worin 0,6% 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure
(HPPA) als POD-Substrat gelöst war, wurden in andere
Teströhrchen zugegeben. Die gewaschenen Polystyrolkugeln wurden in
diese Teströhrchen übertragen, jeweils eine Kugel pro
Teströhrchen. Zwei Teströhrchen, die das POD-Substrat HPPA alleine
enthielten, wurden in diesem Reaktionsschritt als Blindprobe
zubereitet und auch die nachfolgenden Schritte damit
durchgeführt. Zu jedem Teströhrchen mit Substrat wurden 50 ul
0,015% wässerige Wasserstoffperoxidlösung hinzugefügt und die
Röhrchen eine Stunde bei 30ºC unter fortgesetztem Schütteln
inkubiert (enzymatische Umsetzung). 2,5 ml 0,1 M Glycin-
Natriumhydroxid-Pufferlösung, pH 10,3, wurden zur Beendigung
der Umsetzung hinzugefügt. Die relative Intensität der
Fluoreszenz wurde mit einem Hitachi Spektralfluorometer (Modell
204) unter Verwendung von Chinin (1 ug/ml 0,1 N Schwefelsäure)
als Kontrolle gemessen. Unter Verwendung von
doppellogarithmischem Millimeterpapier, wobei die Abszisse die Menge in ng
des hPH-Präparats und die Ordinate die relative Intensität der
Fluoreszenz zeigte, wurde jeder gemessene Wert für die
relative Intensität der Fluoreszenz minus dem Wert der Blindprobe
aufgetragen, wodurch eine Standardkurve erhalten wurde. Die
Menge hPH pro ml einer Probe wurde erhalten, indem der Wert
für hPH (ng) aus der Standardkurve, welcher der mit 10 ul der
Probe erhaltenen relativen Intensität entsprach, mit 100
multipliziert wurde.
2) Kolorimetrie
-
Zehn Teströhrchen (innerer Durchmesser 9,5 mm, Länge 105
mm) wurden in doppelter Ausführung hergestellt. Portionen zu
300 ul des Standard-hPH-Präparats, das in Beispiel 1(a)
gereinigt und auf Konzentrationen von 0, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,
3, 10, 30 und 100 ng/300 ul verdünnt worden war, wurden
einzeln in die Röhrchen hinzugegeben. 10 ul menschliches Serum
und 290 ul Puffer A wurden als Probe in ein Teströhrchen
hinzugefügt und gut miteinander gemischt. Eine in Beispiel 3(e)
hergestellte, mit Antikörpern beschichtete Kugel wurde mit
einer Pinzette vorsichtig herausgegriffen, die daran hängende
Flüssigkeit durch Absorption mit Filterpapier entfernt und
eine Kugel in jedes Teströhrchen gebracht. Jedes Teströhrchen
wurde eine bis 4 Stunden bei 37ºC unter fortgesetztem
Schütteln (oder eine bis 2 Stunden bei 30ºC) inkubiert (erste
Umsetzung). Die Reaktionslösung in jedem Teströhrchen wurde
abgesaugt und der Rückstand zweimal mit jeweils 2 bis 3 ml der
zugegebenen Waschlösung gewaschen. Die gewaschenen
Polystyrolkugeln wurden in andere Teströhrchen übertragen, die jeweils
300 ul einer Lösung enthielten, die 10 oder 100 ng von einem
der in den vorstehenden Beispielen 3(a) und (b) hergestellten,
mit Enzym markierten Antikörper enthielt (eine Kugel pro
Röhrchen). Alle diese Teströhrchen wurden 3 bis 4 Stunden bei 20ºC
(oder eine bis 2 Stunden bei 30ºC) unter fortgesetztem
Schütteln inkubiert (zweite Umsetzung). Die nicht umgesetzte, mit
Enzym markierte Antikörperlösung in jedem Teströhrchen wurde
abgesaugt und der Rückstand zweimal mit 2 bis 3 ml Waschlösung
gewaschen. 300 ul 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 5,5, worin
0,0134% 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMBZ) gelöst war,
wurden in andere Teströhrchen hinzugefügt. Die gewaschenen
Polystyrolkugeln wurden in diese Teströhrchen übertragen (eine
Kugel pro Röhrchen). Zwei Teströhrchen, die das POD-Substrat
TMBZ alleine enthielten, wurden in diesem Reaktionsschritt als
Blindprobe zubereitet, mit ihnen wurden auch die nachfolgenden
Schritte durchgeführt. Zu jedem Teströhrchen mit Substrat
wurden 100 ul 0,01% wässerige Wasserstoffperoxidlösung
hinzugefügt und die Röhrchen 45 Minuten bei 30ºC unter fortgesetztem
Schütteln inkubiert (enzymatische Umsetzung). Anschließend
wurden zur Beendigung der Umsetzung 600 ul 1,33 N
Schwefelsäure hinzugefügt. Die Absorbanz bei 450 nm wurde mit einem
Shimadzu Doppelstrahl-Spektralphotometer (Modell UV-150-02)
gemessen, wobei Wasser als Kontrolle verwendet wurde, und die
Absorbanzwerte für die Proben minus denjenigen für die
Blindprobe erhalten. Die Berechnung der hPH-Menge pro ml der Probe
wurde genauso wie bei der im vorstehenden Abschnitt 1)
beschriebenen Fluorimetrie durchgeführt.
(g) Absuchen nach dem besten Antikörperpaar für Festphasen
und Konjugate
-
Bevor der Test von hPH nach dem vorstehend beschriebenen
Sandwich-Verfahren durchgeführt wurde, wurde der nachstehende
Absuchtest durchgeführt, um die besten Kombinationen von
Antikörpern als Festphase und als Konjugat zu bestimmen. Die in
den Beispielen 1 bzw. 2 erhaltenen acht monoclonalen
Antikörper und der polyclonale Anti-hPH-Antikörper vom Kaninchen
wurden auf das beste Paar hin untersucht, wobei das in Beispiel
1(a) gereinigte Standard-hPH-Präparat verwendet wurde. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie bei dem
Immunglobulin(Ig)-POD-Konjugat (mit Enzym markierter Antikörper)
zeigte bei Paaren von 2-5G8 / 3-2B12, 2-1C2 / 3-2B12, 2-6G9 / 3-
2B12 und 2-1C2 / Anti-hPH-IgG vom Kaninchen (alle als
Festphase / Konjugat ausgedrückt) das Verhältnis (S/N) von
spezifischer
Bindung (S) zu unspezifischer Bindung (N) hohe Werte. Im
Fall vom Fab'-POD-Konjugat wurden hohe Werte des
S/N-Verhältnisses zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Paaren noch
von einem Paar von 3-2B12 / Anti-hPH-IgG vom Kaninchen
gezeigt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden Standardkurven mit
den nachstehenden Kombinationen von Festphase / Konjugat
angefertigt: Paare aus 2-5G8 / monoclonaler Antikörper-IgG(3-
2B12); 3-2B12 / Anti-hPH-Fab' vom Kaninchen; und Anti-hPH-IgG
vom Kaninchen / Anti-hPH-Fab' vom Kaninchen (vgl. die Figuren
1 und 2). Fig. 1 zeigt eine durch Fluorimetrie erhaltene hPH-
Standardkurve, wobei der Test bei der ersten Umsetzung eine
Stunde bei 37ºC; bei der zweiten Umsetzung 3 Stunden bei 20ºC
und bei der dritten Umsetzung eine Stunde bei 30ºC unter
fortgesetztem Schütteln durchgeführt wurde. In Fig. 1 stellt das
Symbol (- -) die Festphase, die Anti-hPH-IgG vom Kaninchen
ist, und das Symbol (-o-) die Festphase, die ein monoclonaler
Antikörper (3-2B12) ist, dar. In beiden Fällen wurde
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD als Konjugat verwendet. Das Symbol (- -)
steht für die Festphase, die der monoclonale Antikörper(2-
5G8) ist, und das Konjugat, das monoclonaler Antikörper-IgG(3-
2B12)-POD ist.
-
Fig. 2 zeigt eine hPH-Standardkurve, die durch
Kolorimetrie erhalten wurde, wobei der Test bei der ersten Umsetzung
eine Stunde bei 37ºC, bei der zweiten Umsetzung 3 Stunden bei
20ºC und bei der dritten Umsetzung 45 Minuten bei 30ºC unter
fortgesetztem Schütteln durchgeführt wurde. In Fig. 2 stellt
das Symbol (- -) die Festphase, die Anti-hPH-IgG vom Kaninchen
ist, und das Symbol (-o-) die Festphase, die ein monoclonaler
Antikörper (3-2B12) ist, dar. In beiden Fällen wurde
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD als Konjugat verwendet, sowohl bei
der Fluorimetrie als auch bei der Kolorimetrie. Eine
Linearität wurde im Bereich von 0,1 bis 100 ng hPH pro Teströhrchen
erhalten, die Empfindlichkeit betrug 0,1 ng. Eine etwas
bessere Empfindlichkeit wurde mit einem Paar von beidemals
polyclonalen Anti-hPH-Antikörpern vom Kaninchen für Festphase
und Konjugat erhalten, im Vergleich zu einem Paar aus
monoclonalem Antikörper / polyclonalem Antikörper oder monoclonalem
Antikörper / monoclonalem Antikörper.
-
Das Absuchen nach dem besten Paar von monoclonalen
Antikörpern für Festphase und/oder Konjugat wurde unter Verwendung
von jeweils 10 ul menschlicher Serumproben von Gesunden
durchgeführt (vgl. Tab. 3). Wie die Tabelle 3 klar zeigt, ist die
spezifische Bindung in jedem der Paare extrem niedrig. Wenn
auf der anderen Seite jeweils 10 ul menschlicher Serumproben
von Gesunden ebenso mit den beiden Kaninchen-Anti-hPH-IgG als
Festphase und als Konjugat verwendet wurden, wurde gefunden,
daß die Intensität der Fluoreszenz mit steigenden Mengen Serum
anstieg. Daher stellt Fig. 3 hPH-Spiegel in 0 bis 50 ul Serum
von Gesunden dar, gemessen durch Fluorimetrie, wobei der Test
bei der ersten Umsetzung eine Stunde bei 37ºC, bei der zweiten
Umsetzung 4 Stunden bei 20ºC und bei der dritten Umsetzung
eine Stunde bei 30ºC unter fortgesetztem Schütteln durchgeführt
wurde. In Fig. 3 steht die durchgezogene Linie () für die
Festphase, die Anti-hPH-IgG vom Kaninchen ist, und das
Konjugat, das Kaninchen-Anti-hPH-IgG-POD ist, und die
gestrichelte Linie () für die Festphase, die monoclonaler
Antikörper (2-5G8) ist, und das Konjugat, das monoclonaler
Antikörper-IgG(3-2B12)-POD ist. Auf der anderen Seite wurde keine
spezifische Bindung beobachtet, wenn der monoclonale
Antikörper (2-5G8) als Festphase und monoclonaler
Antikörper-IgG(3-2B12)-POD als Konjugat verwendet wurde. Diese Ergebnisse
zeigen also, daß hPH mit Paaren von monoclonalen Antikörpern
alleine nicht quantitativ bestimmt werden kann. Tabelle 4
zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die
monoclonalen Antikörper oder Anti-hPH-Antikörper vom Kaninchen einzeln
als Festphase und Kaninchen-Anti-hPH-IgG oder -Fab'-POD als
Konjugat verwendet wurden. Befriedigende Werte des
Verhältnisses (S/N) von spezifischer Bindung (S) zu unspezifischer
Bindung (N) wurden erhalten, wenn das Konjugat aus Kaninchen-
Anti-hPH-IgG-POD und die Festphase aus den Clonen 3-2B12, 3-
6H5, 2-6G9, 2-7F8 oder Kaninchen-Anti-hPH-IgG bestand.
Befriedigende Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn das Konjugat
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD und der Festphasenantikörper 3-2B12,
3-4H2 oder Kaninchen-Anti-hPH-IgG war. Weniger unspezifische
Bindung wurde mit Fab'-POD als mit IgG-POD als Konjugat
beobachtet.
(h) Bestimmung von hPH-Spiegeln in Sera
-
Aufgrund des im vorstehenden Abschnitt (g) dargestellten
Absuchverfahrens nach dem besten Antikörper paar zur
Verwendung als Festphase- und Konjugat-Antikörper wurden als
Festphase monoclonaler Antikörper-IgG(3-2B12) oder Kaninchen-Anti-
hPH-Antikörper-IgG und als Konjugat Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-
POD verwendet, um die hPH-Spiegel in Sera von Gesunden und von
Patienten mit Leberzirrhose zu bestimmen (vgl. Tabelle 5A).
Wenn die Kombination von Festphase und Konjugat aus einem Paar
von 3-2B12 / Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD bestand, betrugen die
hPH-Spiegel in Sera von Gesunden und Patienten mit
Leberzirrhose 95,3 bzw. 151,5 ng/ml. Es wurde also ein
signifikanter Unterschied zwischen den zwei Spiegeln beobachtet (p =
0,001). Wenn die Kombination aus einem Paar von Kaninchen-
Anti-hPH-IgG / Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD bestand, betrugen
die entsprechenden Spiegel 92,5 bzw. 142,9 ng/ml, was einen
signifikanten Unterschied zeigt (p = 0,05).
Beispiel 4
-
Einstufiger Test auf hPH unter Verwendung einer
Mikrotiterplatte aus Polyvinylchlorid (Costar) als Festphase
200 ul des monoclonalen Antikörpers (3-2B12) in der
Konzentration von 100 ug/ml wurden in jede Vertiefung einer
Polyvinylplatte mit 96 Vertiefungen gefüllt und die Platte bei 4ºC
stehengelassen, um die Vertiefungen mit dem Antikörper zu
beschichten. Für die Tests wurden die Vertiefungen mit
Verdünnungspuffer (10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 0,1% BSA
und 0,1 M Natriumchlorid enthielt) gewaschen. Jeweils 20 ul
einer Verdünnung von 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 und 12,8
ng/20 ul der in Beispiel 1(a) gereinigten Standard-hPH und 20
ul Serum wurden jeweils gleichzeitig mit 150 ul Kaninchen-
Anti-hPH-Fab'-POD-Konjugat in der Konzentration von 100 ng/150
ul in der vorstehend beschriebenen Verdünnungspufferlösung in
die Vertiefungen gegeben. Die Vertiefungen wurden 2 Stunden
bei 37ºC stehengelassen (erste Umsetzung). Anschließend wurden
sie dreimal mit 220 ul 10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die
0,1 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen, mit 150 ul 0,0134%
TMBZ, gelöst in 0,1 M Acetatpufferlösung, pH 5,5, und 50 ul
0,01% wässeriger Wasserstoffperoxidlösung versetzt und die
Platte 45 Minuten bei 37ºC inkubiert (enzymatische Umsetzung).
Zur Beendigung der Umsetzung wurden 180 ul von jeder
Reaktionslösung in ein Teströhrchen überführt, das 270 ul 1,33 N
Schwefelsäure enthielt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde
die Absorbanz bei 450 nm mit einem Shimadzu
Doppelstrahl-Spektralphotometer gemessen, wobei Wasser als Kontrolle verwendet
wurde. Unter Verwendung von halblogarithmischem
Millimeterpapier, wobei die Abszisse die Menge in ng hPH und die Ordinate
die Absorbanz zeigte, wurden die gesamten Daten aufgetragen,
wodurch eine Standardkurve erhalten wurde. Die Menge hPH pro
ml einer Probe wurde berechnet, indem der Wert für hPH aus der
Standardkurve, welcher der mit 20 ul der Probe erhaltenen
Absorbanz entsprach, mit 100 multipliziert wurde. In Fig. 4 der
begleitenden Zeichnungen ist eine Standardkurve dargestellt,
die bei Verwendung des monoclonalen Antikörpers (3-2B12) zur
Beschichtung einer Polyvinylplatte mit 96 Vertiefungen und von
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD als Konjugat erhalten wurde. Wie
in Fig. 4 dargestellt ist, wird im Bereich von 0 bis 12,8 ng
eine geschwungene Linie beobachtet, wobei die Sensitivität
etwa 0,1 ng betrug. Der hPH-Spiegel im Serum wurde bei drei
Gesunden unter Verwendung dieser Standardkurve gemessen, wobei
49, 32 und 18 ng/ml Serum erhalten wurden.
-
Dieses einstufige Testverfahren eignet sich für die
quantitative oder qualitative Analyse, wenn eine große Anzahl von
Proben behandelt werden muß, es weist jedoch eine etwas
schlechtere Genauigkeit auf als das zweistufige
Sandwich-Testverfahren, bei dem Polystyrolkugeln als Festphase verwendet
werden.
Beispiel 5
Identifizierung des Antigens
-
Das nachstehende Experiment wurde durchgeführt, um
festzustellen, ob das durch den Sandwich-Enzymimmuntest
eingefangene Antigen mit dem hPH, das in Beispiel 1(a) in reiner
Form aus Placenta isoliert worden war, identisch war. Hierfür
wurde 1 ml Serum eines Patienten mit Leberstörungen (hPH, 298
ng/ml) auf eine Ultrogel AcA 34-Gelfiltrationssäule (1,5 x 45
cm), die mit 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0, äquilibriert
worden war, aufgetragen. Fig. 5 der begleitenden Zeichnungen
zeigt ein Elutionsprofil, das bei Durchfühung einer Ultrogel
AcA 34-Gelfiltration mit menschlichem Serum erhalten wurde. In
Fig. 5 steht () für die Absorbanz bei 280 nm und (o)
für den hPH-Spiegel, der mit einem Paar aus monoclonalem
Antikörper (3-2B12) als Festphase und Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD
als Konjugat gemessen wurde. Wie in Fig. 5 dargestellt, wurden
zwei Peaks des hPH-Spiegels bei den (Ve/Vo)-Werten von etwa
1,38 bzw. 1,96 eluiert. Diese Fraktionen, die reich an hPH
waren, wurden gesammelt und die vorstehend beschriebene
Gelfiltration zweimal wiederholt, wobei zwei Fraktionen gesammelt
wurden, die einen hohen hPH-Gehalt aufwiesen (entsprechend 3
ml Serum). Die Fraktionen wurden durch Ultrafiltration
eingeengt.
-
Die vorstehend beschriebenen eingeengten Proben wurden
einer Affinitätschromatographie auf einer mit dem monoclonalen
Antikörper (3-2B12) gekoppelten Sepharose 4B-Säule (0,35 x 10
cm, 62,4 ug Antikörper/40 ul Gel) unterworfen, um hPH in den
entsprechenden Fraktionen zu reinigen. Hierfür wurde die
eingeengte Probe auf die vorstehend beschriebene Affinitätssäule
adsorbiert, die mit 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,0,
äquilibriert worden war, und die Säule mit 6 ml
Äquilibrierungspufferlösung gewaschen. Anschließend wurde das Adsorbat in der
Säule mit 300 ul 0,1 M Glycin-HCl-Pufferlösung, pH 2,5, in
einen Behälter eluiert, der 300 ul 2 M Tris-HCl-Pufferlösung,
pH 8,0, enthielt. Die auf diese Weise erhaltenen, von den zwei
Fraktionen abgeleiteten Ausflüsse wurden gegen 0,1 M
Phosphatpufferlösung, pH 7,0, dialysiert, eingeengt und sodann einer
SDS-PAGE nach dem Verfahren von Baum et al. unterworfen, wie
es in Beispiel 1(a) beschrieben wird. Nach Durchführung der
SDS-PAGE wurden die Proteine durch das in Beispiel 1(h)
beschriebene Western-Blotting-Verfahren von Towbin et al. vom
Acrylamidgel auf einen Nitrocellulosebogen (Trans-Blot , 0,45
um, Bio-Rad) überführt. Dieser Nitrocellulosebogen wurde mit
einem monoclonalen Antikörper-IgG(3-2B12)-POD (spezifisch
reaktionsfähig mit der β-Untereinheit, vgl. Tab. 1),
3,3'-Diaminbenzidin und wässeriger Wasserstoffperoxidlösung behandelt.
Fig. 6 der begleitenden Zeichnungen zeigt Muster, die erhalten
wurden, wenn die zwei in Fig. 5 dargestellten, hPH-reichen
Fraktionen jeweils auf einer mit dem monoclonalen Antikörper
(3-2B12) gekoppelten Sepharose 4B-Affinitätssäule gereinigt,
einer SDS-PAGE unterworfen und sodann auf einen
Nitrocellulosebogen übertragen wurden. In Fig. 6 zeigt (a)
gereinigtes hPH, (b) die Fraktionen F27-41 aus Fig. 5 und (c) die
Fraktionen F45-59 aus Fig. 5. Als Referenz für
Molekulargewichte wurde in diesem Experiment ein Proteinmarkerbesteck (BRL)
verwendet, das die schwere Kette von Myosin (200 000),
Phosphorylase b (92 500) , BSA (68 500), Ovalbumin (43 000),
α-Chymotrypsinogen (25 700), β-Lactoglobulin (18 400) und
Cytochrom C (12 300) enthielt. Wie in Fig. 6 dargestellt, wurden bei
der aus der Placenta stammenden hPH eine Hauptbande, die der
β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 60 kD entsprach,
und eine weitere Bande, die einem Molekulargewicht von 170 bis
190 kD entsprach, festgestellt (vgl. Fig. 6-a). Andererseits
wurden bei den zwei Fraktionen, die F27-41 und F45-59 aus Fig.
5 entsprachen, zusätzlich zu der Bande, die einem
Molekulargewicht von 60 kD entsprach, einige wenige Banden im höheren
Molekulargewichtsbereich beobachtet (vgl. Fig. 6-c).
-
In Geweben soll hPH in Form eines Tetramers (α&sub2;β&sub2;) mit
einem Molekulargewicht von 240 000 vorliegen und aus α(64 kD)-
und β(60 kD)-Untereinheiten bestehen. Obwohl, wie in Fig. 5
deutlich gezeigt wird, hPH im Blut teilweise zersetzt wird und
daher die genaue Zusammensetzung der Untereinheiten nicht klar
ist, läßt das Elektrophoresemuster in Fig. 6 vermuten, daß der
als Festphase des Immuntests verwendete monoclonale Antikörper
(3-2B12) intakte oder teilweise zersetzte hPH eingefangen hat.
Beispiel 6
Sandwich-Technik-Radioimmuntest für hPH
(a) Verfahren zur Herstellung von mit Radioisotop markiertem
Antikörper
-
100 ug des im vorstehenden Beispiel 2(b) erhaltenen
Kaninchen-Anti-hPH-IgG wurden nach dem Lactoperoxidase-Verfahren
mit 1 mCi Na[¹²&sup5;I] markiert.
-
Zur Entfernung von freiem [¹²&sup5;I&supmin;] wurde eine
Chromatographie auf einer Sephadex G50-Säule (φ 1,0 x 15 cm)
durchgeführt. Der von der Säule mit 50 mM Phosphatpufferlösung, pH
7,0, eluierte, markierte Antikörper wurde für die Lagerung mit
110 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 1% BSA enthielt,
verdünnt (spezifische Aktivität: 2,4 uCi/ug).
(b) Verfahren zur Herstellung von mit Antikörper
beschichteten Polystyrolkugeln
-
Monoclonale Anti-hPH-Antikörper der Maus wurden jeweils
in 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 7,5, die 0,1% Natriumazid
enthielt, in einer Konzentration von 0,1 mg/ml gelöst.
Polystyrolkugeln (6,5 mm Durchmesser) wurden 24 Stunden bei 4ºC in
jeder der Lösungen eingeweicht, um die Kugeln mit den
entsprechenden Antikörpern zu beschichten. Nach Entfernung der zum
Einweichen verwendeten Antikörperlösungen wurde 10 mM
Phosphatpufferlösung, pH 7,0, die 2% BSA enthielt, hinzugefügt und
die Gemische 2 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Die
Polystyrolkugeln wurden mit Puffer A gewaschen und bis zur Verwendung in
Puffer A gelagert.
(c) Testverfahren
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Nachstehend wird ein Beispiel gezeigt, wobei die im
vorstehenden Abschnitt (b) hergestellten, mit dem monoclonalen
Antikörper (3-2B12) gekoppelten Polystyrolkugeln verwendet
wurden. Zu den Teströhrchen in doppelter Ausführung wurden
einzelne Verdünnungen der gereinigten Standard-hPH in
Konzentrationen von 0, 0,2, 0,4, .... 6,4, 12,8 ng/150 ul oder 10 ul
menschliches Serum und Puffer A hinzugefügt, so daß ein
Gesamtvolumen von 300 ul erhalten wurde, und die Inhaltstoffe
gut gemischt wurden.
-
Die im vorstehenden Abschnitt (b) hergestellten, mit
Antikörper beschichteten Kugeln wurden in die Teströhrchen
gebracht (eine Kugel pro Röhrchen) und die Röhrchen eine bis 4
Stunden bei 30ºC unter fortgesetztem Schütteln inkubiert.
Nachdem die Umsetzung vollständig abgelaufen war, wurde die
Reaktionslösung aus jedem Teströhrchen abgesaugt und die
Kugeln jeweils zweimal mit 2 bis 3 ml Waschlösung gewaschen,
wobei die Waschlösungen jeweils abgesaugt wurden.
-
Die Kugeln wurden in andere Teströhrchen überführt, 300
ul (500 000 cpm) [¹²&sup5;I]-Kaninchen-Anti-hPH-IgG-Konjugat in
jedes Teströhrchen hinzugefügt und diese über Nacht bei 4ºC
stehengelassen.
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Die radiomarkierte Antikörperlösung wurde abgesaugt, die
Kugeln jeweils zweimal mit 2 ml Waschlösung gewaschen und die
Menge an Radioaktivität der jeweiligen Kugel 5 Minuten unter
Verwendung eines Gamma-Zählers gemessen.
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Eine Standardkurve wurde aufgezeichnet und die hPH-Serum-
spiegel daraus abgelesen.
(d) hPH-Spiegel in Sera
-
Unter Verwendung der in Fig. 7 dargestellten
hPH-Standardkurve wurden die hPH-Spiegel in Sera von Gesunden und von
Patienten, bei denen durch Biopsie die Diagnose Leberzirrhose
gestellt worden war, gemessen. Die Ergebnisse werden in
Tabelle 5B gezeigt.
-
Werte von 30, 68 und 34 ng/ml wurden für die Gesunden und
Werte von 165, 210 und 940 ng/ml für die Patienten mit
Leberzirrhose erhalten.
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Durch Verwendung eines durch Affinität gereinigten, mit
Iod markierten Kaninchen-Antikörpers oder F(ab')&sub2;-Fragments
von IgG auf einer hPH-gekoppelten 4B-Säule sollte eine weitere
Erhöhung der Genauigkeit der Analysen möglich sein.
Tabelle 1
Clon
Isotyp
Kette
Immunkreuzreaktion mit Untereinheit
Tabelle 2
Konjugat
unspezifische Bindung (N) und spezifische Bindung (S) mit monoclonalem
Maus-Anti-hPHAntikörper(Ig)-POD-Konjugat
Feststoff
Clon
Kaninchen-Anti-hPH
Intensität der Fluoreszenz
Die Standard-hPH (2,4 ng/Röhrchen) wurde untersucht, indem die Proben bei der ersten Umsetzung 4
Stunden bei 37ºC; bei der zweiten Umsetzung 4 Stunden bei 20ºC; und bei der dritten Umsetzung eine
Stunde bei 30ºC unter Verwendung von mit monoclonalen oder polyclonalen Antikörpen beschicheten
Polystyrolkugeln (Durchmesser 3,2 mm) inkubiert wurden.
Tabelle 3
Konjugat
Unspezifische Bindung (N) und spezifische Bindung (S) mit
monoclonalem Maus-Anti-hPH-Antikörper-IgG-POD-Konjugat
Feststoff
Clon
Intensität der Fluoreszenz
Eine 10 ul-Serumprobe von einem Gesunden wurde untersucht,
indem sie bei der ersten Umsetzung eine Stunde bei 37ºC; bei der
zweiten Umsetzung 3 Stunden bei 20ºC; und bei der dritten
Umsetzung eine Stunde bei 30ºC unter Verwendung von mit
monoclonalen Antikörpen beschichteten Polystyrolkugeln (Durchmesser
3,2 mm) inkubiert wurde.
Tabelle 4
Konjugat
Kaninchen-Anti-hPH-IgG-POD-Konjugat
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD-Konjugat
Feststoff
Clon
Anti-hPH-IgG-POD
Anti-hPH-Fab'-POD
unspezifische Bindung (N)
spezifische Bindung (S)
Verhältnis S/N
Intensität der Fluoreszenz
Eine 10 ul-Serumprobe von einem Gesunden wurde untersucht,
indem sie bei der ersten Umsetzung eine Stunde bei 37ºC; bei der
zweiten Umsetzung 3 Stunden bei 20ºC; und bei der dritten
Umsetzung eine Stunde bei 30ºC unter Verwendung von mit
monoclonalen oder polyclonalen Antikörpen beschichteten Polystyrolkugeln (Durchmesser
3,2 mm) inkubiert wurde.
Tabelle 5A hPH-Spiegel in Sera
Feststoff
Konjugat
Gesunde Personen
Patienten mit Leberzirrhose
Unterschied
Kaninchen-Anti-hPH-Fab'-POD
signifikant
Tabelle 5B hPH-Spiegel in Sera
drchschn. Impulse
Proben
hPH-Spiegel ng/ml
CPM-Blindwert
Blindwert
Serumproben
Gesunde Person
Patient mit Leberzirrhose
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Figuren 1 und 2 zeigen hPH-Standardkurven; Fig. 3
zeigt eine graphische Darstellung, worin die hPH-Spiegel in
Sera von Gesunden erläutert werden; Fig. 4 zeigt eine, mit dem
einstufigen Test erhaltene hPH-Standardkurve; Fig. 5 zeigt
eine graphische Darstellung, worin ein Elutionsprofil der
Gelfiltration von menschlichen Sera und die darin enthaltenen
hPH-Spiegel erläutert werden; Fig. 6 zeigt ein Muster, das
erhalten wurde, indem hPH-Fraktionen einer Elektrophorese
unterworfen und sodann auf Nitrocellulosebögen übertragen
wurden; Fig. 7 zeigt eine hPH-Standardkurve, die im Test in
Beispiel 6 verwendet wurde, wobei die Kurve durch das Sandwich-
Verfahren unter Verwendung eines monoclonalen
Anti-hPH-Antikörpers der Maus (3-2B12), der als Schicht auf
Polystyrolkugeln physikalisch aufgetragen worden war, als
Festphase und des mit [¹²&sup5;I] markierten
Kaninchen-Anti-hPH-Antikörper-IgG als Konjugat erhalten wurde.