CN103224542B - 一种用于常温下抗体活性保存的溶液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于常温下抗体活性保存的溶液，其特征在于：以0.01M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶质包括0.75～1.5%牛血清白蛋白，0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，0.02～0.05%叠氮钠，0.001～0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2；以占溶液总质量的百分比计，溶液的pH值为7.2。本发明还公开这种溶液的制备方法。本发明产品用于常温下保存抗体，保存时间长，抗体效价高。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于常温下抗体活性保存的溶液及其制备方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
抗体是动物（牛、马、羊、鼠、兔等）体内产生的针对特异性抗原物质（如蛋白质等）免疫球蛋白。由于抗体能够特异、稳定地结合特异性抗原，因此广泛用于临床诊断、治疗与实验室研究。但由于抗体属于生物活性物质，其活性不可避免地受到温度、氧化等环境变化的影响，和抗原的结合能力（效价）逐步降低，影响其使用效果。目前常规保存抗体效价的方法主要是以较高浓度（>1mg/ml）低温保存（4度、零下20度与零下80度），但是效价保存的时间往往小于1年，并且如果在冷冻过程中，如果发生反复冻融，则效价往往以1个数量级的速度下降，冻融一次，效价甚至会下降至原效价的10%。为解决这一问题，美国Invitrogen公司开发出一种抗体稀释液（货号003218），应用后抗体效价能够在4度保持12个月。但是由于运输、储存和应用环节都要保持4度，因此在具体使用过程中仍有各种不便。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于常温下抗体活性保存的溶液，能够使抗体效价在常温（小于等于25度）环境下，长期（大于6个月）保持不变。
本发明的另一目的在于提供这种溶液的制备方法。
技术方案：本发明所述的用于常温下抗体活性保存的溶液，以0.01M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶质包括0.75～1.5%牛血清白蛋白，0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，0.02～0.05%叠氮钠， 0.001～0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2；以占溶液总质量的百分比计，溶液的pH值为7.2。
优选地，所述牛血清白蛋白为1%，所述冷水鱼皮肤胶原为1%，所述叠氮钠为0.05%， 所述多肽为0.001%。
本发明所述的溶液的制备方法，取0.01M磷酸盐缓冲液，加入溶液总质量的0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，搅拌溶解后，在1.1～1.2个大气压下加热沸腾20～30分钟，冷却至室温，再加入溶液总质量的0.75～1.5%牛血清白蛋白、0.02～0.05%叠氮钠和0.001～0.0015%的多肽，溶解后过滤，分装保存，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2。
本发明与现有技术相比，其有益效果是： 本发明产品用于常温下保存抗体，保存时间长，抗体效价高。与现有产品（美国Invitrogen抗体稀释液，货号003218）相比，抗体经本发明产品稀释后，常温下保存超过6个月，抗体效价相当或高于003218保存或与负20度保存的抗体。
附图说明
图1为本发明产品与其他方式对抗体保存后，抗体效价测定结果图；
图2为本发明产品与其他方式对抗体保存后，胆碱酯酶抗体的免疫印迹实验结果图；
图3为本发明产品与其他方式对抗体保存后，胆碱酯酶抗体的免疫共沉淀实验结果图。
具体实施方式
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：用于常温下抗体活性保存的溶液，以0.01M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶质包括1%牛血清白蛋白，1%冷水鱼皮肤胶原，0.05%叠氮钠， 0.001%的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2；以占溶液总质量的百分比计，溶液的pH值为7.2。
制备方法，取0.01M磷酸盐缓冲液，加入溶液总质量的1%冷水鱼皮肤胶原，搅拌溶解后，在1.2个大气压下加热沸腾20分钟，冷却至室温，再加入溶液总质量的1牛血清白蛋白、0.05%叠氮钠和0.001%的多肽，溶解后过滤，分装保存。
实施例2：用实施例1制得的本发明产品常温保存6个月的小鼠抗AChE单克隆抗体（购自美国Abgent公司，货号AM2184a），与美国Invitrogen抗体稀释液（货号003218，以下简称003218）保存6个月的抗体、负20℃条件下保存6个月的抗体和1%牛血清白蛋白（溶于磷酸盐缓冲液）常温保存6个月的抗体，进行抗体效价比较。对抗体效价用直接ELISA法测定，操作步骤如下：
（1）包被：用包被缓冲液（0.05mol/L，pH9.6）稀释包被抗原(人重组AChE，购自Sigma公司，货号：C-1682)至1μg/ml浓度，加入酶标板，每孔100μl，37℃温箱中孵育2h。
（2）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。
（3）封闭：每孔加入1%脱脂奶粉200μl，37℃温箱中孵育1.5h。
（4）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。
（5）加入一抗：不同保存方法的小鼠抗AChE单克隆抗体（购自美国Abgent公司，货号AM2184a）以不同浓度加入酶标板，每孔100μl，37℃温箱中孵育1h。
（6）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。
（7）加酶标抗体：加入用PBST溶液稀释10000倍的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，每孔100μl，37℃温箱中孵育1 h。
（8）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。
（9）显色：每孔加入新鲜配制的显色液100μl，避光置37℃温箱10～15min。
（10）终止：每孔加50 μl 2mol/L的H2SO4终止反应。
（11）吸光度测定：酶标仪上测定450nm波长处的各孔吸光值。
图中横坐标为抗体稀释度，1表示1:1000；2表示1:2000；3表示1:4000；4表示1:8000；5表示1:16000；6表示1:32000；7表示1:64000。
测定结果如图1所示，图中：
系列1：本发明产品常温保存6个月的抗体；
系列2：负20度保存6个月的抗体；
系列3：003218在4度保存6个月的抗体；
系列4：1%牛血清白蛋白（溶于磷酸盐缓冲液）常温保存6个月的抗体；
系列5：阴性对照。
由图1可知，本发明产品用于保存抗体，在同等条件下，抗体的效价高于其他保存方法保存的抗体的效价。
实施例3：用实施例1制得的本发明产品保存的胆碱酯酶抗体的免疫印迹（Western）实验。
实验步骤如下：
1、取成年SD大鼠脑组织,置于冰上的组织匀浆液中，匀浆。
2、4度，12000转离心15分钟，取上清，测定蛋白浓度。
3、取相同质量的组织匀浆，进行常规SDS-PAGE电泳。
4、常规转膜，孵育鼠抗ACHE抗体（购自美国Abcam公司，产品货号：ab78228）4度过夜。
5、磷酸盐缓冲液清洗，孵育辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体（购自美国Santa cruz公司，产品货号：sc-2005）室温1.5小时。
6、磷酸盐缓冲液清洗，ECL化学发光液室温下孵育1分钟后，X光片曝光。
结果如图2所示。图中：
4:蛋白Marker；
40:003218在4度保存6个月的抗体；
41：负20度保存6个月的抗体；
42：本发明产品常温保存6个月的抗体；
43：1%牛血清白蛋白（溶于磷酸盐缓冲液）常温保存6个月的抗体。
实验结果表明：
本发明产品用于保存抗体，在同等条件下的免疫印迹反应中，抗体的效价高于其他保存方法保存的抗体的效价。
实施例4：用实施例1制得的本发明产品保存胆碱酯酶抗体的免疫共沉淀（IP）实验。
实验步骤如下：
1、取SD大鼠脑组织匀浆，方法及步骤同实施例3。
2、取相同质量的脑组织匀浆，加入20微升蛋白A包被的免疫磁珠（购自国内碧云天公司，产品货号：P2C12）和5微升自制的胆碱酯酶抗体4度孵育过夜。
3、4度12000转离心15分钟，弃上清，磷酸盐缓冲液清洗。
4、沉淀物加上样缓冲液，煮沸5分钟，常规进行常规SDS-PAGE电泳。
5、常规转膜，孵育鼠抗ACHE抗体（购自美国Abcam公司，产品货号：ab78228）4度过夜。
6、磷酸盐缓冲液清洗，孵育辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体（购自美国Santa cruz公司，产品货号：sc-2005）室温1.5小时。
7、磷酸盐缓冲液清洗，ECL化学发光液室温下孵育1分钟后，X光片曝光。
结果如图3所示。图中：
13:蛋白Marker；
14: 0032184度保存6个月的抗体；
15：负20度保存6个月的抗体；
16：本产品常温保存6个月的抗体；
17：1%牛血清白蛋白（溶于磷酸盐缓冲液）常温保存6个月的抗体；
18：阴性对照。
实验结果表明：
本发明产品用于保存抗体，在同等条件下的免疫共沉淀反应中，抗体的结合能力高于其他保存方法保存的抗体的效价。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (3)
1.一种用于常温下抗体活性保存的溶液，其特征在于：以0.01M磷酸盐缓冲液为溶剂，溶质包括0.75～1.5%牛血清白蛋白，0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，0.02～0.05%叠氮钠， 0.001～0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2；以占溶液总质量的百分比计，溶液的pH值为7.2，制备方法为：取0.01M磷酸盐缓冲液，加入溶液总质量的0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，搅拌溶解后，在1.1～1.2个大气压下加热沸腾20～30分钟，冷却至室温，再加入溶液总质量的0.75～1.5%牛血清白蛋白、0.02～0.05%叠氮钠和0.001～0.0015%的多肽，溶解后过滤，分装保存。
2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于：所述牛血清白蛋白为1%，所述冷水鱼皮肤胶原为1%，所述叠氮钠为0.05%， 所述多肽为0.001%。
3.根据权利要求1所述的溶液的制备方法，其特征在于：取0.01M磷酸盐缓冲液，加入溶液总质量的0.75～1.5%冷水鱼皮肤胶原，搅拌溶解后，在1.1～1.2个大气压下加热沸腾20～30分钟，冷却至室温，再加入溶液总质量的0.75～1.5%牛血清白蛋白、0.02～0.05%叠氮钠和0.001～0.0015%的多肽，溶解后过滤，分装保存，所述多肽的氨基酸序列为：Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2。
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