DE3872575T2

DE3872575T2 - Ckmb-bestimmung, monoclonale antikoerper zur verwendung darin und hybrid-zellinien.

Info

Publication number: DE3872575T2
Application number: DE8888303056T
Authority: DE
Inventors: Uri Piran; Christine Anne Vitkauskas
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-04-09
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2008-04-07
Also published as: AU1409688A; JP2657388B2; CA1340557C; ATE78102T1; JPH01262471A; AU598358B2; DE3872575D1; ES2052710T3; EP0288179B1; EP0288179A1

Description

Die Erfindung betrifft einen CKMB-Test, monoklonale Antikörper zur Verwendung in diesem Test und Hybridzellinien.
Das Enzym Kreatinkinase (d.h. ATP: Kreatin-N-Phosphotransferase, EC 2.7.3.2) ist ein Dimer, welches entweder aus zwei M- Monomeren (CKMM), zwei B-Monomeren (CKBB), oder einem M- und einem B-Monomer (CKMB) zusammengesetzt ist. Jedes dieser Isoenzyme besitzt das gleiche Molekulargewicht und katalysiert die gleiche Reaktion, d.h., die reversible Phosphorylierung von Kreatin. Sie unterscheiden sich in ihrer molekularen Struktur und nehmen in einem alkalischen Puffer eine Ladung an, wodurch es möglich ist, sie durch Elektrophorese zu trennen. Vergleiche hierzu Lott, J.A., Creatine Kinase, Lactate Dehydrogenase and their Isoenzymes in Clinical Medicine, Corning Medical Publication, Medfield, Massachusetts, 1984; und Lang, H. (ed), Creatine Kinase Isoenzymes, Pathophysiology and Clinical Application, Springer-Verlag, New York, 1981.
Die korrekte Diagnose des akuten Myocardinfarktes (MI) bedeutet eine kritische klinische Herausforderung, die das überleben eines Patienten bestimmen kann. Da CKMB fast ausschließlich im Herzmuskel vorhanden ist, können Serumkonzentrationen an CKMB dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob eine Schädigung (z.B. MI) des Herzmuskels vorliegt. Im Vergleich zu anderen Enzymen, wie beispielsweise Laktatdehydrogenase und Aspartattransaminase, ist CKMB ein spezifischer Marker für einen Myokardinfarkt, weil sie insbesondere im Herzmuskel lokalisiert ist. Vergleiche hierzu Galen, R.S., et al., "Isoenzymes of CPK and LDH in Myocardial Infarction and Certain Other Diseases", Pathobiol. Annu., 5: 283-315 (1975); und Lott, S.A., et al., "Serum Enzymes and Isoenzymes in the Diagnosis and Differential Diagnosis of Myocardial Infarction", Clin. Chem., 26: 1241, (1980). Weiterhin wird CKMB bei einem Infarkt vor den anderen Enzymen freigesetzt, woraus sich die Möglichkeit zu einer früheren Diagnosestellung ergibt. Vergleiche hierzu Kiyasu, J.Y., "Current Status of Detecting CK-MB for Patient Management", Amer. Clin. Prod., 4: 23-31, (1985). Zusätzlich zum Nachweis für das Vorliegen oder das Fehlen eines Infarktes können die Serumkonzentrationen an CKMB ebenfalls dazu verwendet werden, das Ausmaß des Myokardinfarktes abzuschätzen und zu erkennen, ob ein Reinfarkt aufgetreten ist. Vergleiche hierzu Lott, J.A., supra; Konttinen, A., "The Isoenzymes of Creatine Kinase in Various Diseases", in Enzymes in Health and Disease, Inaug. Scient. Meet. Int. Soc. Clin. Enzymol., London, 1977, pages 149-153; Kupper N. and Bliefeld W., "Serum Enzyme changes in Patients with Cardiac Disease", in Advances in Clinical Enzymology, 1979, pages 106-122; und Hackshaw B., Clinical Chemistry, 30: 1285 (1984).
Aufgrund der diagnostischen Bedeutung dieses Enzyms wurden zahlreiche Techniken zur Bestimmung von CKMB-Konzentrationen im Serum entwickelt. Vergleiche hierzu Abbott et al., "Methods for CK-MB Analysis Used to Monitor Cardiac Patients", Journal of Clinical Immunoassay, 8: 147-151 (1985); Chan et al., "Immunoenzymetric Assay for Creatine Kinase MB with Subunit-Specific Monoclonal Antibodies Compared with an Immunochemical Method and Electrophoresis", Clinical Chemistry, 31: 465-469 (1985); Jackson et al., "Two-Site Monoclonal Antibody Assays for Human Heart- and Brain-Type Creatine Kinase", Clinical Chemistry, 30: 1157-1162 (1984); und PCT-Offenlegungsschrift No. WO 86/00992, veröffentlicht am 13. Februar 1986. Die herkömmlichen Testverfahren weisen verschiedene Nachteile auf, z.B. konnte das volle diagnostische Potential von CKMB bis heute noch nicht ausgenutzt werden.
Zu den Techniken, die entwickelt wurden, um die Konzentration von CKMB im Serum zu bestimmen, gehört die elektrophoretische Abtrennung oder die Ionenaustauschtrennung von CK-Fraktionen, gefolgt von der Bestimmung der CK-Aktivität in der MB-Fraktion. Weiterhin wurden Radioimmunotests und Immunoinhibierungstests einschließlich zweiseitiger immunometrischer Tests und Immunoinhibierungs-/Immunopräzipitationstests entwickelt. All diese Methoden können falsch positive Resultate ergeben, und zwar aufgrund von Artefakten und Varianten, die ähnlich wie CKMB migrieren (Trennungstyptechniken) oder aufgrund von Wechselwirkungen, beispielsweise solche, die von CKBB, CKMM, Makro CK-1 und anderen Enzymen verursacht werden (Immunotechniken). Weiterhin sind Elektrophoresetests und zweiseitige immunometrische Tests zeitraubend und ermüdend, weil sie viele Inkubations- und Waschschrittte umfassen.
Aus dem Stand der Technik sind zweiseitige immunometrische Tests für CKMB bekannt, die auf einer Sandwichbildung zwischen Anti-CKMM und Anti-CKBB-Antikörpern basieren. Vergleiche hierzu die PCT-Offenlegungsschrift No. WO 86/00992, veröffentlicht am 13. Februar 1986; Youens, J.E.B., et al., "Clinical and Analytical Validation of an Enzymometric Assay for Creatine Kinase-MB Isoenzyme", Ann. Clin. Biochem., 23: 463-469, (1986); Medeiros, L.J., et al., "Quantification of CK-MB by the Quick MB and Tandem-E CK-MB Immunoassays: Comparison to Elektrophoresis", J. Clin. Immunoassay, 8 : 152-156, (1985); und Chan, D.W., et al., "Immunoenzymetric Assay for Creatine Kinase-MB with Subunit-Specific Monoclonal Antibodies Compared with an Immunochemical Method and Elektrophoresis", Clin. Chem., 31: 465-469, (1985). Wie unten gezeigt wird, ergeben sich bei dieser Vorgehensweise, wenn sie in einem Einzel-Inkubationstest verwendet wird, Standardkurven, die für die Wechselwirkung zwischen CKMM und CKBB anfällig sind.
Vor kurzem wurde die Verwendung eines monoklonalen Anti-CKMB- Antikörpers in einem CKMB-Test beschrieben. Vergleiche hierzu Vaidya et al., "Direct Measurement of Creatine Kinase-MB Activity in Serum after Extraction with a Monoclonal Antibody Specific to the MB Isoenzyme", Clinical Chemistry, 32: 657-663 (1986). Der bei dieser Untersuchung verwendete monoklonale Antikörper war ein Maus-Antikörper vom IgG2b-Typ Der Antikörper war an Polymerkügelchen gekoppelt und die Kügelchen wurden dazu verwendet, CKMB aus den Serumproben zu extrahieren. Die Menge an extrahiertem CKMB wurde enzymatisch dadurch bestimmt, daß die Kügelchen mit CK-Reagenz 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert wurden, die Kügelchen anschließend zentrifugiert, ein Teil des Überstandes entfernt und die Absorption dieses Teiles bei 340 nm gemessen wurde.
Dieser Test von Vaidya et al. weist eine Anzahl von Problemen auf. In erster Linie liegen diese Probleme darin, daß durch den Test die CKMB-Aktivität bestimmt wird und weniger die Gewichtskonzentration; dies führt zu Ungenauigkeiten und der Verringerung der CKMB-Aktivität zwischen dem Zeitpunkt der Blutprobenentnahme und dem Zeitpunkt, an welchem der Test durchgeführt wird. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß derartige Zeiträume als auch die Umweltbedingungen, die auf die verschiedenen Proben während dieser Zeitabschnitte einwirken, in einer klinischen Einrichtung von Probe zu Probe in einem weiten Bereich variieren können. Die Gewichtskonzentration von CKMB in einer Probe ist andererseits relativ unempfindlich gegen die einzelnen Lagerzeiten und Lagerbedingungen, denen die Probe ausgesetzt war. Vergleiche hierzu Murthy et al., "Activity Concentration and Mass Concentration (Monoclonal Antibody Immunoenzyometric Method) Compared for Creatine Kinase MB Isoenzyme in Serum", Clin. Chem., 32: 1956 (1986).
Weiterhin ist der im Bericht von Vaidya et al. offenbarte monoklonale Antikörper nicht besonders gut zur Verwendung im kommerziellen Test geeignet. Wie oben ausgeführt, ist der Antikörper von Vaidya et al. vom IgG2b-Typ. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß Antikörper dieses Typs gegen Einfrieren empfindlich reagieren, daß sie dazu neigen, in Lösungen mit geringen Salzkonzentrationen zu präzipitieren und auf den Abbau durch proteolytische Enzyme empfindlicher reagieren als andere IgG-Antikörper-Typen, insbesondere Antikörper vom IgG1- Typ. Weiterhin sind, im Vergleich zu Antikörpern vom IgG2b- Typ, Antikörper vom IgG1-Typ im allgemeinen leichter zu derivatisieren, d.h., leichter mit einem Enzym, einem chemilumineszierenden Material oder ähnlichem zu markieren. Vergleiche hierzu Goding, J.W., Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press, Inc., New York, New York, 1983, page 15; und Parham, P., "On the Fragmentation of Monoclonal IgG1, IgG2a and IgG2b from BALB/c Mice", Journal of Immunology, 131: 2895-2902 (1983).
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Tests zur Bestimmung der Konzentration von CKMB in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Serumproben, bereitzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte CKMB-Tests von leichter Handhabbarkeit und hoher Genauigkeit bereitzustellen, die im wesentlichen nicht mit CKMM, CKBB, Makro-CK-1 oder anderen Enzymen, die in Serumproben vorkommen, interferieren. In Verbindung mit diesen Aufgaben ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, monoklonale Anti-CKMB-Antikörper bereitzustellen, die sich zur Verwendung in kommerziellen CKMB-Tests eignen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Anti-CKMB monoklonale Antikörper der Maus vom IgG1-Typ bereitzustellen.
Dieses und weitere Aufgaben der Erfindung werden durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis von CKMB in einer biologischen Flüssigkeit gelöst, welches die folgenden Verfahrensschritte aufweist:
(a) Herstellen einer Mischung aus (i) einer Probe der biologischen Flüssigkeit, (ii) einem Antikörper gegen CKB, der an einen festen Träger gebunden vorliegt, und (iii) einem markierten, monoklonalen Antikörper gegen CKMB;
(b) Inkubieren der Mischung;
(c) Abtrennen des festen Trägers von der Mischung und
(d) Nachweis der Menge an Markierung, die mit dem festen Träger verbunden ist.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besteht der feste Träger aus magnetischen Partikeln, und der monoklonale Anti-CKMB-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper der Maus vom IgG1-Typ, der mit einem chemilumineszierenden Material markiert ist.
Weiterhin werden durch die Erfindung monoklonale anti-CKMB Antikörper bereitgestellt, die von von der Maus stammenden Hybridzellinien produziert werden und die vom IgG1-Typ sind. Derartige monoklonale Antikörper können bei der Durchführung des oben beschriebenen bevorzugten Verfahrens zum Nachweis von CKMB oder bei anderen bereits bekannten oder in der Folge entwickelten Verfahren zum Nachweis dieser oder anderer Enzyme verwendet werden.
Insbesondere wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des MB-Isoenzyms der Kreatinkinase in einer biologischen Flüssigkeit bereitgestellt. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
(a) Herstellen einer Mischung aus (i) einer Probe der biologischen Flüssigkeit, (ii) einem Antikörper gegen das B-Monomer der Kreatinkinase, wobei dieser Antikörper an einen festen Träger gebunden vorliegt, und (iii) einem markierten monoklonalen Antikörper der Maus vom IgG1-Typ, der spezifisch für das MB- Isoenzym der Kreatinkinase ist;
(b) Inkubieren der Mischung;
(c) Abtrennen des festen Trägers von der Mischung und
(d) Nachweis der Menge an Markierung, die mit dem festen Träger verbunden ist.
(a)-(d) Sind in etwa einer Stunde abgeschlossen.
Durch die vorstehende Erfindung wird weiterhin ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er von einer von der Maus stammenden Hybridzellinie produziert wird, wobei dieser Antikörper in der Lage ist, spezifisch an wenigstens eine antigene Determinante des MB-Isoenzyms der menschlichen Kreatinkinase zu binden, und dieser Antikörper vom IgG1-Typ ist und im wesentlichen nicht mit den BB- und MM-Isoenzymen der menschlichen Kreatinkinase kreuzreagiert.
Die vorstehende Erfindung stellt weiterhin die von der Maus stammenden Hybridzellinien ATCC HB 9389 oder HB 9388 bereit.
Die beiliegenden Zeichnungen bedeuten :
Figur 1 zeigt eine Tabelle, welche die Spezifität und "sandwich"-Kompatibilität der folgenden Anti-CK-Antikörper illustriert; AH6 -- anti-CKM; CA8 -- anti-CKB; 13G1 -- anti-CKMB; und 007 -- anti-CKMB. Je für CKBB, CKMM und CKMB wurde eine Standardkurve (0-1000 µg/l) hergestellt, wobei die in der Tabelle aufgeführten Fang-/Tracer-Antikörper verwendet wurden. Kompatible Kombinationen ("+"-Kombinationen) zeigten eine Sensitivität von wenigstens 1 µg/l. Inkompatible Kombinationen ("-"-Kombinationen) zeigten eine Immunoreaktivität von weniger als 0,1 %. Es zeigte sich, daß der 13G1-Antikörper eine "trace"-Kreuzreaktivität mit CKBB aufwies (etwa 1%).
Figur 2 zeigt die Spezifität des 007-Antikörpers. Insbesondere zeigt diese Figur die Bindung von markiertem CKMB an den 007-Antikörper in Gegenwart verschiedner Konzentrationen an gereinigtem CKMB (Dreiecke), CKMM (Kreuze) und CKBB (Kreise). Die Daten sind aufgetragen in Form von Prozenten an Zählimpulsen, die in Gegenwart des Kompetitors gebunden sind, im Vergleich zu den Zählimpulsen für den 0 Standard (B&sub0;), gegen die Konzentration des hinzugefügten Kompetitors (µg/ml).
Figur 3 zeigt die Empfindlichkeit von CKMB Standardkurven gegen die Inhibierung durch CKMM und CKBB in verschiedenen Testkonfigurationen. Die geschlossenen Kreise zeigen Standards, die ausschließlich CKMB betreffen, die offenen Kreise zeigen Standards, zu denen 5000 ug/l CKMM hinzugegeben wurden; die Dreiecke stehen für Standards, zu welchen 1000 µg/l CKBB zugefügt wurde.
Figur 4 zeigt eine typische Standardkurve, die durch die Verwendung eines Anti-CK-Antikörpers (CA8) als Fangantikörper und einen Anti-CKMB-Antikörper (007) als Tracer-Antikörper.
Figur 5 zeigt die Korrelation zwischen einem CKMB-Test, der erfindungsgemäß durchgeführt wurde (Anti-CKB (CA8) war der Fangantikörper und Anti-CKMB (007) war der Tracer-Antikörper) und einem Test, der gemäß der herkömmlichen elektrophoretischen Trennungstechnik durchgeführt wurde. Patientenseren wurden zweifach in beiden Verfahren getestet. Die in Fig. 5 gezeigten alphabetischen Datenpunkte zeigen die Zahl an Probenergebnissen bei einer bestimmten Koordinate wie folgt: A = 1, B = 2, C = 3, D = 4, G = 7, I = 9 und M = 13.
Wie bereits oben angeführt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung einen zweiseitigen (sandwich) Immunotest zum Nachweis von CKMB in Proben biologischer Flüssigkeiten wie z.B. menschlichem Serum. Insbesondere verwendet der Test einen Antikörper gegen CKB, der an einem festen Träger (den "Fangantikörper") gebunden ist und einem markierten Antikörper gegen CKMB (den "Tracerantikörper").
Der Fangantikörper kann ein polyklonaler Antikörper sein, der aus dem Serum eines Tieres gewonnen wurde, welches gegen CKBB immunisiert wurde oder ein monoklonaler Antikörper, der von einer Hybridzellinie produziert wird. Monoklonale Antikörper und insbesondere monoklonale Antikörper der Maus vom IgG1-Typ werden erfindungsgemäß bevorzugt. Polyklonale Antikörper gegen CKBB sind unter anderem von der Fa. Pel Freez Corporation und der Fa. Ventrex Corporation erhältlich; ein gegen dieses Antigen gerichteter monoklonaler Antikörper ist von der Fa. Hybritech, Inc. erhältlich. Wie unten in Beispiel 2 gezeigt wird, ist anti-CKB der bevorzugte Fangantikörper, da der Test im wesentlichen frei von CKMM- und CKBB-Wechselwirkungen ist, wenn dieser Fangantikörper in Kombination mit einem CKMB-Tracer-Antikörper verwendet wird, und zwar sogar dann, wenn nur ein einzelner Inkubationsschritt und ein einzelner Trennungs/Waschschritt verwendet werden.
Der Fangantikörper kann von einer Vielzahl von festen Trägern getragen werden, wozu beispielsweise Glas- und Kunststoffkügelchen, magnetische Teilchen, die Außenoberfläche eines Stabes, einer Scheibe oder einer ähnlichen Struktur, die Innenoberfläche eines Teströhrchens oder eines anderen Behälters und ähnliches gehören. In gleicher Weise können verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Techniken verwendet werden, um den Fangantikörper an seinen festen Träger anzulagern. Aufgrund ihrer einfachen Verwendungsweise sind magnetische Teilchen und insbesondere solche magnetische Teilchen, die im US-Patent No. 4,554,088 offenbart sind, erfindungsgemäß bevorzugt. Fangantikörper können einfacherweise an Teilchen dieser Art durch die Beschichtung der Teilchen mit Silan, Aktivierung der Teilchen mit Glutaraldehyd, Waschen der Teilchen und anschließender Zugabe des Antikörpers gekoppelt werden. Vergleiche hierzu Reichlin, M., "Use of glutaraldehyde as a Coupling Agent for Proteins and Peptides", Method of Enzymology, 70: 159-165, (1980).
Der Tracer-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper gegen CKMB. Wie oben bereits ausgeführt wurde, sind, um einen zur Verwendung in einem kommerziellen Test geeigneten Antikörper bereitzustellen, monoklonale Antikörper der Maus vom IgG1-Typ bevorzugt. Antikörper dieses Typs sind stabiler und leichter zu markieren als beispielsweise Antikörper vom IgG2-Typ. Insbesondere wurde gefunden, daß sich bei Verwendung eines IgG1- Tracer-Antikörpers im vorliegenden Test ein höheres Signal ergibt als die Verwendung eines IgG2b-Antikörpers unter den gleichen Bedingungen. Weiterhin können IgG1-Typ Antikörper eingefroren und aufgetaut werden, ohne daß signifikante Verluste in der Aktivität auftreten. Im kommerziellen Rahmen kann ein derartiges Einfrieren und Auftauen beispielsweise während des Transportes und der Lagerung der Testkits und der Testbestandteile auftreten
Wie im nachfolgenden Beispiel 1 im einzelnen ausgeführt wird, können die monoklonalen Antikörper der Maus gegen CKMB vom IgG1-Typ durch Immunisierung der Mäuse mit gereinigtem CKMB, Entfernen der Splenocyten von den immunisierten Mäusen, Fusionieren der Splenocyten mit einer unsterblichen Zellinie der Maus und Screening der sich daraus ergebenden Hybridome nach Zellen, die Antikörper gegen CKMB produzieren, hergestellt werden. Die von den ausgewählten Hybridomen produzierten Antikörper werden anschließend weiterhin nach dem Antikörper-Typ und der Kreuz-Reaktivität mit CKBB und CKMM gescreent. Die Antikörper vom IgG1-Typ mit geringen Kreuz-Reaktivitäten, z.B. weniger als 1 % für CKBB und CKMM, bilden die bevorzugten Tracer-Antikörper zur Verwendung in der vorstehenden Erfindung.
Der Anti-CKMB-Antikörper kann mit einer Vielzahl von Markierungen markiert werden; hierzu gehören beispielsweise radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen, enzymatische Markierungen, chemilumineszierende Markierungen und ähnliches. Chemilumineszierende Markierungen und insbesondere chemilumineszierende Markierungen, die einen Acridiniumester als chemilumineszierendes Material verwenden, werden erfindungsgemäß bevorzugt.
Wie im nachfolgenden Beispiel 3 gezeigt wird, können durch die Verwendung einer Markierung dieses Typs CKMB Konzentrationen in Serumproben durch den Endverbraucher durch die Verwendung von nur zwei Kalibratorproben bestimmt werden, während im Gegensatz dazu vier oder mehr Standards bei anderen Markierungen benötigt werden. Eine Beschreibung der bevorzugten Markierungen und geeignete Techniken zur Kopplung der Markierungen an die Antikörper sind in der EP-A 263657 offenbart.
In einer bevorzugten Ausgestaltung erfordert der vollständige Test die Ausführung von lediglich vier Schritten: 1) Inkubation, 2) Abtrennung, 3) Waschen und 4) Zählen. Selbstverständlich können zusätzliche Inkubations- und Waschschritte bei der Ausführung der Erfindung durchgeführt werden, falls dies wünschenswert ist.
Wie im nachfolgenden Beispiel 3 ausgeführt wird, können Inkubationen bei Raumtemperatur durchgeführt werden, die lediglich 30 Minuten oder sogar nur 10 Minuten dauern, wenn der Test in einem "stat"-Mode durchgeführt wird. Weiterhin benötigt der Benutzer bei Verwendung einer Acridiniumester-Markierung nur zwei Kalibratorproben, um den gemessenen Lichtdurchgang für eine Patientenprobe zu einem Konzentrationswert umzurechnen. Weiterhin sind bei Verwendung magnetischer Teilchen als fester Träger Abtrennungen schnell und leicht durchführbar.
Durch die kombinierten Wirkungen jedes einzelnen dieser Faktoren ist der erfindungsgemäße Test sowohl einfach verwendbar als auch schnell durchzuführen. Im Vergleich zu den Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen es typischerweise ca. zwei Stunden oder länger dauerte, um ein Ergebnis für eine Probe zu erhalten, kann der erfindungsgemäße Test leicht in weniger als einer Stunde vollständig durchgeführt werden. Aufgrund der besonderen Bedeutung, die der schnellen Diagnose von Myocardinfarkten zukommt, sind die kurze Gesamtdauer des erfindungsgemäßen Tests und dessen leichte Durchführbarkeit wichtige Faktoren für seinen Wert.
Basierend auf der vorstehenden Beschreibung wird die Erfindung nachfolgend durch einzelne Beispiele näher veranschaulicht.

Beispiel 1

Herstellung von monoklonalen Anti-CKMB Antikörpern

Monoklonale Antikörper gegen menschliches CKMB wurden hergestellt unter Verwendung der nachfolgenden Immunisierungs-, Fusions-, Screening- und Isotyp-Charakterisierungsverfahren.
Immunisierungsprotokoll: Sechs Wochen alte weibliche A/J-Mäuse, H-2a Haplotyp, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 04609), wurden intraperitoneal mit 30 µg an gereinigtem CKMB (Scripps Laboratories, San Diego, CA), emulgiert im gleichen Volumen von vollständigem Freund's Adjuvans (CFA) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) am Tag 0 und am Tag 21 injiziert. Einen Monat später wurde die gleiche Menge an Antigen in unvollständigem Freund's Adjuvans in die Fußpfoten und subkutan verabreicht. Fünf Wochen später wurden 20 ug in CFA intraperitoneal injiziert. Der abschließende Boost von 19 µg in steriler Kochsalzlösung wurde intravenös vier Tage vor der Fusion und sieben Wochen nach der letzten Injektion verabreicht.
Fusionsprotokoll: Splenocyten aus einer immunisierten Maus (1x10&sup8;) wurden mit Zellen (2x10&sup7;) aus einer Balb/c Maus Myelomazellinie (Sp2/0-Ag14 Zellen, erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Zugangsnummer ATCC CRL-1581) in Gegenwart von Polyethylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht 950 - 1050) (J.T. Baker Company, Phillipsburg, N.J. 05865) fusioniert, wobei im wesentlichen das von Kohler und Milstein (Nature, 256; 495- 497, (1975)) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die Fusion wurde auf die Vertiefungen in 96-Well Microtiter Gewebekulturplatten (Corning Glass Works, Corning NY) verteilt und bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Nach zwei Wochen wurden die Hybridome nach Antikörpern, die mit CKMB reagieren, gescreent.
Screening Verfahren: Die Hybridome wurden auf Antikörper gegen CKMB unter Verwendung eines Doppel-Antikörperchemilumineszenz- Tests gescreent. Gereinigtes CKMB wurde mit Dimethylacridiniumester (n-Hydroxysuccinimid) (DMAE-NHS) wie folgt markiert: zu 100 ug gereinigtem CKMB in 1 ml Markierungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,0) wurden 5 µg DMAE-NHS in 0,1 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Mischung wurde vorgetext und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde anschließend auf eine Sephadex (Registriertes Warenzeichen) G-25 (PD-10) Säule (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ 08854) aufgebracht und das Porenvolumen gesammelt. Das markierte CKMB wurde in 0,1 % Rinderserum Albumin (BSA) und phosphatgepufferter Saline von pH 7,4 mit 0,01 % Thimerosal verdünnt und bei 4ºC gelagert.
Das Screeningverfahren bestand aus der Verbindung von 100 µl CKMB-DMAE mit 100 µl des Hybridoma-Kulturüberstandes in 12x75 mm Polystyrolröhrchen (Walter Sarstedt, Princeton, NJ 08540) und dem Inkubieren der Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Ein zweiter Antikörper, d.h. Ziege Anti-Maus Ig (Cambridge Medical Diagnostics, Inc., Billerica, MA 01865) immobilisiert auf magnetischen Teilchen (Advanced Magnetics, Inc. Cambridge, Massachusetts; see Groman et al., "Product Application Focus, BioMag -- A New Support for Magnetic Affinity Chromatograph", Biotechniques, March/April 1985, pages 156- 160) wurde zu den Reagenzröhrchen gegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Eine Corning-Vorrichtung zur magnetischen Abtrennung (Ciba- Corning Diagnostics, Walpole, MA 02135) wurde verwendet, um die Antigen/Doppel-Antikörper Komplexe vom Rest der Lösung abzutrennen. Die Komplexe wurden einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und unter Verwendung eines Photonenzählers (810 Luminometer, Ciba-Corning Diagnostics, Walpole, MA 02135). Vergleiche Weeks et al., "Chemiluminescence Immunoassay", J. of Clin. Immunoassay, 7: 82-88, (1984)) gezählt.
Die Hybridoma-Überstände wurden als positiv gewertet, wenn die Zählimpulse wenigstens das dreifache der negativen Kontrollüberstände, die aus den Wachstumsnegativen Wells stammten, betrugen. Die positiven Hybridome wurden selektiert und in 24 Well Gewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA 02139) überführt, wo es den Zellinien ermöglicht wurde, zu wachsen. Der Kulturüberstand wurde von den 24 Well Platten abgeerntet und erneut auf Antikörper gegen CKMB getestet.
Isotyp-Charakterisierungsverfahren: Die Isotypen der monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung des Mono-AB ID Enzym Immunotest Kits (Zymed Laboratories, San Francisco, CA 94080) bestimmt.
Nach Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahren wurden zwei monoklonale Anti-CKMB Antikörper identifiziert, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Tests geeignet sind (Antikörper "007" und "13G1",). Beide Antikörper waren vom IgG1 Typ und hatten kappa leichte Ketten. Zusätzlich zur Produktion von Anti-CKMB-Antikörpern wurde gefunden, daß die Fusionen ebenfalls Anti-CKM und Anti-CKMB-Atnikörper produzierten.
Die Hybridome, die die 007 und 13G1 Antikörper produzierten, wurden durch Grenzverdünnung kloniert, um sicherzustellen, daß die monoklonale Antikörperzellinie stabil war. Vergleiche hierzu Goding, aaO auf Seite 85. Es wurde gefunden, daß beide Zellinien stabil waren.
Zur weiteren Auswertung wurden die von diesen Zellinien produzierten Antikörper wie folgt gereinigt. 50 ml des Kulturüberstandes wurden unter Verwendung eines Amicon-Konzentrators (Amicon Corporation, Danvers, MA) konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend gereinigt unter Verwendung eines AFFI-Gels (eingetragenes Warenzeichen)-Bio-Rad Protein A MAPS II KIT (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94801). Schließlich wurden die Antikörper gegen 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,0, dialysiert. Die Reinheit der Antikörper wurde durch eine hochauflösende Gelelektrophorese bestimmt.
Um die Brauchbarkeit der zwei monoklonalen Anti-CKMB Antikörper für zweiseitige Immunotests abzuschätzen, wurden Standardkurven für verschiedene Konzentrationen an CKMB, CKBB und CKMM aufgestellt unter Verwendung der potentiellen Anti-CKMB-Antikörper und Anti-CKM und Anti-CKB monoklonalen Antikörper (Antikörper "AH6" bzw. "CA8"), die mit Hilfe von Verfahren hergestellt wurden, die denjenigen Verfahren ähnlich sind, die verwendet wurden, um Anti-CKMB-Antikörper herzustellen, wobei allerdings CKMM und CKBB als Antigene verwendet wurden. Insbesondere wurden die Standardkurven durch Markierung des Tracer-Antikörpers mit DMAE und Kupplung des Fangantikörpers an magnetische Teilchen (Advanced Magnetics, aa0) aufgestellt.
Die Markierung der Tracer-Antikörper wurde wie folgt durchgeführt. Zu 0,25 mg Antikörper in 1 ml Markierungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,0) wurden 40 µg DMAE-NHS in 0,2 ml Dimethylformamid zugegeben. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden 5 mg DL-Lysin in 0,5 ml Markierungspuffer hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Die Reaktionsmischung wurde auf eine kleine Sephadex G-25 Säule (PD-10) aufgetragen, und das Porenvolumen wurde gesammelt. Das zur Chromatographie und zur Lagerung der Tracer verwendete Puffersystem war ein sogenannter "Tracer-Puffer", der aus 0,01 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid, 0,25% BSA, 0,1 % Natriumazid, pH 7,4, bestand. Eine weitere Aufreinigung des Tracers wurde durch Chromatographie auf Sephacryl (eingetragenes Warenzeichen) S-400 erreicht. Der Tracer in 3 ml wurde auf eine Sephacryl S-400 Säule aufgetragen und in "Tracer-Puffer" chromatographiert. Es wurden Säulengrößen von 10 ml, 20ml und 200 ml getestet. Die große Säule trennte den Tracer von größeren Aggregaten und kleineren Peaks, die nach dem Tracer Peak eluierten. Die kleinen Säulen zeigten einen Hauptpeak. In beiden Fällen jedoch wurde eine zehnfache Zunahme im Signal/Rauschverhältnis aufgrund der Abnahme im Hintergrund gefunden. Es ist anzunehmen, daß die Sephacrylsäule nicht identifizierte Verunreinigungen durch Adsorption entfernte.
Das zur Herstellung der Standardkurven verwendete Testformat war wie folgt (das Format variierte etwas von Experiment zu Experiment, jedoch nicht in einem solchen Maß, bei dem die abschließenden Ergebnisse beeinflußt würden): 0,1 ml Standard wurde zu 0,1 ml Tracer Antikörper hinzugegeben und vorgetext. In Abhängigkeit vom spezifischen Experiment wurden 0,1, 0,2 oder 0,5 ml des Fangantikörpers zugegeben, und die Mischung wurde 10 Minuten lang, 30 Minuten lang oder 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, ebenfalls wieder in Abhängigkeit vom spezifischen Experiment. Der Komplex wurde unter Verwendung einer magnetischen Trenneinheit von Corning abgetrennt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Test wurde auf einem 810 Luminometer ausgezählt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Wie Fig. 1 zu entnehmen ist, zeigten die monoklonalen Antikörper 007 und 13G1 CKMB- "Sandwich"-Kombatibilität sowohl mit Anti-CKM und Anti-CKB, jedoch nicht mit anderen Antikörpern. Die Anti-CKM (AH6) und Anti-CKB (CA8)- Antikörper wiesen ebenfalls CKMB "Sandwich"- Kompatibilität auf. Das Fehlen der "Sandwich"-Bildung mit CKMM und CKBB Antigenen (bis zu 1000 µg/l) zeigt die hohen Spezifitäten (größer als 99,9 %) der 007, AH6 und CA8 Antikörper. Der 13G1 Antikörper zeigte eine leichte Kreuzreaktion mit CKBB. Obwohl dieser Antikörper ebenfalls als geeignet zur Verwendung in einem CKMB Test angesehen wurde, wurde er aus diesem Grund als weniger geeignet angesehen als der 007 Antikörper.
Der 007 Antikörper wurde weiterhin bezüglich seiner Spezifität charakterisiert. Im einzelnen wurde die Bindung von CKNB-DMAE an diesen Antikörper in Gegenwart von bis zu 10 µg/ml von gereinigtem CKBB, CKMM und CKMB (Scripps Laboratories, San Diego, CA) bestimmt. Die Isoenzymstandards wurden aus Stammlösungen hergestellt, die in 50 % Glycerin bei -20ºC gelagert wurden. Jedes Isoenzym wurde auf die gewünschten Konzentrationen in 50 mM PIPES, 100 mM Natriumchlorid, 5 % BSA, 0,1 % Natriumazid, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (pH 6,7) verdünnt.
Zu 100 µl einer Grenzverdünnung des Kulturüberstandes, d.h. die Verdünnung, die 50 % der maximalen Bindung ergab, wurden 100 µl CKMB-DMAE und 100 µl des Isoenzymstandards zugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Hierzu wurden Ziege Anti-Maus Ig magnetische Teilchen (Advanced Magnetics, aa0) zugegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde abgetrennt und wie oben im Zusammenhang mit dem Screeningverfahren beschrieben, abgetrennt. Die Innibierung der Zellimpulse zeigte die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers mit dem Isoenzym.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Wie darin gezeigt wird, wies der 007 Antikörper im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit CKMM oder CKBB bis zu Konzentrationen von 10 µg/ml auf.
Die Hybridzellinie, die den 007 Anti-CKMB-Antikörper produziert, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, und sie weist die Zugangsnummer HB 9389 auf Die Hybridzellinie, die den CA8 Anti-CKB-Antikörper produziert, wurde ebenfalls bei der American Type Culture Collection hinterlegt und weist die Zugangsnummer HB 9388 auf. Wie der 007 Antikörper ist der CA8 Antikörper vom IgG1 Typ und besitzt kappa leichte Ketten. In ähnlicher Weise ist die den CA8 Antikörper produzierende Zellinie eine stabile Zellinie.

Beispiel 2

Testgestaltung

Dieses Bespiel veranschaulicht die Entwicklung einer CKMB-Test Konfiguration, die für Wechselwirkungen mit CKMM oder CKBB nicht empfänglich ist und sogar nur einen Inkubationsschritt erfordert.
Die CKMB Standardkurven wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit von entweder 5000 µg/l CKMM oder 1000 µg/l CKBB unter Verwendung von vier verschiedenen Testkonfigurationen erstellt, d.h., Anti-CKM (AH6) als Fangantikörper, entweder mit Anti-CKB (CA8) oder Anti-CKMB (007) als Tracer-Antikörper, und Anti-CKB (CA8) als Fangantikörper, entweder mit Anti-CKM (AH6) oder Anti-CKMB (007) als Tracer-Antikörper. Die Standardkurven wurden in gleicher Weise wie die Standardkurven des Beispiels 1 erstellt.
Wenn der Festphasen-Antikörper Anti-CKM war, wurde die Standardkurve durch CKBB inhibiert, wenn als Tracer-Antikörper markiertes Anti-CKB verwendet wurde (Fig. 3A); sie wurde jedoch nicht inhibiert, wenn Anti-CKMB als Tracer fungierte (Fig. 3B). Die Inhibierung mit CKBB konnte entweder durch einen Waschschritt vor der Zugabe des markierten Anti-CKB oder durch eine vielfache Erhöhung der Menge an Tracer entfernt werden. Die Vergrößerung der Tracermenge führte jedoch zu einem hohen, nicht-spezifischen Signal. Bei Verwendung von Anti- CKM als Fangantikörper wurde die Standardkurve durch CKMM erniedrigt, unabhängig von der Art des verwendeten Tracers (Figuren 3A und 3B).
Wenn als Festphasen-Antikörper Anti-CKB und als Tracer-Antikörper Anti-CKM verwendet wurde, konnte eine starke Inhibierung der Standardkurve durch CKMM beobachtet werden (Fig. 3C). Mit CKBB war jedoch keine Inhibierung beobachtbar (Fig. 3C). Ein Waschschritt vor Zugabe des Tracers war wirksam bei der Eliminierung der CKMM Inhibierung.
Wenn als Festphasen-Antikörper Anti-CKB und als Tracer-Antikörper Anti-CKMB verwendet wurden, trat keine Wechselwirkung mit CKMM oder CKBB auf (fig. 3D). Hieraus folgt, daß diese Konfiguration im Vergleich zu den anderen Konfigurationen die besten Eigenschaften aufweist, da sowohl beide Wechselwirkungen vermieden werden als auch nur ein Inkubationsschritt erforderlich ist.

Beispiel 3

Test-Optimierung und Testverfahren

Dieses Beispiel betrifft die Optimierung und den Testablauf der bevorzugten CKMB Testkonfiguration aus Beispiel 2, wobei Anti-CKB (CA8) und Anti-CKMB (007) als Fang- bzw. Tracer-Antikörper verwendet werden.
Es wurde gefunden, daß die mit dem 007-Antikörper als Tracer- Antikörper erstellte Standardkurve auf den pH des Mediums sensitiv reagiert. Insbesondere wurde eine graduelle Abnahme des Signals beobachtet, wenn der pH-Wert von 6,5 auf 8,0 erhöht wurde, wobei das Signal bei einem pH-Wert von 7,4 um 40 % niedriger war als bei einem pH von 6,5. Konsequenterweise wurden die im Test verwendeten Reagenzien mit 0,1 M PIPES Puffer bei pH 6,5 gepuffert, und es wurde ein Medium-/ Probenverhältnis von 7 verwendet, um mögliche Fehler aufgrund von Serumproben mit abnormalen pH-Werten zu vermeiden.
In verschiedenen neueren Publikationen wurde die Wechselwirkung von heterophilen Antikörpern, möglicherweise Anti-Maus Antikörpern, in Immunotests, die monoklonale Antikörper der Maus verwenden, beschrieben. Vergleiche hierzu Thompson, R.J., et al., "Circulating Antibodies to Mouse Monoclonal Immunoglobulins in Normal Subjects -- Incidence, Species Specificity , and Effects of a Two-Site Assay for Creatine-Kinase-MB Isoenzyme", Clin. Chem., 32: 476-481, (1986); und Murthy, V.V., et al., "Activity Concentration and Mass Concentration (Monoclonal Antibody Immunoenzymometric Method) Compared for Creatine Kinase MB Isoenzyme in Serum", Clin. Chem., 32 : 1956-1959, (1986). Aus diesem Grunde wurde zum Testmedium 0,1 % (v/v) von non-immun Mäuseserum zugegeben, wodurch sich keine ersichtliche Wirkung auf die Standardkurve ergab.
Unter Verwendung der vorstehenden Reagenzien wurde das folgende Testprotokoll verwendet, um den erfindungsgemäßen Test mit den CKMB-Tests gemäß dem Stand der Technik zu vergleichen:
1. 100 µl der Probe, der Kontrolle, des Standards, oder des Kalibrators wurden zu einem Teströhrchen gegeben. (Proben mit CKMB Konzentrationen von größer als 500 µg/l wurden zuerst verdünnt. Das bevorzugte Verdünnungsmittel ist der Nieder-Kalibrator, der verwendet wurde, um die Lichtimpulsmessungen zu Konzentrationswerten umzuwandeln. Vergleiche hierzu die nachstehende Diskussion.)
2. Anschließend wurden 100µl des Anti-CKMB Tracer-Antikörpers zum Teströhrchen zugegeben.
3. Das Röhrchen wird 3 Mal 5 Sekunden lang vorgetext, wobei das Schäumen minimiert wurde.
4. 500 µl des an magnetische Teilchen (Advanced Magnetics) gekoppelten Anti-CKB Fangantikörpers wurden zu jedem Röhrchen hinzugefügt.
5. Das Röhrchen wurde 3 Mal 5 Sekunden lang vorgetext, wobei das Schäumen minimiert wurde.
6. Das Röhrchen wird 30 Minuten lang +/-1 Minute bei Raumtemperatur (zwischen 15 und 30ºC) inkubiert.
7. Die feste Phase wird in einer Magnettrenneinheit von Corning 3 Minuten lang abgetrennt.
8. Das Röhrchen wird dekantiert, 3 Minuten lang abtropfen gelassen und anschließend geblottet.
9. Zum Röhrchen wird 1,0 ml destilliertes oder deionisiertes Wasser zugegeben.
10. Das Röhrchen wird 3 Mal 5 Sekunden lang vorgetext, wobei das Schäumen minimiert wurde.
11. Die feste Phase wird in einer Magnettrenneinheit 3 Minuten lang abgetrennt.
12. Das Röhrchen wird dekantiert, 3 Minuten lang abtropfen gelassen und anschließend geblottet.
13. 100 µl destilliertes Wasser werden zum Röhrchen zugegeben.
14. Das Röhrchen wird 3 Mal 5 Sekunden lang vorgetext, wobei das Schäumen minimiert wurde.
15. Der Lichtimpuls-Output des Röhrchens wird 2,0 Sekunden lang mit einem "Magic Lite" (eingetragenes Warenzeichen)-Analysegerät, erhältlich von der Fa. Ciba Corning Diagnostics (Walpole, Massachusetts), gemessen.
Die Umwandlung des Lichtimpuls-Outputs zu Konzentrationswerten wird unter Verwendung von zwei Kalibratoren durchgeführt, d.h., einem Hoch-Kalibrator und einem Nieder-Kalibrator. Für jede Charge von Reagenzien wird eine vollständige Standardkurve mittels Durchführung der oben beschriebenen Verfahren mit einer Serie von Standards mit bekannten CKMB-Mengen erstellt. Diese Standardkurve wird dem Benutzer zur Verfügung gestellt, und der Benutzer programmiert diese Standardkurve in sein Magic Lite-Analysegerät ein. Die Hoch- und Nieder-Kalibratoren werden vom Analysator verwendet, um die Standardkurve für die spezifischen Bedingungen, die der Benutzer bei Durchführung des Tests verwendet, anzupassen.
Die zu erwartenden Werte für den Test wurden dadurch bestimmt, daß der Test bei 621 diagnostizierten Patientenproben in den folgenden Kategorien durchgeführt wurde: Nicht-Krankenhaus Normal-Versuchspersonen (228), Patienten mit diagnostiziertem Myocardinfarkt (180) und im Krankenhaus behandelte, Nicht- Herzpatienten (213). Auf der Basis dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß ein normaler Bereich von 0 - 7 µg/l für normale, nicht im Krankenhaus behandelte Versuchspersonen und ein Bereich von 0 - 10 µg/l für im Krankenhaus behandelte Normalpersonen, die jedoch keine Herzerkrankungen aufwiesen, die beste diagnostische Effizienz ergaben. Auf der Grundlage diese Untersuchungen wurde weiterhin geschlossen, daß ein CKMB-Peak im Serum von mehr als 10µg/l im allgemeinen eine Myocard-Verletzung anzeigt. Wie jedoch aus dem Stand der Technik bekannt ist, können erhöhte CKMB-Konzentrationen im Serum in dieser Größenordnung auch auf Erkrankungen des Herzens zurückzuführen sein, die nicht-myocardinfarkt bedingt sind (z.B. kongestive Herzfehler, Myocarditis und Ischämie) oder auf nicht-kardiale Gewebe (z.B. Skelettmuskel). Vergleiche hierzu Lott et al., "Serum Enzymes and Isoenzymes in the Diagnosis and Differential Diagnosis of Myocardial Ischemia and Necrosis", Clin. Chem., 26: 1241, 1980.
Zusätzlich zum vorstehenden "Standard"-Testprotokoll wurde ebenfalls ein "Stat"-Testprotokoll entwickelt. Dieses Protokoll war mit dem Standardprotokoll identisch, mit der Ausnahme, daß die Inkubationszeit von 30 Minuten auf 10 Minuten (+/- 30 Sekunden) verringert wurde. Die Korrelation des Stat-Tests mit dem Standardtest wurde als r = 0,998 mit einer Regressionsgleichung von : stat = 0,96 Standard - 3,5 µg/l ermittelt.
Eine typische Standardkurve für den Standardtest ist in Fig. 4 gezeigt. Die Standards reichten von 1 - 700 µg/l CKMB, mit einer maximalen Tracer-Bindung von 25%. Bis zu 1000 µg/l CKMB wurde kein "Hook-Effekt" ermittelt, und bis zu 120 Teströhrchen konnten gleichzeitig ohne "end of run"-Effekt untersucht werden.
Die minimale nachweisbare Dosis für den Standardtest betrug 0,65 µg/l, und die nicht-spezifische Bindung der zugegebenen Markierung betrug 0,07 %. Beim Vergleich der Bindungskinetiken der Fang- und Tracer-Antikörper wurde beobachtet, daß nach 10 Minuten Inkubation mehr als 90 % von CKMB an die Festphase gebunden waren. Der Tracer hatte jedoch noch nicht das Gleichgewicht erreicht. Demzufolge war für eine Testinkubationszeit von 10 Minuten, d.h. dem Stat-Test, die Standardkurve etwa 50 % niedriger als die Kurve bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten. Unter diesen Bedingungen betrug die minimale nachweisbare Dosis 1 µg/l.
Die Richtigkeit und Genauigkeit der Standardtests wurde wie folgt bestimmt. 146 Serumproben, im Bereich von 1,14 bis 263 ug/l, wurden mit Hilfe des erfindunsgemäßen Verfahrens und unter Verwendung einer herkömmlichen Elektrophoresetechnik getestet. Der erfindungsgemäße Test korrelierte sehr gut mit dem Elektrophoreseverfahren (r=0,938), mit einer linearen Regressionsgleichung von : CKMB (erfindungsgemäß) = 1,03 CKMB (Elektrophorese) - 0,719 ug/l (vergleiche Fig. 5).
Für 168 Proben im Bereich von 0,1 bis 340 ug/l korrelierte der Standardtest in ähnlicher Weise sehr gut mit dem Tandem-E CKMB immunoenzymatischen Test der Firma Hybritech, Inc. (r=0,942); die Regressionsgleichung war : CKMB (erfindungsgemäß) = 1,16 CKMB (Tandem-E) - 17,5 µg/l.
Um die Genauigkeit des Tests weiter zu bestätigen, wurden drei Serumproben (1,7 - 105 µg/l) 1:2 und 1:4 mit dem niedrigsten Standard verdünnt und auf CKMB getestet. Die Rückgewinnung reichte von 81 % bis 110 % mit einem Mittelwert von 93 %.
Verschiedene Proben mit makro-CK-1 ergaben richtige Ergebnisse. Hämolyse, Lipämie und Bilirubin in Konzentrationen bis zu 30 mg/dl ergaben keine signifikanten Effekte auf den Tests.
Die Intra-Test CV-Werte, erhalten aus drei Proben, die 3 - 5 Mal in jedem der 26 Tests (N=96) getestet wurden, betrugen 12,7 %, 8,1 % und 4,1 % für Patientensera, die 2,5 , 4,1 bzw. 210 µg/l CKMB enthielten. Für die gleichen Proben wurden inter-Test CV-Werte von 14,4 %, 11,7 % und 6,8 % ermittelt.
Bezüglich der Stabilität der Reagenzien wurde gefunden, daß sowohl die an magnetische Teilchen gebundenen Anti-CKB-Antikörper als auch die mit DMAE markierten Anti-CKMB-Antikörper wenigstens sechs Monate lang stabil waren, wenn sie in einem wäßrigen Medium bei 4ºC aufbewahrt wurden. Bezeichnenderweise wurde bezüglich des oben beschriebenen Verfahrens von Vaidya et al. beobachtet, daß die enzymatische Aktivität der CKMB- Standards um 40 % verringert wurde, wenn sie einen Tag lang bei 25ºC in einem wäßrigen Medium gelagert wurden. Andererseits wurde gefunden, daß die CKMB Menge der gleichen Standards vollständig stabil war, wenn sie unter den gleichen Bedingungen zwei Tage lang gelagert wurden.
Wie oben gezeigt wurde, wird durch die vorliegende Erfindung durch die Markierung von Anti-CKMB mit Acridiniumester und dem Immobilisieren von Anti-CKB auf magnetischen Teilchen ein schneller und hoch-sensitiver Test für CKMB bereitgestellt. Durch den Test kann eine minimal nachweisbare Dosis von wenigstens 1 µg/l CKMB bei so geringen Inkubationszeiten wie 10 Minuten bei Raumtemperatur erreicht werden, wobei die Standardkurve bis zu 700 µg/l CKMB wirksam ist. Wenn der Test bei Testproben durchgeführt wird, korreliert er sehr gut mit den Verfahren gemäß dem Stand der Technik, und der Test leidet nicht an Wechselwirkungen aufgrund der Anwesenheit von makro-CK-1 oder hohen Spiegeln an CKMM und CKBB in Patientenproben. Zusammenfassend ist der erfindungsgemäße Test schneller, einfacher im Gebrauch und weniger anfällig gegen Wechselwirkungen als die Tests gemäß dem Stand der Technik, und er weist dennoch die Sensitivität dieser Tests geinäß dem Stand der Technik auf.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des MB-Isoenzyms der Kreatinkinase in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(a) Herstellen einer Mischung aus (i) einer Probe der biologischen Flüssigkeit, (ii) einem Antikörper gegen das B-Monomer der Kreatinkinase, wobei dieser Antikörper an einen festen Träger gebunden vorliegt, und (iii) einem markierten monoklonalen Antikörper der Maus vom IgG1-Typ, der spezifisch für das MB- Isoenzym der Kreatinkinase ist;

(b) Inkubieren der Mischung;

(c) Abtrennen des festen Trägers von der Mischung und

(d) Nachweis der Menge an Markierung, die mit dem festen Träger verbunden ist.

(a)-(d) Sind in etwa einer Stunde abgeschlossen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper gegen das MB-Isoenzym der Kreatinkinase mit einem chemilumineszierenden Material markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das chemilumineszierende Material ein Acridiniumester, bevorzugt ein Dimethylacridiniumester ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der feste Träger magnetische Teilchen enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei dieses Verfahren zusätzlich umfaßt das Bestimmen der Konzentration des MB-Isoenzyms der Kreatinkinase in der Probe durch Erstellen einer Standardkurve mittels Durchführung der Verfahrensschritte (a) bis (d) bei Proben mit bekannten Konzentrationen an MB-Isoenzym und Verwenden der Standardkurve, um die nachgewiesene Markierungsmenge in einen Konzentrationswert umzurechnen.

6. Monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er produziert wird von einer von einer Maus abstammenden Hybridzellinie, wobei dieser Antikörper in der Lage ist, spezifisch an wenigstens eine antigene Determinante des MB-Isoenzyms der menschlichen Kreatinkinase zu binden und vom IgG1 Typ ist und im wesentlichen mit den BB- und MM-Isoenzymen der menschlichen Kreatinkinase nicht kreuzreagiert.

7. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 6, wobei die von einer Maus abstammende Hybridzellinie ATCC HB 9389 oder NB 9388 ist.

8. Von der Maus abstammende Hybridzellinie ATCC HB 9389 oder HB 9388.

9. Mutante einer Hybridzellinie nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Antikörper produziert, der in der Lage ist, spezifisch an wenigstens eine antigene Determinante des MB-Isoenzyms der menschlichen Kreatinkinase zu binden und er vom IgG1 Typ ist.