CN105435867B - 检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接。

Description

检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现CK-MB高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血样本中CK-MB的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。

背景技术

当前我国心血管疾病的防控形势依然严峻，心血管疾病发病率呈不断上升态势。据统计，心血管病死亡率占人口死亡的40％，因此做好早发现、早预防、早救治，提高心血管病防治水平是关键。心血管疾病常用检测指标为心肌酶谱系列。心肌酶是指心肌细胞内的酶类物质，具有催化心肌细胞代谢和调节心肌细胞电活动的作用。心肌酶谱包括乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)等。如心肌细胞受损，这些酶会释放到血液。因此心肌酶谱升高程度可间接衡量心肌细胞的损害程度。其中CK和CK-MB是灵敏度较高的指标，能在发病早期心肌尚未大面积坏死时，在患者血液中检测出来，第一时间为临床提供可靠资料。

CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，正常人体组织主要含3种同工酶，即CK-MM、CK-BB、CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中，CK-MB主要存在于心肌细胞中。

CK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断心肌梗死的“金标准”。CK-MB在急性心肌梗死发病后4～8小时内增高，24小时达峰值，两三天恢复正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。

传统上多用酶联免疫吸附法、化学发光法及胶体金免疫层析法等测定血清中的CK-MB。但酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长；化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。

中国专利200610114997.9公布了一种血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并产生过氧化氢，再经过氧化物酶作用，过氧化氢使鲁米诺氧化而发光。中国专利200520041211.6披露了一种心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒采用化学发光法(如辣根过氧化氢酶和鲁米诺)检测，并能同时检测C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶等八种抗体。虽然化学发光法灵敏度较高，但重复性和稳定性均较差，且配套仪器昂贵，不能单人份快速即时检测，限制了他们的广泛应用。

因此开发快速、准确、灵敏度高的检测方法，具有巨大发展潜力和应用前景。与荧光和吸收光相比，化学发光没有外来激发光源背景信号干扰，交叉干扰小，灵敏度高、线性范围宽。微流控芯片技术把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可完成全过程分析。

针对现有CK-MB检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光方法利用磁微粒化学发光和微流控技术，可实现对CK-MB准确、高灵敏定量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，通过集成化芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场样本中CK-MB的快速、准确、高灵敏定量检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接；

所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗CK-MB抗体，磁颗粒包被区(7)包被预封装磁颗粒标记抗CK-MB抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集；所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；所述过滤区包含滤血膜，所述顶板(1)与底板(2)用胶带(19和20)密封。

具体地，本发明所述的微流控芯片，其发光基底液保质期少于1年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)通过预混合通道(25)连接。

具体地，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒为包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物的超顺磁性颗粒，磁颗粒尺寸为0.1～10μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500-30000高斯。

优选地，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，磁颗粒尺寸为1～3μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000-8000高斯。

具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液、磁颗粒标记抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。

具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液；所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液；所述清洗液包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液。

具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述清洗液包含牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

具体地，本发明所述微流控芯片的配套仪器为小型便携设备，包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能。

本发明所述微流控芯片制备方法如下：

步骤1)酶或发光剂标记抗CK-MB抗体，磁颗粒标记抗CK-MB抗体，这两种抗体可相同或不同；

步骤2)将酶或发光剂标抗体溶液放入顶板的标记抗体存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底板的磁颗粒包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，用胶带(19和20)密封顶板和底板，并组装成微流控芯片。

本发明提供的一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现CK-MB快速、准确、高灵敏检测的微流控芯片。

这种芯片是将抗CK-MB抗体修饰酶，抗CK-MB抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测全血样本中是否含有CK-MB，并准确分析其含量。

本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10)；但当混合液保质期少于1年时应分开，如图3所示分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，通过预混合通道(25)连接，如图3所示，储存在存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)中的发光基底液在预混合通道(25)混合均匀。本发明一个实施例采用过氧化氢酶。

本发明所述发光剂，包含但不限于吖啶酯和吖啶磺酰胺。发光剂与发光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接参与发光反应。本发明的一个实施例采用吖啶酯。发光基底液包含H2O2溶液和碱性溶液，可合并成碱性H2O2溶液，注入发光基底液存储池(10)；但当稳定性不好时，H2O2溶液和碱性溶液应分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，通过预混合通道(25)混合均匀，如图3所示。

本发明采用的标记方法包含化学交联或生物分子间特异性作用将抗CK-MB抗体连接到酶或磁颗粒表面，得到抗体标记的酶或抗体标记的磁颗粒。

本发明的CK-MB抗体包含单克隆抗体和多克隆抗体。该抗体可与CK-MB结合(如双抗体夹心法)。其中酶标记的抗体与磁颗粒标记的抗体可以相同，也可以不同。

本发明的酶或发光剂标记抗体溶液和磁颗粒标记抗体溶液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。其中HRP标记的配体，缓冲体系中不能含有NaN3；ALP标记配体，缓冲体系不能是磷酸体系。

本发明的微流控芯片如图1所示，包含顶板结构(1)和底板结构(2)，以胶带(19和20)密封后，组装形成微流控芯片。顶板和底板的成型材料为聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、环氧树脂等，胶带可为双面胶或单面胶，其中双面胶可用两片单面胶替代。如图1所示，顶板结构由气泵(3)、加样口(4)、标记抗体存储池(5)、盖子(11)、样本填充区(12)和样本混合区(13)组成。底板结构由过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、检测区(8)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)、清洗区(14)、废液池(15)和液体释放通道(16)。如图2所示，在发光基底液和清洗液存储池区域，以及磁铁滑轨区域，在顶板上需留出存储池和磁铁滑轨的让位孔(分别为17和18)，在双胶带上应留出存储池和样本混合液流入过滤区时的让位孔(分别为21和22)，让位孔的作用是让开一定的区域，不干扰液体流路，或配套仪器部件作用于微流控芯片的通路。

本发明的存储池为液体密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡胶、铝箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可为同种材料组成，也可为多种材料组合而成。在物理挤压下，存储池可局部破裂，从而把密封的液体释放出来。其中酶标CK-MB抗体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池可采用相同或不同材料和方法制作。在本发明的一个实施例中，酶标CK-MB抗体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池均采用塑料和弹性橡胶密封而成。本发明的另一个实施例中，酶标CK-MB抗体存储池采用塑料和弹性橡胶密封而成，而清洗液存储池、发光基底液存储池采用高阻隔薄膜密封而成。

本发明的过滤区包含滤血膜，其中滤血膜可通过物理孔径或生物/化学试剂使液体与细胞分离，实现血浆与红细胞分离，血浆流到磁颗粒包被区，而红细胞停留在滤血膜上，从而减少红细胞对试验结果的干扰。其中所述生物/化学试剂包含凝血剂等，可使红细胞间连接，形成凝块，增大尺寸，更容易被滤血膜的网状结构阻挡。

本发明的微流控芯片，当存在发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，应在底板上增加发光基底液预混合通道(25)，该预混合通道可为蛇形通道或上下结构混合通道，如图3所示。

在一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入HRP标记抗CK-MB抗体，包被区包被磁颗粒标记抗CK-MB抗体(与酶标抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测CK-MB。另一个实施例中，标记抗体存储池(5)封入吖啶酯标记抗CK-MB抗体，包被区包被磁颗粒标记抗CK-MB抗体(与吖啶酯标记抗体不同)，以磁微粒酶促化学发光法检测CK-MB。

本发明的清洗液，用于清洗磁颗粒，去除非特异性吸附的CK-MB、酶标记物及其他影响检测结果的物质。清洗液主要包含缓冲体系、蛋白质和表面活性剂，其中缓冲体系包含但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐等。清洗液pH 6.0～10.0，当检测样本为强酸或强碱性时，pH范围可放宽。其中蛋白质包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为优选，本发明一个实施例中，清洗液为包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.0Tris-HCl缓冲液。另一个实施例中，清洗液为牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

本发明的样本体积在10～500μl，优选20～100μl。作为优选，在实施例中加样体积为50μl。

一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的测试流程包括：

步骤1)将全血样本滴入加样口后，盖上盖子，微流控芯片放入配套仪器中，酶标抗体释放后，气泵使样本和酶标抗体混合均匀，然后注入底板过滤区；

步骤2)样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁标抗体，充分反应后磁铁收集磁颗粒，清洗液存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，移至检测区，释放发光基底液，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现全血样本中CK-MB的定量检测。

本发明的微流控芯片为快速检测，检测时间应小于30分钟，作为优选，实施例中采用15分钟。

本发明的抗体仪器包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能，应可包含挤压装置、磁铁及移动装置、检测系统、控制分析模块和软件系统。

本发明的核心是采用磁微粒化学发光免疫检测技术在微流控芯片实现目标物的快速、高灵敏度、准确定量检测。

微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。

本发明的微流控芯片将检测过程所需的所有试剂组分(酶标CK-MB抗体、磁颗粒标记CK-MB抗体、清洗液、发光基底液等)均集成、内置到微流控芯片中，并通过巧妙沟道设计，在配套仪器的操作下，实现微流控芯片的一键式检测(只需按开始键就能实现检测，无需复杂操作)，实现全血分离、免疫反应、清洗分离、化学发光检测，从而避免了现有微流控芯片中结构设计简单、检测时操作复杂等不足和缺陷。还克服了传统化学发光仪只能进行血清或血浆检测，而不能对全血样本进行检测的缺点。

由于磁颗粒易沉淀，传统化学发光仪采用手工混合，并以持续振荡维持磁颗粒的悬浮状态，但微流控芯片内磁颗粒混均操作难以在小型便携仪器中实现。

本发明将磁颗粒包被、干燥于微流控芯片沟道中，并设计了磁铁主动驱动磁颗粒(而传统微流控芯片一般采用流体驱动或电驱动)，从而使磁颗粒复溶，并在微流控芯片不同区域实现免疫反应、清洗、发光。此设计不仅解决了磁颗粒应用于微流控芯片时易沉淀、重复性差等问题，还实现了更可控的免疫反应和物理清洗，提高了灵敏度和重复性。其中磁铁磁性和磁颗粒尺寸对检测效果了明显影响，本发明选择磁铁磁感应强度为500-30000高斯，优选1000-8000高斯；磁颗粒尺寸为0.1-10μm，优选0.5-3μm。

本发明中微流控芯片配套仪器与微流控芯片无液体接触，无需要清洗的部件，避免了传统大型化学发光仪需要搅拌或加样、清洗等操作而产生的交叉干扰及污染。

所以本发明并非简单叠加磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术，而是通过液体密封设计、沟道设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，并以磁铁主动驱动，实现一键式的磁微粒化学发光免疫检测，从而在便携配套仪器中实现全血中CK-MB的快速、高灵敏度、准确定量检测。

本发明可应用于心血管疾病尤其是心力衰竭中CK-MB的定量检测。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用化学发光方法，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。

2)本发明采用磁颗粒技术，具有磁富集功能，增强并放大信号；并能利用磁铁把磁颗粒转移区域(如由包被区-清洗区-检测区)，减少样本基质的影响。

3)本发明采用微流控芯片技术，把样本混合、反应、分离和检测集成在芯片上，并把反应所需的所有试剂组分集成到芯片上。

4)本发明操作简便，检测时，只需加入样本，盖上盖子，把芯片放入小型便携配套仪器中即可。

5)本发明配套仪器是小型便携仪器，仪器只与芯片发生物理接触，芯片内液体不与仪器接触，不会污染仪器而产生交叉干扰。

附图说明

图1为CK-MB定量检测的微流控芯片主体结构示意图，其中1为顶板，2为底板，3为气泵，4为加样口，5为标记抗体存储池，6为过滤区，7为磁颗粒包被区，8为检测区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为盖子，12为样本填充区，13为样本混合区，14为清洗区，15为废液池，16为液体释放通道，17为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于顶板)，18为磁铁滑轨让位孔。

图2为CK-MB定量检测的完整微流控芯片的结构示意图，其中1为顶板，2为底板，19为双面胶带，20为单面胶带，21为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于双面胶带)，22为混合液流入过滤区时的让位孔。

图3为双发光基底液的微流控芯片底板结构示意图，其中23为发光基底液存储池A，24为发光基底液存储池B，25为预混合通道。

具体实施方式

本发明公开了一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：酶促化学发光测定CK-MB

(一)抗体标记

取5μg HRP溶解于1mL蒸馏水中，再加入0.2mL0.1M新配NaIO₄溶液，室温避光反应20min后，以1mM pH4.4醋酸钠缓冲液透析纯化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节pH至9.0，加入10μg抗CK-MM单抗，室温避光反应2h。加0.1mL新配的4mg/mL NaBH₄液，混匀，于4℃反应2h。将上述溶液装入透析袋，以0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜，得到HRP标记CK-MM抗体。

向磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒(直接为2μm)、10μg EDC和15μg NHS溶液和10～30μg抗CK-BB单抗(与HRP标记的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁吸附富集纯化，去除未反应的CK-BB抗体，得到磁颗粒标记CK-BB抗体。

(二)微流控芯片组装

HRP标记CK-MM抗体溶液中含0.2％牛血清白蛋白、0.1％吐温20和0.02％Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液；磁颗粒标记CK-BB抗体溶液为包含0.5％牛血清白蛋白、1％葡萄糖、0.2％吐温20和0.02％Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液。

将HRP标抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。

清洗液为0.3％牛血清白蛋白、0.2％曲拉通X-100和0.02％Proclin300的pH7.0Tris-HCl缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为HRP底物(鲁米诺的双氧水溶液)和碱性增强液(苯衍生物的碱性溶液)，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)中，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将CK-MB标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和500ng/ml。

将50μl样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为6000高斯)中，仪器挤出HRP标记单抗，并使样本和HRP标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成HRP标记单抗-CK-MB抗原-磁颗粒标记单抗的三明治结构，然后磁铁收集磁颗粒。水泡释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中CK-MB浓度。

检测原理为：当全血加入微流控芯片后，全血先与HRP标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了HRP标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有CK-MB，则形成HRP标记抗体-CK-MB-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，再发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血样中CK-MB浓度。样本中CK-MB含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为100pg/ml，最低定量限为500pg/ml，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例2：直接化学发光测定CK-MB

(一)抗体标记

向磷酸缓冲液中加入适量活化的吖啶酯和100μg抗CK-BB单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。透析后，得到吖啶酯标记CK-BB抗体。

向1ml 10mM pH7.4磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒(直径为1μm)、10μg EDC和15μgNHS溶液和20μg链霉亲和素，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。以磁铁吸附富集，去除未反应的链霉亲和素，得到磁颗粒标记链霉亲和素。

将10μg抗CK-MM单抗加入5μL 0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-biotin溶液中，反应1h。以超滤离心管纯化，去除未反应的生物素。得到生物素化抗CK-MM抗体。

通过亲和素-生物素间的相互作用，把抗CK-MM抗体连接到磁颗粒表面，得到磁颗粒标记CK-MM抗体。其中亲和素标记的磁颗粒和生物素化的抗体比例为5∶10⁴。

(二)微流控芯片组装

吖啶酯标记CK-BB抗体溶液中含0.1％牛血清白蛋白、0.05％吐温20和0.05％Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液；磁颗粒标记CK-MM抗体溶液为包含0.2％牛血清白蛋白、0.1％酪蛋白、2％蔗糖、0.2％吐温20、0.1％曲拉通X-100和0.02％Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液。将吖啶酯标记抗体溶液放入顶板标记抗体存储池中，密封。将磁标抗体溶液放入底板磁颗粒包被区中，室温干燥。

清洗液为0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.2％曲拉通X-100和0.02％Proclin300的pH7.0磷酸盐缓冲液。将清洗液注入清洗液存储池。发光基底液分为包含H₂O₂溶液和碱性溶液，分别注入发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将CK-MB标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和500ng/ml。

将50μl样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为2000高斯)中，仪器挤出吖啶酯标记单抗，并使样本和吖啶酯标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成吖啶酯标记抗体-CK-MB抗原-磁颗粒标记抗体的三明治夹心结构，然后磁铁收集磁颗粒。水泡释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光激发液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl血浆样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中CK-MB浓度。

检测原理为：当血浆加入微流控芯片后，血浆先与吖啶酯标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了吖啶酯标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有CK-MB，则形成吖啶酯标记抗体-CK-MB-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，发光激发液释放，经混合后与吖啶酯作用产生直接化学发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血浆中CK-MB浓度。血浆中CK-MB含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为200pg/ml，最低定量限为700pg/ml，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例3：磁微粒颗粒尺寸筛选

其他的实验条件参见实施例2，磁颗粒尺寸和磁铁磁感应强度按照以下方案进行。

颗粒尺寸为0.1μm、O.5μm、1μm、3μm、10μm。磁铁磁感应强度为500高斯、1000高斯、4000高斯、8000高斯、12000高斯。分别以这五种磁铁分别驱动五种尺寸的磁颗粒。

实验结果显示：0.1μm磁颗粒和500高斯磁铁组合时，化学发光信号较弱，灵敏度不高；而10μm磁颗粒和10000高斯磁铁组合时，阴性样本信号较高，线性范围不宽。

根据以上结果，磁颗粒尺寸优选1～3μm，磁铁磁感应强度优选1000-8000高斯。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括顶板(1)结构和底板(2)结构，其中顶板(1)上的气泵(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接；底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接；底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接；

所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗CK-MB抗体，磁颗粒包被区(7)包被预封装磁颗粒标记抗CK-MB抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集；所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；所述过滤区包含滤血膜，所述顶板(1)与底板(2)用胶带(19和20)密封。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于发光基底液保质期少于1年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)通过预混合通道(25)连接。

3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，由铁、钴或镍的化合物构成，磁颗粒尺寸为0.1～10μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500～30000高斯。

4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，磁颗粒尺寸为1～3μm，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000～8000高斯。

5.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记抗体溶液、磁颗粒标记抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。

6.如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液；所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液；所述清洗液包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液。

7.如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述清洗液包含牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

8.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的配套仪器为小型便携设备，包含挤压气泵和存储池，磁铁移动，发光检测系统功能。

9.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的测试流程包括：

步骤1)将全血样本滴入加样口后，盖上盖子，微流控芯片放入配套仪器中，酶标抗体释放后，气泵使样本和酶标抗体混合均匀，然后注入底板过滤区；

步骤2)样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁标抗体，充分反应后磁铁收集磁颗粒，清洗液存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，移至检测区，释放发光基底液，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现全血样本中CK-MB的定量检测。