CN105259162B - 定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测全血中脑钠肽(BNP)的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片由顶部胶带(12)、芯片基板(1)和底部胶带(15)构成，其中芯片基板(11)上的过滤区(2)、磁颗粒标记BNP抗体包被区(3)、反应区(5)、清洗区(6)、检测区(7)、液体释放通道(8)依次连接；芯片基板(11)上标记BNP抗体存储池(4)与反应区(5)连接，检测区(7)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(8)连接等。

Description

定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现BNP高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血中BNP的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。

背景技术

脑钠肽是1988年日本学者Tetsuji Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽。大量基础和临床研究表明，血液中BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断、病程进展的监测、对疗效和预后评估有重要价值。

目前用于临床检测的BNP包括BNP和NT-proBNP两种。两者虽有相同生物学来源，但生物学效应和临床意义并不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体，该肽的一个信号肽(26个氨基)被立即去除，形成BNP前体(proBNP，108个氨基酸)，然后在内切酶作用下裂解为无生物活性的氮末端B型脑钠肽(NT-proBNP，76个氨基酸)和有活性的B型脑钠肽(BNP，32个氨基酸)。BNP的清除主要通过与清除受体结合，而NT-proBNP主要由肾小球滤过，因此NT-proBNP血浓度受肾功能影响大于BNP。

BNP和NT-proBNP检测已经为各医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。

测定BNP的主要方法有化学发光法、免疫比浊法、免疫层析法(试纸条)和荧光芯片法等。化学发光法和免疫比浊法敏感高、准确，但需配套昂贵的大型仪器，检测时间长，并不适合急性诊断和小样本检测。免疫层析法虽简便快速，但灵敏度低、重复性差，易出现误判。荧光芯片法随较免疫层析法准确、灵敏度更高，但由于操作复杂，组分集成差，重复性并不高。

中国专利201010139399.3描述了一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒，采用纳米微球增强常规比浊法信号，实现对脑钠肽进行定量分析。

中国专利200720140931.7公布了一种脑钠肽颜色颗粒诊断试纸，采用颜色颗粒对脑钠肽进行定性检测。中国专利201310524436.6公开了一种同时检测人脑钠肤和N末端脑钠肤前体的快速定量检测装置及检测方法，采用胶体金免疫层析法配套相应仪器对试纸条进行定量检测。美国专利US60/576327和60/592202也对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于化学发光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄、重复性差等缺陷。

中国专利200910077950.3描述了一种检测脑钠肤的光学生物传感器及试剂制备方法，采用毛细沟道，以磁颗粒和量子点分别标记抗体，形成双抗体夹心法检测脑钠肽。虽灵敏度提高了，但试剂组分集成差，操作复杂，重复性并不高。

针对现有脑钠肽检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光法利用磁微粒化学发光的优势，在微流控芯片上集成所有试剂组分，可提供一种脑钠肽定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，对BNP进行快速准确定量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场全血样本中BNP的快速、准确、高灵敏定量检测。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由顶部胶带12、芯片基板1和底部胶带15构成，其中芯片基板11上过滤区2、磁颗粒标记BNP抗体包被区3、反应区5、清洗区6、检测区7、液体释放通道8依次连接；芯片基板11上标记BNP抗体存储池4与反应区5连接，检测区7分别与清洗液存储池9和发光基底液存储池10通过液体释放通道8连接，顶部胶带包含加样口13、发光基底液和清洗液存储池让位孔14；所述磁颗粒标记BNP抗体包被区3预封装包被磁颗粒标记BNP抗体；标记BNP抗体存储池4存储预封装酶或发光剂标记BNP抗体；清洗液存储池9和发光基底液存储池10分别存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。

发光基底液存储池10也可以由发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17替代，发光基底液存储池A 16和发光基底液存储池B 17通过发光液预混合通道18连接。

具体地，本发明所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，其中磁颗粒尺寸和磁铁的磁感应强度对检测结果有明显的影响，磁铁颗粒尺寸为0.1～10μm，磁感应强度500～30000高斯。

优选地，所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，颗粒尺寸为0.5～3μm，磁感应强度为1000～8000高斯。

具体地，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液；所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液。

具体地，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

具体地，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池10，或分别注入发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17。

具体地，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池10，或分别注入发光基底液存储池A 16和发光基底液存储池B17。

具体地，本发明的芯片配套仪器为小型便携设备，包含挤压存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能；芯片检测样本的体积为10～500μl，优选20～100μl。更优选加样体积为50μl。

本发明提供的定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现脑钠肽快速、准确、高灵敏检测的新方法。

这种方法是将抗BNP抗体修饰酶，抗BNP抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测样本中是否含有BNP，并准确分析其含量。

本发明脑钠肽定量检测的磁微粒化学发光方法及其微流控芯片能够解决现有化学发光技术中仪器昂贵、检测时间长的不足和缺陷，解决现有快速诊断方法灵敏度不高、重复性差的不足和缺陷。由于化学发光灵敏度高，其灵敏度是荧光检测方法的100倍以上。

本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池10；但当混合液保质期少于1年时应分开，如图4所示分别注入发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17，通过预混合通道18混合均匀，如图4所示。本发明一个实施例采用过氧化氢酶。

本发明所述发光剂，包含但不限于吖啶酯。吖啶酯与发光液作用后，不需酶的催化作用，直接参与发光反应。本发明的一个实施例采用吖啶酯。发光基底液包含H₂O₂溶液和碱性溶液，可合并成碱性H₂O₂溶液，注入发光基底液存储池10；但当稳定性不好时，H₂O₂溶液和碱性溶液应分别注入发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17，通过预混合通道18混合均匀，如图4所示。

本发明采用的标记方法包含化学交联或生物分子间特异性作用将抗BNP抗体连接到酶或磁颗粒表面，得到抗体标记的酶或抗体标记的磁颗粒。

本发明中所述化学交联为：当磁颗粒或酶表面有活性基团，可与抗体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把抗体修饰到磁颗粒表面或酶上。

在本发明的实施例中采用化学交联法对磁颗粒或酶进行抗体修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将磁颗粒表面的官能团(如羧基、氨基)与抗体表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。

作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对磁颗粒进行修饰，一般步骤为：将磁颗粒溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的抗体，以缓冲液为反应介质，反应充分后加入L-甘氨酸封闭，磁铁吸附富集纯化，从而得到抗体修饰的磁颗粒。

本发明中所述生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统结合方式对BNP抗体进行磁颗粒修饰，该结合方式具有放大信号的作用，具体为：以EDC将链霉亲和素连接到磁颗粒表面，生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，把蛋白质分子连接到磁颗粒表面。

本发明的BNP抗体包含单克隆抗体和多克隆抗体。该抗体可与BNP结合。其中酶或发光剂标记的抗体与磁颗粒标记的抗体可相同或不同。

本发明的酶或发光剂标记抗体溶液和磁颗粒标记抗体溶液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。其中HRP标记的配体，缓冲体系中不能含有NaN₃；ALP标记配体，缓冲体系不能是磷酸体系。

本发明的微流控芯片如图2所示，微流控芯片由顶部胶带12、芯片基板1和底部胶带15构成，其中芯片基板成型材料为聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、环氧树脂等。如图1所述，芯片基板包含过滤区2、磁颗粒标记BNP抗体包被区3、标记BNP抗体存储池4、反应区5、清洗区6、检测区7、液体释放通道8、清洗液存储池9、发光基底液存储池10和废液池11。

本发明的存储池为液体密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡胶、铝箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可为同种材料组成，也可为多种材料组合而成。在物理挤压下，存储池可局部破裂，从而把密封的液体释放出来。其中酶标配体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池可采用相同或不同材料和方法制作。在本发明的一个实施例中，酶标配体存储池、清洗液存储池、发光基底液存储池均采用塑料和弹性橡胶密封而成。本发明的另一个实施例中，酶标配体存储池采用塑料和弹性橡胶密封而成，而清洗液存储池、发光基底液存储池采用高阻隔薄膜密封而成。

本发明的过滤区包含滤血膜，其中滤血膜可通过物理孔径或生物/化学试剂使液体与细胞分离，实现血浆与红细胞分离，血浆流到磁颗粒包被区，而红细胞停留在滤血膜上，从而减少红细胞对试验结果的干扰。其中所述生物/化学试剂包含凝血剂等，可使红细胞间连接，形成凝块，增大尺寸，更容易被滤血膜的网状结构阻挡。

本发明的微流控芯片，当存在发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17，应在底板上增加发光基底液预混合通道18，该预混合通道可为蛇形通道或上下结构混合通道，如图4所示。

本发明的微流控芯片，当发光基底液由发光底物和发光增强液组成，且不能混合并并长时间保存时，可分别注入水泡中，并在底板上增加发光底物液和发光增强液预混合通道18，该预混合通道可为蛇形通道或上下结构混合通道，如图4所示。

本发明的清洗液，用于清洗磁颗粒，去除非特异性吸附的BNP、酶标记物及其他影响检测结果的物质。清洗液主要包含缓冲体系、蛋白质和表面活性剂，其中缓冲体系包含但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐等。清洗液pH 6.0～10.0，当检测样本为强酸或强碱性时，pH范围可放宽。其中蛋白质包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为优选，本发明一个实施例中，清洗液为包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.0硼酸缓冲液。另一个实施例中，清洗液为牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

在一个实施例中，标记BNP抗体存储池4封入HRP标记抗体，包被区包被磁颗粒标记抗体，以酶促化学发光法检测BNP。另一个实施例中，标记BNP抗体存储池4封入吖啶酯标记抗体，包被区包被磁颗粒标记抗体，以直接化学发光法检测BNP。

本发明的微流控芯片为快速检测，检测时间应小于30分钟，作为优选，实施例中采用15分钟。

本发明的抗体仪器包含挤压气泵、存储池和水泡，磁铁移动，发光检测系统等功能，应可包含挤压装置、磁铁及移动装置、检测系统、控制分析模块和软件系统。

本发明所述微流控芯片按照以下方法制备：

步骤1)酶或发光剂标记抗BNP抗体，磁颗粒标记抗BNP抗体，这两种抗体可相同或不同；

步骤2)将酶或发光剂标记BNP抗体溶液放入标记BNP抗体存储池中，密封，将磁颗粒标记BNP抗体溶液放入磁颗粒标记BNP抗体包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，组装成微流控芯片。

本发明涉及一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其测试流程包括：

步骤1)将微流控芯片放入配套仪器，把全血样本滴入加样口13后，开始测试，样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁颗粒标记配体，磁铁加速样本中分析物与磁颗粒标记配体反应，磁铁收集磁颗粒，标记抗体存储池释放溶液，磁铁将磁颗粒移至反应区，磁铁搅拌加速反应，充分反应后收集磁颗粒；

步骤2)清洗液存储池释放溶液，磁颗粒清洗后，被移至检测区，发光基底液存储池释放溶液，检测区产生化学发光信号，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现分析物的定量检测。

本发明可广泛应用于病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、违禁药品、毒品检测、食品安全等多种BNP的定量检测。

本发明的核心是采用磁微粒化学发光免疫检测技术在微流控芯片实现全血中BNP的快速、高灵敏度、准确定量检测。

微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。

本发明在微流控芯片将检测过程所需的所有试剂组分(酶标抗体、磁颗粒标记抗体、清洗液、发光基底液等)均集成、内置到微流控芯片中，并通过巧妙沟道设计，在配套仪器的操作下，实现微流控芯片的一键式检测(只需按开始键就能实现检测，无需复杂操作)，实现全血分离、免疫反应、清洗分离、化学发光检测，从而避免了现有微流控芯片中结构设计简单、检测时操作复杂等不足和缺陷。还克服了传统化学发光仪只能进行血清或血浆检测，而不能对全血样本进行检测的缺点。

由于磁颗粒易沉淀，传统化学发光仪采用手工混合，并以持续振荡维持磁颗粒的悬浮状态，但微流控芯片内磁颗粒混均操作难以在小型便携仪器中实现。

本发明将磁颗粒包被、干燥于微流控芯片沟道中，并设计了磁铁主动驱动磁颗粒(而传统微流控芯片一般采用流体驱动或电驱动)，从而使磁颗粒复溶，并在微流控芯片不同区域实现免疫反应、清洗、发光。此设计不仅解决了磁颗粒应用于微流控芯片时易沉淀、重复性差等问题，还实现了更可控的免疫反应和物理清洗，提高了灵敏度和重复性。其中磁铁磁性和磁颗粒尺寸对检测效果了明显影响，本发明选择磁铁磁感应强度为500～30000高斯，优选1000-8000高斯；磁颗粒尺寸为0.1～10μm，优选0.5～3μm。

本发明中微流控芯片配套仪器与微流控芯片无液体接触，无需要清洗的部件，避免了传统大型化学发光仪需要搅拌或加样、清洗等操作而产生的交叉干扰及污染。

所以本发明并非简单叠加磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术，而是通过液体密封设计、沟道设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，并以磁铁主动驱动，实现一键式的磁微粒化学发光免疫检测，从而在便携配套仪器中实现全血中BNP的快速、高灵敏度、准确定量检测。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用化学发光方法，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。

2)本发明采用磁颗粒技术，具有磁富集功能，增强并放大信号；并能利用磁铁把磁颗粒转移区域(如由包被区-清洗区-检测区)，减少样本基质的影响。

3)本发明采用微流控芯片技术，把样本混合、反应、分离和检测集成在芯片上，并把反应所需的所有试剂组分集成到芯片上。

4)本发明操作简便，检测时，只需加入样本，盖上盖子，把芯片放入小型便携配套仪器中即可。

5)本发明配套仪器是小型便携仪器，仪器只与芯片发生物理接触，芯片内液体不与仪器接触，不会污染仪器而产生交叉干扰。

附图说明

图1为脑钠肽定量检测微流控芯片基板结构示意图，其中1为芯片基板，2为过滤区，3为磁颗粒标记BNP抗体包被区，4为标记BNP抗体存储池，5为反应区，6为清洗区，7为检测区，8为液体释放区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为废液池。

图2为脑钠肽定量检测微流控芯片的完整结构示意图，其中1为芯片基板，12为顶部胶带，13为加样口，14为发光基底液和清洗液存储池让位孔，15为底部胶带。

图3为微流控芯片基板示意图，其中1为芯片基板，2为过滤区，3为包被区，4为标记配体存储池，5为反应区，6为清洗区，7为检测区，8为液体释放通道，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为废液池。

图4为双发光基底液存储池的微流控芯片基板示意图，其中16为发光基底液存储池A，17为发光基底液存储池B，18为预混合通道。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：酶促化学发光测定BNP

(一)抗体标记

向磷酸缓冲液中加入适量HRP、10μg EDC和15μg NHS溶液和10～30μg抗BNP单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到HRP标记BNP抗体。

向磷酸缓冲液中加入1mg磁颗粒(尺寸为2μm)、10μg EDC和15μg NHS溶液和10～30μg抗BNP单抗(与HRP标记的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。磁铁吸附富集纯化，去除未反应的抗BNP抗体，得到磁颗粒标记BNP抗体。

(二)微流控芯片组装

HRP标记BNP抗体溶液中含0.1％牛血清白蛋白、0.1％吐温20和0.01％Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液；磁颗粒标记BNP抗体溶液为包含0.5％牛血清白蛋白、0.1％酪蛋白、0.2％吐温20和0.01％Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液。

清洗液为包含0.4％BSA、0.3％曲拉通X-100和0.01％Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液。发光基底液分A液和B液，A液为含鲁米诺的酸性溶液，B液为含苯衍生物的碱性溶液。

将HRP标抗体溶液放入抗BNP抗体存储池4中，密封。将磁标抗体溶液放入磁颗粒包被区3中，室温干燥。将清洗液注入清洗液存储池9中，将发光基底液的A液和B液分别注入发光基底液存储池A16和发光基底液存储池B17，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将BNP标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml和5000ng/ml。

将50μl标准品样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为6000高斯)中，仪器挤出HRP标记单抗，并使标准品样本和HRP标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成HRP标记单抗-BNP抗原-磁颗粒标记单抗的三明治结构，然后磁铁收集磁颗粒。水泡释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中BNP浓度。

检测原理为：当全血加入微流控芯片后，全血先与HRP标记抗体混合，然后经过滤区，红细胞停留在过滤区上，混合了HRP标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有BNP，则形成HRP标记抗体-BNP-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，再发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血样中BNP浓度。样本中BNP含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为2.0pg/ml，最低定量限为15pg/ml，定量检测范围为2.0～5000pg/ml，线性相关系数R²＞0.99；在检测范围内，未出现HOOK效应；且批内与批间重复性均小于10％。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例2：直接化学发光测定BNP

(一)抗体标记

向磷酸缓冲液中加入适量活化的吖啶酯和10～30μg抗BNP单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到吖啶酯标记BNP抗体。

以1∶1000～1∶100000的比例混合亲和素化磁颗粒(颗粒尺寸为0.5μm)和生物素化BNP抗体，得到磁颗粒标记BNP抗体。

(二)微流控芯片组装

吖啶酯标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

清洗液为包含0.4％BSA、0.5％吐温20、0.3％曲拉通X-100和0.01％Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。发光基底液分A液和B液，A液为含金刚烷的酸性溶液，B液为碱性溶液。

将吖啶酯标记抗体溶液放入抗BNP抗体存储池4中，密封。将磁标抗体溶液放

入磁颗粒包被区3中，室温干燥。将清洗液注入清洗液存储池9中，将发光基底液的A液和B液分别注入发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B17，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。

(三)样本检测

用正常人血浆作稀释液，将BNP标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml和5000ng/ml。

将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为2000高斯)中，往加样口滴入50μl标准品，标准品过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，然后磁铁收集磁颗粒，形成吖啶酯标记抗体-BNP抗原-磁颗粒标记抗体的三明治夹心结构，然后磁铁收集磁颗粒。水泡释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光激发液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

将50μl全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中BNP浓度。

检测原理为：当全血加入微流控芯片后，全血先与吖啶酯标记抗体混合，然后经过滤区，红细胞停留在过滤区上，混合了吖啶酯标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有BNP，则形成吖啶酯标记抗体-BNP-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，发光激发液释放，经混合后与吖啶酯作用产生直接化学发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血浆中BNP浓度。血浆中BNP含量越高，则发光信号越强。

结果表明，其最低检测限为7.0pg/ml，最低定量限为25pg/ml，定量检测范围为7.0～5000pg/ml，线性相关系数R²＞0.99；在检测范围内，未出现HOOK效应；且批内与批间重复性均小于10％。可为心梗心衰疾病诊断提供参考。

实施例3：磁微粒颗粒尺寸筛选

其他的实验条件参见实施例2，磁颗粒尺寸和磁铁磁感应强度按照以下方案进行。

颗粒尺寸为0.1μm、0.5μm、0.7μm、1.6μm、2.4μm、3μm、10μm。磁铁磁感应强度为500高斯、1000高斯、4000高斯、8000高斯、12000高斯、30000高斯。分别以这六种磁铁分别驱动七种尺寸的磁颗粒。

实验结果显示：0.1μm磁颗粒和500高斯磁铁组合使用时，其最低检测限为30pg/ml，定量检测范围为30～4000pg/ml，线性相关系数R²＞0.93；批内与批间重复性均小于20％。即：化学发光信号较弱，灵敏度不高，重复性较差。

10μm磁颗粒和30000高斯磁铁组合使用时，其最低检测限为60pg/ml，定量检测范围为60～2000pg/ml，线性相关系数R²＞0.90；批内与批间重复性均小于20％。即：阴性样本信号较高(清洗不充分)，线性范围不宽。

0.5～3μm的磁颗粒为和1000～8000高斯的磁铁组合使用时，其最低检测限均小于20pg/ml，定量检测范围可达到20～5000pg/ml，线性相关系数R²＞0.95；批内与批间重复性均小于10％。满足为临床心梗心衰疾病诊断提供参考的需要。

根据以上结果，磁颗粒尺寸优选0.5～3μm，磁铁磁感应强度优选1000～8000高斯。可根据磁颗粒所用尺寸，进一步确定磁铁磁感应强度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由顶部胶带(12)、芯片基板(1)和底部胶带(15)构成，其中芯片基板(11)上的过滤区(2)、磁颗粒标记BNP抗体包被区(3)、反应区(5)、清洗区(6)、检测区(7)、液体释放通道(8)依次连接；芯片基板(11)上标记BNP抗体存储池(4)与反应区(5)连接，检测区(7)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(8)连接，顶部胶带包含加样口(13)、发光基底液和清洗液存储池让位孔(14)；所述磁颗粒标记BNP抗体包被区(3)预封装包被磁颗粒标记BNP抗体；标记BNP抗体存储池(4)存储预封装酶或发光剂标记BNP抗体；清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)分别存储预封装清洗液和发光基底液；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。

2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述发光基底液存储池(10)由发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)替代，发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)通过发光液预混合通道(18)连接。

3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，颗粒尺寸为0.1～10μm，磁感应强度500～30000高斯。

4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，颗粒尺寸为0.5～3μm，磁感应强度为1000～8000高斯。

5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液；所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温-20和Proclin300的pH7.4硼酸缓冲液。

6.如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液；所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)。

8.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)。

9.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，芯片配套仪器为小型便携设备，包含挤压存储池，磁铁移动，发光检测系统功能；芯片检测样本的体积为10～500μl。

10.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的测试流程包括：

步骤1)将微流控芯片放入配套仪器，把全血样本滴入加样口(13)后，开始测试，样本经过滤区后，到达包被区，溶解磁颗粒标记BNP抗体，磁铁加速样本中分析物与磁颗粒标记配体反应，磁铁收集磁颗粒，标记抗体存储池释放溶液，磁铁将磁颗粒移至反应区，磁铁搅拌加速反应，充分反应后收集磁颗粒；

步骤2)清洗液存储池释放溶液，磁颗粒清洗后，被移至检测区，发光基底液存储池释放溶液，检测区产生化学发光信号，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现分析物的定量检测。