CN112237948B - 一种荧光磁珠微流控芯片及其分析仪器 - Google Patents

一种荧光磁珠微流控芯片及其分析仪器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光磁珠微流控芯片，可根据驱动力和反应步骤分为四种不同布局，分别为负压一步法，负压两步法，正压一步法，正压两步法；本发明还公开了具有荧光磁珠微流控芯片的分析仪器，包含仪器框架、定量加样装置、清洗液储仓、废液储仓、负压控制泵、气泵挤压装置、反应区磁场、发光检测系统、控制分析模块和软件系统等，芯片放入仪器后，点击开始测试，仪器可自动完成所有操作。

Description

一种荧光磁珠微流控芯片及其分析仪器
技术领域
本发明涉及一种利用荧光微球、磁珠、微流控芯片和分析仪器实现分析物高灵敏、定量检测系统，可实现病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病)、违禁药品、毒品检测、食品安全等分析物的准确、高灵敏、定量检测，属于微流控芯片检测技术领域。
背景技术
微流控芯技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元，通过微细加工技术集成到一块芯片上,具有微型化、集成化、分析速度快、试剂消耗少等显著优点。
现有的微流控芯片液体驱动以离心法和毛细管作用为主，混合和反应采用弯曲管道或混合区内置立柱方式，混合效率低，反应效果差，如公开号为“CN106807461A”和“CN108181458A”的中国专利；另外用于定量检测的微流控芯片使用化学发光法，试剂组份多，反应过程复杂，造成微流控芯片多层结构，制备繁琐，如公开号为“CN201510696706”的中国专利。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种荧光磁珠微流控芯片及其分析仪器，该微流控芯片以荧光探针为标记物，以免疫磁珠为捕获物，试剂用量少，集成化高，荧光探针和捕获磁珠易复溶、混合迅速、均相反应，具有快速、准确、线性范围宽、高通量、稳定等优点。
本发明采用的技术方案为：一种荧光磁珠微流控芯片，包括顶板和底板，其中顶板和底板的设置为如下其中一种：
负压一步法：顶板中依次设置有加样口、清洗液入口、负压接口，底板中依次设置有样本处理区、过滤区、反应区、负压区；加样口与样本处理区、清洗液入口和反应区、负压接口与负压区分别对应设置；样本处理区与过滤区相通；过滤区与反应区、反应区与负压区分别通过微通道相连接，微通道中均设有微阀，分别为1#微阀、2#微阀；
负压两步法：顶板中依次设置有加样口、1#清洗液入口、2#清洗液入口、负压接口，底板中依次设置有样本处理区、过滤区、1#反应区、2#反应区、负压区；加样口与样本处理区、1#清洗液入口与1#反应区、2#清洗液入口与2#反应区、负压接口与负压区分别对应设置；样本处理区与过滤区相通；过滤区与1#反应区、1#反应区与2#反应区、2#反应区与负压区、1#反应区与负压区分别通过微通道相连接，微通道中均设有微阀，分别为1#微阀、3#微阀、4#微阀、2#微阀；
正压一步法：顶板中依次设置有加样口、气泵接口、废液池气孔，底板中依次设置有清洗液储池、正压区、样本处理区、过滤区、反应区、废液池；加样口与样本处理区、气泵接口与正压区、废液池气孔与废液池分别对应设置；样本处理区与过滤区相通；清洗液储池与正压区、正压区与样本处理区、过滤区与反应区、反应区与废液池、清洗液储池与反应区分别通过微通道相连接，微通道中均设置有微阀，分别为3#微阀、1#微阀、2#微阀、5#微阀、4#微阀；
正压两步法：顶板中依次设置有加样口、气泵接口、废液池气孔，底板中依次设置有清洗液储池、正压区、样本处理区、过滤区、1#反应区、2#反应区、废液池；加样口与样本处理区、气泵接口与正压区、废液池气孔与废液池分别对应设置；样本处理区与过滤区相通；清洗液储池与正压区、正压区与样本处理区、过滤区与1#反应区、1#反应区与2#反应区、2#反应区与废液池、清洗液储池与1#反应区、清洗液储池与2#反应区、1#反应区与废液池分别通过微通道相连接，微通道中均设置有微阀，分别为3#微阀、1#微阀、2#微阀、5#微阀、8#微阀、4#微阀、7#微阀、6#微阀。
进一步地，所述微流控芯片的液体驱动为负压控制泵或正压气泵。
进一步地，还包括如下特征中的一个或多个：样本处理区用于装载样本处理液；过滤区装载了红细胞滤血膜；清洗液储池用于装载清洗液；废液池装载了吸水材料；负压一步法/正压一步法中，反应区用于装载干燥的荧光探针和捕获磁珠混合粉末；负压两步法/正压两步法中，1#反应区用于装载干燥的捕获磁珠粉末，2#反应区用于装载干燥的荧光探针粉末。
进一步地，该荧光探针是荧光微球偶联抗体或抗原或二抗或核酸的复合物，该捕获磁珠是磁珠偶联抗体或抗原或二抗或核酸的复合物；
进一步地，样本处理区、过滤区、清洗液储池、反应区、废液池是圆形、椭圆形、多边形或不规则形。
进一步地，还包括如下特征中的一个或多个：所述芯片材料为石英、玻璃、PDMS、PMMA、PS、PC、COC或COP；顶板为光滑透明的平板；顶板和底板通过超声焊接或胶水粘接或双面胶带粘接密封固定在一起。
本发明还提供一种荧光磁珠微流控芯片配套的分析仪器，包括仪器框架，所述荧光磁珠微流控芯片安装在所述仪器框架中。
进一步地，还包括如下特征中的一种或多个：定量加样装置、清洗液储仓、废液储仓、负压控制泵、气泵挤压装置、反应区磁场、发光检测系统、控制分析模块、软件系统。
进一步地，还包括如下特征中的一种或多个：所述清洗液储仓与所述微流控芯片的清洗液入口可通断地连通；所述废液储仓与所述负压控制泵的排液口可通断地连通；所述负压控制泵与所述微流控芯片的负压接口可通断地连通，是为了获得芯片中液体流动所需的负压驱动力；所述气泵挤压装置布设于所述微流控芯片的气泵接口一侧，是为了获得芯片中液体流动所需的正压驱动力；所述反应区磁场为外置于微流控芯片反应区的上方和下方一对电磁铁构成；所述控制分析模块可控制两块电磁铁交替呈现磁性状态或任一块呈现磁性状态，从而控制反应区里的磁珠处于运动状态或积聚在反应区某一小块区域；所述发光检测系统与微流控芯片中含有荧光探针的反应区对应设置，并包含可发射某一波长激光的功能和可检测某一波长荧光强度的功能。
进一步地，所述样本处理液为含有表面活性剂、醇类的缓冲液，作用是稀释或解离或转化分析物，以及中和干扰物；所述滤血膜作用是过滤全血样本的红细胞；所述清洗液为含有BSA、表面活性剂的缓冲液，作用为清洗反应区去除未参与反应的组份。
进一步地，所述的荧光微球的直径为10～500nm，荧光发射波长范围为400～800nm；荧光微球核壳材质为聚苯乙烯或聚烷基氰基丙烯酸酯或二氧化硅，微球表面修饰活性基团为氨基、羧基、巯基或链霉素亲和素中的任意一种，荧光微球内包裹荧光物质，所述荧光物质包括罗丹明、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、叶绿素蛋白、镧系元素化合物、量子点、碘化丙啶；优选地，荧光微球为聚苯乙烯包裹铕化学物的纳米微粒，直径200nm，表面修饰基团为羧基，激发波长365nm，发射波长610nm。
进一步地，所述磁珠的直径为0.1μm～10μm，磁珠核壳材质为聚苯乙烯或聚烷基氰基丙烯酸酯或葡聚糖，磁珠表面修饰活性基团为氨基、羧基、巯基或链霉素亲和素中的任意一种，磁珠内包裹磁性微粒，所述磁性微粒为一种或几种磁性金属氧化物微粒(如铁、钴、镍及其化合物)组成；优选地，磁珠为为聚苯乙烯包裹铁化学物的纳米微粒，直径0.3μm～3μm，表面修饰基团为羧基。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
(1)以荧光探针为标记物，以免疫磁珠为捕获物，操作步骤少，试剂用量少，集成化高，使得微流控芯片结构简化，极大降低了芯片制造难度，并提高芯片可靠性。
(2)大部分试剂均事先装载于芯片中，重要的试剂组份荧光探针和捕获磁珠以干燥粉末形式装载于芯片中，利于运输和保存，并提高了试剂稳定性。
(3)在微流控芯片上设置了样本处理区和样本处理液，可在芯片上实现稀释或解离或转化分析物，以及中和干扰物。
(4)微流控芯片的液体驱动为负压控制泵或正压气泵，使得液体移动更迅速、无残留和利于精确控制。
(5)在反应区设置了可控磁场，一方面在混合反应时，通过控制反应区上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态，从而达到快速混合及提高反应效率的目的；另一方面在结果检测时，通过控制反应区下方电磁铁单独呈现磁性状态，使得磁珠积聚在反应区下方一小块区域，从而提高了荧光信号值，达到提高灵敏度的目的。
(6)加样量极少，单个指标仅需要10μl～50μl；检测快速，操作简单，3～20分钟即可自动完成全部检测；全封闭的独立检测单元，避免了交叉污染。
(7)采用负压两步法/正压两步法，可避免由于分析物含量太高而引起的HOOK效应。
(8)可以进行多个样本或多指标同时检测，实现检测的高通量。
附图说明
图1是本发明负压一步法一种实施例示意图，其中11为加样口，12为清洗液入口，13为负压接口，14为样本处理区，15为过滤区，16为反应区，17为负压区，F11为1#微阀，F12为2#微阀；
图2是本发明负压两步法一种实施例示意图，其中21为加样口，22为1#清洗液入口，23为2#清洗液入口，24为负压接口，25为样本处理区，26为过滤区，27为1#反应区，28为2#反应区，29为负压区，F21为1#微阀，F22为2#微阀，F23为3#微阀，F24为4#微阀；
图3是本发明正压一步法一种实施例示意图，其中31为加样口，32为加样口盖子，33为气泵接口，34为废液池气孔，35为样本处理区，36为过滤区，37为正压区，38为清洗液储池，39为反应区，310为废液池，F31为1#微阀，F32为2#微阀，F33为3#微阀，F34为4#微阀，F35为5#微阀；
图4是本发明正压两步法一种实施例示意图，其中41为加样口，42为加样口盖子，43为气泵接口，44为废液池气孔，45为样本处理区，46为过滤区，47为正压区，48为1#反应区，49为废液池，410为清洗液储池，411为2#反应区，F41为1#微阀，F42为2#微阀，F43为3#微阀，F44为4#微阀，F45为5#微阀，F46为6#微阀，F47为7#微阀，F48为8#微阀；
图5是本发明CRP检测标准曲线图；
图6是本发明SAA检测标准曲线图；
图7是本发明25羟基维生素D检测标准曲线图；
图8是本发明HCG检测标准曲线图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
以下，以图1负压一步法的芯片结构应用于检测全程C-反应蛋白(CRP)为例(双抗体夹心法检测)，对本发明进行说明：
(一)抗体标记
向1ml 10mM pH7.5磷酸缓冲液中加入1mg磁珠(聚苯乙烯包裹铁化合物，直径3μm，表面修饰羧基)、10μg EDC和15μg NHS溶液和20μg抗CRP单抗(CRP一抗)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg赖氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的抗体，加入含0.1％BSA0.01M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到CRP一抗标记捕获磁珠溶液。
取上固含量为1％的荧光微球(聚苯乙烯包裹铕化合物，直径200nm，表面修饰羧基)1ml，加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS溶液和15μg另一株抗CRP单抗(CRP二抗)溶液，混合均匀于37℃反应2h，加入1mg BSA封闭，通过离心弃上清去除未反应组份，加入含0.1％BSA 0.02M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到荧光探针标记CRP二抗溶液。
(二)微流控芯片组装
取图1微流控芯片底板四周边缘贴上双面胶带，将CRP一抗标记捕获磁珠溶液和荧光探针标记CRP二抗溶液各取200μl装入反应区16，冷冻干燥；将裁剪好的滤血膜装入过滤区15；样本处理液为包含0.5％吐温20和0.1％甲醇的pH 7.5PBS缓冲液，取样本处理液150μl装入样本处理区14；然后尽快盖上顶板进行密封组装成微流控芯片，芯片装入铝箔袋中密封，于2～8℃保存。
(三)样本检测
清洗液为包含0.2％BSA、0.5％吐温20和0.01％Proclin300的pH7.5PBS缓冲液；将清洗液装入微流控芯片配套仪器的清洗液储仓。
用阴性血清将CRP标准品配制成如下浓度：0、0.16、0.8、4、20、100mg/L。
将微流控芯片放入配套仪器中，往加样口11定量加入50μl样本，进入样本处理区14；仪器打开1#微阀F11和2#微阀F12，在负压驱动下，样本混合液过滤后，进入反应区16，溶解荧光探针和捕获磁珠并反应，同时仪器通过控制反应区16上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区16内的磁珠处于运动状态，从而达到快速混合及提高反应效率；样本中CRP分别与捕获磁珠和荧光探针反应，形成类似“捕获磁珠一抗-CRP-荧光探针二抗”的三明治结构(双抗体夹心法)。
反应结束后，仪器控制反应区16下方电磁铁单独呈现磁性状态，将磁珠吸附在反应区16下方，并保持至检测完毕；然后仪器打开清洗液入口12和2#微阀F12，在负压驱动下，排出反应区16多余液体并注入清洗液对反应区16进行清洗；清洗完毕，仪器关闭清洗液入口12，打开1#微阀F11和2#微阀F12，将反应区16液体排空；仪器控制反应区16下方电磁铁的磁场大小，将磁珠积聚于小块区域；仪器发光检测系统从反应区16上方对磁珠积聚区域发射365nm激光，同时检测荧光探针发出的610nm荧光强度，该荧光强度与样本中CRP浓度呈正相关。
总检测时间5min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，以荧光强度和标准品浓度值的双对数函数处理绘制标准曲线，测得CRP微流控芯片的剂量-反应曲线线性相关系数(R2)为0.999，表明该方法具有良好的剂量反应线性关系，如图5所示。
实施例2
以下，以图2负压两步法的芯片结构应用于检测血清淀粉样蛋白A(SAA)为例，对本发明进行说明：
(一)抗体标记
向1ml 10mM pH7.5磷酸缓冲液中加入1mg磁珠(聚苯乙烯包裹铁化合物，直径3μm，表面修饰羧基)、10μg EDC和15μg NHS溶液和15μg抗SAA单抗(SAA一抗)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg赖氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的组份，加入含0.1％BSA0.01M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到SAA一抗标记捕获磁珠溶液。
取上固含量为1％的荧光微球(聚苯乙烯包裹铕化合物，直径200nm，表面修饰羧基)1ml，加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS溶液和15μg另一株抗SAA单抗(SAA二抗)溶液，混合均匀于37℃反应2h，加入1mg BSA封闭，通过离心弃上清去除未反应组份，加入含0.1％BSA 0.02M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到荧光探针标记SAA二抗溶液。
(二)微流控芯片组装
取图2微流控芯片底板四周边缘贴上双面胶带，取200μl SAA一抗标记捕获磁珠溶液装入1#反应区27，取200μl荧光探针标记SAA二抗溶液装入2#反应区28，冷冻干燥；将裁剪好的滤血膜装入过滤区26；样本处理液为包含0.5％吐温20和0.1％甲醇的pH7.5PBS缓冲液，取样本处理液150μl装入样本处理区25；然后尽快盖上顶板进行密封组装成微流控芯片，芯片装入铝箔袋中密封，于2～8℃保存。
(三)样本检测
清洗液为包含0.2％BSA、0.5％吐温20和0.01％Proclin300的pH7.5PBS缓冲液；将清洗液装入微流控芯片配套仪器的清洗液储仓。
用阴性血清将SAA标准品配制成如下浓度：0、5、20、50、100、200mg/L。
将微流控芯片放入配套仪器中，往加样口21定量加入50μl样本，进入样本处理区25；仪器打开1#微阀F21和2#微阀F22，在负压驱动下，样本混合液过滤后，进入1#反应区27，溶解捕获磁珠并反应，同时仪器通过控制1#反应区27上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态，从而达到快速混合及提高反应效率；反应两分钟后，仪器控制1#反应区27下方电磁铁单独呈现磁性状态并保持，将磁珠吸附在1#反应区27下方，通过负压将1#反应区27内液体排空，打开1#清洗液22入口，注入清洗液冲洗一次并排空，再吸入清洗液，撤掉1#反应区27磁场；仪器关闭2#微阀F22，打开1#微阀F21、3#微阀F23、4#微阀F24，利用负压将1#反应区27内液体及磁珠吸进2#反应区28，溶解荧光探针并反应，同时仪器通过控制2#反应区28上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态；反应两分钟后，仪器控制2#反应区28下方电磁铁单独呈现磁性状态并保持，将磁珠吸附在2#反应区28下方，通过负压将2#反应区28内液体排空，打开2#清洗液入口23，注入清洗液冲洗两次并排空，仪器控制反应区下方电磁铁的磁场大小，将磁珠积聚于小块区域；仪器发光检测系统从2#反应区28上方对磁珠积聚区域发射365nm激光，同时检测荧光探针发出的610nm荧光强度，该荧光强度与样本中SAA浓度呈正相关。
总检测时间20min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，以荧光强度和标准品浓度值的双对数函数处理绘制标准曲线，测得SAA微流控芯片的剂量-反应曲线线性相关系数(R2)为0.9944，表明该方法具有良好的剂量反应线性关系，如图6所示。
实施例3
以下，以图3正压一步法的芯片结构应用于检测25羟基维生素D为例(竞争法检测)，对本发明进行说明：
(一)抗体标记
向1ml 10mM pH7.5磷酸缓冲液中加入1mg磁珠(聚苯乙烯包裹铁化合物，直径3μm，表面修饰羧基)、10μg EDC和15μg NHS溶液和20μg BSA偶联25羟基维生素D(VD-BSA)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg赖氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的组份，加入含0.1％BSA 0.01M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到VD-BSA标记捕获磁珠溶液。
取上固含量为1％的荧光微球(聚苯乙烯包裹铕化合物，直径200nm，表面修饰羧基)1ml，加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS溶液和30μg 25羟基维生素D单抗(VD单抗)溶液，混合均匀于37℃反应2h，加入1mg BSA封闭，通过离心弃上清去除未反应组份，加入含0.1％BSA 0.02M pH 7.5PBS溶液1ml复溶，得到荧光探针标记VD单抗溶液。
(二)微流控芯片组装
取图3微流控芯片底板四周边缘贴上双面胶带，将VD-BSA标记捕获磁珠溶液和荧光探针标记VD单抗溶液各取200μl装入反应区39，冷冻干燥；将裁剪好的滤血膜和吸水材料分别装入过滤区36、废液池310；样本处理液为包含0.5％吐温20和0.1％甲醇的pH 7.5PBS缓冲液，取样本处理液150μl装入样本处理区35；清洗液为包含0.2％BSA、0.5％吐温20和0.01％Proclin 300的pH 7.5PBS缓冲液，取400μl清洗液装入清洗液储池38；然后尽快盖上顶板进行密封组装成微流控芯片，芯片装入铝箔袋中密封，于2～8℃保存。
(三)样本检测
用阴性血清将25羟基维生素D标准品配制成如下浓度：0、5、15、30、60、120ng/ml。
将微流控芯片放入配套仪器中，往加样口31定量加入30μl样本，进入样本处理区35，盖上加样口盖子32；仪器打开1#微阀F31、2#微阀F32和5#微阀F35，在正压气体驱动下，样本混合液过滤后，进入反应区39，溶解荧光探针和捕获磁珠并反应，同时仪器通过控制反应区39上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态，从而达到快速混合及提高反应效率；样本中25羟基维生素D和VD-BSA标记捕获磁珠共同竞争与荧光探针反应，形成类似“25羟基维生素D-荧光探针”或者“VD-BSA标记捕获磁珠-荧光探针”的免疫复合物(竞争法)。
反应结束后，仪器控制反应区39下方电磁铁单独呈现磁性状态，将磁珠吸附在反应区39下方，并保持至检测完毕；然后仪器打开3#微阀F33、4#微阀F34和5#微阀F35，在正压气体驱动下，将清洗液注入反应区39进行清洗；清洗完毕，将反应区39液体排空；仪器控制反应区39下方电磁铁的磁场大小，将磁珠积聚于小块区域；仪器发光检测系统从反应区39上方对磁珠积聚区域发射365nm激光，同时检测荧光探针发出的610nm荧光强度，该荧光强度与样本中25羟基维生素D浓度呈负相关。
总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，以荧光强度和标准品浓度值的双对数函数处理绘制标准曲线，测得25羟基维生素D微流控芯片的剂量-反应曲线线性相关系数(R2)为0.9962，表明该方法具有良好的剂量反应线性关系，如图7所示。
实施例4
以下，以图4正压两步法的芯片结构应用于检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例，对本发明进行说明：
(一)抗体标记
向1ml 10mM pH7.5磷酸缓冲液中加入1mg磁珠(聚苯乙烯包裹铁化合物，直径3μm，表面修饰羧基)、10μg EDC和15μg NHS溶液和20μg抗HCG单抗(HCG一抗)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg赖氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的抗体，加入含0.1％BSA0.01M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到HCG一抗标记捕获磁珠溶液。
取上固含量为1％的荧光微球(聚苯乙烯包裹铕化合物，直径200nm，表面修饰羧基)1ml，加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS溶液和15μg另一株抗HCG单抗(HCG二抗)溶液，混合均匀于37℃反应2h，加入1mg BSA封闭，通过离心弃上清去除未反应组份，加入含0.1％BSA 0.02M pH7.5PBS溶液1ml复溶，得到荧光探针标记HCG二抗溶液。
(二)微流控芯片组装
取图4微流控芯片底板四周边缘贴上双面胶带，取HCG一抗标记捕获磁珠溶液200μl装入1#反应区48，取荧光探针标记HCG二抗溶液200μl装入2#反应区411，冷冻干燥；将裁剪好的滤血膜和吸水材料分别装入过滤区46、废液池49；样本处理液为包含0.5％吐温20和0.1％甲醇的pH 7.5PBS缓冲液，取样本处理液150μl装入样本处理区45；清洗液为包含0.2％BSA、0.5％吐温20和0.01％Proclin 300的pH 7.5PBS缓冲液，取600μl清洗液装入清洗液储池410；然后尽快盖上顶板进行密封组装成微流控芯片，芯片装入铝箔袋中密封，于2～8℃保存。
(三)样本检测
用阴性血清将HCG标准品配制成如下浓度：0、5、20、200、2000、20000IU/L。
将微流控芯片放入配套仪器中，往加样口41定量加入20μl样本，进入样本处理区45，盖上加样口盖子42；仪器打开1#微阀F41、2#微阀F42和6#微阀F46，在正压气泵驱动下，样本混合液过滤后，进入1#反应区48，溶解捕获磁珠并反应，同时仪器通过控制1#反应区48上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态，从而达到快速混合及提高反应效率；反应两分钟后，仪器控制1#反应区48下方电磁铁单独呈现磁性状态并保持，将磁珠吸附在1#反应区48下方，通过正压气泵将1#反应区48内液体排空；仪器关闭1#微阀F41、2#微阀F42，打开3#微阀F43、4#微阀F44、6#微阀F46，注入清洗液冲洗一次并排空，再注入清洗液，撤掉1#反应区48磁场；仪器关闭3#微阀F43、4#微阀F44、6#微阀F46，打开1#微阀F41、2#微阀F42、5#微阀F45、8#微阀F48，利用正压将1#反应区48内液体及磁珠推进2#反应区411，溶解荧光探针并反应，同时仪器通过控制2#反应区411上方、下方的两块电磁铁交替呈现磁性状态，使得反应区内的磁珠处于运动状态；反应两分钟后，仪器控制2#反应区411下方电磁铁单独呈现磁性状态并保持，将磁珠吸附在2#反应区411下方，通过正压将2#反应区411内液体排空；仪器关闭1#微阀F41、2#微阀F42、4#微阀F44、5#微阀F45、6#微阀F46，打开3#微阀F43、7#微阀F47、8#微阀F48，注入清洗液冲洗两次并排空，仪器控制反应区下方电磁铁的磁场大小，将磁珠积聚于小块区域；仪器发光检测系统从2#反应区411上方对磁珠积聚区域发射365nm激光，同时检测荧光探针发出的610nm荧光强度，该荧光强度与样本中HCG浓度呈正相关。
总检测时间20min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，以荧光强度和标准品浓度值的双对数函数处理绘制标准曲线，测得HCG微流控芯片的剂量-反应曲线线性相关系数(R2)为0.9991，表明该方法具有良好的剂量反应线性关系，如图8所示。

Claims (9)

1.一种荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，包括顶板和底板，其中顶板和底板的设置为如下其中一种：
负压两步法：顶板中依次设置有加样口(21)、1#清洗液入口(22)、2#清洗液入口(23)、负压接口(24)，底板中依次设置有样本处理区(25)、过滤区(26)、1#反应区(27)、2#反应区(28)、负压区(29)；加样口(21)与样本处理区(25)、1#清洗液入口(22)与1#反应区(27)、2#清洗液入口(23)与2#反应区(28)、负压接口(24)与负压区(29)分别对应设置；样本处理区(25)与过滤区(26)相通；过滤区(26)与1#反应区(27)、1#反应区(27)与2#反应区(28)、2#反应区(28)与负压区(29)、1#反应区(27)与负压区(29)分别通过微通道相连接，微通道中均设有微阀，分别为1#微阀(F21)、3#微阀(F23)、4#微阀(F24)、2#微阀(F22)；
正压两步法：顶板中依次设置有加样口(41)、气泵接口(43)、废液池气孔(44)，底板中依次设置有清洗液储池(410)、正压区(47)、样本处理区(45)、过滤区(46)、1#反应区(48)、2#反应区(411)、废液池(49)；加样口(41)与样本处理区(45)、气泵接口(43)与正压区(47)、废液池气孔(44)与废液池(49)分别对应设置；样本处理区(45)与过滤区(46)相通；清洗液储池(410)与正压区(47)、正压区(47)与样本处理区(45)、过滤区(46)与1#反应区(48)、1#反应区(48)与2#反应区(411)、2#反应区(411)与废液池(49)、清洗液储池(410)与1#反应区(48)、清洗液储池(410)与2#反应区(411)、1#反应区(48)与废液池(49)分别通过微通道相连接，微通道中均设置有微阀，分别为3#微阀(F43)、1#微阀(F41)、2#微阀(F42)、5#微阀(F45)、8#微阀(F48)、4#微阀(F44)、7#微阀(F47)、6#微阀(F46)。
2.根据权利要求1所述的荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，还包括如下特征：样本处理区用于装载样本处理液；过滤区装载了红细胞滤血膜；清洗液储池用于装载清洗液；废液池装载了吸水材料；负压两步法/正压两步法中，1#反应区用于装载干燥的捕获磁珠粉末，2#反应区用于装载干燥的荧光探针粉末。
3.根据权利要求2所述的荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，该荧光探针是荧光微球偶联抗体或抗原或二抗或核酸的复合物，该捕获磁珠是磁珠偶联抗体或抗原或二抗或核酸的复合物。
4.根据权利要求1所述的荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，样本处理区、过滤区、清洗液储池、反应区、废液池是圆形、椭圆形、多边形或不规则形。
5.根据权利要求1所述的荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的液体驱动为负压控制泵或正压气泵。
6.根据权利要求1所述的荧光磁珠微流控芯片，其特征在于，还包括如下特征中的一个或多个：所述芯片材料为石英、玻璃、PDMS、PMMA、PS、PC、COC或COP；顶板为光滑透明的平板；顶板和底板通过超声焊接或胶水粘接或双面胶带粘接密封固定在一起。
7.一种权利要求1所述的荧光磁珠微流控芯片配套的分析仪器，其特征在于，包括仪器框架，所述荧光磁珠微流控芯片安装在所述仪器框架中。
8.根据权利要求7所述的分析仪器，其特征在于，还包括如下特征中的一种或多个：定量加样装置、清洗液储仓、废液储仓、负压控制泵、气泵挤压装置、反应区磁场、发光检测系统、控制分析模块、软件系统。
9.根据权利要求8所述的分析仪器，其特征在于，还包括如下特征中的一种或多个：所述清洗液储仓与所述微流控芯片的清洗液入口可通断地连通；所述废液储仓与所述负压控制泵的排液口可通断地连通；所述负压控制泵与所述微流控芯片的负压接口可通断地连通，是为了获得芯片中液体流动所需的负压驱动力；所述气泵挤压装置布设于所述微流控芯片的气泵接口一侧，是为了获得芯片中液体流动所需的正压驱动力；所述反应区磁场为外置于微流控芯片反应区的上方和下方一对电磁铁构成；所述控制分析模块可控制两块电磁铁交替呈现磁性状态或任一块呈现磁性状态，从而控制反应区里的磁珠处于运动状态或积聚在反应区某一小块区域；所述发光检测系统与微流控芯片中含有荧光探针的反应区对应设置，并包含可发射某一波长激光的功能和可检测某一波长荧光强度的功能。
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