DE3751182T2

DE3751182T2 - Monoklonale Antikörper, B-spezifisch für Apolipoprotein, die von zwei Hybridomen erzeugt werden.

Info

Publication number: DE3751182T2
Application number: DE3751182T
Authority: DE
Inventors: Linda K Curtiss; Joseph L Witztum; Steven Young
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1995-10-26
Anticipated expiration: 2007-07-21
Also published as: JP2831352B2; DE3751182D1; NO172596C; FI873410A0; EP0257778A3; NO172596B; DK407987A; DK174932B1; NO873271L; JPS63279783A; PT85490A; FI92714B; DK407987D0; FI873410L; PT85490B; US5460947A; IE872104L; IE66195B1; AU7657387A; CA1338032C

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neue Hybridome und betrifft insbesondere Hybridome, die Rezeptormoleküle produzieren, die mit Apolipoprotein B- 100 immunreagieren, sowie die so hergestellten Rezeptormoleküle und die diagnostischen Verfahren und Systeme, die die Rezeptormoleküle verwenden.

Hintergrund der Erfindung

Lipoproteine sind die primären Träger von Plasma-Cholesterin und -Triglyzeriden. Sie sind micellare Lipid-Protein-Komplexe, die Protein (als Apoprotein bezeichnet) und polare Lipide, die in einem Oberflächenfilm organisiert sind, der einen neutralen Lipid- (Triglyzerid und Cholesterinester) Kern umgibt, enthalten. Die Lipoproteine wurden ursprünglich auf der Grundlage ihrer Schwimmdichten, wie sie durch Ultrazentrifugieren gemessen werden, identifiziert. Dementsprechend existieren vier hauptsächliche Dichteklassen: Chylomikrone, Lipoproteine sehr niedriger Dichte (very low density lipoproteins, VLDL), niedrig dichte Lipoproteine (low density lipoproteins, LDL) und hoch dichte Lipoproteine (high density lipoproteins, HDL).
Bei der Angleichung der Fortschritte in der Technologie der Trennung durch Ultrazentrifugen ergab sich noch eine Unterteilung der Dichteklassen von LDL und HDL in weitere Unterklassen größerer Homogenität. Zum Beispiel kann LDL in ein Lipoprotein mittlerer Dichte (intermediate density lipoprotein, IDL) und eine LDL&sub2;-Unterklasse unterteilt werden. Jedoch sind auch diese Unterklassen wegen ihrer unterschiedlichen Apoprotein-Gehalte aus funktionell heterogenen Populationen von Lipoprotein- Partikeln zusammengesetzt.
Es wurden acht hauptsächliche Apoproteine isoliert, A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III und E, und von der Gruppe der geringfügiger anwesenden Apoproteine, die in größeren Mengen aus bestimmten Dichteklassen gewonnen werden können, können die meisten auch in anderen Dichteklassen gefunden werden. Somit enthalten die meisten LDL-Partikel nur Apo B, jedoch enthalten einige wenige Partikel auch andere Apoproteine und dadurch kommen die Spurenmengen von Apo C-I, Apo C-II, C-III und Apo E, die in dieser Dichteklasse vorliegen, zustande.
In manchen Fällen wurden speziellen Apoproteinen auch spezielle Funktionen zugeordnet. Zum Beispiel wird eine Spezies von Apo B, die in der Leber synthetisiert wird und als Apo B-100 bezeichnet wird, von zellulären LDL-Rezeptoren erkannt und gebunden. Durch die Bindung von Apo B-100 binden diese Rezeptoren LDL-Partikel und extrahieren sie aus dem Plasma. Das LDL wird dadurch in die Zellen aufgenommen und zerlegt, wodurch sein Cholesterin gewonnen wird, um den Bedürfnissen jeder Zelle zu dienen. Die Wechselwirkung von Apo B und LDL-Rezeptoren spielt somit eine bedeutende Rolle bei der Abtrennung von LDL-Cholesterin aus dem Blutstrom.
Eine andere Spezies von Apo B, die Apo B-48 genannt wird, wird von dem LDL-Rezeptor nicht erkannt. Diese Spezies von Apo B, die nur 48 % der Größe von Apo B-100 ausmacht, wird im Menschen nur vom Darm synthetisiert. Lipoproteine, die Apo B-48 enthalten, wie etwa Chylomikrone und Chylomikron-Rückstände, binden nicht an den LDL-Rezeptor.
Obwohl diese beiden Spezies von Apo B unter getrennter genetischer Steuerung zu stehen scheinen (es wurde ein einziger Patient beschrieben, dessen Körper Apo B-48, jedoch nicht Apo B-100 produziert), zeigten immunologische Studien, daß die Apoproteine B-100 und B-48 antigene Determinanten gemeinsam haben. Mindestens drei Forschergruppen berichteten über die Entwicklung von insgesamt sieben verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die sowohl an Apo B-100 als auch an Apo B-48 binden. Die von diesen Forschern berichteten Ergebnisse deuten stark darauf hin, daß Apo B-48 und Apo B-100 strukturell miteinander verwandte Proteine sind; d.h., daß Apo B-48 einen Teil des Proteins Apo B-100 darstellen könnte. Es wurde auch ein Beweis dafür erbracht, daß Apo B-48 und Apo B-100 nicht auf dem gleichen Lipoprotein-Partikel gefunden werden, was darauf hindeutet, daß getrennte Apo B-Partikel existieren.
In letzter Zeit haben mehrere Forscher die Annahme getroffen, daß die Plasmagehalte von Apo B eine bessere Vorhersage des Risikos einer Coronararterien-Erkrankung (CAD) darstellen könnten als die Plasmagehalte von LDL-Cholesterin. Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 604-608 (1980). Da artherosklerotische Gefäßerkrankungen und ihre Komplikationen weiterhin die führende Ursache für Tod und Debilität in der westlichen Gesellschaft darstellen, besteht in der biomedizinischen Industrie schon immer ein langanhaltendes Bedürfnis nach einem Assay-System, das imstande ist, Risikopatienten für CAD zu identifizieren.
Es wurden viele Arten von Immunoassays für Plasma-Apoprotein B unter Verwendung von Antiseren, die spezifische Antikörper enthalten, berichtet, inklusive kompetitiver Flüssigphasen- und Festphasen-Radioimmunoassays (RIA), Assays mit Enzym-gebundenem Immunosorbent (ELISA), Radioimmunodiffusions-Assays und anderer. Probleme, die die weit gestreute Anwendung dieser Immunoassays für Apo B begrenzen, waren die Reproduzierbarkeit sowie die Qualität und Spezifität der verwendeten Antiseren. Überblicksartikel über die methodologischen Probleme jedes der verschiedenen Typen der Assays für Apo B finden sich in Currey et al., Clin. Chem. 24, 280-286 (1978) und Rosseneu et al., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983).
Mehrere Forscher berichteten über die Entwicklung von Reihen von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Apo B zur Verwendung bei der Untersuchung von dessen antigener Struktur und Rolle im Lipoprotein-Stoffwechsel. Außerdem gab es Berichte über die Verwendung von monoklonalen Anti-Apo B Antikörpern in Flüssigphasen- RIAs zur Messung der Gehalte von Plasma-Apo B. Patton et al., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) und Maynard et al., Clin. Chem. 30, 1620-1624 (1984). Außerdem berichtete eine Gruppe über die Verwendung einer Mischung von monoklonalen Anti-Apo B Antikörpern in einem Radioimmunodiffusions-Assay für Plasma-Apo B. Marconvina et al., Clin. Chim. Acta 147, I 17-125 (1985). Diese Assay-Verfahren leiden jedoch alle an der Notwendigkeit langwieriger Inkubationen, häufiger Zentrifugierungen oder der Verwendung von radioaktiven Materialien.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als Reagenzien zur Feststellung der Anwesenheit von Apo B-100 in Proben humaner Körperflüssigkeit ist deshalb attraktiv, weil solche Reagenzien, sobald sie einmal gewonnen wurden, in relativ großen Mengen mit gleichbleibender Qualität produziert werden können. Jedoch sprechen eine Reihe von Faktoren gegen die Verwendung eines speziellen monoklonalen Antikörpers als Bestandteil eines Assay-Systems für Apo B-100.
Zuerst lehrt der Stand der Technik, daß ein monoklonaler Antikörper wegen der antigenen Heterogenität seines Ziel-Antigens allzu immunspezifisch sein kann, um verwendbar zu sein. Zum Beispiel hängt die Spezifität von üblichen Antiseren, die polyklonale Antikörper enthalten, auf einer Übereinstimmung von hunderttausenden unterschiedlichen Antikörpern ab, die sich an antigene Determinanten, die den meisten Teil oder das gesamte antigene Protein bedecken, binden. Infolgedessen werden geringe Veränderungen in der Struktur des Antigens, die auf genetischen Polymorphismus, Heterogenität der Glycosylierung oder geringe Denaturierung zurückzuführen sind, in der Regel eine geringe Wirkung auf die Bindung eines polyklonalen Antikörpers ausüben. In ähnlicher Weise wird eine größere oder kleinere Untergruppe von Antikörpern, die von polyklonalen Antiseren stammen, in der Regel Antigene binden, die modifiziert oder denaturiert worden sind.
Im Gegensatz dazu binden monoklonale Antikörper in der Regel an eine antigene Determinante (Epitop) auf dem Antigenmolekül. Wenn aus irgendeinem Grund diese Determinante verändert wird, kann der Antikörper weiterhin binden oder er kann dies nicht. Ob das ein Problem oder einen Vorteil darstellt, hängt von den einzelnen Umständen ab. Wenn, wie in dem vorliegenden Fall, der monoklonale Antikörper in einem diagnostischen Assay für ein Apoprotein eingesetzt werden soll, könnte eine geringe antigene Veränderung in diesem Protein große Fehler verursachen.
Die antigene Heterogenität von Apoprotein B-100 ist ausreichend dokumentiert. Zum Beispiel wurde gefunden, daß Epitop-Expression an Apo B verändert werden kann durch (1) die Zusannnensetzung der assoziierten Lipide, (2) die Temperatur der Immunreaktion, (3) das Ausmaß der Isolierung von LDL aus seiner natürlichen Umgebung und (4) die genetische Expression zwischen den Individuen.
Zweitens hängt die erfolgreiche Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (Moab) wegen dessen einzigartiger Spezifität oft von seiner Affinität für das Ziel- Antigen ab. Während zum Beispiel ein MoAb eine ausreichende Affinität aufweisen kann, um bei der Bindung von Flüssig- und Festphasen-Antigen verwendbar zu sein, wobei der MoAb selbst in flüssiger Phase vorliegt, ist es möglich, daß dieser gleiche Antikörper als ein Festphasen-gebundener Antikörper, der zur Bindung des Antigens und zum "Herausziehen" desselben aus der Lösung verwendbar ist, nicht einsatzbar ist.
Die obigen Probleme gelten allgemein für die Verwendung monoklonaler Antikörper. Der Fachmann auf diesem Gebiet hat daher erkannt, daß es notwendig ist, monoklonale Antikörper in einem beliebigen Assay-System, in welchem sie eingesetzt werden sollen, zu testen und zu charakterisieren. Vgl. Goding, James W., Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice." Seiten 40-46, Academic Press, New York (1983).

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf das Hybridom mit der Bezeichnung HL130C2.3C5, das die ATCC Eintragungsnummer HB 8746 hat. Dieses Hybridom und seine Rezeptormoleküle werden hier auch als M847 bezeichnet.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung Rezeptormoleküle, die mit Apoprotein B-100 immunreagieren und von dem Hybridom ATCC HB 8746 ausgeschieden werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung das Hybridom mit der Bezeichnung V82A6. 1G4, das die ATCC Eintragungsnummer HB 8742 hat. Dieses Hybridom und seine Rezeptormoleküle werden hierin auch als M824 bezeichnet.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung Rezeptormoleküle, die mit Apoprotein B-100 immunreagieren und von dem Hybridom ATCC HB 8742 ausgeschieden werden.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung betrifft eine Zellkultur, umfassend (a) ein erfindungsgemäßes Hybridom; (b) Rezeptormoleküle, die von dem genannten Hybridom ausgeschieden werden und mit Apoprotein B-100 immunreagieren, ; und (c) ein Kulturmedium für das Hybridom.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Körperfluid-Probe auf die Anwesenheit von Apoprotein B-100, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellung einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;
(b) Bereitstellung von Rezeptormolekülen in biologisch aktiver Form, die (i) mit Apoprotein B-100 immunreagieren, und (ii) entweder von dem Hybridom HB 8746 oder von dem Hybridom HB 8742 ausgeschieden wurden;
(c) Mischen der Körperfluid-Probe mit den Rezeptormolekülen;
(d) Halten der Mischung unter Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums, der ausreicht, daß sich die Rezeptormoleküle immunologisch an in der Probe vorliegendes Apoprotein B-100 unter Bildung eines Immunreaktants immunologisch binden; und
(e) Bestimmung der Menge des gebildenten Immunreaktants. Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Prüfung einer Körperfluid-Probe auf Apoprotein B-100, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellung einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;
(b) Bereitstellung eines festen Trägers, enthaltend eine feste Matrix mit einem daran in biologisch aktiver Form fixierten ersten Rezeptor, der mit Apoprotein B-100 immunreagiert und von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 ausgeschieden ist;
(c) Bereitstellung eines biologisch aktiven zweiten Rezeptors, der mit Apoprotein B-100 immunreagiert und von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742 ausgeschieden ist, wobei der genannte zweite Rezeptor an ein Enzym- Label gebunden ist, das imstande ist, die Anwesenheit des genannten zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren;
(d) praktisch gleichzeitiges Zusammenmischen von:
(i) der Körperprobe;
(ii) dem ersten Rezeptor; und
(iii) dem gekennzeichneten zweiten Rezeptor zur Bildung einer Festphasen-/Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung;
(e) Halten der Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums, der ausreicht, daß der erste Rezeptor und der gekennzeichnete zweite Rezeptor in der Probe vorliegendes Apoprotein B-100 immunologisch binden, um einen Festphasen-Sandwich-Immunreaktant zu bilden;
(f) Abtrennung des genannten Festphasen-Sandwich-Immunreaktants von der flüssigen Phase; und
(g) Bestimmung der Menge des gekennzeichneten zweiten Rezeptors, der in dem gebildenten Festphasen-Sandwich-Immunreaktant gebunden ist.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein kompetitives Verfahren zur Untersuchung einer Körperfluid-Probe auf Apoprotein B-100, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellung einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;
(b) Bereitstellung eines festen Trägers, enthaltend eine feste Matrix, die eine vorherbestimmte Menge von Reagenz Apoprotein B-100 daran fixiert enthält;
(c) praktisch gleichzeitiges Zusammenmischen von:
(i) der Körperprobe;
(ii) dem festen Träger; und
(iii) einer vorherbestimmten Menge von Rezeptormolekülen, die mit Apoprotein B- 1 00 immunreagieren und ausgeschieden sind entweder von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 oder dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742, zur Bildung einer Festphasen-/Flüssigphasen-Mischung;
(d) Halten der Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums, der ausreicht, daß die Rezeptormoleküle an Apoprotein B-100 Moleküle des festen Trägers und Apoprotein B-100 Moleküle in der Körperfluid- Probe immunologisch binden und einen Festphasen-Immunreaktant und einen Flüssigphasen-Immunreaktant bilden;
(e) Abtrennung des Festphasen-Immunreaktants von der genannten flüssigen Phase;
(f) Mischen des Festphasen-Immunreaktants mit einem biologisch aktiven zweiten Rezeptor, der mit dem ersten Rezeptor immunreagiert, um eine zweite Festphasen- /Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung zu bilden, wobei der zweite Rezeptor an ein Enzym-Label gebunden ist, das imstande ist, die Anwesenheit des zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren;
(g) Halten der genannten zweiten Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums, der ausreicht, daß der gekennzeichnete zweite Rezeptor sich an den ersten in dem Festphasen-Immunreaktant vorliegenden Rezeptor bindet, um einen Festphasen-Sandwich-Immunreaktant zu bilden;
(h) Abtrennung des Festphasen-Sandwich-Immunreaktants aus der flüssigen Phase; und
(i) Bestimmung der Menge des gekennzeichneten, in dem genannten Festphasen-Sandwich-Immunreaktant gebundenen zweiten Rezeptors.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung eine Zellkultur, umfassend:
(a) das Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746;
(b) Rezeptormoleküle, die von dem Hybridom ausgeschieden wurden und mit Apoprotein B-100 immunreagieren; und
(c) ein Kulturmedium für das Hybridom.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend:
(a) das Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742;
(b) Rezeptormoleküle, die von dem Hybridom ausgeschieden sind und mit Apoprotein B-100 immunreagieren; und
(c) ein Kulturmedium für das Hybridom.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein diagnostisches System zur Bestimmung der Menge von Apo B-100 in einer Körperprobe, umfassend:
(a) ein biologisch aktives erstes spezifisches Bindeagens, das Rezeptormoleküle umfaßt, die (i) mit Apoprotein B-100 irnmunreagieren; und (ii) entweder die von dem Hybridom ATCC HB 8746 ausgeschiedenen Rezeptormoleküle oder die von dem Hybridom ATCC HB 8742 ausgeschiedenen Rezeptormoleküle sind; und
(b) ein biologisch aktives gekennzeichnetes zweites spezifisches Bindeagens zur Signalisierung der Immunreaktion des ersten Bindeagens mit Apo B-100.
Eine feste Matrix aus Affinitäts-Sorptionsmittel besteht aus einer Festphasen-Matrix, an die biologisch aktive Rezeptormoleküle fixiert sind, die mit Apoprotein B-100 immunreagieren und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
(a) den Rezeptormolekülen, die von dem Hybridom HB 8746 ausgeschieden sind;
(b) den Rezeptormolekülen, die von dem Hybridom ATCC HB 8742 ausgeschieden sind; und
(c) einer Mischung der Rezeptormoleküle von (a) und (b).
Die vorliegende Erfindung bewirkt verschiedene günstige Effekte und Vorteile.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die erfindungsgemäßen Hybridome zur Herstellung relativ großer Mengen von Rezeptoren mit gleichbleibender Qualität, die mit Apo B-100 immunreagieren, verwendet werden können.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die erfindungsgemäßen Rezeptoren unter anderem verwendbar sind, um die Menge von Cholesterin tragendem Apo B-100 in einer Körperfluid-Probe zu bestimmen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die erfindungsgemäßen Rezeptoren in Assays mit Enzym-gebundenen Immunosorbant für Apo B-100 in Formaten verwendet werden können, die keine Zentrifugierverfahren erforderlich machen.
Ein weiterer Vorteil ist der, daß die erfindungsgemaßen Assay-Methoden in relativ kurzen Zeiträumen zu Ende gebracht werden können.
Andere Vorteile und günstige Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann auf diesem Gebiet aus der folgenden Beschreibung der Erfindung, den Zeichnungen und den angeschlossenen Ansprüchen ersichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Fotographie eines Western Blot Assay-Autoradiogramms, in welchem die Fähigkeit der Rezeptormoleküle M847 und M824 zur Immunreaktion mit Apo B-100 und Apo B-48, die aus delipidierten Chylomikronen und VLDL erhalten wurden aufgezeigt ist. VLDL und Chylomikrone wurden delipidiert und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von Gradientengelen mit 3 bis 6 Prozent unterworfen. Sechzig Mikrogrannn (µg) VLDL-Protein und 20 µg Chylomikron-Protein wurden auf unterschiedlichen Streifen des Gels laufen gelassen, wodurch die Proteine jedes Präparates nach ihrer Größe aufgetrennt wurden. Die Sichtbarmachung des elektrophoretischen Musters der Proteinbanden durch Färbung des Gels mit 0,1 Prozent Coomassie-Blau zeigten Banden von Apo B-100 und Apo B-48 in Chylomikronen und VLDL. Die Proteinbanden wurden dann zur Bildung eines festen Trägers durch elektrophoretischen Trasfer auf Nitrozellulose-Papier fixiert. Die am Festträger fixierten Apoprotein-Antigene wurden dann getrennt mit immungereinigten Rezeptormolekülen M847 und M824 immunreagieren gelassen. Monoklonale Rezeptormoleküle M847 und M824, die immunologisch an das Festphasen-fixierte Antigen gebunden waren, wurden unter Verwendung von ¹²&sup5;I-gekennzeichnetem Ziegen-Anti-Maus Ig und durch Autoradiographie festgestellt.
Spalte A erläutert, daß monoklonales M824 mit Apo B-100 und Apo B-48 aus VLDL (V) und Chylomikronen (C) immunreagiert. Spalte B zeigt, daß monoklonales M847 mit Apo B-100 aus V und C immunreagiert, dies jedoch nicht mit Apo B-48, weder aus V noch aus C, tut. Spalte C ist ein negativer Vergleich, der zeigt, daß ein für rote Schafsblutzellen spezifischer monoklonaler Antikörper mit keinem vorliegenden Antigen immunreagiert. Spalte D ist ein weiterer negativer Vergleich, der zeigt, daß ein immungereinigtes polyklonales Antiserum für Phenyl-beta-O-glukosid keines der vorliegenden Antigene erkennt. Spalte E ist ein positiver Vergleich, der zeigt, daß ein immungereinigtes polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen humanes LDL-Apoprotein sowohl Apo B-100 als auch Apo B-48 sowohl in V als auch in C erkennt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die den Prozentsatz der durch steigende molare Konzentrationen von monoklonalem Antikörper M847 [Abszisse; Ab-Konzentration (Moab)] in einem Flüssigphasen-Radioimmunoassay (RIA) gebundenen ¹²&sup5;I- gekennzeichneten LDL-Partikeln zeigt.
LDL wurde aus gepooltem Plasma von 10 Personen ( - - - - ) oder aus einer normolipidämischen Person ( ) hergestellt. Das Plasma wurde durch Plasmaphorese der Personen im Anschluß an eine 12-stündige Fastenperiode gewonnen.
Figur 3 ist ein Balkendiagramm, das das Ausmaß der Inhibition durch den Antikörper M847 (offene Balken: M847) und überschüssiges ungekennzeichnetes humanes LDL (schraffierte Balken: LDL) von ¹²&sup5;I-Human-LDL-Bindung, -Intermerung und -Abbau durch gezüchtete humane Fibroblasten zeigt. Monoschichten aus Fibroblasten wurden in Vertiefungen mit 35 Millimeter in DME mit einem Gehalt an 10 Prozent fetalem Kalbsserum gezüchtet.
Fibroblast-LDL-Rezeptoren wurden durch etwa 24-stündige Vorinkubation der Fibroblasten mit Wachstumsmedium, das 2,5 Milligramm pro Milliliter (mg/ml) von Lipoprotein befreites Serum (lipoprotein depleted serum, LDS) (DME-LDS) enthielt, stimuliert. DME-LDS, das 2,5 Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml) ¹²&sup5;I-LDL und entweder 20 Prozent M847 Hybridom Kulturüberstand (Vol./Vol.) oder einen 200-fachen Überschuß von ungekennzeichnetem LDL (Endkonzentration 500 µg/ml) enthielt, wurden gemischt und etwa 16 Stunden lang bei 4ºC gehalten (inkubiert), bevor sie auf die Fibroblast-Monoschichten aufgebracht wurden.
Die Bestimmungen von Bindung, Internierung und Abbau wurden dreifach durchgeführt und sind als Prozentsatz der Vergleichswerte ausgedrückt, die in Abwesenheit des monoklonalen Rezeptors M847 bestimmt wurden. Die Inhibition von spezifischer Bindung, Internierung und Abbau durch den monoklonalen Rezeptor M847 war vergleichbar mit jener, die durch einen 200-fachen Überschuß von ungekennzeichnetem LDL erreicht wurde.
Figur 4 enthält zwei Diagramme, die die Fähigkeit der monovalenten Fab- Fragmente des monoklonalen Antikörpers M847 hinsichtlich der Inhibierung von ¹²&sup5;I- Human-LDL-Bindung und -Abbau durch humane Fibroblasten zeigen. Einzelne Medien, die ansteigende Mengen von M847-Fab-Fragmenten und eine konstante Menge von ¹²&sup5;I- LDL (2,5 µm/ml) enthielten, wurden gemischt und während eines Zeitraums von etwa 15 Stunden bei 4ºC gehalten (inkubiert), bevor sie auf die Fibroblast-Monoschichten aufgebracht wurden. Die Fab-Konzentration wird als das Molverhältnis von in jedem Medium vorliegendem Fab/LDL ausgedrückt (unter der Annahme eines Molekulargewichts (MW) des Fab von 40.000 Dalton und eines Molekulargewichts des Apo B von 550.000 Dalton).
Bindung und Abbau werden als der Prozentsatz der Vergleichwerte in Abwesenheit von M847-Fab-Fragmenten ausgedrückt. Alle Bestimmungen wurden doppelt durchgeführt. Überschüssiges ungekennzeichnetes LDL (Endkonzentration 500 µg/ml) bewirkte mehr als 95%ige Inhibition von ¹²&sup5;I-LDL-Bindung (Spalte A) und Abbau (Spalte B). Ähnliche Ergebnisse wurden in drei Studien mit unterschiedlichen Fab-Präparaten des monoklonalen Rezeptors M847 erhalten.
Figur 5 enthält zwei Diagramme. Diagramrn A veranschaulicht die Fähigkeit einer bekannten konstanten Menge von Meerrettich-Peroxidase-gekennzeichneten Rezeptoren M847 (HRPO-M847) zur Immunreaktion mit Festphasen-fixiertem Reagenz Apo B 100 in Gegenwart steigender Mengen von Rezeptormolekulen M824. Auf der Ordinate sind die relativen Einheiten der optischen Dichte aufgetragen, wahrend auf der Abszisse die Einheiten der Mikrogramme pro Milliliter von ungekennzeichnetem Antikörper- Protein, das als Konkurrent (µg/ml) zugegeben ist, aufgetragen sind.
Eine konstante Menge (20 µg) von HRPO-gekuppelten Rezeptoren M847 wurde praktisch gleichzeitig mit steigenden Mengen von ungekennzeichneten M847 ( ) oder ungekennzeichneten M824 ( ) Rezeptoren und Festphasen-fixiertem Reagenz Apo B-100 (LDL) gemischt. Die Mischungen wurden 3 Stunden bei 25ºC gehalten, wodurch es den Rezeptoren ermöglicht wurde, sich immunologisch an das Reagenz Apo B-100 zu binden und einen Festphasen-Immunreaktant zu bilden. Die Menge des Festphasen-gebundenen gekennzeichneten M847 wurde dann wie in dem, in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschriebenen Kompetitionstest ELISA bestimmt.
Das Diagramm A veranschaulicht, daß die Anwesenheit zunehmender Mengen von ungekennzeichneten M847 Rezeptoren in der Immunreaktionsmischung in entsprechender Weise die Menge der als Festphasen-Immunreaktant gebundenen gekennzeichneten M847 Rezeptoren herabsetzt. Somit konkurriert ungekennzeichnetes M847 mit gekennzeichnetem M847 um das LDL.
Andererseits zeigt das Diagramm A auch, daß zunehmende Mengen von ungekennzeichneten M824 Rezeptoren die Menge des als Festphasen-Immunreaktant gebundenen gekennzeichneten M847 nicht in signifikanter Weise herabsetzen. Somit konkurriert ungekennzeichnetes M824 nicht mit gekennzeichnetem M847 um die Bindung an LDL.
Das Diagrannn B veranschaulicht, daß ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von HRPO-gekennzeichneten M824 Rezeptoren und ungekennzeichneten M847 Rezeptoren erhalten werden. M847 und M824 Rezeptoren binden daher an unterschiedliche Epitope, die auf der Oberfläche von Apo B- 100 ausreichend voneinander entfernt sind, sodaß die Bindung beider Rezeptoren an ein einziges Apo B-100 Molekül ermöglicht wird, ohne daß eine sterische Konkurrenz mit der Bindung und eine Inhibierung derselben stattfindet.
Figur 6 enthält zwei Diagramme. Das Diagrannn A stellt die Bindung von ¹²&sup5;I-gekennzeichnetem B-47 an LDL in einem Flüssigphasen-RIA dar. Auf der Ordinate sind die Einheiten von gebundenen Femtomolen (fMol) angegeben, während auf der Abszisse die Einheiten des zugemischten Antikörpers in Nanomolen (nM) aufgetragen sind.
Immungereinigter monoklonaler Antikörper M847 wurde unter Verwendung der Jodogen-Technik mit ¹²&sup5;I bis zu einer spezifischen Aktivität von 3000 Zählern pro Minute pro Nanogramm (cpm/ng) jodiert. Nach einer ausgedehnten Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) waren mehr als 95 Prozent der Radioaktivität durch 10%ige Trichloressigsäure (TCA) ausfällbar. Mehr als 98 Prozent des ¹²&sup5;I-M847 waren an eine LDL-Säule gebunden. Die Assays wurden in dreifacher Ausführung in 10x75 Milliliter (mm) Silikon-beschichteten Glasröhrchen durchgeführt. Steigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-M847 in 0,1 ml Rinderserum-Albumin-Barbital (BSA-Barbital) Puffer (ph-Wert 8,0) wurden zu 100 ng von gepooltem normolipidämischem humanem LDL, das in 0,2 ml BSA-Barbital-Puffer verdünnt war, zugesetzt. Jedes Röhrchen enthielt 182 fMol LDL Apo B (unter der Annahnie eines Molekulargewichts von Apo B mit 550.000 Dalton).
Nach der Inkubation (Mischung und Aufbewahrung) während eines Zeitraums von 16 Stunden bei 4ºC wurde LDL quantitativ durch ein für humanes LDL spezifisches, von Lipoprotein befreites Kaninchen-Antiserum ausgefällt. [Es wurde nur jene Fraktion des Kaninchen-Antiserums verwendet, die eine Dichte (d) von mehr als 1,21 g/ml aufwies, da der monoklonale Antikörper M847 sich an Kaninchen-Apolipoprotein B bindet.]
In vorangehenden Studien wurde eine Konzentration von entlipidiertem Kaninchen-Antiserum erstellt, die mehr als 98 Prozent von 100 ng ¹²&sup5;I-Human-LDL ausfällte. Nach Zusatz des Kaninchen-Antiserurns wurden die Röhrchen während etwa 16 Stunden bei 4ºC inkubiert.
Die Überstände wurden abgetrennt und die Pellets zweimal mit 2 ml eiskaltem Barbital-Puffer (ph-Wert 8,0) gewaschen. Die unspezifische Bindung und die Ausfällung wurden in zwei Gruppen parallel geführter Röhrchen bestimmt. In der ersten Gruppe wurde kein humanes LDL zu der anfänglichen Inkubation zugesetzt, jedoch wurde die gleiche Menge von zweitem Kaninchen-Antikörper zugefügt. Bei der zweiten Gruppe von Röhrchen wurde Nicht-Immun-Kaninchen-Serum (Fraktion mit d größer als 1,21 mg/ml) anstelle des Immun-Kaninchen-Serum-Antikörpers verwendet.
Beide Verfahren lieferten im wesentlichen idente Werte für die nicht-spezifische Bindung, die mit steigenden Konzentrationen von monoklonalem Antikörper ¹²&sup5;I- M847 linear verlief, und in allen Fällen wurde weniger als 1 Prozent der Gesamtzähler zugesetzt. Durch Abziehen der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtbindung wurde die spezifische ¹²&sup5;I-M847 Bindung an LDL erhalten. Die Bindungsdaten wurden unter Verwendung eines Programms der linearen Regression für die Scatchard-Analyse von Liganden- Bindungssystemen analysiert, wodurch eine Abschätzung der Antikörper-Affinitätskonstante (Ka) und der Rezeptor- oder Epitop-Konzentration erhalten wurde.
Der Ka-Wert von ¹²&sup5;I-M847 für LDL wurde dabei mit 3,82x10&sup9;M&supmin;¹ ermittelt. Extrapolation der Geraden auf Bedingungen unendlichen Antikörper-Überschusses ergaben eine Abschätzung von 212 fmol (35 ng) ¹²&sup5;I-M847, die durch 182 fMol (100 ng) LDL gebunden waren, wenn das Molekulargewicht von Apo B mit 550.000 Dalton angenommen wird. Diese Daten sind in dem Diagramm B dieser Figur gezeigt, in welchem auf der Ordinate die Einheiten des Verhältnisses von gebundenem (B) zu freiem (F) (B/F) Antikörper aufgetragen sind, während auf der Abszisse die Einheiten von fMol gebundenem Antikörper (fmol M847) aufgetragen sind.
Figur 7 veranschaulicht den Zusammenhang zwischen den mg LDL-Cholesterin pro Deziliter (dl) der Probe, bestimmt durch LiDid Research Clinic Procedures, HEW Publication Nr. 75-628 (NIH), 2.Ausgabe, Wash., D.C. Gov. Print. Off. (1974), und den mg Apo B- 1 00 pro dl Probe, bestimmt unter Verwendung des in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschriebenen nicht-kompetitiven ELISA.
Der Korrelationskoeffizient r=0,89, bestimmt durch den Spearrnan Rank Korrelationstest für nicht-parametrische Daten [Sokal et al., Biometry, 2. Aufl., W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 561-616 (1981)], deutet auf eine signifikante Korrelation zwischen den Gehalten von Apo B-100, bestimmt durch den hier beschriebenen nichtkompetitiven ELISA, und den LDL-Cholesteringehalten in 60 humanen Plasmaproben.
Figur 8 ist ähnlich wie Figur 7 und veranschaulicht einen signifikanten Zusammenhang, r=0,92, zwischen den Gehalten von Apo B-100, wie sie durch ein Kompetitions-ELISA-Verfahren gemäß dieser Erfindung bestimmt wurden, und den LDL-Cholesteringehaiten in den selben 60 humanen Proben.
Figur 9 veranschaulicht den signifikanten Zusammenhang, r=0,92, wie er durch den Spearman Rank Korrelationstest bestimmt wurde, zwischen den Ergebnissen, di unter Verwendung des nicht-kompetitiven ELISA (Ordinate) und des kompetitiven ELISA (Abszisse) an den gleichen 60 humanen Proben, die in den Figuren 7 und 8 verwendet wurden, erhalten wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

I. Allgemeine Diskussion

A. Definitionen

Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf ein Rezeptormolekül, das ein Mitglied einer Familie von glykosylierten Proteinen ist, die Immunglobuline genannt werden und sich spezifisch mit einem Antigen vereinigen können.
Eine "Antikörper-Vereinigungstelle" ist jener strukturelle Teil eines aus variablen und hypervariablen Regionen schwerer und leichter Ketten zusammengesetzten Antikörpermoleküls, der spezifisch an Antigen bindet.
Das Wort "Antigen" wurde ursprünglich dazu verwendet, jenes Gebilde zu bezeichnen, das von einem Antikörper gebunden wird, und auch das Gebilde zu definieren, das die Produktion des Antikörpers anregt. Die modernere Verwendung dieses Worts beschränkt die Bedeutung von Antigen auf jenes Gebilde, das durch einen Antikörper gebunden wird, während das Wort "Immunogen" für jene Gesamtheit verwendet wird, die die Antikörper-Produktion anregt. Wenn ein hier besprochenes Gebilde sowohl Immuno gen als auch Antigen ist, wird es im allgemeinen als Antigen bezeichnet.
"Antigene Determinante" bezieht sich auf den tatsächlichen strukturellen Teil des Antigens, der immunologisch durch eine Antikörper-Vereinigungsstelle gebunden wird. Der Ausdruck ist auch austauschbar mit dem Wort "Epitop" verwendet.
Der Ausdruck "biologisch aktiv" bezieht sich mindestens auf die Fähigkeit zur spezifischen Bindung von Liganden oder spezifischen Bindeagenzien, obwohl auch eine andere allgemeine oder eine Effektorfahigkeit vorliegen kann.
Das Wort "Komplex", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf das gebildete Produkt, wenn ein spezifisches Bindeagens sich an einen Ziel-Liganden bindet. Beispielhafte Komplexe sind Immunreaktanten, Protein A, das an einen Antikörper gebunden ist, und dergleichen.
"ELISA" bezieht sich auf einen Assay mit Enzym-gebundenem Immunosorbent, der einen an eine Festphase gebundenen Antikörper oder ein solches Antigen und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat verwendet, um die in einer Probe anwesende Menge von Antigen oder Antikörper quantitativ zu bestimmen. Eine Beschreibung des ELISA-Verfahrens findet sich in Kapitel 22 der 4. Ausgabe von Basic and Clinical Immunologv von D.P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publications in Los Altos, CA, 1982, und in den US-Patenten Nr. 3,654.090; Nr. 3,850.752; und Nr. 4,016.043, die hier alle als Referenz aufgenommen sind.
"Enzym" bedeutet ein Protein, das imstande ist, durch katalytische Wirkung eine gewisse Änderung in einem Substrat, für welches es oft spezifisch ist, zu beschleunigen oder zu bewirken.
"Epitop" bezieht sich auf jenen Teil eines Moleküls, der durch eine Antikörper-Vereinigungsstelle spezifisch erkannt wird. Es wird auch als Determinante oder antigene Determinante bezeichnet.
"Idiotope" oder "idiotypische Determinanten" sind antigene Determinanten an den variablen und hypervariablen Teilen eines Antikörpermoleküls, die von einer Vereinigungsstelle anderer Antikörper erkannt werden können. Idiotope werden in der Regel in zwei Arten unterteilt, jene, die Bindungsstellen-assoziierte Determinante sind, und jene, die nicht-Bindungsstellen-assoziierte Determinante sind. Die Gesamtheit der Idiotope auf einem Antikörpermolekül stellt dessen Idiotyp dar. Es wird angenommen, daß eine von einem Hybridom produzierte Antikörper-Vereinigungsstelle eine einzige, einzigartige Gruppe von Idiotopen besitzt; d.h. einen einzigartigen Antikörper-Vereinigungsstellenldiotyp.
"Immunreaktant", wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezieht sich auf das Produkt einer immunologischen Reaktion; d.h., das Gebilde, das entsteht, wenn ein Ligand immunologisch von einem Rezeptormolekül gebunden wird. Ein "Immunreaktant" ist eine spezielle Art von "Komplex".
Das Wort "isoliert", wie es hier im Zusammenhang mit Rezeptormolekülen verwendet wird, bedeutet, daß praktisch nur eine Spezies von Antikörper-Vereinigungsstellen vorliegt.
Die Ausdrücke "Kennzeichnungsmittel", "Indikatorgruppe" oder "Label" werden hier austauschbar verwendet, um einzelne Atome und Moleküle zu umfassen, die entweder direkt oder indirekt an der Produktion eines feststellbaren Signals zum Hinweis auf das Vorliegen eines Immunreaktants beteiligt sind. Beliebige kennzeichnende Mittel können in einen Rezeptor eingebaut oder an diesen gebunden sein oder sie können in getrennter Form verwendet werden und jene Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Solche Indikatorgruppen oder Label sind an sich in der Immunchemie allgemein bekannt und stellen nur insofern einen Teil dieser Erfindung dar, als sie mit sonst neuen Rezeptoren, Verfahren und/oder Systemen gemeinsam verwendet werden.
"Ligand" bezieht sich auf ein Molekül das einen strukturellen Teil enthält, der durch einen spezifischen Rezeptor gebunden ist, z.B. ein Antigen, das durch einen Rezeptor gebunden ist.
Der Ausdruck "Rezeptor" wird hier verwendet, um ein biologisch aktives Molekül zu bezeichnen, das sich immunologisch an (oder mit) ein(em) Antigen bindet. Eine derartige Bindung tritt in der Regel mit einer Affinität von etwa 10&sup5; bis etwa 10¹&sup0; Litern pro Mol (M&supmin;¹) auf und ist eine spezifische Wechselwirkung des Epitops des Antigens mit der Antikörper-Vereinigungsstelle des Rezeptors.
Ein Rezeptormolekül gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein beliebiger intakter Antikörper, ein im wesentlichen intakter Antikörper oder ein Polypeptidanteil eines Antikörpers, der einen Antikörper-Vereinigungsstellen-Idiotyp enthält (z.B. ein Fab- Fragment), wie es etwa in Ascitesflüssigkeit oder in Gewebskulturüberstand vorliegt.
Das Wort "Rezeptor" wird hier auch für Moleküle an Zelloberflächen verwendet, die andere Moleküle binden. Zelloberflächen-Rezeptoren werden hier immer mit dem Namen des gebundenen Gebildes bezeichnet, das dem Wort "Rezeptor" vorhergeht, um jede Zweideutigkeit zu vermeiden. Ein beispielhafter Zelloberflächen-"Rezeptor" ist der oben beschriebene LDL-Rezeptor.
Biologische Aktivität eines Rezeptormoleküls wird durch die immunologische Reaktion des Rezeptors mit seinem antigenen Liganden bei deren Mischung in einem wässerigen Medium zumindest bei physiologischen pH-Werten und Ionenstärken zur Bildung eines Immunreaktants unter Beweis gestellt. Vorzugsweise tritt die biologische Aktivität unter den Bedingungen eines biologischen Assays auf, d.h. jenen Bedingungen, unter welchen sich die erfindungsgemäßen Rezeptorrnoleküle an den antigenen Liganden binden, nämlich innerhalb eines ph-Wert-Bereichs von etwa 5 bis etwa 9, bei Ionenstärken, wie etwa der von destilliertem Wasser bis zu jener von etwa 1 molarem Natrumchlorid und bei Temperaturen von etwa 4ºC bis etwa 45ºC. Alle hier beschriebenen Rezeptormoleküle waren biologisch aktiv.
Polypeptidteile, die einen Antikörper-Vereinigungsstellen-Idiotyp (Antikörper-Vereinigungsstellen) enthalten, von Antikörpern sind jene Teile der Antikörpermoleküie, die die Vereinigungsstellen-Idiotypen enthalten und an den Ligand binden, und die die Fab-, Fab'-, F(ab')&sub2;- und F(v)-Teile des Antikörpers enthalten. Fab- und F(ab')&sub2;-Teile von Antikörpern sind in der Fachwelt allgemein bekannt und werden durch die proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin an im wesentlichen intakten Antikörpern durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt. Vgl, zum Beispiel US-Patent Nr. 4,342.566 von Theofilopolous und Dixon. Fab'-Antikörperteile sind ebenfalls allgemein bekannt und werden hergestellt aus F(ab')&sub2;-Teilen mit anschließender Reduktion, etwa mit Mercaptoethanol, der Disulfidbrückenbindungen, die die beiden Teile der schweren Ketten miteinander verbinden, und darauffolgende Alkylierung des entstehenden Proteinmercaptans mit einem Reagenz, wie etwa Jodacetamid. Intakte Antikörper werden bevorzugt und werden gemeinsam mit Fab-Teilen zur Veranschaulichung der erfindungsgemäßen monoklonalen Rezeptormoleküle verwendet.
Die Worte "ausscheiden" und "produzieren" werden in der Fachwelt oft mit gleicher Bedeutung verwendet und beziehen sich auf Zellen, aus welchen Antikörpermoleküle gewonnen werden. Es besteht jedoch die Möglichkeit, daß die die Antikörper produzierenden Zellen diese Moleküle nicht in ihre Umgebung ausscheiden. Die hier interessierenden Hybridom-Zellen scheiden monoklonale Antikörper in ihre Umgebung aus. Nichtsdestoweniger wird auf solche Zellen hier oft als "Antikörper-produzierende" Zellen Bezug genommen und ihre Antikörper werden als "produziert" bezeichnet, womit der in der Fachwelt verwendete Ausdruck beibehalten wird.
Der Ausdruck "spezifisches Bindeagens", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein molekulares Gebilde, das zur selektiven Bindung eines Liganden befähigt ist. Beispielhafte spezifische Bindeagenzien sind Rezeptoren, komplemente Fragmente, Protein A und dergleichen.
Der Ausdruck "im wesentlichen rein", wie er hier im Zusammenhang mit Rezeptormolekülen verwendet wird, bedeutet, daß innerhalb feststellbarer Grenzen nur eine Spezies von Antikörper-Vereinigungsstelle als ein effektives Bindeagens für Apo B-100 vorliegt. Obwohl somit eine praktisch reine Rezeptormolekül-Zubereitung mehr als eine Spezies von Antikörper-Vereinigungsstellen enthalten kann, entfaltet eine solche Zubereitung eine einzige Bindungsaffinität für Apo B-100. Gewebskulturüberstände, die von einem erfindungsgemäßen Hybridom produziert werden, enthalten zum Beispiel in der Regel Myelom-Proteine ebenso wie erfindungsgemäße Rezeptoren. Ein Rezeptormolekül in praktisch reiner Form wird in der Regel von dem Fachmann auf diesem Gebiet als "monoklonaler Antikörper" bezeichnet, da solche Zusammensetzungen unter Verwendung von Kulturen eines monoklonalen Hybridoms hergestellt werden.
Der Ausdruck "im wesentlichen gleichzeitig", wie er hier in Verbindung mit der Mischung von drei oder mehr Antigen- und Rezeptorbestandteilen zur Bildung einer Immunreaktionsmischung verwendet wird, bedeutet daß alle Bestandteile innerhalb von etwa 15 Minuten und vorzugsweise innerhalb von etwa 5 Minuten nach dem Zusammenmischen beliebiger zwei der Bestandteile vorliegen und miteinander vermischt werden.

B. Hybridome und monoklonale Rezeptoren

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hybridom mit der Laboratoriumsbezeichnung HL130C2.3C5, welches Rezeptormoleküle produziert, die:
(a) mit einer konservierten antigenen Determinante auf Apoprotein B-100 immunreagieren;
(b) kompetitiv die Bindung von Apoprotein B-100 an einen LDL-Rezeptor inhibieren; und
(c) eine Affinitätskonstante für LDL von etwa 3,82x10&sup9;M&supmin;¹ in einem kompetitiven Flüssigphasen-Gleichgewichts-Radioimmunoassay (RIA) aufweisen. Diese Rezeptormoleküle werden im allgemeinen als M847 bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom mit der Laboratoriumsbezeichnung V82A6.1G4, das Rezeptormoleküle produziert, die mit einer antigenen Determinante von Apoprotein B-100 immunreagieren und eine Affinitätskonstante für LDL von etwa 3,0x10&sup9;M&supmin;¹ in einem kompetitiven Festphasen-Gleichgewichts-RIA aufweisen. Diese Rezeptormoleküle werden in der Regel als M824 bezeichnet.
Die Hybridome HL130C2.3C5 und V82A6.1G4 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD am 6. März 1985 unter den folgenden ATCC-Eintragungsnummern hinterlegt: Hybridom Rezeptor Bezeichnung ATCC Eintragungsnummer
Die obigen ATCC-Hinterlegungen erfolgten in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.
Die erfindungsgemäßen Hybridome wurden durch Fusion einer Antikörperproduzierenden Zelle und einer Myelom-Zell-Line gebildet. Solche Rezeptor-produzierende Zellen wurden zuerst von Köhler und Milstein, Naturen 256, 495 (1975) beschrieben, welche Beschreibung hier als Referenz angegeben ist. Rezeptoren werden im allgemeinen gewonnen aus den Überständen von Hybridom-Zellkulturen, vorzugsweise aus Kulturen monoklonaler Zellen, oder andererseits aus Ascitesflüssigkeit oder anderen Körperfluiden, die aus nicht-humanen, warmblütigen Wirtstieren, erhalten wurden, vorzugsweise solchen, die histokompatibel oder immunkompromittiert sind und in welchen die Hybridomzellen eingesetzt und gezüchtet wurden.
Somit betrifft gemäß einer anderen Ausführungsform die vorliegende Erfindung eine Zellkultur, umfassend (a) ein erfindungsgemäßes Hybridom; (b) Rezeptormoleküle, die von dem Hybridom ausgeschieden wurden und mit Apoprotein B-100 immunreagieren; sowie (c) ein Kulturmedium für das Hybridom. Für die Herstellung dieser Zusammensetzungen verwendbare Medien sind sowohl in der Fachwelt allgemein bekannt als auch im Handel erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und dergleichen. Ein Beispiel für ein synthetisches Medium ist Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8, 396 (1959)), das mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin und 20 Prozent fetalem Kalbsserum ergänzt wurde. Ein beispielhafter Stamm von Inzuchtmäusen ist Balb/c.
Bei einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die mit M847 und M824 bezeichneten Rezeptoren, die von den als HB 8746 bzw. HB 8742 bezeichneten Hybridomen produziert werden und mit Apoprotein B-100 immunreagieren. Somit kann ein erfindungsgemäßer Rezeptor durch Züchtung eines entsprechenden erfindungsgemäßen Hybridoms in einem geeigneten Medium und Gewinnung des Rezeptors aus dem Medium hergestellt werden.
Früher berichteten Curtiss et al., J. Biol. Chem., 257, 15213 (1982) über die Produktion und Kennzeichnung von 11 Apo B spezifischen Rezeptormolekülen, inklusive jenen mit der Bezeichnung M824, die von dem Hybridom HB 8742 produziert werden. Das Hybridom HB 8742 wurde, wie in dem Abschnitt über "Materialien und Verfahren" detaillierter beschrieben wird, durch Fusion von Splenozyten von Mäusen, die mit humanem VLDL immunisiert worden waren, gewonnen.
Die IGG-Fraktion von M824-enthaltender Ascitesflüssigkeit, die durch intraperitoneales Wachstum von Hb 8742 entwickelt wird, wurde durch isoelektrische Fokusierung (IEF) charakterisiert. Wie von Curtiss et al., supra, angegeben, erfolgte die Fusion mit P3x63a98 Myelomzellen, die ein IgG&sub1;k-Immunglobulin ausscheiden. Bei der IEF zeigte daher die HB 8742 Ascitesflüssigkeit ein einzigartiges Muster von mehrfachen Proteinbanden, die schwere und leichte Ketten enthaltende Immunglobulin-Moleküle in zufälliger Verteilung zusätzlich zu dem P3x63A98 Myelom IgG&sub1;k-Antikörper und dem Rezeptor M824 darstellten.
Das Hybridom HB 8746 produziert M847 Rezeptormoleküle und wurde durch Fusion von S plenozyten von Mäusen, die mit LDL immunisiert worden waren, mit P3x63Ag8.653.1 Myelomzellen gebildet. Diese Varietät von Parent-Myelom scheidet kein Myelom-Protein aus. Die IEF an HB 8746 Ascitesflüssigkeit ergibt ein einzigartiges Muster von Proteinbanden, die die IgG2a schweren und kappa-leichten Ketten darstellen. Somit können beide erfindungsgemäße Hybridome zum Teil durch das IEF-Muster der Rezeptormoleküle, das sie produzieren charakterisiert werden.
Obwohl das erfindungsgemäße V82A6.1G4-Hybridom mehr als eine Art von Rezeptormolekülen produziert, können die erfindungsgemaßen Rezeptormoleküle leicht durch ihre individuellen Fähigkeiten zur Immunreaktion mit antigenen Determinanten von Apo B-100 identifiziert und isoliert werden. Die antigenen Spezifitäten von M824 und M847 wurden geprüft, indem ihre individuellen Fähigkeiten zur Immunreaktion mit Apoproteinen, die aus Chylomikronen, VLDL, LDL und HDL gewonnen wurden, in dem im folgenden beschriebenen Western Blot Assay erfaßt wurden.
Die so erhaltenen Daten deuten darauf hin, daß M847 und M824 mit aus LDL, VLDL und Chylomikronen gewonnenem Apo B-100, jedoch nicht mit aus VLDL oder Chylomikronen gewonnenem Apo B-48 immunreagieren. Die Fähigkeit sowohl von M847 als auch von M824 zur individuellen Immunreaktion mit Apo B-100 aus Chylomikronen und VLDL ist in Figur 1 gezeigt.

1. Charakterisierung der antigenen Determinante von Apo B-100 die immunologisch durch M847 gebunden ist

Frühere Untersuchungen zeigten die antigene Heterogenität in Apo B-100. Das heißt, daß manche Apo B-100 Epitope nicht von allen LDL-Teilchen exprimiert werden. Somit führt eine Mischung mit einem Uberschuß bestimmter monoklonaler Antikörper in einem Flüssigphasen-RIA nicht zur immunologischen Bindung aller radiogekennzeichneter LDL (¹²&sup5;I-LDL) Partikel.
Zur Bestimmung, ob das von den M847 Rezeptormolekülen erkannte Epitop einheitlich von allen LDL exprimiert wird, wurde die Fähigkeit von M847 zur immunologischen Bindung an ¹²&sup5;I-LDL in einem Flüssigphasen-RIA untersucht. Aus gepooltem Plasma von 10 normalen Personen und aus einer einzigen normalen Person isoliertes LDL wurde nach der folgenden Beschreibung radioaktiv gekennzeichnet und mit biologisch aktiven M847 Rezeptormolekülen gemischt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wurde unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums gehalten der ausreicht, daß die M847 Rezeptormoleküle sich an Apo B in jeder Probe immunologisch binden und ein Immunreaktionsprodukt (Immunreaktant) bilden.
Die maximale Menge von durch einen Überschuß von M847 Rezeptormolekülen gebundenem ¹²&sup5;I-LDL wurde durch Ausfällung aller Rezeptormoleküle mit IgSORB (The Enzyme Co., Boston, MA) und quantitative Bestimmung der mit ¹²&sup5;I-LDL assoziierten Zähler in dem Niederschlag mit einem Gammazähler bestimmt. Die als Prozentsatz von durch Trichloressigsäure (TCA) ausgefälltem ¹²&sup4;I-LDL ausgedrückten Ergebnisse, die in Figur 2 gezeigt sind, demonstrieren, daß praktisch das gesamte ¹²&sup5;I- LDL durch Antikörper gebunden war, was darauf hindeutet, daß das von M847 erkannte und gebundene Epitop von allen LDL-Partikeln exprimiert wird.

2. Kompetitive Inhibierung der Bindung von Apo B-100 an den LDL-Rezeptor durch M847

Apoprotein B-100 ist das hauptsächliche Apoprotein in humanem oder anderem Säugetier-LDL und es mediiert die Bindung von LDL an den Fibroblast-LDL-Rezeptor. Frühere Untersuchungen schilderten die zentrale Rolle des LDL-Rezeptors im Lipoprotein-Stoffwechsel des Säugetiers. Die Tatsache, daß LDL-Partikel, die aus vielfachen tierischen Spezies isoliert wurden, spezifisch an den humanen LDL-Rezeptor-Bindungsbereich binden, deutet darauf hin, daß die Bindungsstelle auf dem Apo B-100 Molekül evolutionär konserviert sein muß und somit von LDL-Partikeln aller tierischen Spezies exprimiert wird.
Um zu prüfen, ob M847 Rezeptormoleküle mit einer innerhalb des LDL- Rezeptor-Bindungsbereichs von humanem Apo B-100 lokalisierten antigenen Determinante immunreagieren, wurde die Fähigkeit von M847 zur Inhibierung der Bindung von ¹²&sup5;I-LDL an den zellulären LDL-Rezeptor untersucht. Dies erfolgte durch Mischen von M847 Rezeptormolekülen in der Form von gesamten Antikörpermolekülen mit ¹²&sup5;I-LDL zur Bildung einer Immunreaktionsmischung. Die Immunreaktionsmischung wurde dann unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß die M847 Rezeptormoleküle sich an das vorliegende ¹²&sup5;I-LDL immunologisch binden und einen Immunreaktant bilden.
Anschließend wurde die den Immunreaktant enthaltende Immunreaktionsmischung über humane Fibroblasten geschichtet, die Fibroblast-LDL-Rezeptoren exprimieren. Die Kulturen wurden dann während eines Zeitraums aufrecht erhalten, der ausreicht zur spezifischen Bindung der Fibroblast-LDL-Rezeptoren an beliebige LDL- Rezeptor-Bindungsstellen, die auf dem ¹²&sup5;I-LDL-M847 Immunreaktionsprodukt zur Verfügung stehen. Es wird angenommen, daß eine solche zelluläre Wechselwirkung von Rezeptor und LDL inhibiert wird, wenn Rezeptormoleküle, wie sie durch M847 beispielhaft dargestellt sind, mit einer antigenen Determinante von Apo B-100, deren Struktur ebenfalls an der LDL-Rezeptor-Bindung beteiligt ist, immunreagieren.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in Figur 3 gezeigt sind, deuten darauf hin, daß M847 Rezeptormoleküle die zelluläre Rezeptor-mediierte Bindung, Internierung und den Abbau von humanem ¹²&sup5;I-LDL durch humane Fibroblasten zu einem Ausmaß inhibieren, das vergleichbar ist mit dem, das durch einen 200 fachen Uberschuß von ungekennzeichnetem LDL erreicht wird.
Zur Prüfung der Möglichkeit, ob M847 Rezeptoren an ein Epitop in der Nachbarschaft des Apo B Rezeptorbereichs binden und wegen ihrer Größe die Bindung von Apo B an den LDL-Rezeptor sterisch hindern, wurde auch die Fähigkeit der Fab- Fragmente der M847 Antikörpermoleküle zur Inhibierung der Aufnahme und des Abbaus von humanem LDL in dem oben beschriebenen Fibroblast-Assay untersucht.
Wie in Figur 4 gezeigt, blockierten die M847 Fab-Fragmente in signifikanter Weise die spezifische zelluläre Bindung und den Abbau von LDL. Da die M847 Fab-Fragmente deutlich kleiner sind als intakte M847 Antikörpermoleküle, wird angenommen, daß das von der M847 Antikörper-Vereinignngsstelle erkannte Epitop innerhalb des LDL-Rezeptor-Bindungsbereichs auf LDL Apo B-100 enthalten ist. Der Antikörper M824 hat nicht die Eigenschaften des Antikörpers N1B47 und inhibiert die Bindung und den Abbau von ¹²&sup5;I-LDL durch gezüchtete Fibroblasien nicht.

3. Sterische Inhibierung

Für manche Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Assay-Methode müssen die ersten und zweiten Rezeptoren an verschiedene Epitope des Apo B-100 Moleküls binden und diese Epitope müssen ausreichend voneinander entfernt sein, sodaß die Bindung des einen Rezeptors die Bindung des anderen Rezeptors nicht sterisch inhibiert. Die Fähigkeit von M847 und M824 zur kompetitiven Inhibierung der immunologischen Bindung des jeweils anderen an das Festphasen-fixierte Reagenz Apo B-100 wurde daher untersucht.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in Figur 5 gezeigt sind, deuten darauf hin, daß ein 70-facher Überschuß von ungekennzeichnetem M824 das Peroxidasegekennzeichnete M847 nicht signifikant daran hinderte, an das Reagenz Apo B-100 zu binden. In ähnlicher Weise hinderte ein 70-facher Überschuß von ungekennzeichnetem M847 das Peroxidase-gekennzeichnete M824 nicht in signifikanter Weise an der Bindung an das Reagenz Apo B-100. Somit binden M824 und M847 an verschiedene Epitope von Apo B-100 und diese Epitope sind voneinander ausreichend entfernt, sodaß M824 und M847 als intakte Antikörper nicht die Bindung des jeweils anderen an ein einzelnes Apo B-100 Molekül inhibieren.

4. Stöchiometrie und Affinität der Bindung von M847 an Apo B-100

Zur Bestimmung der Anzahl antigener determinanter Stellen pro Apo B-100 Molekül an dem LDL, die von den M847 Rezeptormolekülen erkannt werden, wurde ein RIA mit gekennzeichnetem Antikörper verwendet. Bei diesem Assay wurden M847 Rezeptormoleküle aus Ascitesflüssigkeit gereinigt (isoliert) und durch allgemein bekannte Verfahren, die detaillierter in dem Abschnitt über N-erfahren und Materialien beschrieben werden, radioaktiv gekennzeichnet (¹²&sup5;I-M847).
Wie in Figur 6A gezeigt, wurden zunehmende Mengen von ¹²&sup5;I-M847 in getrennten Reaktionsmischungen mit einer bestimmten Menge Apo B-100 in der Form von LDL gemischt. Die Mischungen wurden unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß die ¹²&sup5;1-M847 Rezeptormoleküle sich an das Apo B-100 (LDL) immunologisch binden und einen Immunreaktant bilden. Auf die Anwesenheit von Immunreaktant wurde dann durch quantitative Fällung des LDL (gebunden und frei) unter Verwendung eines für humanes LDL spezifischen Kaninchen-Antiserums geprüft und die Menge an ¹²&sup5;I-M847, die als Immunreaktant vorlag, wurde durch Garnnia-Zählung festgestellt.
Die spezifische immunologische Bindung der ¹²&sup5;I-M847 Rezeptormoleküle erreichte, wie in Figur 6A gezeigt ist, eine Sättigung. Außerdem war eine Scatchard- Aufzeichnung der in diesen Untersuchungen erhaltenen Bindungswerte linear (Figur 68), was auf Einheitlichkeit der M847 Bindungsstellen auf den LDL-Partikeln hindeutet.
Zusätzlich dazu wurde gefunden, daß die scheinbare Affinitätskonstante (Ka) von M847 für humanes Apo B-100 in der Form von LDL bei Bestimmung durch einen RIA mit Antikörper-Kennzeichnung 3,82x10&sup9;M&supmin;¹ betrug. Auch zeigte die Scatchard-Analyse, daß ein Maximum von 212 fmol ¹²&sup5;I-Mb47 Antikörper sich an 182 fMol LDL band, was darauf hindeutet, daß nur ein Molekül M847 sich an jedes Molekül Apo B-100 bindet. Das heißt, daß Mb47 sich an eine einzelne, einzigartige antigene Determinante auf Apo B- 100 bindet.
Auch die durchschnittliche Affinitätskonstante von M847 für Apo B-100 wurde in dem oben beschriebenen RIA mit Antigen-Kennzeichnung bestimmt. Bei diesem kompetitiven Gleichgewichts-Flüssigphasen-RIA bewirkte ungekennzeichnetes Apo B-100 das als LDL vorlag, eine vollständige Verdrängung von ¹²&sup5;I-LDL. Die berechnete Affinitätskonstante der M847 Rezeptormoleküle, die als ganzer, intakter Antikörper für LDL in diesem Assay vorlagen, betrug 4x10&sup9;M&supmin;¹, was in guter Übereinstimmung mit der Ka war die in dem oben beschriebenen Assay mit Äntikörper-Kennzeichnung bestimmt worden war.

C. Assay-Methoden

Die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle sind besonders wertvoll zur Erfassung der Anwesenheit und Menge von Apoprotein B-100 in einer Körperfluid-Probe, wie etwa in Blut, Serum oder Plasma.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung einer Körperprobe hinsichtlich der Menge von Apoprotein B-100 welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellen einer Körperprobe die untersucht werden soll; in der Regel wird eine solche Probe in Form einer gemessenen Quantität oder bekannten Menge von Blut oder, bevorzugter, von Plasma oder Serum zur Verfügung gestellt. Verfahren zur Bereitstellung von Proben von Blut, Plasma und Serum sind in der Fachwelt allgemein bekannt und werden hier nicht weiter besprochen.
(b) Bereitstellen von Rezeptormolekülen in biologisch aktiver Form, die (i) mit Apoprotein B-100 immunreagieren und (ii) von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 oder von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742 ausgeschieden werden und in einer zur Durchführung der Untersuchung wirksamen Menge vorliegen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rezeptor ein intakter Antikörper oder ein Fab-Fragment.
Die wirksame Menge von Rezeptormolekülen kann, wie allgemein bekannt ist, unter anderem von der speziellen verwendeten Assay-Methode abhängen. Es ist auch allgemein bekannt, daß die wirksame Menge unter Verwendung von Standard-Laboratoriumsverfahren durch den Fachmann auf diesem Gebiet leicht bestimmt werden kann.
(c) Vermischen der Körperfluid-Probe mit den Rezeptormolekülen von Stufe (b) zur Bildung einer Immunreaktionsmischung.
(d) Die Mischung wird unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums von Minuten bis zu Stunden gehalten, wie etwa während ungefähr 10 Minuten unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums von etwa 16 bis 20 Stunden, was ausreicht, daß sich die Antikörper-Vereinigungsstellen der Rezeptormoleküle an Apoprotein B-100 in der Körperprobe immunologisch binden und einen Immunreaktant (erster Komplex) bilden. Bedingungen eines biologischen Assays sind solche, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle aufrechterhalten und einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis etwa 45ºC, einen ph-Wert-Bereich von etwa 5 bis etwa 9 und eine Ionenstärke, die von der des destillierten Wassers bis zu jener einer etwa ein molaren Natriumchloridlösung variiert, umfassen. Verfahren zur Optimierung derartiger Bedingungen sind in der Fachwelt allgemein bekannt.
(e) Bestimmung der Menge eines beliebigen gebildeten Immunreaktants und dadurch Bestimmung der Menge des Apo B-100, das in der genannten Probe vorliegt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird weiters die Körperfluid-Probe von Stufe (a) zur Bestimmung gemäß Stufe (e) durch die folgenden Schritte vorbereitet:
(1) Bereitstellen von biologisch aktiven zweiten Rezeptormolekülen, die von dem anderen der beiden Hybridome von Stufe (b) ausgeschieden wurden;
(g) Mischen einer vorherbestimmten Menge dieser zweiten Rezeptormoleküle mit der Körperfluid-Probe zur Bildung einer Immunreaktionsmischung.
(h) Halten der so gebildeten Mischung aus zweitem Rezeptor/Körperfluid- Probe in einer ähnlichen Weise wie in Stufe (d) beschrieben wurde, zur Bildung eines Sandwich-Immunreaktants (zweiter Komplex), der ein Molekül M847 und ein Molekül M824 in immunologischer Bindung an ein Molekül Apo B-100 enthält.
Die oben beschriebenen allgemeinen Assay-Methoden können, wie allgemein in der Fachwelt bekannt ist, unter Verwendung einer Vielzahl verschiedener Formate durchgeführt werden. Während somit die spezielleren, im folgenden beschriebenen Assay- Methoden Festphasen-Formate verwenden, ist die Erfindung nicht auf diese beschränkt.
Festphasen-Assay-Formate können solche sein, bei denen entweder die Rezeptormoleküle oder das Antigen an einer festen Matrix fixiert sind, um einen festen Träger zu bilden. Bei solchen Ausführungsformen, in welchen der feste Träger den Rezeptor von Stufe (b) enthält, ist die Mischung von Stufe (c) eine Mischung aus Fest-/Flüssigphase und der Immunreaktant von Stufe (d) ist ein Festphasen-Immunreaktant, der das Apo B-100 aus der Körperprobe enthält.
Bei jenen Ausfühngsförmen, in welchen der feste Träger das Reagenz Apo B-100 enthält, ist die Mischung von Stufe (c) auch eine Fest-/Flüssig-Mischung, jedoch ist der Immunreäktant, der das Apo B-100 aus der Körperprobe enthält, und aus Stufe (d) stammt, ein Flüssigphasen-Immunreaktant. Das Reagenz Apo B-100 ist biologisch aktiv; d.h. antigenes Apo B-100, das von einer anderen als der zur Untersuchung gebrachten Quelle stammt, in der Regel in Form von isoliertem LDL.
Die Bestimmung der Menge von als Immunreaktant in Stufe (d) gebundenem Apo B-100 kann direkt oder indirekt durch Assay-Verfahren, die in der Fachwelt allgemein bekannt sind, vorgenommen werden. Zum Beispiel können homogene Assay- Systeme, wie jene, die in den US-Patenten Nr. 4,536.479; Nr. 4,233.401; Nr. 4,233.402 und Nr. 3,996.345, die hier alle als Referenz angegeben werden, beschrieben sind, verwendet werden.
Bei bevorzugten Festphasen-Ausführungsformen wird das Körperfluid zur Untersuchung weiter vorbereitet, indem ein gekennzeichnetes spezifisches Bindeagens verwendet wird. Die Art und Spezifität des gekennzeichneten spezifischen Bindeagens hängt, wie in der Fachwelt allgemein bekannt ist, von dem verwendeten Verfahren und Format ab.
Bei den bevorzugten Festphasen-Ausführüngsformen, bei welchen der feste Träger einen Rezeptor von Stufe (b) enthält, d.h. einen Rezeptor gemäß dieser Erfindung, wird die Menge an Festphasen-gebundenem Apo B-100 in den folgenden Schritten zur Untersuchung vorbereitet:
(i) Bereitstellung von biologisch aktiven gekennzeichneten zweiten Rezeptormolekülen, die sich an in der Körperprobe vorhandenes Apoprotein B-100 binden, um einen Immunreaktant zu bilden. Das Label des gekennzeichneten zweiten Rezeptors ist imstande, die Anwesenheit des gekennzeichneten zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen tritt Immunreaktion der gekennzeichneten zweiten Rezeptormoleküle mit einem zweiten Apo B-100 Epitop auf, das sich von dem Epitop, mit welchem die Festphasen-Rezeptormoleküle reagieren unterscheidet, und die genannten zweiten Rezeptormoleküle inhibieren die Festphasen-Rezeptormoleküle bei der Reaktion mit Apo B-100 nicht wesentlich. Vorzugsweise sind die gekennzeichneten zweiten Rezeptormoleküle jene, die von dem verbleibenden der beiden Hybridome von Stufe (b) ausgeschieden werden; d.h. die genannten Rezeptormoleküle, die nicht als erste Rezeptormoleküle gewählt wurden.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Rezeptormolekül die immunologische Bindung an das gleiche Antigen eines anderen Rezeptormoleküls inhibieren wird (damit interferieren wird), sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und werden im folgenden detaillierter beschrieben.
(j) Mischen einer vorherbestimmten Menge der gekennzeichneten zweiten Rezeptormoleküle mit der Körperfluid-Probe zur Bildung einer Immunreaktionsmischung.
Die so gebildete Mischung kann eine flüssige Mischung sein, wie es der Fall ist, wenn die Stufe (i) vor der obigen Stufe (b) durchgeführt wird, oder sie kann eine Fest-/Flüssig-Mischung sein, wenn der gekennzeichnete zweite Rezeptor im wesentlichen gleichzeitig mit oder nach der Stufe (b) zugemischt wird. Wenn die Stufe (i) vor oder im wesentlichen gleichzeitig mit Stufe (b) durchgeführt wird, werden die gekennzeichneten zweiten Rezeptormoleküle mit einem zweiten Epitop von Apo B-100 immunreagieren, das sich von dem Epitop unterscheidet, mit welchem die Festphasen-Rezeptormoleküle reagieren, und werden die Festphasen-gebundenen Rezeptormoleküle nicht wesentlich an der Immunreaktion mit Apo B-100 hindern.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Stufe (i) im wesentlichen gleichzeitig mit der Stufe (b) oder nach der Stufe (c) durchgeführt.
(k) Die Mischung aus gekennzeichnetem zweiten Rezeptor/Körperfluid- Probe, die so gebildet wird, wird in einer Weise gehalten, die der in Stufe (d) beschriebenen entspricht, um einen Immunreaktant zu bilden.
Die Festphasen-gebundenen Rezeptormoleküle und zweiten Rezeptormoleküle werden somit immunologisch an Apo B-100, das in der Körperfluid-Probe vorliegt, gebunden und bilden dabei einen Festphasen-gebundenen Sandwich-Immunreaktant, der als Teil desselben das gebundene Label enthält. Das heißt, daß ein Festphasen-Sandwich-Immunreaktant, der ein Label enthält, gebildet wird, wenn ein Molekül Apo B-100 sowohl mit einem Festphasen-gebundenen Rezeptormolekül als auch mit einem gekennzeichnetem zweiten Rezeptormolekül in Immunreaktion tritt. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden alle gekennzeichneten zweiten Rezeptormoleküle, die nicht einen Teil des Festphasen-gebundenen Immunreaktants bilden (d.h. jene, die nicht immunologisch an das Apo B-100 gebunden sind, das seinerseits an Festphasen-Rezeptormoleküle gebunden ist) von dem Immunreaktant, vorzugsweise durch Waschen, abgetrennt, bevor die Menge des als Immunreaktant vorliegenden gekennzeichneten zweiten Rezeptors bestimmt wird.
Die Bestimmung der Menge des nach Stufe (e) gebildeten Immunreaktants erfolgt durch Bestimmung der Menge des gekennzeichneten zweiten Rezeptors, der als Teil des Immunreaktants gebunden ist, der das Apo B-100 enthält. Das liefert einen direkten Assay bezüglich der Menge von Apo B-100 in der Probe. Diese Menge kann null sein, was bedeutet, daß in der Probe innerhalb der feststellbaren Grenzen kein Apo B-100 vorliegt. Die Verfahren zur Bestimmung der Menge eines gekennzeichneten zweiten Rezeptors hängen von dem verwendeten Label ab, wobei solche Label und Assay-Methoden in der Fachwelt allgemein bekannt sind.
Bei den bevorzugten Festphasen-Ausführungsformen, bei welchen der feste Träger das Reagenz Apo B-100 enthält, wird die Menge des in Stufe (d) gebildeten Immunreaktants zur Bestimmung in den folgenden Stufen vorbereitet:
(1) Mischen eines biologisch aktiven gekennzeichneten spezifischen Bindeagens vorzugsweise eines Rezeptormoleküls, das an beliebige in Stufe (b) verwendete und als Festphasen-Immunreaktant vorliegende Rezeptormoleküle bindet, zur Bildung eines Komplexes, vorzugsweise eines zweiten Immunreaktants. Das Label des gekennzeichneten spezifischen Bindeagens ist imstande, die Anwesenheit des gekennzeichneten spezifischen Bindeagens in einem Komplex zu signalisieren. In bevorzugten Ausführungsformen von Assay-Typen dieser Art werden die Stufen (i)-(k) nach der Stufe (d) durchgeführt.
(m) Mischen einer vorherbestirnmten Menge des gekennzeichneten spezifischen Bindeagens mit der Körperfluid-Probe zur Bildung einer Reaktions-, vorzugsweise einer Immunreaktionsmischung.
(n) Die so gebildete Mischung aus gekennzeichnetem spezifischem Bindeagens/erstem Immunreaktant wird in einer Weise, die ähnlich der in Stufe (d) beschriebenen ist, gehalten, um einen Komplex zu bilden.
Der so gebildete Festphasen-Komplex enthält ein als Teil desselben gebundenes Label. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird jedes gekennzeichnete spezifische Bindeagens, das nicht als Teil des Festphasen-Komplexes gebunden ist, von dem Komplex, vorzugsweise durch Waschen, abgetrennt bevor auf Anwesenheit von Festphasen-gebundenem Label geprüft wird.
Die Bestimmung der Menge von gemäß Stufe (e) gebildetem Immunreaktant wird durch Bestimmung der Menge des als Teil des Komplexes vorliegenden Labels durchgeführt. Dadurch wird ein indirekter Assay hinsichtlich der Menge des in der Probe vorliegenden Apo B-100 zur Verfügung gestellt.
Die Kennzeichnung von proteinartigen Antigenen und spezifischen Bindeagenzien ist in der Fachwelt allgemein bekannt. Zum Beispiel können von Hybridomen produzierte Rezeptoren durch metabolischen Einbau von Radioisotop-enthaltenden Aminosäuren, die als ein Bestandteil des Gewebskulturrnediums vorliegen, gekennzeichnet werden. Vgl, zum Beispiel Galfrè et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981).
Die Verfahren zur Protein-Konjugierung oder -Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders anwendbar und führen zu einem Label, das kovalent an das Antigen oder an das spezifische Bindeagens gebunden ist. Vgl, zum Beispiel Aurameas, et al., Scand. J. Immunol. Vol. 8, Suppl 7, 7-23, (1978) und die US-PS Nr. 4,493.795, die hier als Referenz angegeben sind. Zusätzlich dazu kann eine stellengelenkte Kopplungsreaktion durchgeführt werden, sodaß das Label die biologische Aktivität eines Antigens oder Rezeptors nicht ernstlich stört, vgl, zum Beispiel Rodwell et al., Biotech. 3, 889-894 (1985).
Die Kennzeichnungsmittel können ein fluoreszierendes Kennzeichnungsmittel sein, das sich chemisch an Antikörper oder Antigene bindet, ohne diese zu denaturieren, wobei ein Fluorochrom (Farbstoff) gebildet wird, das als Immunfluoreszenz-Tracer verwendbar ist. Geeignete fluoreszierende Kennzeicbnungsmittel sind Fluorochrome, wie etwa Fluorescein-Isocyanat (FIC), Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), 5-Dimethylamin-1- naphthalinsulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin 8200 Sulfonylchlorid (RB 200 SC) und dergleichen. Eine Beschreibung der Immunfluoreszenz-Analysentechnik findet sich in DeLuca, "Immunofluorescence Analysis" in Antibody As A Tool, Marchalonis et al., Hg. J. Wiley & Sons, Ltd., S. 189-231, 1982, was hier als Referenz angegeben ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Anzeigegruppe ein Enzym, wie etwa Meerrettich-Peroxidase (HRPO), Glukoseoxidase oder dergleichen. Wenn die hauptsächliche Anzeigegruppe ein Enzym ist, wie etwa HRPO oder Glukoseoxidase, sind zusätzliche Reagenzien erforderlich, um die Tatsache sichtbar zu machen, daß ein Komplex aus Rezeptor und Ligand (Immunreaktant) sich gebildet hat. Derartige zusätzliche Reagenzien für HRPO sind unter anderem Wasserstoffperoxid und eine Oxidationsfarbstoff-Vorstufe, wie etwa Diaminobenzidin. Ein zur Verwendung mit Glukoseoxidase zusätzliches Reagenz ist 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsäure) (ABTS).
Auch radioaktive Elemente sind zur Kennzeichnung wertvolle Mittel und werden zur Veranschaulichung hier verwendet.
Ein Beispiel für ein radioaktives Kennzeichnungsmittel ist ein radioaktives Element, das eine Emission von Gammastrahlen produziert. Elemente, die selbst Gammastrahlen aussenden, wie etwa ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup8;I, ¹³¹I, ¹³²I und &sup5;¹Cr, stellen eine Klasse von Indikatorgruppen aus Garnmastrahlen emittierenden radioaktiven Elementen dar. Besonders bevorzugt ist ¹²&sup5;I. Eine andere Gruppe wertvoller Indikatorgruppen sind jene Elemente, wie ¹¹C, ¹&sup8;F, ¹&sup5;O und ¹³N, die ihrerseits Positronen emittieren. Die so emittierten Positronen bewirken ihrerseits Gammastrahlen beim Auftreffen auf Elektronen, die in dem Körper des Tieres vorliegen. Ebenso verwendbar ist ein Beta-Emitter, wie etwa ¹¹¹Indium.
Die Assay-Methoden und -Systeme gemäß der vorliegenden Erfindung können somit einen erfindungsgemäßen Rezeptor, der zur Bildung eines festen Trägers an einer festen Matrix fixiert ist, verwenden oder aus ihm bestehen.
Das Antigen oder der Rezeptor ist in der Regel durch Adsorption aus einem wässerigen Medium an der festen Matrix fixiert, obwohl unterschiedliche Adsorptionsverfahren ebenso wie andere Möglichkeiten der Befestigung, die für den Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, eingesetzt werden können. Beispiele solcher Verfahrensweisen sind die Reaktion des Rezeptors oder Antigens mit der reaktiven Carboxylfunktion, die durch Reaktion von Bromcyan mit Glukose enthaltenden Matrices, wie etwa vernetzter Dextrose oder Zellulose, gebildet wurde, oder Glutaraldehyd, ein im folgenden besprochenes Vernetzungsmittel in Verbindung mit Latex-Partikeln und dergleichen. Verwendbare feste Matrices sind in der Fachwelt allgemein bekannt. Solche Materialien umfassen das vernetzte Dextran, das unter der Handelsmarke Sephadex von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist; Agarose; Perlen aus Polystyrol mit etwa 1 µ bis etwa 5 mm Durchmesser, die von Abbott Laboratories in North Chicago, IL, erhältlich sind; Bannen oder Blätter, Streifen oder Schaufeln aus Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztem Polyacrylamid, Nitrozellulose oder auf Nylonbasis; oder Röhrchen, Platten oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, wie jenen, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt sind.
Latex-Teilchen, die in Assays vom Agglutinationstyp verwendbar sind, sind ebenfalls geeignete feste Matrices. Solche Materialien werden von der Japan Synthetic Rubber Company in Tokyo, Japan, geliefert und werden als Carboxy-funktionelle Teilchen, die in einer anionischen Seife dispergiert sind, beschrieben. Typische Muster solcher Teilchen haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,308 Mikron (µ) und haben eine durchschnittliche Verteilung der Carboxy-funktionellen Gruppen von etwa 15 bis etwa 30 Quadrat-Angstrom pro Carboxygruppe.
Vor der Verwendung werden die Partikel mit einem Diamin, wie etwa 1,3- Diamino-2-propanol umgesetzt, um eine Vielzahl von Amid-Bindungen mit den Carboxygruppen der Teilchen zu bilden, wobei freie Aininogruppen beibehalten werden. Die freien Amine werden im Anschluß daran mit einem Dialdehyd, wie etwa Glutaraldehyd, und dem Rezeptor oder Antigen umgesetzt, um Reaktionsprodukte vom Typ Schiffscher Basen zu bilden. Die Schiffschen Basen Reaktionsprodukte werden im folgenden mit einem wasserlöslichen Reduktionsmittel, wie etwa Natriumborhydrid, reduziert, um einen verwendbaren festen Träger zu bilden.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird verstehen, daß es zahlreiche Verfahren von Festphasen-Immunoassays gibt, die hier verwendet werden können. Beispielhafte verwendbare Festphasen-Assays umfassen Enzym-vervielfältigte Immunoassay-Verfahren (EMIT) und Fluoreszenz-Immunoassays (FIA) zusätzlich zu den speziell besprochenen RJAs und ELiSAs. Jedoch wird jedes Verfähren, das zu einer feststellbaren Reaktion von Apoprotein B-100 mit erfindungsgemäßen Rezeptormolekülen führt, als Teil dieser Erfindung betrachtet. Jedes dieser Assay-Verfahren kann einzelnen oder doppelte Antikörper-Verfahren verwenden, bei welchen ein Anzeigemiuel verwendet wird, um die Immunreaktion und dadurch die Bindung von beliebigem Apoprotein B-100, das mit dem erfindungsgemäßen Rezeptor bestimmt werden soll, zu signalisieren. Erklärungen beispielhafter Verfahren können geflmden werden in Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981) und in Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).
Eine Ausführungsform einer speziellen Methode zur Prüfung einer Körperfluid-Probe auf Apo B-100 unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Festphasenfixierten Rezeptors ist ein nicht-kompetitiver ELISA, in welchem die Immunreaktionen aufeinanderfolgend durchgeführt werden. In einem solchen Assay wird ein aliquoter Anteil von M847 Rezeptoren, z.B. im allgemeinen etwa 1 bis etwa 500 µg, an den inneren Wänden einer Mikrotiter-Vertiefung zur Bildung eines festen Trägers fixiert.
Jedes in der zur Verfügung gestellten Körperprobe vorliegende Apo B-100 wird dann mit den Festphasen-fixierten Rezeptoren in Immunreaktion umgesetzt. Das erfolgt durch Vermischen einer bekannten Menge, z.B. von etwa 10 bis etwa 200 Mikroliter (ml) Probe (die vorverdünnt sein kann), wie etwa Serum oder Plasma, in den Mikrotiter- Vertiefungen mit den Festphasen-fixierten Rezeptoren zur Bildung einer Mischung aus Fest-/Flüssigphase. Die Mischung wird unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimrnten Zeitraums gehalten der ausreicht, daß jedes in der Probe vorliegende Apo B-100 immunologisch an die Rezeptormoleküle bindet und einen Festphasen-Immunreaktant bildet. Die festen und flüssigen Phasen werden anschließend voneinander getrennt und die feste Phase wird in der Regel gespült, um dazu beizutragen, daß die Abtrennung von nicht spezifisch gebundenen Materialien gewährleistet wird.
Apo B-100, das als Festphasen-Inimunreaktant vorliegt (d.h. Apo B-100, das an Festphasen-fixierte M847 Rezeptoren gebunden ist), wird dann mit Enzym-gekennzeichneten zweiten Rezeptormolekülen immunreagieren gelassen. Das wird dadurch erreicht, daß eine vorherbestimmte Menge, z.B. etwa 0,1 bis etwa 10 µg der Enzym-gekennzeichneten zweiten Rezeptormolekule in wasseriger Pufferlosung, vorzugsweise Meerrettich Peroxidase (HRPO) gekennzeichneten MB24 Rezeptoren, zugemischt wird, um eine zweite Fest/Flussig-Mischung zu bilden. Die zweite Mischung wird wie oben be schrieben gehalten, wodurch sich ein Festphasen Immunreaktant in Form eines "Sandwich" bildet, der aus M847 Rezeptor, Apo B 100 und Enzym gekennzeichneten M824 Rezeptoren besteht.
Nach der Abtrennung der flüssigen Phase von der festen Phase gemäß obiger Beschreibung wird ein aliquoter Teil des chromogenen Substrats, etwa o-Phenylendiamin (OPD) für HRPO in der Mikrotiter-Vertiefung, die den Festphasen-Immunreaktant enthält, zugemischt, um eine dritte Fest/Flüssig-Mischung zu ergeben. Diese Mischung wird unter Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß jedes als Immunreaktant vorliegende Enzym einen proportionalen Anteil des Subtrats in ein gefärbtes Produkt umwandelt. Die optische Dichtung der entstehenden gefärbten Lösung wird dann gemessen und mit Ergebnissen verglichen, die erhalten werden, wenn Lösungen mit bekannten Gehalten des Reagenz Apo B-100 gemessen werden.
Es wurde die Fähigkeit des nicht-kompetitiven sequenziellen ELISA, der oben und detaillierter im Abschnitt über die Materialien und Verfahren beschrieben ist, hinsichtlich der Feststellung von Apo B-100 in einer Körperfluid-Probe untersucht. Bei diesen Untersuchungen wurden aliquote Anteile von humanem Plasma, das von Lipoprotein befreit ist (LDP) und zu welchem bekannte Mengen des Reagenz Apo B-100 zugestzt wurden, als Vergleich für die Körperfluid-Proben verwendet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in der folgenden Tabelle 1 angegeben sind, zeigen, daß das oben beschriebene Verfahren klinisch relevante Mengen Apo B-100, die in einer Körperfluid-Probe vorliegen, genau bestimmen kann. Tabelle 1 Nicht-kompetitive sequenzielle ELISA-Studien von Apo B-100 in humanem Plasma Probe¹ Niedrig Normal Hoch Pool ¹ Vergleichslösungen mit klinisch niedrigen, normalen und hohen Gehalten an Apoprotein B-100 wurden erhalten von Johnson & Johnson Biotechnology Center, Inc., La Jolla, CA (B) und Tago, Inc., Burlingame, CA (T). Plasmaproben wurden von klinisch normalen Personen erhalten (ein oder zwei Buchstaben-Bezeichnungen und C1-C4) und Pool bedeutet die Mischung von 10 solcher Proben. ² Tatsächliche Konzentration von Apoprotein B-100, bestimmt durch das Gesamtprotein, das der Probe zugesetzt ist. Alle in der Tabelle angegebenen Konzentrationen sind in den Einheiten mg/dl. ³ Die Konzentration von Apoprotein B-100 nach der Bestimmung unter Verwendung des Referenz-Assays (Ref.), der im folgenden beschrieben wird. Die Werte sind als Drei-Standard-Abweichungsbereich angegeben. Tabelle I Fortsetzung &sup4; Konzentrationen von Apoprotein B-100 (Mittelwert I 3 Standardabweichungen), erhalten unter Verwendung von Festphasen-fixierten M847 Rezeptoren und HRPO-gekennzeichneten M824 Rezeptoren in dem nicht-kompetitiven sequenziellen ELISA, nach obiger Beschreibung. &sup5; Konzentrationen von Apoprotein B- 100 (Wiederholungswerte sind angegeben, wo diese durchgeführt wurden), die unter Verwendung von Festphasen-fixierten M824 Rezeptoren und HRPO-gekennzeichneten B18 Rezeptoren in dem nicht-kompetitiven ELISA erhalten wurden (Curtiss et al., J. Biol. Chem. 257, 15213-15221(1982), in welchem die Immunreaktionen aufeinanderfolgend mit dem Festphasen-Immunreaktant, der zuerst gebildet wurde, durchgeführt werden.
Eine andere Ausführungsform eines spezifischen Verfahrens zur Bestimmung von Apo B-100 in einer Körperfluid-Probe ist ein nicht-kompetitiver ELISA, in welchem die Immunreaktionen im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden. In die oben beschriebene Mikrotiter-Vertiefüng, die Festphasen-fixierte M847 Rezeptoren enthält, werden im wesentlichen gleichzeitig die vorgesehene Körperprobe und die Enzymgekennzeichneten zweiten Rezeptoren, die mit einem zweiten Epitop von Apo B-100 immunreagieren und die Bindung von M847 Rezeptoren an Apo B-100 im wesentlichen nicht inhibieren, zugesetzt. Solche Enzym-gekennzeichnete zweite Rezeptoren sind vorzugsweise M824 Rezeptoren.
Die entstehende Fest/Flüssig-Mischung wird dann gehalten, aufgetrennt und es wird die Menge des Enzyms, das Teil des Festphasen-gebundenen Immunreaktant- Sandwiches ist, wie oben beschrieben bestimmt.
Der oben beschriebene nicht-kompetitive ELISA wurde verwendet, um den Gehalt an Apo B-100 von Plasma von 20 Patienten mit Coronararterien-Erkrankung (CAD), 20 Patienten mit familiär bedingter Hypercholesterinämie und 20 normalen Personen zu untersuchen. Wie in der folgenden Tabelle 2 gezeigt, wurde der mittlere Plasmawert für Apo B-100 bei normalen Personen mit 85 Milligramrn/Deziliter (mg/dl) bei einem 2-Standard-Abweichungsbereich von ±21 mg/dl bestimmt. Dieser Wert ist in enger Übereinstimmung mit dem normalen Bereich von Apo B-Werten, der von Curry et al., Clin. Chem. 24, 280-286 (1987) und Rosseneu et al., Clin. Chem 28, 427-433(1983) berichtet wurde, welche Autoren jeweils unterschiedliche Immunoassays verwendeten.
Außerdem waren die Plasmagehalte von Apo B-100 bei Patienten mit CAD und Hypercholisterinämie höher als die obere Grenze des 2-Standard-Abweichungsbereichs, der bei normalen Personen gefunden wurde. Ähnliche Ergebnisse unter Verwendung anderer Verfahren für CAD- und Hypercholesterinämie-Patienten wurden berichtet von Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 604-608 (1980) und Lipid Research Council, JAMA 251, 351-364 (1984). Tabelle 2 Simultane ELISA-Studien für Apo B-100 in Humanplasma Personen¹ Lipoprotein-Gehalte² Apoprotein B-Gehalte³ Normal
¹ Die Personen umfassen 20 normolipidämische, gesunde Vergleichspersonen (normal); 20 Personen mit Coronararterien-Erkrankung, die durch Herzkatheder definiert ist (CAD); und 20 Personen mit familiär bedingter Hypercholesterinämie (FH).
² Die gegebenen Werte sind Mittelwerte ±2 Standardabweichungen vom Mittel (±SD) in Einheiten von mg/dl.
³ Gesamtcholesterin.
&sup4; Cholesterin als HDL vorliegend.
&sup5; Cholesterin als LDL vorliegend.
&sup6; Apo B-100 Gehalt nach der Bestimmung durch den kompetitiven (Kompet.) ELISA, der im Abschnitt über Materialien und Verfahren beschrieben ist.
&sup7; Apo B-100 Gehalt nach der Bestimmung durch den nicht-kompetitiven (Nicht-Kompet.) ELISA unter Verwendung von Festphasen-fixierten M847 Rezeptoren und HRPO-gekennzeichneten M824 Rezeptoren, in welchen die Probe und die Rezeptoren im wesentlichen gleichzeitig zusarnmengemischt werden.
&sup8; Apo B Gehalt, bestimmt unter Verwendung des Radioimmunodiffusions- Kits Modell Diffü-gen RID, erhältlich von Tago, Inc., Burlingame, CA.
&sup9; Apo B Gehalt, bestimmt unter Verwendung des Radioimmunodiffusions- Kits Modell M-Partigen RIA, erhältlich von Calbiochem-Behring, La Jolla, CA.
Es wurde auch die Wirkung der Verdünnung der Körperfluid-Probe vor der Untersuchung auf Apo B-100 mit einem nicht-kompetitiven simultanen ELISA-Verfahren untersucht. Diese Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle 3 angegeben sind, deuten darauf hin, daß kein signifikanter Unterschied in den Apo B-100 Gehalten festgestellt werden konnte, wenn diese über einen 5-fachen Bereich von Plasmaverdünnungen, d.h. 1 : 1000 bis 1:5000, bestimmt wurden. Tabelle 3 Gleichzeitige ELISA-Studien der Apo B Gehalte, bestimmt an verschiedenen Plasmaverdünnungen Plasmaverdünnung Plasma 1¹ Mittelwert² ¹ Konzentration von Plasma Apo B-100 in den Einheiten mg/dl. ² Mittelwert der Konzentration von Plasma Apo B-100 für alle 3 Verdünnungen. ³ Eine Standardabweichung. 4 Prozentueller Koeffizient der Streuung zwischen den Ergebnissen, die für die verschiedenen Verdünnungen erhalten wurden.
Der Zusammenhang zwischen LDL-Cholesterin und den Plasmagehalten von Apo B-100, bestimmt durch einen nicht-kompetitiven ELISA für normale und Patientenproben nach der obigen Beschreibung, ist in Figur 7 gezeigt. Der Korrelationskoeffizient von 0,89 ist ähnlich dem, der von Albers et al., Metabolism 24, 1339-1351 (1975) und Slater et al., Clin. Chem. 31, 841-845 (1985) berichtet wurde.
Ausführungsformen der Assay-Methoden dieser Erfindung unter Verwendung eines festen Trägers, der das Reagenz Apo B-100 fixiert an einer festen Matrix enthält, werden verwendet, wobei die folgenden Schritte vorgenommen werden:
(a) Eine Körperfluid-Probe, die Apo B-100 enthält, wird wie oben beschrieben bereitgestellt.
(b) Im wesentlichen gleichzeitiges Zusammenmischen von
(1) der Fluidprobe;
(2) einer vorherbestimmten Menge entweder von M824 oder M847 Rezeptormolekülen; und
(3) einer vorherbestimmten Menge des Festphasen-fixierten Reagenz Apo B-100 zur Bildung einer Fest-/Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung.
Die Mischung wird unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß die Antikörper-Vereinigungsstellen der Rezeptormoleküle entweder mit dem Reagenz Apo B-100 oder mit beliebigem Apo B-100, das in der Körperfluid-Probe vorliegt, immunreagieren (sich immunologisch daran binden). Die Rezeptormoleküle, die sich immunologisch an das in der Körperprobe vorliegende Apo B-100 binden, bilden einen Flüssigphasen-Immunreaktant und solche Rezeptormoleküle, die Festphasen-fixiertes Reagenz Apo B-100 binden, bilden einen Festphasen-Immunreaktant.
(c) Die Anwesenheit von Festphasen-fixiertem Immunreaktant wird dann geprüft und nach obiger Beschreibung die Menge des in der Probe anwesenden Apo B-100 dabei durch Vergleich mit dem Bindungsausmaß bestimmt, das von einer bekannten Menge M847 oder M824, die mit ähnlichem Festphasen-fixiertem Apo B-100 gemischt wird, entwickelt wird. Vorzugsweise wird der Immunreaktant-Assay durchgeführt, nachdem der Flüssigphasen- und Festphasen-Immunreaktant von Stufe (b) getrennt sind, was etwa durch Waschen geschieht. Die Menge des Apo B-100 der Proben, das als Flüssigphasen-Immunreaktant gebunden ist, kann durch Verwendung von gekennzeichneten Antikörpern bestimmt werden, die mit den erfindungsgemäßen Rezeptormolekülen immunreagieren, wie etwa mit Peroxidase-gebundenem Ziegen-Anti-Maus-Ig, oder nach einer anderen hier angegebenen Beschreibung.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kompetitions- Assays werden etwa 1 µg bis etwa 10 µg des Reagenz Apo B-100 an einer festen Matrix, vorzugsweise den Wänden einer Mikrotiter-Vertiefung, fixiert, um einen festen Träger zu bilden. Alle nicht-spezifischen Bindungsstellen an dem festen Träger werden in der Regel mit einem Protein, wie etwa BSA oder dergleichen, blockiert.
Eine vorbestimmte Menge von erfindungsgemäßen Rezeptormolekülen, z.B. im allgemeinen etwa 0, 1 µg bis etwa 10 µg, wird im wesentlichen gleichzeitig mit dem Festphasen-fixierten Reagenz Apo B-100 und beliebigem in einer Körperfluid-Probe (die verdünnt sein kann) vorliegendem Apo B-100, wie etwa in Serum oder Plasma, immunreagieren gelassen. Das wird durch praktisch gleichzeitiges Zusammenmischen eines aliquoten Anteils der Probe und der Rezeptormoleküle in der Mikrotiter-Vertiefung, die das Festphasen-fixierte Reagenz Apo B-100 enthält, erreicht.
Die so gebildete Fest/Flüssig-Mischung wird unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß die anwesenden Rezeptormoleküle sich immunologisch an das anwesende Apo B-100 binden. Die festen und flüssigen Phasen werden daraufhin vorzugsweise etwa durch Waschen getrennt und die feste Phase wird in der Regel gespült, um dazu beizutragen, die Abtrennung der nicht spezifisch gebundenen Materialien zu gewährleisten.
Die Anwesenheit von Festphasen-fixierten Immunreaktanten wird dann in der Regel durch Verwendung von gekennzeichneten Antikörpern festgestellt, die immunologisch an die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle binden, wie etwa Peroxidase-gekennzeichnetes Ziegen-Anti-Maus IgG.
In dem kompetitiven ELISA konkurriert das in der Patientenprobe vorliegende Apo B-100 mit einer konstanten bekannten Menge von Reagenz Apo B-100 um eine konstante bekannte Anzahl von Rezeptormoleküi-Antikörper-Vereinigungsstellen in der Immunreaktionsmischung. Die Konkurrenz durch das Apo B-100 aus der Probe führt zu einer Abnahme von feststellbarem Festphasen-fixiertem Immunreaktant; je größer die Abnahme, umso größer die Menge an Apo B-100, die in der zu untersuchenden Körperprobe vorliegt.
Zur Bestimmung der relativen Mengen von in Patientenplasma vorliegendem Apo B-100 werden die Ergebnisse, die unter Verwendung von in Patientenplasma vorliegendem Apo B-100 als Kompetitoren erhalten wurden, mit Ergebnissen verglichen, die unter Verwendung von kompetitiven Standards, die bekannte Mengen von Reagenz Apo B-100 aufweisen, erhalten wurden. Es wurde eine Standardkurve unter Verwendung der LDL-Konzentrationen im Bereich von 32 mg/ml bis 0,25 mg/ml (320 mg/dl bis 2,5 mg/dl) erstellt.
Der oben beschriebene kompetitive ELISA wurde zur Untersuchung der gleichen normalen und Patientenproben verwendet, die durch den nicht-kompetitiven ELISA bewertet wurden. Jene Ergebnisse, die ebenfalls in der obigen Tabelle 2 angegeben sind, sind in enger Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die durch den nicht-kompetitiven Assay erhalten wurden.
Es wurde die Wirkung der Verdünnung der Körperfluid-Probe vor der Bestimmung derselben auf Apo B in dem oben beschriebenen kompetitiven ELISA untersucht. Diese Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle 4 angegeben sind, zeigen keinen signifikanten Unterschied in den Gehalten von Apo B, die über einen 4-fachen Bereich von Plasmaverdünnungen bestimmt wurden; d.h. 1:100 bis 1:400. Tabelle 4 Kompetitive ELISA-Studien von Apo B Gehalten, bestimmt an unterschiedlichen Plasmaverdünnungen Plasmaverdünnung Plasma 1¹ Mittelwert² ¹ Konzentration von Plasma Apo B-100 in den Einheiten mg/dl. ² Mittelwert der Konzentration von Plasma Apo B-100 für alle 3 Verdünnungen. ³ Eine Standardabweichung. 4 Prozentueller Koeffizient der Streuung zwischen den Ergebnissen, die für die verschiedenen Verdünnungen erhalten wurden.
Der Zusammenhang zwischen LDL-Cholesterin und den Plasmagehalten von Apo B, nach der Bestimmung durch den oben beschriebenen kompetitiven ELISA für die normalen und die Patientenproben, ist in Figur 8 gezeigt. Der Korrelationskoeffizient von 0,92 ist ähnlich dem der von Albers et al., Metabolism 24, 1339-1351(1975) und Slater et al., Clin. Chem., 31, 841-845 (1985) berichtet wurde, was darauf hindeutet, daß der kompetitive ELISA die zirkulierenden Gehalte an LDL-Cholesterin genau vorhersagt.
Es wurde auch der Zusammenhang zwischen den Apo B-100 Gehalten, die unter Verwendung des kompetitiven und des nicht-kompetitiven ELISA erhalten wurden, überprüft. Wie in Figur 9 gezeigt, besteht ein starker Zusammenhang (r=0,92) zwischen den in jedem Assay erhaltenen Ergebnissen.
Ein diagnostisches System, vorzugsweise in Form eines Kits, der zur Durchführung der obigen Assay-Methoden verwendbar ist, umfaßt in getrennten Packungen (a) ein erstes spezifisches Bindeagens, worin das genannte Agens ist (i) ein Rezeptor, der mit Apo B-100 immunreagiert und ausgewählt ist aus den Rezeptoren, die von dem Hybridom HB 8746 ausgeschieden sind (M847), oder den Rezeptoren, die von dem Hybridom HB 8742 ausgeschieden sind (M824), und (b) ein gekennzeichnetes zweites spezifisches Bindeagens zur Signalisierung der Immunreaktion des ersten Bindeagens mit Apo B-100. Vorzugsweise ist das gekennzeichnete spezifische Bindeagens ein an ein Enzym gebundener Rezeptor. Bevorzugter ist das gekennzeichnete Agens der andere der beiden oben genannten Rezeptoren (a), der an ein Enzym gebunden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das System weiters einen anderen Behälter für Reagenz Apo B-100 zur Verwendung als Vergleichs- und/oder Ziel- Antigen. Bevorzugt sind auch Ausführungsformen, in welchen das System eine feste Matrix enthält, an welche das erste spezifische Bindeagens oder Reagenz Apo B-100 fixiert ist, um einen festen Träger zu bilden. Verwendbare feste Matrices sind bereits beschrieben. Vorzugsweise ist jedoch die feste Matrix die Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Bekannte Mengen der spezifischen Bindeagenzien werden bereitgestellt.
Diese Mengen sind mindestens ausreichend, um einen Assay durchzuführen. Die bereitgestellten spezifischen Bindeagenzien liegen in der Regel in einer Form und einer Menge vor, die zur Verdünnung mit Wasser, Salzlösung oder einem Puffer, wie etwa Phosphatgepufferter Salzlösung bei ph 7,3 bis 7,5 auf ein vorgeschriebenes Volumen gedacht sind.
Zusätzliche Packungen können in dem System ebenfalls enthalten sein. Solche Packungen können enthalten (i) Puffersalze in trockener oder flüssiger Form, (ii) Enzym-Substrate wie o-Phenylendiamin, und dergleichen.
Beispiele für Verpackungen schließen Flaschen oder Phiolen aus Glas und Kunststoff, wie etwa Polyethylen und Polypropylen ein; sowie Hüllumschläge aus Kunststoff, Kunststoff-Metallfolie, Kunststoff-Metallfolie-Papier und dergleichen. Die speziellen Bindeagenzien können in einer wässerigen flüssigen Form, wie in Ascites oder Puffer, verpackt sein, werden vorzugsweise jedoch in getrockneter Forrn zur Verfügung gestellt, wie sie durch Lyophilisierung bereitgestellt wird.

D. Affinitäts-Sorptionsmittel

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Affinitäts-Sorptionsmittel, das vorzugsweise steril ist und aus einem biologisch aktiven erfindungsgemäßen Rezeptor, der an einer festen Matrix zur Bildung eines festen Trägers fixiert ist, besteht. Die feste Matrix liegt vorzugsweise in Teilchenform vor. Derartige Affinitäts-Sorptionsmittel sind zur spezifischen Abtrennung von Apoprotein B-100 enthaltendem Lipoprotein (VLDL und LDL) durch Immunadsorption aus Plasma von Patienten, die an Hypercholesterinämie leiden, verwendbar.
Der feste Träger kann aus einer großen Vielzahl von Materialien bestehen, wie etwa aus vernetztem Dextran, z.B. Sephadex G-25, -50, -100, -200 und dergleichen, die von Pharmacia Fine Chemicals in Piscataway, N.J, erhältlich sind, oder aus Agarose und vernetzter Agarose, z.B. Sepharose 6B, CL6B, 48, CL4B und dergleichen, die ebenfalls von Pharmacia Fine Chemicals erhältlich sind, oder aus Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M, A-50M und dergleichen, die von Bio-Rad Laboratories, Richmond CA, erhältlich sind, oder aus Polyacrylamid-Perlen, z.B. Bio-Gel P-2 P-30, P-100, P-300 und dergleichen, die ebenfalls von Bio-Rad Laboratories erhältlich sind. Die Agarose und vernetzten Agarose- Materialien werden hier wegen ihrer hohen Porosität und niedrigen unspezifischen Bindungseigenschaften bevorzugt und werden beispielhaft als feste Matrix verwendet.
In der Regel wird vor der Bindungsreaktion eine Sterilisation der Rezeptoren und festen Matrix durchgeführt. Um die biologische Aktivität aufrechtzuerhalten, werden die Rezeptoren in der Regel durch Filtration sterilisiert, zum Beispiel durch Durchgang über ein 0,22 Mikron Nitrozellulose-Filter. Die Sterilisation der Matrix hängt, wie allgemein bekannt ist, von der Art der Matrix ab. Zum Beispiel kann Sepharose nicht durch Autoklavieren sterilisiert werden, sondern sie kann chemisch, zum Beispiel durch Behandlung mit Diethylpyrocarbonat, sterilisiert werden. Andererseits kann vernetzte Sepharose durch Autoklavieren bei pH 7 und 120ºC während 20 Minuten sterilisiert werden.
Das Sephadex oder die Sepharose-Matrix wird in der Regel zur Bindung aktiviert, indem Bromcyan in an sich in der Fachwelt bekannten Verfahren verwendet wird. Die aktivierte Matrix wird dann gewaschen und an die Rezeptoren gebunden, die mit Apo B-100 immunreagieren und von dem Hybridom HB 8746 oder dem Hybridom HB 8742 ausgeschieden wurden. Der Matrix-gebundene Rezeptor wird dann gewaschen und ist gebrauchsfertig. Unumgesetzte reaktive Gruppen auf dem Träger können mit einem Amin, wie etwa Ethanolamin oder Tris, gewünschtenfalls umgesetzt werden.
Das Affinitäts-Sorptionsmittel kann in seinem losen Zustand eingesetzt werden, wird jedoch vorzugsweise in einer Säule eingeschlossen. Patientenplasma mit einem Gehalt an Apo B-100 wird dann mit dem Affinitäts-Sorptionsmittel zur Bildung einer Immunreaktionsmischung vermischt. Die Mischung wird unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums gehalten, der ausreicht, daß die Festmatrix-fixierten Rezeptoren immunologisch an das in dem Plasma vorliegenden Apo B-100 binden und einen Festmatrix-fixierten Immunreaktant bilden. Dann wird das Plasma von dem Festmatrix-fixierten Immunreaktant abgetrennt. Das so hergestellte, von Apo B-100 (LDL und VLDL) befreite Plasma kann dann in den Patienten wieder eingebracht werden, aus dem es ursprünglich gewonnen wurde.
Die Herstellung eines Affinitäts-Sorptionsmittels und seine Verwendung zur Abtrennung von Apolipoprotein 13, das in Lipoproteinen aus Plasma enthalten ist, wird beschrieben in Stoffel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 611-615 (1981), worauf hier als Referenz Bezug genommen wird. Es zeigte sich, daß eine Affinitäts-Adsorptionssäule, die durch Bindung von praktisch reinen M847 Rezeptoren an CNB4-aktivierte Sepharose 48 hergestellt worden war, 3mg LDL pro ml des festen Trägers immunadsorbierte (band).

II. Materialien, Verfahren

A. Herstellung von Humanen Lipoproteinen

Fraktionen von humanem Lipoprotein wurden durch Zentrifugieren mit den folgenden Dichten isoliert: VLDL, Dichte (d) weniger als 1,006 g/ml; LDL, d gleich 1,025-1,050 g/ml; HDL, d gleich 1,070-1,21 g/ml und LDS, d gleich 1,21 g/l). In manchen Fällen wurde humanes LDL auch mit d 1,019-1.063 g/ml oder mit 1,045-1,065 g/ml isoliert. Die Proteinkonzentration des Plasmas und jeder Fraktion wurde durch das Lowry- Verfahren [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)] mit der Modifikation von Markwell et al., Anal. Biochem. 87, 206-210 (1978) unter Verwendung eines BSA- Standards bestimmt.
Für jede LDL- und VLDL-Fraktion wurden im Anschluß an die Ausfällung des Apo B mit Tetramethylharnstoff (TMU) urner Verwendung des Verfahrens von Kane et al., J. Clin. Invest. 56, 1622-1634, (1975) oder mit Isopropylalkohol nach den Lehren von Equsa et al., J. Lipid Res.p 24, 1261-1267 (1983) Abschätzungen des Gehalts an Apo B durchgeführt.
Frisches humanes Fastenplasma,wurden aus normalen gesunden Spendern durch Plasmaphorese erhalten und wurde auf 0,1 Prozent EDTA (s/v) eingestellt. Wenn nicht anders angegeben, wurden Pools aus drei oder mehr Spendem verwendet. Die Lipoproteine wurden durch sequenzielle Ultrazentrifugierung des Plasmas unter Verwendung von festem KBR zur Einstellung der Dichte (d) isoliert. Die Lipoprotein-Fraktionen enthielten VLDL, d weniger als 1,006 g/ml; IDL, d = 1,006-1,019 g/ml; LDL, d = 1,019- 1,063 g/ml; und HDL, d = 1,063-1,25 g/ml.
Die Bodenfraktion, die das von Lipoprotein befreite Serum enthielt (d größer als 1,25 g/ml) wurde ebenfalls aufgefangen.
Die Fraktionen wurden sorgfältig gegen Lipoprotein-Puffer mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl, 0,3 mM EDTA, 0,0005 Prozent Alpha-Tocopherol bei einem pH- Wert von 7,4 dialysiert.
Eine Chylomikron-Fraktion wurde aus der VLDL-Fraktion von gepooltem Nicht-Fastenplasma durch Flottieren der Chylomikrone durch einen Lipoprotein-Puffer mit Ultrazentrifugierung bei 120.000xg während 40 Minuten bei 4ºC abgetrennt.
Alle Lipoproteine wurden Filter-Sterilisiert und bei 4ºC während nicht mehr als 20 Tagen gelagert. Die Lipoproteine wurden auf den Proteingehalt durch eine Modifikation des Verfahrens von Lowry, J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951) und unter Verwendung eines BSA-Standards analysiert. Alle Lipoprotein-Konzentrationen sind auf der Basis Protein ausgedrückt.
Die Apoprotein-Zusammensetzung jeder der Lipoprotein-Klassen wurde durch SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese testgestellt. Die Chylomikrone enthielten feststellbare Mengen von Apoproteinen B, E und C, während das VLDL die Apoproteine B. E. C und Spurenmengen von Apoprotein A-I enthielt.
Das IDL enthielt die Apoproteine B E und C, während das LDL nur Apoprotein B enthielt. Das HDL enthielt Apoproteine AI, AII und C.
Während des Verlauf dieser Untersuchungen zeigten die Lipoprotein-Präparate eine gleichbleibende Apoprotein-Zusammensetzung. Zur Kontrolle der möglichen Proteolyse der Apoproteine wurden ausgewahlte Plasma-Pools isoliert und in Anwesenheit von 1 mg/ml Gentamycinsulfat, 0,2 Prozent Natriumazid und 1 mM Benzamidin. 10 mM Diisopropylfluorphosphat, 10 µg/ml Sojabohen-Trypsin-Inhibitor gelagert.
Der Vergleich der SDS-PAGE Apoprotein-Färbemuster dieser Lipoproteine ebenso wie jener, die in Abwesenheit von Antibiotika und Protease-Inhibitoren unmittelbar nach dem Ultrazentrifugieren sowie nach der Lagerung während bis zu 3 Wochen isoliert wurden, zeigten keinen Beweis für Proteolyse. Alle verwendeten Präparate waren steril.

B. Produktion und Kultur der Hybridome

Intakte native Lipoproteine, die aus gepooltem Plasma isoliert worden waren, wurden zur Immunisierung verwendet. Balb/c Mäuse im Alter von vier bis fünf Wochen wurden intraperitoneal rnit 50 Mikrogramm Lipoprotein in komplettem Freund- Adjuvans immunisiert. Sekundäre intravenöse Injektionen von 50 µg Lipoprotein in Lipoprotein-Puffer wurden zwischen dem Tag 28 und dem Tag 33 verabreicht. Die Milzen wurden aus den immunisierten Mäusen 72 Stunden nach der letzten Injektion entnommen und es wurden Einzelzell-Suspensionen in HT-Medium hergestellt. Das Blut wurde auch aufgefangen und das Serum wurde als positiver Vergleich für jeden der Immunoassays verwendet.
Die Maus-Myelom-Zell-Linien wurden in stationären Kulturen in komplettem HT-Medium [Kennet et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 77-91 (1978), worauf hier als Referenz Bezug genommen wird] mit einem Gehalt von 0,1 mM Azaguanin in der logarythmischen Wachstumsphase gehalten. In Gegenwart von 30 Prozent (Vol./Vol.) Polyethylenglykol 1000 (Sigma, St. Louis, MO) in einem Verhältnis von immunen Milzzellen zu P3x63Ag8 von 10:1 wurden die Fusionen durchgeführt. Drei Tage nach der Fusion wurden die Zellen auf Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem Ausmaß von 1x10&sup5; lebensfähigen Zellenjvertiefung in HT-Medium mit einem Gehalt von 0,1 mM Aminopterin ausgestrichen.
Die Zellen wurden 7 Tagen nach der Fusion mit HT-Medium und anschließend in etwa 4-Stägigen Intervallen nach Bedarf gefüttert. Das Wachstum wurde mikroskopisch verfolgt und die Kulturüberstände wurden am Tag 14 für den Assay auf Antigen-spezifische Antikörperproduktion durch einen Festphasen-RIA gesammelt. Hybndome, die spezifische Antikorper produzierten, wurden 19 bis 47 Tage nach der Fusion durch Grenzverdünnung in Gegenwart von Balb/c Milz-Futterzellen geklont und Hybridome in Vertiefungen, die Einzelkolonien enthielten, wurden nach 10 Tagen durch Festphasen-RIA auf Antikörperproduktion gescreent. Die geklonten Hybridome wurden in einem Medium, das 10 Prozent Kalbsserum enthielt, gezüchtet und in flüssigem Stickstoff gefroren aufbewahrt.

C. Inhibierung der LDL-Bindung Internierung und Abbau

Die Fähigkeit von Anti-Apo B-100 Rezeptoren zur Inhibierung von Bindung, Internierung und Abbau von ¹²&sup5;I-LDL durch humane Fibroblasten wurde in folgender Weise bestimmt. LDL wurde mit ¹²&sup5;I (spezifische Aktivität 200 cpm/ng) unter Verwendung des Jodmonochlorid-Verfahrens von Bilheimer et al., J. Clin. Invest. 56 1420-1430 (1975) jodiert.
Um eine Wechselwirkung Antikörper-LDL zu gestatten, wurde 0,1 ml jedes Hybridom-Überstands mit ¹²&sup5;I-LDL in 0,4 ml Dulbecco's Minimal Essential Medium (DME), das 2,5 mg/ml Lipoprotein-freies Serum (LDS) enthielt, 12 Stunden bei 4ºC inkubiert (gemischt und gehalten) (Endkonzentration 2,5 mg/ml). Dann wurden die einzeln inkubierten Mischungen auf Monoschichten humaner Vorhaut-Fibroblasten, die in DME mit 10 Prozent fetalem Kalbsserum (FCS) in Vertiefungen von 10 Millimeter Durchmesser gezüchtet worden waren, transferiert. Die LDL-Rezeptoren dieser Zellen waren durch vorangehende Inkubation dieser Zellen während eines Zeitraums von 24 Stunden in DME, das 2,5 mg/ml LDS enthielt, maximal exprimiert worden.
Nach den einzelnen Inkubationen der Überstände und Fibroblasten-Zellen während 6 Stunden bei 37ºC wurde der zelluläre Abbau von ¹²&sup5;I-LDL in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Drevon et al., J. Lipid Res.p 22, 37-46 (1981) bestimmt. Die Vergleichskulturen enthielten 0,4 ml DME rnit einem Gehalt von ¹²&sup5;I-LDL und eine der folgenden Substanzen: a) 0,1 ml frisches Hybridom-Medium, das 20 Prozent fetales Kalbsserum enthielt; oder b) 0,1 ml Hybridom-Medium aus Vertiefungen von Hybridom- Kolonien, die hinsichtlich der Produktion von Apo B-spezifischen Antikörpern negativ waren; c) 0,1 ml DME, das 2,5 mg/ml LDS enthielt; oder d) 0,1 ml ungekennzeichnetes LDL (um die endgültige Konzentration von ungekennzeichnetem LDL in den Medien auf 500 µg pro ml zu bringen).

D. Isolierung von Anti-LDL-Immunglobulin

Ascitesflussigkeiten, die erfindungsgemaße Rezeptoren enthielten, wurden aus 10 Wochen alten Balb/c Mausen gewonnen, die mit 0,3 ml Mineralol primiert und intraperitoneal mit 3-50x10&sup5; Hybridomzellen injiziert worden waren. Die durchschnitt liche Zeit fur die Entwicklung des Ascites betrug 12 Tage. Im Anschluß an die Klarung durch Zentrifugieren bei 15.000xg wahrend 1 Stunde bei 4ºC wurden die Ascitesflüssigkeiten gesammelt und bei -20º C gefroren aufbewahrt.
Isolierter Antikörper M847 wurde durch Chromatographie der monoklonalen Hybridom-Ascitesflüssigkeiten an einer Protein A-Sepharose 48 Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) hergestellt. Der Antikörper wurde mit 0, 1 molarer (M) Essigsäure von der Säule eluiert.
Die isolierten Rezeptoren wurden auch durch rasche Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) einer monoklonalen Hybridom-Ascitesflüssigkeit an einer Pharmacia Mono Q HR 5/5 Anionentauschersäule in einem Pharmacia FPLC-System unter Verwendung eines 0-0,5 M NaCl-Gradienten in 10 mM Tris, pH 8,0, hergestellt, wobei den mit der Säule mitgelieferten Anweisungen Folge geleistet wurde.

E. Charakterisierung der Hybridom-Antikörper

Der Gesamtgehalt an Gamma-Globulin (Ig) jedes Pools von Ascitesflüssigkeit wurde durch Elektrophorese von 1-3 ml Proben von Zelluloseacetatstreifen in 75 mM Veronal-Puffer bei einem pH-Wert von 8,6 während 45 Minuten bei 200 Millivolt (mV) erhalten. Der Prozentsatz an Gesamtprotein, das aus Ig bestand, wurde durch densiometrisches Scanning der mit Ponceau S gefärbten Gele quantitativ bestimmt und das Gesamtprotein wurde durch die modifizierten Lowry-Verfahren, wie oben besprochen, festgestellt.
Schwere und leichte Ketten von murinen Ig wurden durch Doppeldiffusion in 0,9 Prozent Agarose identifiziert. 10 Mikroliter einer entsprechenden Verdünnung von Ascitesflüssigkeit wurden mit einem gleichen Volumen entsprechend verdünnten Kaninchen-Antiseren, die gegen murine schwere und leichte Ketten spezifisch waren (Litton Bionetics), umgesetzt. Im Anschluß an die Diffusion während etwa 15 Stunden bei 20ºC und Waschung wurden die Precipitin-Linien durch Färben mit 0,5 Prozent Coomassie- Brilliantblau R-250 identifiziert.
Die isoelektrischen Profile jedes monoklonalen Antikörpers wurden durch isoelektrische Focusierung von 0,01 ml Proben der Ascitesflüssigkeiten in 0,8 Prozent Agarose (EF 802-300 LKB) mit einem Gehalt an 10 Prozent Sorbitol, 2 Prozent Ampholin, innerhalb eines ph-Wert-Bereichs von 5-8, (LKB) während 150 Minuten bei konstanter Leistung von 3 Watt erhalten. Im Anschluß an die Fixierung und Trocknung wurden die Gele mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt und fotografiert.
1. Western Blotting - Die Apoproteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) der Lipoproteine in einer Vorrichtung mit vertikalen Gel-Platten (14x12x0,15 cm) (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA) aufgetrennt. Die Gele wurden unter Verwendung eines 25 mM Tris- Glyzin-Puffers bei einem ph-Wert von 8,6 hergestellt. Das obere Stapelgel enthielt 1 Prozent SDS, 3 Prozent Acrylamid, und das untere Laufgel war entweder ein 3 bis 20 Prozent oder ein 3 bis 6 Prozent Acrylamidgradient mit einem Gehalt an 1 Prozent SDS. Die Lipoproteine wurden durch Sieden während 3 Minuten in Elektrophorese- Probepuffer, der 1 Prozent Natriumdodecylsulfat, 10 mM Tris und 0,24 mM EDTA enthielt, von Lipiden befreit. Die Molekulargewichtsmarker und ihre jeweiligen scheinbaren relativen Molekularmassen waren folgende: Fibrinogen, 340.000; IgG, 140.000; Albumin, 69.000; Ovalbumin, 43.000; Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, 20.500; und Lysozym, 14.300. Die Gele wurden etwa 18 Stunden bei 13,5 Milliampere (mA) Gleichstrom der Elektrophorese unterworfen.
Die Gele wurden 10 Minuten in destilliertem Wasser und dann 10 Minuten in 25 mM Tris, 192 mM Glycin, pH 8,3, mit einem Gehalt von 20 Prozent (Vol./Vol.) Methanol gewaschen. Der Transfer auf Nitrozellulose (0,45 Mikro, Millipore Corp.) erfolgte durch Elektrophorese während 1 Stunde bei 400 mA. Die verbleibenden aktiven Bindungsstellen auf der Nitrozellulose wurden durch Eintauchen über Nacht in PBS mit einem Gehalt von 3 Prozent BSA, 3 Prozent normalem Ziegenserum, 0,01 Prozent Natriumazid (Blockierungslösung) abgesättigt.
Die fixierten Gele oder Nitrozellulose-Transfers wurden 18 Stunden bei 4ºC entweder mit immunem Maus-Serum oder Ascitesflüssigkeit in entsprechender Verdünnung in PBS, die 3 Prozent BSA, 3 Prozent normales Ziegenserum, 0,05 Prozent Tween-20 (Polyoxyethylen (20 Monolaurat)) enthielt, inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurde die Antikörper-Bindung durch eine zweite 4-stündige Inkubation bei 4ºC mit ¹²&sup5;I-Ziegen-Anti-Immun Ig (0,5 MikroCi/ml) in dem gleichen Puffer mit ebenfalls anschließender ausgedehnter Waschung festgestellt.
Die unspezifische Bindung an die Nitrozellulose wurde durch Waschen nach der Inkubation sowohl mit den ersten als auch den zweiten Antikörpern in PBS mit einem Gehalt von 3 Prozent BSA, 0,05 Prozent Tween-20 und dann in 0,5 M LiCl mit einem Gehalt von 0,1 Prozent SDS in signifikanter Weise herabgesetzt.
Die Gele oder Nitrozellulose-Trar:sfers wurden getrocknet und durch Autoradiographie (X-Omat; Eastman Kodak) bei -20ºC analysiert. Wo es angebracht war, wurden die Gele entweder mit 0,1 Prozent Coomassie-Brilliantblau R-250 in 50 Prozent Trichloressigsäure oder durch Silberfärbung (Bio-Rad) nach der Beschreibung von Merril et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4335-4339 (1979) gefärbt.

F. Herstellung von Fab-Fragmenten

Fab-Fragmente des Antikörpers aus isolierten Rezeptormolekülen wurden durch Abbau mit Papain hergestellt. Die Fc-Teile des Antikörpers und unverdaute Antikörper wurden mit Hilfe eines Durchgangs über eine Protein A-Sepharose 48 Säule abgetrennt. SDS-PAGE der Fab-Fragmente lieferte zwei diskrete Banden von 25.000 und 40.000 Dalton. Die Immunreaktivität der Fab-Fragmente wurde durch spezifische Bindung an LDL in einem Festphasen-RIA verifiziert (Milne et al., Arteriosclerosis 3, 23-30 (1983).

G. Radioimmunoassays (RIAS)

1. Flüssigphasen-RIA mit ¹²&sup5;I-gekennzeichnetem Antigen Zur Bestimmung des Anteils der ¹²&sup5;I-LDL-Teilchen, die durch M847 und M824 gebunden sind, wurde ein Flüssigphasen-RIA eingesetzt [Curtiss und Edgington, L Biol. Chem., 25, 15213-15221(1982)]. Zwei unterschiedliche LDL-Präparate (d=1,019- 1.063 g/ml) wurden untersucht, eines, das aus gepooltem Plasma von 10 normalen Personen isoliert worden war, und eines, das aus Plasma von einer normalen Person stammte. ¹²&sup5;I-LDL (2000 cpm/ng), hergestellt unter Verwendung des Jodogen-Verfahrens (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) war mit 90-prozentiger Trichloressigsäure (TCA) ausflillbar. Es wurde in 9-prozentigem Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO) verdünnt und bei 30.000xg 15 Minuten zentrifugiert, bevor jeweils der Assay zur Abtrennung von Komplexmaterial durchgeführt wurde. Die Assays wurden in 3-facher Ausführung in Glasröhrchen von 12x75 mm in 55 mM Natrium-Barbital-Puffer bei einem pH-Wert von 8 und einem Gehalt von 150 mM NaCl, 0,02 Prozent Natriumazid, 3 Prozent BSA und 1,5 mM Natrium-EDTA vorgenommen. Zu 0, 1 ml ¹²&sup5;I-LDL (enthaltend 20 ng LDL- Protein) wurden 0,1 ml Puffer oder konkurrierendes Antigen und 0,1 ml isolierte M847 Rezeptoren mit steigenden Konzentrationen, verdünnt in BSA-Barbital-Puffer, zugesetzt. Nach 18 Stunden bei 4ºC wurde 0,1 ml IgSorb (The Enzyme Co., Boston, MA) zugemischt. Nach dem Stehenlassen während 2 Stunden wurden 2 ml BSA-freier Barbital-Puffer zugesetzt und die Röhrchen wurden unmittelbar nachher bei 1500xg 60 Minuten zentrifügiert. Die Niederschläge wurden zweimal mit Barbital-Puffer gewaschen. Die maximale ausfällbare Radioaktivität wurde durch Ersetzen des IgSORB mit 100 Prozent TCA bestimmt. Die minimale ausfällbare Radioaktivität wurde in Abwesenheit von M847 Rezeptoren bestimmt. Die Prozent gebundenes ¹²&sup5;I-LDL wurden dann berechnet.

2. Flüssigphasen-RlA mit ¹²&sup5;I-gekennzeichnetem Rezeptor

Intakte Antikörper M847 Rezeptoren, die durch Immunreinigung isoliert worden waren, wurden unter Verwendung des Jodogen-Verfahrens mit ¹²&sup5;I (spezifische Aktivität 3000 cpm/ng) (Pierce) jodiert. Im Anschluß an eine ausgedehnte Dialyse gegen PBS waren mehr als 95 Prozent der Radioaktivität durch 10 Prozent TCA ausfällbar. Mehr als 98 Prozent des ¹²&sup5;I-M847 banden an eine Afflnitätssäule mit humanem LDL. Die Assays wurden in dreifacher Ausführung in Silikon beschichteten Glasrohrchen von 10x75 mm durchgefuhrt. Ansteigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-M847 in 0,1 ml BSA- Barbital-Puffer wurden zu 100 ng von gepooltem normalem humanem LDL, das in 0,2 ml BSA Barbital Puffer verdunnt war, zugesetzt. Jedes Rohrchen enthielt 182 fMol LDL Apo B (unter der Annahme eines Molekulargewichts von Apo B von 550.000 Dalton). Nach 16 stundigem Stehenlassen bei 4 ºC wurde das LDL quantitativ durch ein von Lipoprotein befreites Kaninchen Antiserum, das fur humanes LDL spezifisch war, ausgefällt. (Es wurde nur jene Fraktion des Kaninchen-Antiserums verwendet, die eine größere Dichte als 1,21 g/ml hatte, da der Antikörper M847 an Kaninchen Apo B bindet.)
Durch vorangehende Studien wurde eine Konzentration von entlipidiertem Kaninchen-Antiserum erstellt, die 97 Prozent von 100 ng humanem ¹²&sup5;I-LDL auställte. Nach dem Zumischen des Kaninchen-Antikörpers wurden die Röhrchen 16 Stunden bei 4ºC gehalten und dann bei 1500xg 50 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden abgetrennt und die Pellets zweimal mit 2 ml eiskaltem Barbital-Puffer gewaschen. Unspezifische Bindung und Ausfällung wurden in zwei Gruppen paralleler Röhrchen bestimmt.
In der ersten Gruppe wurde kein hurnanes LDL zu der anfänglichen Inkubation zugesetzt, jedoch wurde die gleiche Menge von zweitem Kaninchen-Antikörper zugefügt. In der zweiten Gruppe von Röhrchen wurde Serum von nicht-immunen Kaninchen (Fraktion mit der Dichte größer als oder gleich 1,21 g/ml) anstelle des Serum-Antikörpers von immunen Kaninchen eingesetzt.
Beide Verfahren lieferten idente Werte für die nicht-spezifische Bindung, die mit steigenden Konzentrationen von ¹²&sup5;I-M847 Antikörper linear verlief und in allen Fällen weniger als 1 Prozent der gesamten zugesetzten Zähler betrug. Spezifische ¹²&sup5;I- M847 Bindung an LDL wurde durch Abziehen der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtbindung erhalten. Die Bindungsdaten wurden unter Verwendung eines Programms für lineare Regression für die Scatchard Analyse von Liganden-Bindungssystemen analysiert, das eine Abschätzung der Antikörper-Affinitätskonstante (Ka) und der Rezeptor- oder Epitopkonzentration lieferte (Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980).

3. RIA mit Festphasen-fixiertem Antigen

Ein Screening-Assay zur Bestimmung, ob eine Hybridomkultur erfindungsgemäße Rezeptoren produzierte, wurde in flexiblen Rundboden-Mikrotiterplatten aus Polyvinylchlorid (Dynatech, Inc., Alexandria, VA) als fester Matrix vorgenommen. Lipoprotein-Antigene (Reagenz Apo B-100) wurden an den inneren Wänden der Vertiefungen der Mikrotiterplatten fixiert (gebunden), indem 0.05 ml Lipoprotein in Lipoprotein-Puffer zugemischt und die Platten bei Raumtemperatur 3 Stunden inkubiert wurden, um eine konstante Endkonzentration an gebundenem Antigen und den festen Träger zu erhalten. Vorangehende Untersuchungen der direkten Bindung unter Verwendung von radiojodierten Lipoproteinen deuteten darauf hin, daß keine signifikanten Unterschiede in den Wirksamkeiten bestanden, mit welchen die Lipoproteine jeweils an die Kunststoff-Mikrotiter-Vertiefungen gebunden waren. Um daher eine endgültige Konzentration von gebundenem Antigen von 50 ng Protein/Vertiefüng zu erreichen, wurde VLDL mit 50 µg/ml, IDL mit 6,2 µg/tnl, LDL mit 4,4 µg/ml und HDL mit 24 µg/ml verwendet. Die unspezifischen Bindungsstellen wurden dann durch Zumischen von 0,25 ml Blockierungslösung in jede Vertiefung blockiert, wobei die Mischung 1 Stunde lang belassen und anschließend die Blockierungslösung aus den Vertiefungen abgetrennt wurde, wodurch ein fester Träger mit einer niedrigen unspezifischen Bindungskapazität gebildet wurde.
Für den Assay wurden 0,050 ml Antiserum, Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit in PBS, die 3 Prozent BSA, 3 Prozent normales Ziegenserum und 0,05 Prozent Tween-20 [Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monolaurat] enthielt, in die Vertiefungen eingebracht, um Fest-/Flüssigphasen-lmmunreaktionsmischungen zu bilden. Die Mischungen wurden dann 1 8 Stunden bei 4ºC gehalten (immunreagiert).
Nach dem Waschen der Vertieftingen mit PBS, die 3 Prozent BSA und 0,05 Prozent Tween-20 enthielt, zur Abtrennung von nicht-gebundenem Material wurden Festphasen-gebundene Rezeptoren für die direkte Bestimmung hergestellt, indem 10 ng immunchemisch gereinigtes und radiojodiertes Ziegen-Anti-Maus-Ig in jede Vertiefung zur Bildung einer zweiten Fest-/Flüssigphasen-Mischung zugesetzt wurden. Diese Mischung wurde 4 Stunden bei 4ºC gehalten, um zu ermöglichen, daß sich die gekennzeichneten zweiten Rezeptoren an die Festphasen-gebundenen ersten Rezeptoren binden und einen Sandwich-Immunreaktant bilden.
Nach einer endgültigen Waschung zur Entfernung ungebundener gekennzeichneter Rezeptoren wurden die einzelnen Vertiefungen herausgenommen und auf ¹²&sup5;I ausgezählt, wobei die festgestellte Menge von ¹²&sup5;I in direktem Verhältnis zu der Menge der ersten Rezeptoren, die als Festphasen-Immunreaktant gebunden waren, stand.
Der immunchemisch gereinigte zweite Antikörper wurde enzymatiseh auf spezifische Aktivitäten von 3-4 MikroCi/Mikrogramm radiojodiert, wobei immobilisierte Laktoperoxidase und Glukoseoxidase (Enzymobeads, Bio-Rad Burlingame, CA) verwendet wurden.

4. Kompetitiver RIA mit Festphasen-fixiertem Rezeptor

Unter Verwendung von Antikörper M847 wurden kompetitive Festphasen- Radioimmunoassays (RIAS) für humanes Apo B durchgeführt. Polyvinylchlorid-Vertiefungen wurden mit 0,5 ml humanem LDL (Reagenz Apo B-100), das in PBS, pH 7,35, auf 10 µg/ml verdünnt war, beschichtet und 2 Stunden bei 37ºC gehalten. Die unspezifischen Bindungsstellen wurden durch überziehen mit 5 Prozent BSA in PBS während 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Dann wurden die Platten mit PBS-Waschpuffer, der zusätzlich 0,1 Prozent BSA, 0,01 Prozent Natriumazid und 0,05 Prozent Tween-20 enthielt, gewaschen.
Frisches humanes LDL, hergestellt aus gepooltem normalem Plasma, wurde als Reagenz Apo B-100 für die Standardkurve in Verdünnungen im Bereich von 0,4 µg/ml bis 97,2 µg/ml verwendet. AIle Verdünnungen erfolgten in einem PBS-Puffer, der 3 Prozent BSA, 0,01 Prozent Natriumazid und 0,05 Prozent Tween-20 enthielt. Das Standard-LDL oder die Kompetitoren (0,025 ml) wurden in die LDL-beschichteten Vertiefungen eingemischt, worauf 0,025 ml Puffer, der einen fixierten und be grenzenden Anteil an monoklonalem Antikörper (Ascitesflüssigkeit) enthielt, zugestzt wurden. Die optimale endgültige Konzentration des Antikörpers wurde aus vorangehenden Antikörper-Verdün nungsstudien ermittelt und wurde als die Menge des Antikörpers gewählt, die zu 50 Prozent maximaler Bindung führte.
Die Platten wurden während eines Zeitraums von etwa 18 Stunden bei 4ºC gehalten, dann mit dem PBS-Waschpuffer gewaschen. Die quantitative Bestimmung der Maus-Antikörper-Bindung erfolgte dann durch Zumischen von 0,05 ml ¹²&sup5;I-immungereinigtem Ziegen-Anti-Maus-Ig (450 ng/Vertiefung, 8.000 cprn/ng). Nachdem die Platten 4 Stunden bei 4ºC stehen gelassen worden waren, wurden sie gewaschen und die einzelnen Vertiefungen ausgezählt.

H. Assay mit Enzym-gebundenem Immunosorbant (ELISA)

1. Nicht-kompetitiver ELISA

Isolierte M847 Rezeptoren wurden an den Wänden von Vertiefungen in Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc-Immuno Plate I) durch Zumischen von 0,15 ml eines Natriumbicarbonat-Puffers, ph 9,0, der 1 µg/ml Rezeptorprotein enthielt, in jede Vertiefung fixiert. Die Wände wurden 16 Stunden bei 4ºC gehalten und dann dreimal mit PBS, die 0,1 BSA und 0,05 Tween enthielt, gewaschen Die verbleibenden unspezifischen Bindungsstellen wurden dann durch Zumischen von 0,2 ml 3-prozentigem BSA in PBS zu jeder Vertiefung blockiert, wobei die Mischung 1 Stunde bei 23ºC gehalten und dann, wie oben beschrieben, gewaschen wurde. Die Vertieftmgen (feste Träger), die so hergestellt worden waren, können, wenn sie in einer Feuchthaltekammer aufbewahrt werden, bis zu einen Monat nach ihrer Herstellung eingestzt werden.
Reagenz Apo B-100 (humanes LDL) wurde in PBS auf Konzentrationen im Bereich von 2,0 bis 0,062 µg/ml zur Verwendung als Standardvergleichslösungen verdünnt. Die Plasmaproben wurden in PBS 1:2000 verdünnt.
50 Mikroliter Standard oder Probe wurden in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen eingebracht. Innerhalb von etwa 5 Minuten wurden im Anschluß daran 50 µl PBS, die mg/ml HRPO-gekennzeichnete M824 Rezeptoren enthielt, zu jeder Vertiefung zugesetzt. Die Immunreaktionsmischungen wurden 30 Minuten bei 25ºC gehalten. Ungebundenes Material wurde dann aus den Vertiefungen durch Waschen, wie oben beschrieben, abgetrennt.
Die Menge des Festphasen-fixierten Sandwich-Immunreaktants, der das HRPO-Label enthielt, wurde dann durch Zumischen von 0,1 ml frisch bereiteter Subtratlösung (destilliertes Wasser, das 3 Prozent H&sub2;O&sub2; und 0,67 mg/ml o-Phenylendiamin (OPD) enthielt) zu jeder Vertiefung geprüft. Die Farbe wurde 30 Minuten bei 25ºC entwickeln gelassen. Die Substrat-Umwandlungsreaktion wurde dann durch Zumischen von 0,05 ml 4N H&sub2;O&sub2; in jede Vertiefung abgebrochen. Die optische Dichte (O.D.) der Lösungen wurde bei 490 Nanometer (nm) Wellenlänger unter Verwendung eines Lesers für Mikrotiterplatten Dynatech MR600 (Dynatech, Alexandria, VA) bestimmt.

2. Kompetitiver ELISA

Reagenz Apo B-100 wurde an den Wänden von Vertiefungen von flexiblen Polyvinylchlorid-Mikrofiterplatten (Microtest III, Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co.. Oxnard, CA) als fester Matrix durch Zumischen von 0,2 ml PBS, die 5 µg/ml isoliertes humanes LDL enthielt, in jede Vertiefung fixiert. Die Vertiefungen wurden 16 Stunden bei 4ºC gehalten und dann dreimal mit 0,2 ml PBS, die 1 Prozent BSA, 0,5 Prozent Tween und 0,02 Prozent Aprotinin (Sigma Chemical Co.) enthielt, gewaschen. Die verbleibenden unspezifischen Bindungsstellen wurden nach der Beschreibung in dem nicht-kompetitiven ELISA blockiert.
Für die Standardkurve, die in jeder Platte enthalten war, wurde Reagenz Apo B-100 in PBS, die 0,5 Prozent von Lipoprotein befreites Plasma (LPDP) enthielt, verdünnt, um Konzentrationen im Bereich von 32 mg/ml bis 0,25 mg/ml bereitzustellen.
Die Plasmaproben wurden 1:200 in PBS, die 0,5 Prozent LPDP enthielt, verdünnt. 50 Mikroliter der Standards oder Proben wurden in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen eingebracht. Innerhalb von 5 Minuten danach wurden 50 µl PBS, die 3 Prozent BSA und etwa 4 µg/ml M824 Rezeptoren enthielt, in jede Vertiefung zugesetzt. Die so gebildeten Mischungen wurden etwa 18 Stunden bei 4ºC gehalten. Das ungebundene Material wurde dann von dem Immunreaktionsprodukt aus Festphasen-fixiertem M824 und Reagenz Apo B-100 durch Waschen wie oben beschrieben abgetrennt.
Die Festphasen-Immunreaktanten wurden durch Zumischen von 0,1 ml PBS, die 1 Prozent BSA und eine wirksame Menge HRPO-gekennzeichnetes Ziegen-Anti- Maus-IGG enthielt, zu jeder Vertiefung zur Untersuchung vorbereitet. Diese zweite Immunreaktionsmischung wurde etwa 1 Stunde bei 24ºC gehalten und dann wie oben beschrieben gewaschen, um einen Sandwich-Immunreaktant zu bilden.
Die Menge an Festphasen-fixiertem Sandwich-Immunreaktant, die HRPO- Label enthielt, wurde wie nach der Beschreibung für den kompetitiven ELISA untersucht.

I. Plasmaproben und quantitative Lipoprotein-Bestimmung

Die Plasmaproben wurden von 20 Patienten mit Coronararterien-Erkrankung aus dem Herzkatheter-Laboratorium im San Diego VA Hospital und von 20 Patienten mit familiär bedingter Hypercholesterinämie einer Klinik der Universität von Kalifornien, San Diego, gewonnen. Zusätzlich dazu wurde Plasma von 20 normalen Personen gewonnen.
Das Blut wurde in Röhrchen, die 1,5 mg/ml Ethylendiamin-tetraacetat (EDTA) enthielten, gesammelt und das Plasma wurde unmittelbar anschließend durch Zentrifugieren bei 4ºC abgetrennt.
Das gesamte Plasma-Cholesterin und die Plasma-Triglyzeride wurden an frischen Plasmaproben in einem klinischen Standard-Laboratorium unter Verwendung eines bichromatischen Analysators Abbott ABA-200 mit dem Hochleistungs-Reagenz 236691 für Cholesterin von Boehringer-Mannheim und dem Triglyzeride Agent von Abbott Laboratories gemessen. Das LDL- und HOL-Cholesterin wurde unter Verwendung der in Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. Nr. 75-628 (NIH), 2. Aufl., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974) beschriebenen Verfahren gemessen. Die Apoprotein B Gehalte wurden unter Verwendung von zwei im Handel erhältlichen Radioimmunodiffusions-Kits bestimmt: Diffu-gen RID (Tago, Inc., Burlingame, CA), der hier als RID #1 bezeichnet wird, und M-Partigen RID (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA), der hier als RID #2 bezeichnet wird.

J. LDL-Bindung an eine M847-Sepharose 48 Säule

50 Milligramm praktisch reine M847 Rezeptoren, erhalten durch Protein A Säulenchromatographie, wurden an 12 ml Bromcyan-aktivierte Sepharose 48 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.Y.) gemäß den Anleitungen des Herstellers gebunden. Anschließend wurden 10 mg LDL zu der Säule zugesetzt und diese über Nacht (etwa 6 Stunden) bei 4ºC gehalten. Das nicht-gebundene LDL wurde dann eluiert und die Bestimmung von LDL-Protein wie oben beschrieben vorgenommen.
Die vorangehende Beschreibung, die die speziellen Ausführungsformen enthält, soll für die vorliegende Erfindung erläuternd wirken, jedoch nicht als deren Begrenzung angesehen werden. Es können zahlreiche andere Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden, ohne den wahren Geist und den Rahmen des neuen Erfindungsgedankens zu verlassen.

Claims

1. Ein Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746.

2. Ein Rezeptor, der (a) mit Apoprotein B-100 immunreagiert und (b) von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 ausgeschieden ist.

3. Der Rezeptor nach Anspruch 2, der ein intakter Antikörper ist.

4. Ein Hybridom mit der ATCC Eintragungsnurnmer HB 8742.

5. Ein Rezeptor, der (a) mit Apoprotein B-100 immunreagiert und (b) von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742 ausgeschieden ist.

6. Der Rezeptor nach Anspruch 5, der ein intakter Antikörper ist.

7. Ein Verfahren zur Untersuchung einer Körperfluid-Probe hinsichtlich der Menge von Apoprotein B-100, welches Verfahren folgende Schrifte umfaßt:

(a) Bereitstellen einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;

(b) Bereitstellen von Rezeptormolekülen in biologisch aktiver Form, die (i) mit Apoprotein B-100 immunreagieren, und (ii) von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 oder dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8742 ausgeschieden sind;

(c) Mischen einer bekannten Menge der genannten Körperfluid-Probe mit einer vorherbestimmten Menge der genannten Rezeptormoleküle zur Bildung einer Immunreaktionsmischung;

(d) Halten dieser Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums, der ausreicht, daß die in der Mischung vorliegenden Rezeptormoleküle das in der Probe vorliegende Apoprotein B-100 unter Bildung eines Immunreaktanten immunologisch binden; und

(e) Bestimmung der Menge des in dieser Mischung gebildeten Immunreaktanten.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die genannte Körperfluid-Probe Plasma oder Serum ist.

9. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem der genannte Rezeptor ein intakter Antikörper ist.

10. Das Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem die Körperfluid-Probe weiters zur Untersuchung vorbereitet wird, wobei die folgenden Schritte umfaßt sind:

(f) Bereitstellung von biologisch aktiven zweiten Rezeptormolekülen, die mit in der genannten Körperfluid-Probe vorliegendem Apoprotein B-100 immunreagieren und die die jeweils verbleibenden von den Rezeptormolekülen sind, die von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer HB 8746 oder dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnummer 8742 ausgeschieden sind; und

(g) Mischen einer vorherbestimmten Menge dieser zweiten Rezeptormoleküle mit der genannten Körperfluid-Probe zur Bildung einer Immunreaktionsmischung;

(h)' Halten dieser Immunreaktionsmischung unter den bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraurns, der ausreicht, daß die in der Mischung vorliegenden Rezeptormoleküle das in der Probe vorliegende Apoprotein B-100 unter Bildung eines Sandwich-Immunreaktanten immunologisch binden.

11. Das Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem der genannte Rezeptor ein intakter Antikörper ist.

12. Das Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem dieser erstgenannte Rezeptor an einer festen Matrix zur Bildung eines festen Trägers fixiert ist; dieser zweite Rezeptor ein Label enthält, das imstande ist, die Anwesenheit des genannten zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren; und der in Stufe (e) untersuchte Immunreaktant ein Festphasen-Sandwich-Immunreaktant ist, der das genannte Label enthält.

13. Ein diagnostisches System zur Bestimmung der Menge von apo B-100 in einer Körperprobe, umfassend:

(a) ein biologisch aktives erstes spezifisches Bindeagens, das Rezeptormoleküle umfaßt, die (i) mit Apoprotein B-100 immunreagieren und (ii) entweder die von dem Hybridom ATCC HB 8746 ausgeschiedenen Rezeptormoleküle oder die von dem Hybridom ATCC HB 8742 ausgeschiedenen Rezeptormoleküle sind; und

(b) ein biologisch aktives gekennzeichnetes zweites Bindeagens zur Signalisierung der Immunreaktion des genannten ersten Bindeagens mit apo B-100.

14. Das Assay-System nach Anspruch 13, bei welchem das gekennzeichnete zweite spezifische Bindeagens aus den jeweils anderen Rezeptormolekülen entweder der von dem Hybridom ATCC HB 8746 ausgeschiedenen Rezeptoren oder der von dem Hybridom ATCC HB 8742 ausgeschiedenen Rezeptoren besteht.

15. Das Assay-System nach Anspruch 14, bei welchem das Label ein Enzym ist.

16. Das Assay-System nach Anspruch 13, bei welchem das genannte erste spezifische Bindeagens an einer festen Matrix zur Bildung eines festen Trägers fixiert ist.

17. Ein steriles Affinitäts-Sorbans, enthaltend biologisch aktive Rezeptormoleküle, die mit Apoprotein B-100 immunreagieren und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

(a) den Rezeptormolekülen, die von dem Hybridom HB 8746 ausgeschieden sind;

(b) den Rezeptormolekülen, die von dem Hybridom HB 8742 ausgeschieden sind; und

(c) einer Mischung der Rezeptormoleküle von (a) und (b); wobei die genannten Rezeptormoleküle an einer festen Matrix zur Bildung eines festen Trägers fixiert sind.

18. Ein Verfahren zur Untersuchung einer Körperfluid-Probe auf Apoprotein B-100, umfassend folgende Schritte:

(a) Bereitstellen einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;

(b) Bereitstellen eines festen Trägers, enthaltend eine feste Matrix mit einem daran in biologisch aktiver Form fixierten ersten Rezeptor, der mit Apoprotein B-100 immunreagiert und von dem Hybridom mit der ATCC Einreichungsnumrner HB 8746 aussgeschieden ist;

(c) Bereitstellen eines biologisch aktiven zweiten Rezeptors, der mit Apoprotein B-100 immunreagiert und durcvon dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnumrner 8742 ausgeschieden ist, wobei der genannte zweite Rezeptor an ein Enzym-Label gebunden ist, das imstande ist, die Anwesenheit des genannten zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren;

(d) praktisch gleichzeitiges Zusammenmischen von:

(i) der genannten Körperprobe;

(ii) dem festen Träger; und

(iii) dem gekennzeichneten zweiten Rezeptor zur Bildung einer Festphasen-/Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung;

(e) Halten dieser Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines vorherbestimmten Zeitraums, der ausreicht, daß der genannte erste Rezeptor und der genannte gekennzeichnete zweite Rezeptor in der Probe vorliegendes Apoprotein B- 100 immunologisch binden, um einen Festphasen-Sandwich-Immunreaktant und eine flüssige Phase zu bilden;

(f) Abtrennen des genannten Festphasen-Sandwich-Immunreaktanten von der genannten flüssigen Phase; und

(g) Bestimmung der Menge des gekennzeichneten zweiten Rezeptors, der in dem Festphasen-Sandwich-Immunreaktant gebunden ist.

19. Ein kompetitives Verfahren zur Untersuchung einer Körperfluid-Probe auf Apoprotein B-100, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer Körperfluid-Probe, die untersucht werden soll;

(b) Bereitstellung eines festen Trägers, enthaltend eine feste Matrix, die eine vorherbestimmte Menge von Reagenz Apoprotein B-100 daran fixiert enthält;

(c) praktisch gleichzeitiges Zusammenmischen von:

(i) der genannten Körperprobe;

(ii) dem genannten festen Träger; und

(iii) einer vorherbestimmten Menge von Rezeptormolekülen, die mit Apoprotein B-100 immunreagieren und ausgeschieden sind entweder von dem Hybridom mit der ATCC Eintragungsnurnmer HB 8746 oder dem Hybridom mit der Eintragungsnummer HB 8742 zur Bildung einer Fest:phasen-/Flüssigphasen-Mischung;

(d) Halten dieser Mischung unter den Bedingungen eines biologischen Assays während eines Zeitraums, der ausreicht, daß die Rezeptormoleküle an Apoprotein B-100 Moleküle des festen Trägers und Apoprotein B-100 Moleküle in der Körperfluid- Probe immunologisch binden und einen Festphasen-Immunreaktant und einen Flüssigphasen-Immunreaktant bilden; und

(e) Abtrennen des genannten Festphasen-Immunreaktanten von der genannten flüssigen Phase;

(f) Zumischen zu dem genannten Festphasen-Immunreaktanten eines biologisch aktiven zweiten Rezeptors, der mit dem genannten ersten Rezeptor immunreagiert, um eine zweite Festphasen-/Flüssigphasen-Immunreaktionsmischung zu bilden, wobei der genannte zweite Rezeptor an ein Enzym-Label gebunden ist, das imstande ist, die Anwesenheit des genannten zweiten Rezeptors in einem Immunreaktant zu signalisieren;

(g) Halten dieser zweiten Mischung während eines Zeitraums, der ausreicht, daß der gekennzeichnete zweite Rezeptor sich an einen beliebigen ersten als Festphasen- Immunreaktant vorliegenden Rezeptor immunologisch bindet, um einen Festphasen- Sandwich-Immunreaktant zu bilden;

(h) Abtrennen des genannten Festphasen-Sandwich-Immunreaktanten aus dieser flüssigen Phase; und

(i) Bestimmung der Menge des gekennzeichneten, in dem genannten Festphasen-Sandwich-Immunreaktant gebundenen zweiten Rezeptors.