PT85490B

PT85490B - Hibridemas produtores de anticorpos monoclonais especificos da apolipoproteina--b e processos de ensaio para a determinacao da referida apolipoproteina

Info

Publication number: PT85490B
Application number: PT85490A
Authority: PT
Inventors: Linda K Curtiss; Joseph L Witztum; Steven Young
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1987-08-05
Publication date: 1990-06-29
Also published as: FI873410A; DE3751182D1; US5330910A; JPS63279783A; NO172596B; DK407987A; NO172596C; DE3751182T2; IE872104L; US5460947A; DK174932B1; FI92714C; AU7657387A; CA1338032C; EP0257778B1; EP0257778A3; FI873410A0; ATE120233T1; FI92714B; EP0257778A2

Description

Âmbito Técnico da Invenção

A presente invenção refere-se duma forma geral a novos hibridomas, e mais especificamente a hibridomas que produzem moléculas receptoras que imunorreagem com a apolipopro teína B-100, a moléculas receptoras assim produzidas bem como a métodos de diagnóstico e seus sistemas utilizando as moléculas receptoras.

Antecedentes da Invenção

As lipoproteínas são os veículos primários do coleste rol e triglicéridos do plasma. Elas constituem complexos mi celares de lípidos-proteínas que contôm proteína (referida como apoproteína) e lípidos polares organizados numa película superficial que rodeia um núcleo de lípido neutral (triglicéri do e éster de colesterilo ). As lipoproteínas foram original, mente identificadas com base nas suas densidades flutuantes medidas por ultracentrifugação. Deste modo existem quatro tipos de densidade principais: quilo micro ns (chylomicrons), lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL), lipoproteínas de baixa densi dade (LDL) e lipoproteínas de elevada densidade (HDL).

Avanços paralelos na tecnologia das s^paraçães por ul tracentrifugação deram origem a uma subdivisão adicional das classes de densidade LDL e HDL em mais subclasses de maior homogeneidade. Por exemplo, pode resolver-se a LDL em lipoproteína de densidade intermédia (IDL) e numa subclasse LDL₂· Contudo, mesmo estas subclasses são compostas de populaçães funcionalmente heterogéneas de partículas de lipoproteínas ' devido ao seu variável conteúdo de apoproteína.

Foram isoladas oito apoproteínas principais, A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, e E, e do grupo de apoproteínas de menor importância que podem ser recuperadas em grandes quanti dades a partir de certas classes de densidade, a maior parte pode ser encontrada noutras classes de densidade. Assim, a

I

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:U

-3maior parte de partículas de LDL contêm apenas apo B, contudo algumas partículas também contêm outras apoproteínas e este facto leva a que estejam presentes quantidades traço de apo C-I, apo C-II, apo C-III, e apo E nesta classe de densidades.

Nalguns casos, foram atribuídas funções específicas para apoproteínas particulares. Por exemplo, reconhece-se uma espécie de apo B sintetizada no fígado, designada como apo B-100, e ligada por receptores celulares LDL. Por ligação de apo B-100, estes receptores ligam partículas LDL e ex, traem as partículas do plasma. A LDL é assim tomada pelas cê lulas e dividida, cedendo o seu colesterol para servir as necessidades de cada célula. A interacção do receptor apo B-LDL joga assim um papel principal, importante na remoção do colesterol LDL da corrente sanguínea.

Outra espécie de apo B, designada por apo B-48, não é reconhecida pelo receptor LDL. Esta espécie de apo B, que representa apenas 48 por cento em relação à apo B-100, é 3in tetizada no homem apenas no intestino. As lipoproteínas cori tendo apo B-48, como por exemplo as chylomicrons e os remanescentes de chylomicron'J não se ligam ao receptor LDL.

Embora estas duas espécies de apo B pareçam ser de cori trolos genéticos separados (descreveu-se um único paciente cju jo corpo produz apo B-48, mas não apo B-100), estudos imunolé gicos demonstraram que as apoproteínas B-100 e B-48 partilham determinantes antigénicos. Pelo menos três grupos de investi, gação referiram a produção de um total de sete anticorpos mo noclonais diferentes que ligam a apo B-100 e a apo B-48. Os dados referidos por esses investigadores sugerem fortemente que as apo B-48 e apo B-100 são proteínas estruturalmente re lacionadas; isto é, a apo B-48 pode representar parte da proteína apo B-100. Foi também referida evidência de que não se encontram apo B-48 e apo B-100 na mesma partícula de lipoproteína, sugerindo que existem partículas separadas de apo B.

Recentemente, vários investigadores sugeriram que os níveis de plasma de apo B podem ser mais preditores do risco

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

da doença de artérias coronárias (CAD) do que os níveis de co lesterol LDL do plasma. Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 604-608 (1980). Dado que a doença vascular arteroesclerótica e as suas complicaçBes continuam a ser a causa principal de morte e debilitação na sociedade do mundo ocidejn tal, sente-se uma grande necessidade na indústria biomédica de sistemas de ensaio susceptíveis de identificarem indivídiJ os com risco para CAD.

Têm sido referidos muitos tipos de imunoensaios para a apoproteína B do plasma utilizando antisoro contendo antiI corpos específicos, incluindo radioimunoansaios (RIA) de fase sólida e de fase fluída competitivos, ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), ensaios de imunodifusão radial e outros. Os problemas que limitam a grande difusão destes imunoensaios de apo B têm sido a reprodutibilidade, e a qualidade e especificidade do antisoro utilizado. As revisães dos problemas metodológicos de cada um dos vários tipos dos ensaios de apo B são encontrados em Currey et al., Clin, Chem. 24, 280-286 (1978) e Rosseneu et al., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983).

Vários investigadores referiram o desenvolvimento de painéis de anticorpos monoclonais contra apo B humana para utilizar no estudo da sua estrutura antigénica e o seu papel no metabolismo das lipoproteínas. Alám disso, têm aparecido referências da utilização de anticorpos monoclonais anti-apo B para medir níveis de apo B no plasma em RIA de fase fluída. Patton et al., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) e Maynard et al., Clin Chem. 30, 1620-1624 (1984). Em adição, um grupo referiu a utilização de uma mistura de anticorpos monoclonais anti-apo B num ensaio de imunodifusão radial para a apo B do plasma. Marconvina et al., Clin, Chim, Acta 147, 117-125 (1985). Contudo, estas técnicas de ensaio têm a desvajn tagem da necessidade de incubaçães demoradas, centrifugação repetida ou utilização de materiais radioactivos.

A utilização de anticorpos monoclonais como reagentes para a determinação de apo 8-100 em amostras de fluído do cor,

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-5po humano é atractiva dado que uma vez obtidos, esses reageri tes podem ser produzidos em quantidades relativamente grandes com qualidade adequada. Contudo, existe um certo número de factores que jogam contra a utilização de um anticorpo monoclonal particular como componente num sistema de ensaio de apo B-100.

Em primeiro lugar, a técnica ensina que um anticorpo monoclonal pode ser demasiado imunoespecífico para ser útil devido à heterogeneidade antigénica do seu antígeno alvo. Por exemplo, a especificidade de antisoros contendo anticorpos po, liclonais convencionais depende do consenso de centenas de mi lhar de anticorpos diferentes que se ligam a determinantes antigénicos que cobrem a maior parte ou toda a proteína ant_i génica. Como resultada disso, pequenas alterações na estrura do antígeno devidas a polimorfismo genético, heterogeneidade de glicosilaçso ou ligeira desnaturação terão geralme_n te um pequeno efeito na ligação de anticorpos policlonais. De modo semelhante, um maior ou menor subconjunto de anticoj? pos de antisoro policlonais ligar-se-á geralmente a antígenos que foram modificados ou desnaturados.

Em contraste, os anticorpos monoclonais ligam-se geral, mente a um determinante antigénico (epítopo) na molécula de antígeno. Se, por qualquer razão, esse determinante for alterado, o anticorpo pode continuar ou não a ligar-se. Se is to constitui um problema ou vantagem depende das circunstâncias individuais. Se, como no caso presente, o anticorpo mo noclonal é para ser utilizado num ensaio de diagnóstico para uma apoproteína, uma variação antigénica menor nessa proteína pode originar grandes erros.

A heterogeneidade antigénica de apoproteína B-1DQ està bem documentada. Por exemplo, verificou-se que a expressão do epítopo em apo B é modulada pela (D composição dos lípidos associados, (2) temperatura da imunorreacção, (3) grau de isolamento de LDL do seu ambiente nativo, e

511

Ref: SCRF 72.0-EPGzll

(4) expressão genética entra os indivíduos.

Em segundo lugar, devido à sua especificidade única, o uso com sucesso de um anticorpo monoclonal (MoAb) está mui, tas vezes dependente da sua afinidade para o antígeno alvo. Por exemplo, enquanto um MoAb pode ter uma afinidade suficiente para ser útil na ligação de antígenos de fase líquida e sólida enquanto o MoAb está ele próprio na fase líquida, esse mesmo anticorpo pode não ser útil como anticorpo fixado na fase sólida que é útil na ligação e arrastamento’' do antígeno da solução.

Os problemas acima citados são genéricas para o uso de anticorpos monoclonais. Os especialistas reconheceram as. sim que é essencial ensaiar e caracterizar anticorpos monocl£ nais em qualquer sistema de ensaio em que eles devem ser uti. lizados. Ver Goding, Clames W., Monoclonal Antibodies: Prin ciples and Practice. Páginas 40-46, Academic Press, New York (1983).

Sumário da Invenção

Um dos aspectos da presente invenção contempla o hibri doma designado por HL130C2.3C5 que tem o número de acesso ATCC HB 8746. Este hibridoma e as suas moléculas receptoras são também aqui referidas como MB47.

Em outro aspecto, a presente invenção contempla molécu las receptoras que imunorreagem com a apoproteína B-100 e que são segregadas pelo hibridoma ATCC HB 8746.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla o hibridoma designado por VB2A6.1G4 que tem o número de aces. so ATCC HB 8742. Este hibridoma e as suas moléculas recepto ras são também referidas aqui como MB24.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla moléculas receptoras que imunorreagem com a apoproteína B-100 e que são segregadas pelo hibridoma ATCC HB 8742.

Outro aspecto da presente invenção contempla a cultura de células compreendendo

| 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll (a) um hibridoma da presente invenção, (b) moléculas receptoras que são segregadas pelo referido hibridoma que imunorreagem com a apoproteína B-100; e (c) um meio de cultura para o hibridoma.

Um aspecto adicional da presente invenção contempla um processo para o ensaio de uma amostra de fluído de corpo para a determinação da presença ds apoproteína B-100 que compreeji de os passos seguintes:

(a) partir-se de uma amostra de fluído do corpo que se pretende ensaiar;

(b) obterem-se moléculas receptoras em forma bioloqi camente activa que (i) imunorreagem com a apoproteína B-100, e (ii) são segregadas pelo hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8746 ou hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8742;

(c) misturar-se a amostra de fluído do corpo com as moléculas receptoras;

(d) manter-se a mistura em condiçães de ensaio bioló gico durante um período pré-determinado de tempo suficiente para que as moléculas receptoras se liguem imuno biologicamente à apoproteína B-100 presente na amostra para formar um imunorreagente; e (e) determinar-se a quantidade de imunorreagente fo.r mado.

Em outro aspecto, a presente invenção contempla um processo para o ensaio de uma amostra de fluído do corpo para a determinação de apoproteína B-100 compreendendo os passos de:

(a) partir-se de uma amostra de fluído de corpo a eri saiar;

(b) obter-se um suporte sólido compreendido por uma

I 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

matriz sólida possuindo nela fixado numa forma biologicamente activa um primeiro receptor que imunorreage com a apoproteina B-100 e que 6 segregada pelo hibridoma que possui o nú mero de acesso ATCC HB 8746;

(c) obter-se um segundo receptor biologicamente acti. vo que imunorreage com a apoproteína B-100 e que é segregado pelo hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8742, estando o referido segundo receptor ligado a um marcador enzimático susceptível de sinalizar a presença do referido segun do receptor num imunorreagente;

» / X (d) misturar de modo substancialmente simultâneo:

(i) a amostra do corpo;

(ii) o primeiro receptor; e (iii) o segundo receptor marcado para formar uma mistura de imunorreacção de fase sólida/lí quida;

(e) manter-se a mistura em condiçães de ensaio bioló gico durante um período pré-determinado de tempo suficiente para que o primeiro receptor e o segundo receptor marcado se liguem imunologicamente à apoproteína B-100 presente na amos, tra para formar imunorreagente do tipo sanduíche de fase só- ) lida;

(f) separar-se o referido imunorreagente de tipo saji duiche de fase sólida da fase líquida; e (g) determinar-se a quantidade do segundo receptor marcado ligado no imunorreagente do tipo sanduíche de fase sólida que se formou.

Em outro aspecto, a invenção contempla um processo com petitivo para ensaio de uma amostra de fluído de corpo para a determinação da apoproteína B-100, compreendendo os passos de:

(a) partir-se de uma amostra de fluído do corpo a e_n saiar;

(b) obter-se um suporte sólido compreendido por uma

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

F.¹ v

-9matriz sólida possuindo uma quantidade pré-determinada de apoproteína

B-100 reagente nela fixado;

(c) misturar-se de modo simultâneo (i) a amostra de corpo;

(ii) o suporte sólido; e (iii) uma quantidade pré-determinada das molécu las receptoras que imunorreagem com a apo. proteína B-100 segregada do hibridoma com o número de acesso ATCC HB 8746 ou o hibri doma com o número de acesso ATCC HB 8742 para formar uma mistura de fase sóiida/II quida;

(d) manter-se a mistura em condiçães de ensaio bioló gico durante um período de tempo suficiente para que as molé cuias receptoras se liguem imunologicamente às moléculas da apoproteína B-100 do suporte sólido e às moléculas da apoprjo teína B-100 presentes na amostra de fluído do corpo e formem um imunorreagente de fase sólida e um imunorreagente de fase líquida;

(θ) ferida fase separar-se o imunorreagente de fase sólida da re líquida;

misturar-se o imunorreagente de fase sólida com receptor biologicamente activo que imunorreage com receptor para formar uma segunda mistura de imunox fase sólida/líquida, estando o segundo receptor li (f) um segundo o primeiro reacção de gado a um marcador enzimático susceptível de sinalizar a presença do segundo receptor num imunorreagente;

(g) manter-se a referida segunda mistura sob condiçõés de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que o segundo receptor marcado se ligue imunologicamente ao primeiro receptor presente como imunorreagente de fase sólida para formar um imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida;

(h) separar-se o imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida da fase líquida; e

I 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

(i) determinar-se a quantidade do segundo receptor marcado ligado ao referido imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida.

Em outro aspecto a presente invenção contempla uma cul tura de células compreendendo:

(a) o hibridoma com o número de acesso ATCC HB 8746;

(b) moléculas receptoras segregadas pelo hibridoma que imunorreage com a apoproteína B-100; e (c) um meio de cultura para o hibridoma.

Em outro aspecto, a presente invenção contempla uma composição compreendendo:

(a) o hibridoma com o número de acesso ATCC HB 8742;

Em outro aspecto, a presente invenção contempla um sis. tema de diagnóstico para determinar a quantidade de apo B-100 numa amostra de corpo compreendendo:

(a) um primeiro agente de ligação específico biologi camente activo que compreende moléculas receptoras que (i) imunorreagem com apoproteína B-100; e (ii) são moléculas receptoras segregadas pelo hi bridoma ATCC HB 8746 ou moléculas receptoras segregadas pelo hibridoma ATCC HB 8742; e (b) um segundo agente de ligação específico marcado biologicamente activo para sinalizar a imunorreacção do primeiro agente de ligação com apo B-100.

Um sorvente de afinidade de matriz sólida compreeri dido por uma matriz sólida fixada a moléculas receptoras bio logicamente activas que imunorreage com a apoproteína B-100 e são escolhidas no grupo consistindo em:

(a) moléculas receptoras segregadas pelo hibridoma

511

Ref: SCRF 72.0-EPGíll

-11HB 8746;

(b) moléculas receptoras segregadas pelo hibridoma

ATCC ΗΘ 8742; e (c) uma mistura das moléculas receptoras de (a) e (b).

A presente invenção tem vários benefícios e vantagens.

Um dos benefícios da presente invenção é o facto dos hibridomas da presente invenção poderem ser utilizados para produzirem em quantidades relativamente grandes e com qualidade adequada receptores que imunorreagem com a apo B-100.

Outro benefício da presente invenção é o facto de os receptores da presente invenção serem úteis, inter alia, para a determinação da quantidade de colesterol que contém apo B-100 numa amostra de fluído do corpo.

Uma vantagem da presente invenção é o facto de os receptores da presente invenção poderem ser utilizados em ensaios imunoabsorventes ligados a enzima para a determinação de apo B-100 em formas que não requerem procedimentos de cerj trifugação.

Outra vantagem é a de que os processos de ensaio da presente invenção podem ser completados em períodos de tempo relativamente curtos.

Outras vantagens e benefícios da presente invenção tornar-se-ão facilmente aparentes aos especialistas a partir da seguinte descrição da invenção, desenhos e reivindicaçães anexas.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é uma fotografia de uma auto-radiografia de um e_n saio de revelação de Western em que se demonstra a capacidade das moléculas receptoras MB47 e MB24 para imunorreagirem com apo B-100 e apo B-48 obtidos de chylomicrons e VLDL deslipida^ das. VLDL e os chylomicrons foram deslipidadas e submetidas a electroforese SIS gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando géis de gradiente de 3-6 por cento. Processaram-se sessenta microgramas ( ug) da proteína VLDL e 20 hg da pro-

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-12teína chylomicron em faixas alternadas do gel separando assim as proteínas de cada preparação de acordo com o seu tamanho. A visualização do padrão electroforético das bandas de proteína por coloração do gel com Coomassie Blue a 0,1 por cento revelou bandas de apo B-100 e apo B-48 em chylomicrons e VLDL. As bandas de proteínas foram em seguida fixadas por transferência electroforética para papel de nitrocelulose para forma rem um suporte sólido. Os antígenos de apoproteína fixada em suporte sólido foram em seguida imunorreagidos separadamente com moléculas receptoras MB47 e MB24 imunopurificadas. Detectaram-se as moléculas receptoras de MB47 monoclonais e MB24 monoclonais imunologicamente ligadas a um antígeno fixa, do em fase sólida utilizando Ig anti-rato de cabra marcado

125 com I e por autoradiografia.

A coluna A ilustra que a MB24 monoclonal imunorreage com apo B-100 e apo B-48 de VLDL (V) e chylomicrons (C). A coluna B ilustra que MB47 monoclonal imunorreage com apo B-100 de V e C mas não com apo B-48 de V ou C. A coluna C é um controlo negativo que mostra que um anticorpo monoclonal específico para os glóbulos vermelhos do sangue de carneiro não imunorreage com qualquer antígeno presente. A coluna D é outro controla negativo que mostra que o antisoro policlonal imunopurifiçado em fenil-beta-O-glucósido não reconhece quaisquer antígenos presentes. A coluna E é um controlo positivo que mostra que o antisoro policlonal de coelho imunopurificado contra a apoproteína LDL humana reconhece quer a apo B-100 quer a apo B-48 em V e C.

A Figura 2 é um gráfico que mostra a percentagem de lígaçôés rfe 125 partículas de LDL marcadas com I (ordenadas) por aumento das concentraçães molares de anticorpo monoclonal MB47 /abeis, sa; Ab concentração (MoAb)_7 num rádioimunoensaio de fase fluída (RIA).

Preparou-se a LDL a partir de um plasma reunido de 10 pacientes ( - - - - ) ou de um único paciente normolipi, démico (________). Obteve-se o plasma de plasmoforese de i_n divíduos apés um período acelerado de aproximadamente doze ho ras.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-13A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra □ grau de inibição pelo anticorpo MB47 (barras vazias : MB47) e LDL huma no não marcado em excesso (barras riscadas : LDL) de ligação, internalização e degradação,por fibroblastos humanos cultiva125 dos, de LDL humana- I. Fizeram-se culturas de monocamadas de fibroblastos em furos de 35 milímetros em DME contendo 10 por cento de soro de vitela fetal.

Estimularam-se os receptores LDL de fibroblastos por pré-incubação de aproximadamente 24 horas dos fibroblastos com meio de cultura contendo 2,5 miligramas por mililitro (mg/ml) I de soro reduzido em lipoproteína (LDS) (DME-LDS). Misturaram

-se DME-LDS contendo 2,5 microgramas por mililitro ( ug/ml)

125 ^z de LDL- I e 20 por cento de sobrenadante da cultura de hibridoma MB47 (v/v) ou um excesso de 200 vezes do LDL não marcado (concentração final, 500 ^g/ml) e mantiveram-se (incubaji do) durante cerca de 16 horas a 4SC antes de serem colocados nas monocamadas de fibroblastos.

A determinação da ligação, internalização, e degradação foi efectuada em triplicado, e é expressa como percentagem dos valores de controlo que foram determinados na ausência do receptor monoclonal MB47. A inibição de ligação, internalização, e degradação específica pelo receptor monoclonal MB47 era com parável à produzida por excesso de 200 vezes de LDL não marca da.

A Figura 4 contém dois gráficos que mostram a capacida de dos fragmentos Fab monovalentes do anticorpo monoclonal MB47 125 para inibir a ligação e a degradação de LDL- I por fibroblas. tos humanos. Misturaram-se e mantiveram-se (incubando) duran te um período de tempo de cerca de 15 horas a 42C antes de.se colocarem em monocamadas de fibroblastos, meios individuais contendo quantidades crescentes de fragmentos de MB47-Fab e uma quantidade constante de I-LDL (2,5 yug/ml). A concentração de Fab é expressa como proporção molar do Fab/LDL presente em cada meio (assumindo um peso molecular (PM) do Fab de 40 000 daltons e um peso molecular de apo B de 550 000 daltons).

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-14A ligação e a degradação são expressas como percentagens dos valores de controlo na ausência de fragmentos de MB47-Fab. Todas as determinações foram efectuadas em duplicado. LDL não marcado em excesso (concentração final, 500 y^g/ml) produzia mais do que 95 por cento da inibição de ligação (PainelA) Obtiveram-se re preparações diferene degradação (Painel B) de .

sultados semelhantes em três estudos com tes de Fab do receptor monoclonal MB47.

A Figura 5 contém dois gráficos

A ordena relativas enquanto a microgramas por adicionada como

Gráfico A ilustra a capacidade de uma quantidade constante, conhecida de receptores MB47 marcados com peroxidase de rábano (HRP0-MB47) para imunorreagir com um reagente apo B-100 fixado na fase sólida na presença de quantidades crescentes de moléculas receptoras MB24 da é apresentada em unidades ópticas abcissa é apresentada em unidades de de proteína de anticorpo não marcada dor ( y^g/ml).

Misturou-se de modo essencialmente simultâneo mililitro competiuma quajj tidade constante (20 dos receptores MB47 acoplados com

HRPO com quantidades crescentes de receptores MB47 não marcados (I) ou MB24 não marcados (A) e um reagente apo B-100 (LDL) fixado em fase sólida. Mantiveram-se as misturas durante 3 ho ras a 259C permitindo assim que os receptores se ligassem imu nologicamente ao reagente apo B-100 e formassem um imunorreagente de fase sólida. Determinou-se em seguida a quantidade de MB47 marcada ligada à fase sólida como no ensaio de ELISA de competição descrito na secção de Materiais e Processos.

Gráfico A ilustra que a presença de quantidades cres, centes de receptores MB47 não marcados em misturas de imunorreacção diminui correspondentemante a quantidade de receptores marcados MB47 ligados como imunorreagente da fase sólida. Aís sim, MB47 não marcado compete com MB47 marcado para LDL.

Por outro lado, □ Gráfico A ilustra também que quantidades crescentes de receptores MB24 não marcados não diminuem significativamente a quantidade de MB47 marcado, ligado como imunorrea

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-15gente de fase sólida. Assim, MB24 não marcado não compete com MB47 marcado para a ligação a LDL.

Gráfico B ilustra que se obtêm resultados semelhantes utilizando receptores MB24 marcados com HRPO e receptores MB47 não marcados. Os receptores MB47 e MB24 ligam-se assim a difje rentes epítopos que estão suficientemente separados na superfí cie de apo B-100 de modo a permitirem a ligação de ambos os re ceptores a uma única molécula de apo B-100 sem competirem,este rioquimicamente, e inibirem a ligação.

A Figura 6 contém dois gráficos. 0 Gráfico A repraseri 125 ta a ligação de MB47 marcada com I a LDL numa RIA de fase fluida. A ordenada está em unidades de fentomoles (fmol) de ligação enquanto a abcissa está em unidades de namoles (nmol) do anticorpo misturado.

Iodou-se o anticorpo monoclonal e imunopurificado MB47

125 com I utilizando a técnica de Iodogénio para uma actividade específica de 3000 contagens por minuto por nanograma (cpm/ng). Após uma diálise extensa contra uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), mais de 95 por cento da radioactividade era precipitada por uma solução a 10 por cento de ácido tricloroinc acético (TCA). Mais de 98 por cento de MB47- I ligou-se a uma coluna de LDL. Efectuaram-se ensaios em triplicado em tubos de vidro revestidos com silicone de 10x75 milímetros (mm). Ad_i

125 cionaram-se concentrações crescentes da I-MB47 em 0,lmL de tanpão de albumina de soro de bovino-barbital (BSA-barbital) (pH 8,0) a 100 ng de uma mistura de LDL humano normolipidémico diluído em 0,2 ml do tampão de BSA-barbital. Cada tubo continha 182 fmol de apo B LDL (assumindo um peso molecular de apo B de 550 000 daltons).

Após incubação (mistura a manutenção) durante um perío do de tempo de 16 horas a 4PC, a LDL foi precipitada quantitativameji ta por um antisoro de coelho reduzido em lipoproteína específico para LDL humana. /Apenas a fracção do antisoro de coelho com uma densidade (d) superior a 1,21 g/ml foi utilizada porque o anticorpo monoclonal MB47 liga a apolipoproteína B do coelho_7.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll :··'< ·, ·ΐ

-16Estudos preliminares estabeleceram uma concentração de antisoro de coelho deslipidado que precipita mais de 98 por 125 cento de 100 ng de LDL humana- I. Após adição do antisoro de coelho, incubaram-se os tubos durante cerca de 16 horas a 49C.

Removeram-se os sobrenadantes, e lavaram-se duas vezes os agregados com 2 ml de tampão barbital refrigerado com gelo (valor de pH 8,0). Determinaram-se a ligação não específica e a precipitação não específica em dois conjuntos de tubos pa^ ralelos. No primeiro conjunto, não se adicionou LDL humana à incubação inicial, mas adicionou-se a mesma quantidade de segundo anticorpo de coelho. No segundo conjunto de tubos, substituiu-se o soro de coelho não imune (d superior à fracção de 1,21 mg/ml) pelo anticorpo de soro de coelho imune.

Ambos os processos produziram valores substancialmente idênticos para a ligação não específica, que era linear com 125 concentraçães crescentes de anticorpo monoclonal I-MB47, e em todos os casos era inferior a 1 por cento do número total de contagens adicionado. Obteve-se a ligação específica de 125

I-MB47 a LDL subtraindo a ligação não específica da ligação total. Os dados da ligação foram analisados utilizando um programa de regressão linear para a análise de Scatchard de sistemas de ligandos, que produziu uma estimativa da constante de afinidade de anticorpos (Ka) e da concentração de receptor ou de epitopo.

125 valor de Ka de I-MB47 para LDL foi assim determinado, sendo 3,82x10 M . A extrapolação da linha para condiçães de excesso infinito de anticorpos produziu uma estimativa de 212 fmol (35 ng) de ¹²⁵I-MB47 ligado por 182 fmol (100 ng) de LDL quando se admite que o peso molecular de apo,B é de 550 000 daltons. Estes dados são apresentados no Gráfico B desta Figura em que a ordenada está em unidades da razão de anticorpo ligado (B) em relação a livre (F) (B/F), enquanto a abcissa está em unidades de fmol de anticorpo ligado (fmol de MB47).

A Figura 7 ilustra a correlação entre mg de LDL-coles66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-17terol por decilitro (dl) da amostra determinado por Ljpid Research Clinic Procedures, HEW Publication N2. 75-628 (NIH), 2-. ed., Wash., D.C. Gov. Print. Off. (1974), e mg de apo B-100 por dl de amostra determinada utilizando o ensaio de ELISA não competitivo descrito na secção de materiais e processos.

coeficiente de correlação r=0,89, determinado pelo teste de Correlação Spearman Rank para dados não-paramétricos /~Sokal et al., Biometry, 2§. ed., W.H. Freeman Co., São Fra.n cisco, CA, 561-616 (1981)_7, indica uma correlação significante entre os níveis de apo B-100 determinados pelo ensaio de ELISA não-competitivo aqui descrito e os níveis de colesterol LDL em 60 amostras de plasma humano.

A Fig. 8 é semelhante à Fig. 7 e ilustra uma correlação significante , r=0,92, entre os níveis de apo B-100 determina dos pelo método competitivo ELISA da presente invenção e os níveis de colesterol LDL nas mesmas 60 amostras humanas.

A Fig. 9 ilustra a correlação significante , r=0,92, determinada pelo teste de Correlação de Spearman Rank, entre os resultados obtidos usando o ensaio ELISA não-competitivo (ordenadas) e o ensaio ELISA competitivo (abcissas) nas mesmas 60 amostras humanas utilizadas nas Figs. 7 e 8.

Descrição Detalhada da Invenção

I» Discussão Geral

A. Definições termo anticorpo” refere-se a uma molécula receptora · que é um membro de uma família de proteínas glicosiladas designadas por imunoglobulinas, que podem combinar-se especificamente com um antígeno.

Um”sítio de combinação de anticorpo é a parte estrutu ral de uma molécula de anticorpo compreendida por regiões variáveis e hiper-variáveis de cadeia pesada e leve que ligam especificamente antígenos.

termo antígeno” tem sido utilizado historicamente

511

Ref: SCRF 72.0-EPGsll

-10para designar uma entidade que se liga por um anticorpo e tajn bém para designar a entidade que induz a produção do anticorpo. A utilização mais corrente limita a significação de anti. geno a entidade ligada por um anticorpo, enquanto o termo imunogene é utilizado para a entidade que induz a produção de anticorpos. Quando uma entidade aqui discutida é simultaneamente imunogénica e antigénica, ela será geralmente designa da como antígeno.

Determinante antigénico refere-se à parte estrutural real do antígeno que está imunologicamente ligada por um sítio de combinação de anticorpo. 0 termo é também utilizado permu tavelmente com epítopo.

termo biologicamente actiuo refere-se pelo menos à capacidade de se ligar especificamente o ligando ou agente de ligação específico embora possa estar presente outra capacidade geral ou efectora. 0 termo complexo aqui utilizado refere-se ao produto formado quando um agente de ligação específico se liga a um ligando alvo. Complexos exemplares são imunorreja gentes, proteína A ligada a um anticorpo e produtos semelhantes.

ELISA refere-se a um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima que utiliza um anticorpo ou antígeno ligado a uma fase sólida e um conjugado de enzima-antígeno ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de antígeno ou anticorpo presente numa amostra. Encontra-se uma descrição da técnica ELISA no Capítulo 22 da 4§. Edição de Basic and Clinicai Immunology por D.P. Sites et al., Altos, CA em 1982 e Patentes U.S. N°. 3 654 090; N°. 3 Θ50 752; e N2. 4 016 043, que estão todos aqui incorporados por referência.

Enzima refere-se a uma proteína susceptível de^acele rar ou produzir por acção catalítica alguma alteração num substrato para a qual é frequentemente específica.

Epitopo refere-se à parte da molécula que é específi camente reconhecida por um sítio de combinação de anticorpo, z

E também referida como determinante ou determinante antigénico.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG;ll

-19Idiótopos ou determinantes idiotipicos são determinantes antigénicos nas pressães variáveis e hipervariáveis de uma molécula anticorpo que pode ser reconhecida por um siΛ tio de combinação de outros anticorpos. Os idiotopos são habitualmente divididos em dois tipos, os que são determinantes associados a sítios de ligação e os que não são associados a sítios de ligação. A colecção de idiotopos numa molécula de anticorpo constitui o seu idiotipo. Crê-se que um sítio de combinação de anticorpo produzido por um hibridoma possui um simples e único conjunto ds idiotopos, isto é, um único idiotipo de sítio de combinação de anticorpo.

Imunorreagente aqui utilizado refere-se ao produto de uma reacção imunológicaí isto é, é a entidade produzida quando um ligando se liga imunologicamente por uma molécula receptora. Um imunorreagente é um tipo particular de complexo .

termo isolado aqui usado em relação a moléculas receptoras significa que essencialmente apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo está presente.

termo meios de marcação, grupo indicador ou marcador são utilizados permutavelmente aqui para incluírem áto mos simples e moléculas que são directamente ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicarem a presença de um imunorreagente. Qualquer meio de marcação pode ser ligado ou incorporado num receptor ou usado sepa radamente, e os átomos ou moléculas podem ser usados isoladamente ou em ligação com outros reagentes adicionais. Esses grupos indicadores ou marcadores são eles próprios conhecidos na imunoquímica e constituem uma parte da presente invenção apenas por serem utilizados com outros receptores, processos e/ou sistemas novos.

Ligando refere-se a uma molécula que contém uma parte estrutural que está ligada a um receptor específico, por exem pio, um antígeno que está ligado por um receptor.

termo receptor é aqui utilizado para indicar uma

511

Ref: 5CRF 72.0-EPG:ll

-20molécula biologicamente activa que se liga imunologicamente a (ou com) um antígeno. Essa ligação ocorre tipicamente com uma afinidade de cerca de 10^ a cerca de ΙΟ^θ litros/mole (M^-1)e é uma interacção especifica do epitopo do antígeno com o sítio de combinação do anticorpo do receptor.

Uma molécula receptora da presente invenção é qualquer anticorpo intacto, anticorpo substancialmente intacto ou porção de polipéptido contendo um idiotipo de sítio de combinação de um anticorpo (por exemplo um fragmento Fab) como por exemplo um fluído ascítico ou um sobrenadante de uma cultura de tecidos.

D termo receptor é também aqui utilizado para molécju las na superfície de células que se ligam a outras moléculas. Os receptores de superfícies de células são sempre aqui designados com o nome da entidade ligada apús o termo receptor para evitar qualquer ambiguidade. Um receptor de superfície de célula exemplar é o receptor LDL previamente descrito.

A actividade biológica de uma molécula receptora é ev,i denciada pela reacção imunológica do receptor com o seu ligar» do antigénico após a sua mistura num meio aquoso para formarem um imunorreagente, pelo menos a valores de pH e forças ió nicas fisiológicos. De preferência, a actividade biológica ocorre em condiçães de ensaio biológico, isto é, nas condiçães em que moléculas receptoras da presente invenção se ligam ao ligando antigénico numa gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, para forças iónicas como as de água destilada até cerca da do cloreto de sódio 1 molar e a temperaturas de cerca de 4SC a cerca de 459C. Todas as moléculas receptoras aqui descritas eram biologicamente activas.

As porçSes de polipéptido contendo idiótipos de sítio de combinação de anticorpo (sítios de combinação de anticorpos), de anticorpos são as porçães de moléculas de anticorpos que contêm idiotopos de sítio de combinação e que se ligam ao ligando, e incluem as porçães Fab, Fab', Fíab'^ e F(v) dos anticorpos. As porçães Fab e Fíab'^ dos anticorpos são bem

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-21conhecidas da técnica e são preparadas pela reacção proteolítica da papaina e pepsina, respectivamente, em anticorpos substancialmente intactos por processos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo Patente U.S. Νδ. 4 342 566 de Theofilp, polus e Dixon. As porções de anticorpos F(ab') são também bem conhecidas e são produzidas das porções FÍab'^ seguido da redução das ligações de dissulfureto ligando as duas porções de cadeias pesadas com mercaptoetanol e em seguida alquilação do mercaptano de proteína resultante com reagente como por exemplo iodoacetamida. Preferem-se anticorpos intactos, e juntamente com as porções Fab são utilizados como ilustrativos das moléculas receptoras monoclonais da presente invenção.

Os termos segregar e produzir são frequentemente utilizados interpermutavelmente na técnica para células a pa_r tir das quais se obtêm moléculas de anticorpo. As células que produzem anticorpos podem, contudo, não segregarem essas moléculas no seu ambiente. As células de hibridoma de interesse nesta invenção segregam anticorpos monoclonais no seu ambiente. Contudo, essas células são muitas vezes aqui referidas como células produtoras de anticorpos, e os seus anticorpos são referidos como sendo produzidos para coerência com a frase utilizada na técnica.

termo agente de ligação específica aqui utilizado refere-se a uma entidade molecular susceptível de se ligar s.e lectivamente a um ligando. Exemplos de agentes de ligação es, pecíficos são os receptores, fragmentos complemento, proteína A e produtos semelhantes.

A frase substancialmente puro aqui utilizada em rela ção a moléculas receptoras significa que, dentro dos limites detectáveis, apenas uma espécie de um sítio de combinação de anticorpo está presente como agente de ligação específico para apo B-100. Assim, embora uma preparaçSo de molécula receptora substanci almente pura possa conter mais do que uma espécie dum sítio de combinação de anticorpos, essa preparação apresenta uma afinidade de ligação simples para apo B-100. Por exemplo, os sobrenadantes da cultura de tecidos produzidos pelo hibridoma da presente invenção contêm tipicamente proteínas de mieloma

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-22bem como receptores da presente invenção. Uma molécula recepto. ra em forma substancialmente pura é tipicamente designada como anticorpo monoclonal pelos especialistas porque essas comp£ siçães são produzidas utilizando culturas de hibridoma monoclo nais.

A frase substancialmente simultânea aqui utilizada em relação à mistura de 3 ou mais componentes antígenos e recept£ res para formar uma mistura de imunorreacção significa que to dos os componentes estão presentes e se misturam numa mistura simples num período de 15 minutos e preferivelmente num perío do de cerca de 5 minutos da mistura de quaisquer dois dos com ponentes.

B, Hibridomas e Receptores Monoclonais

A presente invenção contempla um hibridoma possuindo a designação laboratorial de HL130C2.3C5, que produz moléculas receptoras que:

(a) imunorreagem com um determinante antigénico conservado em apoproteína B-100;

(b) inibem competitivamente a ligação da apoproteína B-100 ao receptor LDL; e (c) têm uma constante de afinidade para LDL de cerca

-1 de 3,82x10 M num radioimunoensaio de equilíbrio competitivo em fase fluída (RIA). Estas moléculas receptoras são habitualmente referidas como MB47.

A presente invenção também contempla um hibridoma, pos. suindo a designação laboratorial de 1/82A6.1G4, que produz moléculas receptoras que imunorreagem com um determinante antigénico de apoproteína B-100 e têm uma constante de afinidade

-1 para LDL de cerca de 3,0x10 M num ensaio de equilíbrio competitivo de fase sólida RIA. Estas moléculas receptoras são habitualmente referidas como MB24.

Os hibridomas HL130C2.3C5 e V82A6.1G4 foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD em 6 de Março de 1985 com os seguintes números de acesso ATCC:

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-23Hibridoma

U82A6.1G4

HL130C2.3C5

Receptor (Designação)

MB24

MB47

NQ. Acesso ATCC

HB 8742

HB 8746

Os depósitos ATCC acima referidos foram efectuados de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure.

Os hibridomas da presente invenção foram obtidos fundindo uma célula produtora de anticorpos e uma linha de células de mieloma. Essas células produtoras de receptores foram em primeiro lugar descritas por Kohler e Milstein, Nature, 256 495 (1975), cuja descrição é aqui incorporada por referên cia. Os receptores são tipicamente obtidos a partir dos sobrenadantes de culturas de células de hibridoma, de preferência culturas de células monoclonais ou, alternativamente, a partir de fluído ascítico ou de outros fluidos do corpo obtidos de animais de sangue quente hospedeiros não humanos, de preferência os que são histocompatíveis ou imunocomprometidos em que se introduziram e cultivaram células de hibridoma.

Assim, noutra concretização a presente invenção contempla uma cultura de células compreendendo (a) um hibridoma da presente invenção; (b) moléculas receptoras que são segregadas pelo hibridoma que imunorreage com apoproteína B-100; e (c) um meio de cultura para o hibridoma. Os meios úteis pa. . ra a preparação destas composiçães são ambos bem conhecidos da técnica e estão comercialmente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticos, ratos de raça purç. e semelhantes^ Um meio sintético exemplar é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DNEM, Dulbecco et al., Virol. 8, 396 (1959) suplementado com 4,5 mg/1 de glicose, 20 ml de glutamina e 20% de soro de vite la fetal. Uma estirpe de rato de raça pura exemplar é Balb/c.

Noutra concretização, a presente invenção contempla os

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll >

«

-24receptores designados por MB47 e MB24 que são produzidos pelos hibridomas designados por HB 8746 e HB 8742 respectivamente, e que imunorreagem com a apoproteína B-100. Assim, pode preparar-se um receptor da presente invenção cultivando num meio adequado um hibridoma adequado da presente invenção e recuperando o receptor do meio.

Anteriormente, Curtiss et al., J. Biol, Chem., 257, 15213 (1982), referiram a produção e caracterização de 11 moléculas receptoras de apo B específicas, incluindo as designadas por MB24 produzidas pelo hibridoma HB 8742. ObtevB-se o hibridoI ma HB8742, como descrito em maior detalhe na Secção de Materi ais e Métodos, fundindo esplenócitos de rato imunizados com VLDL humano.

Caracterizou-se a fracção IgG do fluido ascítico contendo MB24 do crescimento intraperitoneal de HB8742 por focagem isoeléctrica (IEF). Tal como referido por Curtiss et al., supra, a fusão foi efectuada com células de mieloma P3x63Ag8 que segregam imunoglobulina IgG^k. Assim, após IEF, o fluído ascítico de HB8742 demonstrava um único padrão de bandas de proteína múltiplas representando moléculas de imunoglobulina cori tendo cadeias leves e pesadas misturadas ao acaso em adição ao anticorpo IgGqk do mieloma P3x63Ag8 e ao receptor MB24.

) 0 hibridoma HB 8746 produz moléculas receptoras MB47 e foi obtido fundindo esplenócitos de ratos imunizados com LDL e células de mieloma P3x63Ag8.653.1. Esta variedade de mielg ma parente não segrega uma proteína de mieloma. IEF do fluído ascítico de HB 8746 revela um padrão único de bandas de proteína representando as cadeias pesadas de IgG2a e leves ”kappa. Assim, os hibridomas da presente invenção podem ser c.aracterizados em parte pelo padrão IEF das moléculas receptoras que eles produzem.

Embora o hibridoma V82A6.1G4 da presente invenção produza mais do que um tipo de moléculas receptoras, as moléculas receptoras da presente invenção podem ser facilmente identificadas e isoladas pelas suas capacidades individuais para imunorreagirem com determinantes antigénicos de apo B-100.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-25Examinaram-se as especificidades antigénicas de MB24 e MB47 por determinação das suas capacidades individuais para imunoj? reagirem com apoproteínas obtidas de chylomicronsF, VLDL, LDL e HDL no ensaio de coloração de Western descrito a seguir.

Os dados assim obtidos indicavam que MB47 e MB24 imunor, reagiam com apo B-100 obtida de LDL, VLDL e'tehylomicronsP mas não com apo B-48 de VLDL e chylomicronsF. A capacidade de MB47 e MB24 para imunorreagirem individualmente com apo B-100 de 'bhylomicrons e VLDL é apresentada na Figura 1.

1. Caracterização do Determinante Antigénico de Apo B-100 Ligado Imunologicamente por MB47

Estudos anteriores demonstraram a heterogeneidade anti. génica em apo B-100. Isto é, alguns epitopos de apo B-100 não são expressos por todas as partículas de LDL. Assim, a mistu ra com um excesso de certos anticorpos monoclonais numa RIA de fase fluída não resulta na ligação imunológica de todas as 125 partículas de LDL( I-LDL) radiomarcadas.

Para determinar se o epítopo reconhecido pelas moléculas receptoras MB47 era uniformemente expresso por todas as LDL, estudou-se a capacidade de MB47 de se ligar imunologica125 mente a I-LDL numa RIA de fase fluída. LDL isolada a partir de plasma reunido de 10 indivíduos no raiais e de plasma de un único indivíduo normal foram radiomarcadas como a seguir descrito e foram misturadas com moléculas receptoras de MB47 biologicamente activas pa ra formarem uma mistura de imunorreacção. A mistura foi manti da em condiçães de ensaio biológico durante um período prede-, terminado suficiente para que as moléculas receptoras de MB47 se ligassem imunologicamente a apo B em cada amostra e forma£ sem um produto de imunorreacção (imunorreagente).

125

A quantidade máxima de I-LDL ligada por um excesso de moléculas receptorasde MB47 foi determinada por precipitação de todas as moléculas receptoras com IgSORB (The Enzyme Co., Boston, MA) e a quantificação de contagens associadas de 125

I-LDL no precipitado num contador de raios-gama. Os resul

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

—26—

125 tados, expressos com percentagem de I-LDL precipitada por ácido tricloroacético (TCA) e apresentado na Figura 2, demons 125 tramque essencialmente toda I-LDL estava ligada por anticorpos indicando que o epítopo reconhecido e ligado pela NB47 é expresso por todas as partículas de LDL.

2. Inibição Competitiva da Ljgagão de flpo B-100 a receptor de LDL por MB47

A apoproteína B-100 é a apoproteína principal em LDL de seres humanos e de outros mamíferos, e ela medeia a ligação de LDL ao receptor de fibroblastos de LDL. Ensaios prévios esclareceram o papel central do receptor LDL no metabolismo de lipoproteínas de mamíferos. 0 facto de partículas de LDL isoladas de muitas espécies animais se ligarem especificamente no domínio do sítio de ligação de receptores de LDL humanos, o sítio de ligação da molécula de apo B-100 deve ser coj} servado em evolução e assim expresso por partículas de LDL de todas as espécies de animais.

Para examinar se as moléculas receptoras MB47 imunorreagem com um determinante antigénico localizado dentro do d_o mínio de ligação de receptores LDL de apo B-100 humana, detej?

125 minou-se a capacidade de MB47 de inibirem a ligação de I-LDL ao receptor de LDL celular. Isto foi realizado misturaji do moléculas receptoras MB47, na forma de moléculas de anti125 corpo globais com I-LDL para formar uma mistura de imunorreacção. A mistura de imunorreacção foi em seguida mantida em condições de ensaio biológico durante um período pré-dete_r minado de tempo suficiente para que as moléculas receptoras

125 de MB47 se ligassem imunologicamente ao I-LDL presente e formassem um imunorreagente.

Subsequentemente, depositou-se a mistura de imunorreaç. ção contendo imunorreagente em fibroblastos humanos que expres. sam receptores de LDL de fibroblastos. Mantiveram-se a seguir as culturas durante um período pré-determinado de tempo suficiente para que os receptores de fibroblastos LDL se ligassem especificamente a quaisquer sítios de ligação de receptores

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll y; .,_f.·'

-27125

LDL disponíveis no produto de imunorreacção I-LDL-MB47. Presume-se que essa interacção celular receptor-LDL é inibida se as moléculas receptoras como exemplificado por MB47 imunoj? reagirem com um determinante antigénico apo B-100 cuja estrutura é também envolvida na ligação de LDL-receptor.

Os resultados deste estudo, apresentados na Fig. 3 indicam que as moléculas receptoras MB47 inibem a ligação, internalização e degradação mediada por receptor celular de 12 5

I-LDL humana por fihróblastos humanos numa extensão comparável com a produzida por um excesso de 200 vezes de LDL não marcada.

Para examinar a possibilidade de os receptores MB47 se ligarem a um epítopo adjacente ao domínio receptor de apo B, e devido ao seu tamanho impedir estereoguimicamente a liga ção de apo B ao receptor LDL, estudou-se também a capacidade dos fragmentos Fab de moléculas de anticorpo MB 4 7 para inibirem a aborpção de LDL humana e a degradação no ensaio de fibroblastos acima descrito.

Como se mostra na Fig. 4, os fragmentos de MB47-Fab bloqueavam significativamente a ligação e a degradação celular específica de LDL. Dado que os fragmentos de MB47 Fab são substancialmente mais pequenos do que as moléculas de anticorpo intacto MB47 crê-se que o epitopo reconhecido pelo sítio de comuinação de anticorpo MB47 está contido dentro do domínio de ligação do receptor LDL em LDL apo B-100. 0 anticorpo

MB24 não tem as propriedades do anticorpo MB47 e não inibe a 125 ligação e degradação de I-LDL de fibroblastos cultivados.

3. Inibição Esteréoquimica

Para algumas concretizaçães do processo de ensaio da presente invenção o primeiro e segundo receptores devem ligajr -se a diferentes epítopos da molécula de apo B-100, e esses epitopos devem ser suficientemente separados de modo a que a ligação de um receptor não iniba estereoqhmicameite a ligação do outro receptor. Examinou-se em seguida a capacidade de MB47 e MB24 para inibirem competitivamente a ligação imunolégica de

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

X/’·-28cada um à apo B-100 reagente fixada em fase sólida.

Os resultados deste estudo, mostrados na Fig. 5, indicam que um excesso de 70 vezes de MB24 não marcada não inibia significativamente a MB47 marcada com peroxidase de se ligar à apo B-100 reagente. De modo semelhante, um excesso de 70 vezes de MB47 não marcada não inibia significativamente MB24 marcada com peroxidase de se ligar à apo B-100 reagente. As. sim, MB24 e MB47 ligam-se a diferentes epítopos em apo B-100 e esses epítopos são suficientemente separados de modo a que MB24 e MB47 como anticorpos intactos não inibam a ligação de cada um,a uma molécula de apo B-100 simples.

4. Estequiometria e Afinidade da Ligação de MB47 a

Apo B-100

Para determinar o número de sítios determinantes antigénicos por molécula de apo B-100 em LDL que foram reconhecidas por moléculas receptoras de MB47, utilizou-se um ensaio RIA marcado com anticorpo. Neste ensaio, purificaram-se (iso. laram-se) moléculas receptoras MB47 de fluido ascítico, e fo125 ram radiomarcadas ( I-MB47) por processos bem conhecidos que são descritos com maior detalhe na secção de Processos e Mate riais.

Como se mostra na Fig. 6A, quantidades crescentes de

125

I-MB47 foram misturadas com uma quantidade fixa de apo B-100 na forma de LDL em misturas reaccionais separadas. Mantiveram-se as misturas em condiçães de ensaio biológico duraji te um período pré-determinado de tempo suficiente para que as 125 moléculas receptoras de I-MB47 se ligassem imunologicamente a apo B-100 (LDL) e formassem um imunorreagente. A preseri ça do imunorreagente foi em seguida determinada precipitando quantitativamente a LDL (ligada e livre) utilizando um anti-soro de coelho específico para LDL humana e determinando a 125 quantidade I-MB47 presente como imunorreagente por contagem gama.

A ligação imunológica específica de moléculas recepto-

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-29125 ras I-MB47 era saturável como se mostra na Fig. 6A. Além disso, um gráfico de Scatchard dos dados de ligação obtidos nestes estudos era linear (Fig. 6B), sugerindo uniformidade de sítios de ligação de MB47 em partículas de LDL.

Em adição, a constante de afinidade aparente (Ka) de MB47 para apo B-100 humana na forma de LDL como determinado pelo ensaio RIA marcado com anticorpo, verificou-se ser de

-1

3,82x10 M . A análise de Scatchard também revelou que um

125 máximo de 212 fmoles de anticorpo I-MB47 se ligava a 182 fmoles de LDL, indicando que apenas uma molécula de MB47 se liga a cada molécula de apo B-100. Isto é, MB47 liga-se a um simples e único determinante antigénico em apo B-100.

A constante de afinidade média de MB47 para apo B-100 foi também determinada num ensaio RIA marcado com um antígeno, acima descrito. Neste ensaio RIA de fase fluída de equilíbrio competitivo, a apo B-100 não marcada presente como LDL produ125 zia a deslocação total de I-LDL. A constante de afinidade calculada das moléculas receptoras MB47 presentes sob a forma de anticorpo intacto global para LDL, neste ensaio era de 4x10 M , que estava em boa correlação com o valor de Ka determinado pelo ensaio marcado pelo anticorpo acima descrito.

C. Processo de Ensaio

As moléculas receptoras da presente invenção são parti, cularmente úteis para determinar a presença e quantidade de apoproteína B-100 numa amostra de fluído do corpo, como por exemplo sangue, soro ou plasma.

Numa concretização a presente invenção contempla um processo para ensaiar uma amostra de corpo para a determinação de quantidade de apoproteína B-100 compreendendo os^seguintes passos:

(a) Partir-se de uma amostra de corpo a ensaiar. Tipicamente essa amostra é obtida como uma quantidade medida ou quantidade conhecida de sangue e mais preferivelmente de pias, ma ou soro. Os processos para obter amostras de sangue, pias, ma e de soro são bem conhecidos da técnica e não são aqui dis

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll <ví^: '·>-'•JJiW’

cutidos mais.

(b) Arranjarem-se moléculas receptoras em forma biolo gicamente activa que (i) imunorreagem com apoproteína B-100 (ii) são segregadas pelo hibridoma com o número de acesso ATCC HB Θ746 ou hibridoma com o número de acesso ATCC HB Θ742, e presente numa quantidade eficaz para efectuar o ensaio.

Nas realizações preferidas o receptor é um anticorpo intacto ou um fragmento Fab.

A quantidade eficaz de moléculas receptoras pode diferir, inter alia, com o processo de ensaio particular utilizado como se sabe bem. E também bem conhecido a facilidade com que a quantidade eficaz pode ser determinada utilizando técn_i cas laboratoriais convencionais pelo especialista.

(c) Misturar-se a amostra de fluído do corpo com as moléculas receptoras do passo (b) para formar uma mistura de imunorreacção.

(d) Manter-se a mistura em condições de ensaio biológico durante um período pré-determinado de tempo entre alguns minutos e algumas horas como por exemplo cerca de 10 minutos em condições de ensaio biológico durante um período pré-detejç minado de tempo de cerca de 16-20 horas que é suficiente para que os sítios de combinação de anticorpo das moléculas recepto ras se liguem imunologicamente à apoproteína B-100 na amostra . do corpo e formem um imunorreagente (13. complexo). As condi ções de ensaio biológico são aquelas que mantêm a actividade biológica das moléculas receptoras da presente invenção^e inç lui uma gama de temperaturas entre cerca de 49C a cerca de 453C, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9 e uma força iónica variando entre a da água destilada e a de cloreto de sódio cerca de 1 molar. Os métodos para optimizar essas condições são bem conhecidos da técnica.

511

Ref: SCRF 72.O-EPG:11

(e) Determinar-se a quantidade de qualquer imunorreagente formado e portanto a quantidade de apo B-100 presente na referida amostra.

Nas concretizações preferidas, a amostra de fluído do corpo do passo (a) é ainda preparada para ensaio de acordo com o passo (e) através dos seguintes passos:

(f) Obterem-se segundas moléculas receptoras biolo. gicamente activas segregadas pelo remanescente de quaLquer dos hibridomas do passo (b);

(g) Misturar-se uma quantidade pré-determinada das s_e gundas moléculas receptoras com a amostra de fluído do corpo para formar uma mistura de imunorreacção.

(h) Manter-se a mistura de segundo receptor/amostra de fluído do corpo assim obtida de modo semelhante ao descrito no passo (d) para formar um imunorreagente de sandui che (segundo complexo) que contém uma molécula de MB47 e uma molécula de MB24 imunologicamente ligadas a uma molécula de apo B-100.

Os métodos de ensaio gerais acima descritos podem ser realizados, como se sabe bem da técnica, utilizando vários formatos diferentes. Assim, enquanto os processos de ensaio mais específicos a seguir descritos usam formatos de fase sólida, a invenção não se limita a esses.

Os formatos de ensaio de fase sólida podem ser realizai dos utilizando ou moléculas receptoras ou antígeno fixado a uma matriz sólida para formar um suporte sólido. Nessas concretizações, em que o suporte sólido contém o receptor do pas. so (b), a mistura do passo (c) é uma mistura de fase sólida/ /líquida e o imunorreagente do passo (d) é um imunorreagente de face solida contendo apo B-100 da amostra de corpo.

Nessas concretizações em que o suporte sólido contêm apo B-100 reagente, a mistura do passo (c) é também uma mistu ra sólido/líquido mas o imunorreagente contendo apo B-100 da amostra de corpo do passo (d) é um imunorreagente de fase lí-

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-32quida. A apo B-100 reagente é biologicamente activa; isto é, apo B-100 antigénico que é fornecido por uma fonte diferente da que se está a investigar, tipicamente na forma de LDL isolada.

Pode conseguir-se a determinação da quantidade de apo B-100 ligada como imunorreagente no passo (d) directa ou indi. rectamente, por técnicas de ensaio bem conhecidas. Por exemplo, podem usar-se sistemas de aisaio homogéneos como os descritos nas Pateri tes U.S. 4 536 479; N9. 4 233 401; N9. 4 233 402 e N9.

996 345 que são todas aqui incorporadas por referência.

Em concretizações de fase sólida preferidas, o fluído do corpo è ainda preparado para ensaio, utilizando um agentB de ligação específico marcado. 0 tipo e a especificidade do agente de ligação específico marcado depende, como se sabe bem da técnica, do processo e do formato utilizado.

Nas concretizações de fase sólida preferidas em que o suporte sólido contém um receptor do passo (b), isto é um receptor desta invenção, a quantidade de apo B-100 ligada à fase sólida é preparada para ensaio através dos seguintes passos:

(i) Proporcionarem-se segundas moléculas receptoras marcadas, biologicamente activas que se ligam à apoproteína B-100 presente na amostra do corpo para formar um imunorreagente. A marca do segundo receptor marcado é susceptível de assinalar a presença do segundo receptor marcado num imunorreagente.

Nas realizações particularmente preferidas, as segundas moléculas receptoras marcadas imunorreagem com um segundo epítopo apoB-iOOqueé diferente do epitopo com o qual as molécu las receptoras de fase sólida reagem e não inibe substancialmente as moléculas receptoras de fase sólida de reagirem com apo B-100. De preferência, as segundas moléculas receptoras marcadas são as segregadas pelo restante de um dos hibridomas do passo (b), isto é as moléculas receptoras referidas não escolhidas como primeiras moléculas receptoras.

Os processos para determinar se uma molécula receptora inibirá (interferirá com) a ligação imunológica ao mesmo anti geno de outra molécula receptora são bem conhecidos da técnica e são descritos com maior detalhe a seguir.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

(j) Misturar-se uma quantidade pré-determinada das sje gundas moléculas receptoras marcadas com a amostra do fluído do corpo para se obter uma mistura de imunorreacção.

A mistura assim obtida pode ser uma mistura líquida tal como quando se efectua o passo (i) antes do passo (b) anteriormente referidos, ou pode ser uma mistura sélido/líquido quando o segundo receptor marcado é misturado de modo substa_n cialmente simultâneo com ou após o passo (b). Quando se efeç. tua o passo (i) antes ou substancialmente simultâneo com o pa£ so (b), as segundas moléculas receptoras marcadas imunorreagem com um segundo epítopo de apo B-100 que é diferente do epítopo com o qual as moléculas receptoras de fase sólida reagem e que não inibem substancialmente as moléculas receptoras ligadas a fase sólida de imunorreagirem com apo B-100,

Nas concretizações preferidas o passo (i) é realizado substancialmente em simultâneo com o passo (b) ou apos o passo (c).

(k) A mistura do segundo receptor marcado/amostra de fluído do corpo assim obtida é mantida de modo semelhante ao descrito no passo (d) para formar um imunorreagente.

As moléculas receptoras ligadas à fase sólida e as segundas moléculas receptoras são assim imunologicamente ligadas à apo B-100 presente na amostra de fluído do corpo formando as. sim um imunorreagente do tipo sanduíche ligado a fase sólida que contém uma ligação marcada como sua parte integrante. Isto é, forma-se um imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida que contém uma marca quando uma molécula de apo B-100 imunor- . reage com uma molécula receptora ligada a fase sólida e uma se. gunda molécula receptora marcada. Nas concretizações preferi, das, quaisquer segundas moléculas receptoras marcadas que não formam parte do imunorreagente ligado à fase sólida (isto é, as não imunologicamente ligadas a apo B-100 que está ela própria ligada às moléculas receptoras de fase sólida) são separadas do imunorreagente, preferivelmente por lavagem, antes de determinar a quantidade do segundo receptor marcado preseji te como imunorreagente.

>

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-34A determinação da quantidade de imunorreagente formado de acordo com o passo (e) é efectuada determinando a quantidja de do segundo receptor marcado ligado como parte do imunorrea. gente que contém apo B-100. Isto fornece um processo de ensaio directo para a determinação da quantidade de apo B-100 na amostra. Essa quantidade pode ser zero, indicando assim que não está presente qualquer apo B-100 na amostra, dentro dos limites que podem ser detectados. Os processos para determinar a quantidade de um segundo receptor marcado dependem do marcador utilizado, sendo esses marcadores e processos de | ensaio bem conhecidos da técnica.

Nas concretizações de fase sólida preferidas em que o suporte sólido contém apo B-100 reagente, a quantidade de in.unorreagente formado no passo (d) é preparado ensaiando segundo os passos seguintes:

(l) Misturar-se um agenteligante específico,marcado,biologicanerie activo, preferivelmente uma molécula receptora, que se liga a quaisquer moléculas receptoras utilizadas no passo (b) presentes como imunorreagente de fase sólida para formar um complexo, preferivelmente um segundo imunorreagente. A marcação do agente de ligação específico marcado é susceptível de ass^i nalar a presença do agente de ligação específico marcado num | complexo. Nas concretizações preferidas deste tipo de ensaio, efectuam-se os passos (i) - (k) após o passo (d).

(m) Misturar-se uma quantidade pré-determinada do agej7 te de ligação específico marcado com a amostra de fluído de corpo para formar uma mistura de reacção, preferivelmente imu norreacção.

(η) A mistura de agente de ligação específico ’ marcado/primeiro imunorreagente assim obtida é mantida ds modo semelhante ao descrito no passo (d) para formar um complexo.

complexo de fase sólida assim formado contém uma liga ção marcada como sua parte integrante. Nas concretizações pre feridas, qualquer agente ligante específico marcado, não liga ) 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll í

-35exo de fase sólida.é separado do compledo, como parte do compl xo, preferivelmente por lavagem, antes de determinar a preseri ça de um marcador ligado a fase sólida.

A determinação da quantidade de imunorreagente formado de acordo com o passo (e) é conseguida determinando a quantidade de marcador presente como parte do complexo. Este facto dá origem a um processo de ensaio indirecto para a determinação da quantidade de apo B-100 presente na amostra.

A marcação de antigenos proteicos e agentes de ligação específicos é bem conhecida da técnica. Por exemplo, os receptores produzidos por hibridomas podem ser marcados por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radio-ásótopos fornecidos como componentes num meio de cultura de tecidos. Ver por exemplo Galfrè et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981).

As técnicas de conjugação ou de acoplamento de proteína através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis e resultam na marcação ser covalentemente ligada ao an tígeno ou ao agente de ligação específica. Ver, por exemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol, Vol. 8 Suppl 7, 7-23 (1978) e Patejn te U.S. NS. 4 493 795 que é aqui incorporada por referência. Em adição, a reacção de acoplamento dirigida a sítios pode ser efectuada de modo a que a marcação não interfira substanci almente com a actividade biológica de um antígeno ou receptor, por exemplo Rodwell et al., Biotech. 3, 889-894 (1985).

Os meios de marcação podem ser um agente de marcação fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou antígenos sem os desnaturar para formar um fluorocromo (corante) que é um traçador imunofluorescente útil. Os agentes marcadçj res imunofluorescentes úteis são fluorocromos como por exemplo isocianato de fluorosceína (FIC), isotiocianato de fluoros. ceína (FITC), cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lissami na, rodamina 8200 cloreto de sulfonilo (RB 200 SC) e semelhan tes. E feita uma descrição de técnicas de análise por imunofluorescência em DeLuca, Immunofluorescence Analysis em Antibody As A Tool, Marchalonis et al., eds. J. Wiley & Sons,

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-36Ltd., p. 189-231, 1982, que aqui se incorpora por referência.

Nas concretizações preferidas, o grupo indicador é uma enzima como por exemplo peroxidase de rábano (HRPO), glicose oxidase ou produtos semelhantes. Quando o grupo indicador principal é uma enzima como por exemplo HRPO ou glicose oxida, se, são necessários reagentes adicionais para visualizar o fajç to de se ter formado um complexo de receptor-ligando (imunorreagente). Esses reagentes adicionais para HRPO incluem peró xido de hidrogénio e um percursor de corante de oxidação como por exemplo diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com a glicose oxidase é o ácido 2,2’-azino-di-( 3-etil-benztiazoli, no-G-sulfónico) (ABST).

Os elementos radioactivos são também agentes de marcação úteis e são aqui ilustrativamente utilizados.

Um agente radiomarcador é por exemplo um elemento radio activo que emite raios gama. Os elementos que emitem raios ga . 124, 125, 128, 131, 132, 51_r ma como por exemplo I, I, I, I, Ie Cr repre, sentam uma classe de elementos radioactivos emissores de raios gama como grupos indicadores. E particularmente preferido 125

I. Outro grupo de indicadores úteis são os elementos como , 11 r* 18r- 15n 13,1 . . , . .

por exemplo C, F, 0 e N que emitem eles próprios pos_i trões. Os positrões emitidos produzem raios gama apús choques 9 com electrões presentes no corpo do animal. E também útil um emissor beta como por exemplo mfndio.

Os métodos e sistema de ensaio da presente invenção pci dem assim utilizar ou serem compreendidos por um receptor da presente invenção fixado numa matriz sólida para formar um su, porte sólido.

antígeno ou receptor está tipicamente fixado à matriz sólida por adsorpção de um meio aquoso embora se possam utili. zar vários modos de adsorpção, bem como outros modos de fixação, bem conhecidos dos especialistas. São exemplos desses modos a reacção do receptor ou antígeno com a função carboxilo reactiva produzida por reacção do brometo de cianogénio com matrizes contendo glicose como por exemplo dextrose ou ce66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-37lulose reticulada, glutaraldeido, um ligante como a seguir discutido em ligação com partículas de látex e semelhantes.

As matrizes sólidas úteis são bem conhecidas da técnica. Esses materiais incluem o dextrano reticulado disponível com marca comercial Ssphadex de Pharmacia Fine Chemicals (Piscatauiay, NJ); agarosej pérolas de poliestireno com cerca de 1 ^m a cerca de 5 mm de diâmetro disponíveis de Abbott Laboratories de North Chicago IL, poli(cloreto de vinilo), po, liestireno, telas à base de poliacrilamida, nitrocelulose ou nilão reticulado, como por exemplo, folhas, tiras ou almofa das; ou -tubos, placas ou furos de uma placa de microtitulação como por exemplo os produzidos em poliestireno ou poli(cloreto de vinilo).

As partículas de látex úteis em ensaios de tipo aglutinação são também matrizes sólidas úteis. Esses materiais são fornecidos pela Japan Syntetic Rubber Company of Tokyo, Japão e são descritas como partículas com funções carboxilo dispersas num sabão aniónico. Lotes típicos de tais partículas têm um diâmetro médio de 0,038 micron Çum), e têm uma distribuição de grupos funcionais carboxilo média de cerca de 15 a cejr ca de 30 Angstroms quadrados por grupo carboxilo.

Antes do uso, fazem-se reagir as partículas com uma diamina como por exemplo 1,3-diamino-2-propanol para se obterem várias ligações amida com os grupos carboxilo das partícu las mantendo entretanto grupos aminos livres. Os aminos livres são em seguida feitos reagir com um dialdeído como por exemplo glutaraldeido e o receptor ou antígeno para formar produtos de reacção de base de Schiff. Os produtos de reacção de base de Schiff são em seguida reduzidos com um redutor solúvel em água como por exemplo boro-hidreto de sédio p_zara se obter um suporte sólido útil.

Os especialistas compreenderão que existem muitos processos de imunoensaios de fase sólida que podem ser aqui utili. zados. Por exemplo, ensaios de fase sólida úteis incluem técni cas de imunoensaio múltiplo de enzima (EMIT) e imunoensaios de

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-38fluorescência (FIA), em adição aos especificamente discutidos RIA e ELISA. Contudo, qualquer processo que resulte numa reac_ çãc detectável de apoproteína 8-100 com moléculas receptoras da presente invenção é considerado parte da presente invenção. Cada um desses processos de ensaio pode utilizar técnicas de anticorpos simples ou duplos nos quais se utilizam meios indj. cadores para assinalar a imunorreacção, e assim a ligação de qualquer apoproteína B-100 que se pretende determinar com um receptor da presente invenção. Podem encontrar-se exemplos de técnicas detalhadas em Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, I Cleveland, OH (1981); e em Goldman, Fluorescent Antibody Methods,

Academic Press, New York, NY (1980).

Uma concretização de um processo específico para ensaiar uma amostra do fluído do corpo para a determinação de apo 8-100 utilizando um receptor fixado em fase sólida da presente inveri ção é uma ELISA não competitiva em que as imunorreacçães são realizadas em sequência. Nesse ensaio fixa-se uma alíquota de receptores MB47, por exemplo, geralmente cerca de 1 a cerca de 500 y*g nas paredes internas de um furo de microtitulação para se obter um suporte sólido.

Qualquer apo B-100 presente na amostra de corpo fornecida é em seguida feita imunorreagir com os receptores fixados } em fase sólida. Isto consegue-se misturando uma quantidade co nhecida, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 200 microlitros ( ^*1) de amostra (que podem ser pré-diluídos) como por exemplo soro de plasma no furo de microtitulação com os receptores fixados a fase sólida para formar uma mistura de fase sólida/ /líquida. A mistura é mantida em condiçães de ensaio biológi co durante um período pré-determinado de tempo suficiente para que qualquer apo B-100 presente na amostra se ligue imunologicamente às moléculas receptoras para formar um imunorreagente de fase sólida. As fases sólida e líquida são em segui da separadas e a fase sólida é tipicamente lavada para assegu. rar a remoção de materiais não especificamente ligados.

A apo B-100 presente como imunorreagente de fase sólida (isto é, apo B-100 ligada a receptores MB47 fixados em fa66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll )

, * λ. ., / ^:

-39se sólida) é em seguida feita imunorreagir com segundas moléculas receptoras marcadas com enzima. Isto consegue-se mistu rando uma quantidade pré-determinada, por exemplo cerca de 0,1 a cerca de 10 jaq de segundas moléculas receptoras marcadas com enzima numa solução tampão aquosa, preferivelmente re ceptores MB24 marcados com peroxidase de rábano (HRPO) para formar, uma segunda mistura de sólido/líquido. Esta segunda mistura é mantida como acima descrito, formando assim um imunorreagente de fase sélida de tipo sanduíche consistindo de receptor MB47, apo B-100 e receptores MB24 marcados com enzi| ma ·

Após separar-se a fase líquida da fase sólida como anteriormente descrito, mistura-se uma alíquota de substrato cromogênico, como por exemplo £-fenilenodiamina (QPD) para HRPO, no furo de microtitulação contendo o imunorreagente de fase sólida para formar uma terceira mistura sólido/líquido. Esta mistura é mantida em condições de ensaio biológico dura_n te um período pré-determinado de tempo suficiente para que qualquer enzima presente como imunorreagente converta numa quantidade proporcional de substrato num produto colorido. A densidade óptica da solução resultante colorida é em seguida medida e comparada com os resultados obtidos usando soluções | contendo quantidades conhecidas do reagente apo B-100.

Examinou-se a capacidade de ELISA sequencial não compe. titiva acima descrita e com maior detalhe na secção de Materi ais e Processos para detectar apo B-100 numa amostra de fluído de corpo. Nesses estudos, as alíquotas de plasma humano reduzido em lipoproteínas (BDP) às quais se misturaram quantidades conhecidas do reagente apo B-100 serviram como amostras do fluído do corpo de controlo.

Os resultados desse estudo, apresentados na Tabela 1 a seguir, demonstram que o processo acima descrito pode determi nar com precisão as quantidades clinicamente relevantes de apo B-100 presentes numa amostra de fluído do corpo.

| 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-40Tabela 1

E nsaios	ELISA sequenciais não competitivos de Apo	B-100 em
Plasma Humano
Amostra''’	Real^{1 2}	Ref.³	MB47/MB24⁴	MB24/B1E	>⁵
B Baixo	40	32 +44,3	42,6+^ 5,0	31,7
B Normal	80	71 +103	82,3.+ 11,8	54,7
B Alto	150	126 +180	149 +24,7	119
T Baixo	22,5	12,6+ 17	16,2+ 0,62	15,4?	9,0
T Normal	44,8	25,4+ 49,2	36,1+ 9,4	22,9;	19,7
T Alto	89,5	64,0+101	77,4+ 7,4	34,9;	36,3
A		73	82,9+11,7	66,4
AM		76	67,1+ 8,1	46,8;	61,0
B		86,5	69,8+ 4,6	68,5;	90,5
C		145	129 + 3,8	147,173
D		109	81,0+ 7,4	76,3;	98,2
K		95	98,4+16,5	77,5;	88,9
R		60	64,2+ 7,5	51,3;	52,9
Conjunto		81,3	78,5+ 6,8	54,7;	65,9
Cl		40,1	47,9+ 6,7	47,0;	68,7
C2		74,8	88,6+13,2	81,3;	98,2
C3		70,4	64,5+ 4,8	64,5;	82,9
C4		39,9	56,7+ 6,6	48,5;	58,0

1. Obtiveram-se soluçães de controlo contendo apoproteína B-100 numa concentração clinicamente baixa, normal e ele vada de Oohnson & Oohnson Biotechnology Center, Inc., La Jolla, CA (B) e Tago, Inc., Burlingame, CA (T). Obtiveram-se amostras de plasma de indivíduos clinicamente normais (designaçães com uma a duas letras e C1-C4), e o conjunto representa uma mistjj ra de dez dessas amostras.

2. A concentração real de apoproteína B-100 determina da pela proteína total adicionada à amostra. Todas as conceri

511

Ref: SCRF 72,0-EPG:ll

-41traçães apresentadas na tabela estão em unidades de mg/dl.

3. Concentração de apoproteína B-100 determinada utilizando o ensaio de referência (Ref.) a seguir descrito. São dados os valores numa gama de três desvios padrão.

4. Concentraçães de apoproteína B-100 (média +. 3 desvios padrão) obtidas utilizando receptores MB47 fixados em fase sólida e receptores MB24 marcados com HRPO num ensaio ELISA sequencial não competitivo como atrás descrito.

5. Concentraçães de apoproteína B-100 (valores replicados apresentados quando efectuados) obtidos usando receptores MB24 fixados em fase sólida e receptores B18 marcados com HRPO (Curtiss et al., 3. Biol Chem.. 257, 15213-15221 (1982)) num ensaio ELISA não competitivo em que se realizaram as imunorreacçães sequencialmente formando—se em primeiro lugar um imunorreagente de fase sólida.

Outra concretização de um processo específico para ensaiar uma amostra de fluido do corpo para a determinação de apo B-100 é um ensaio de ELISA não competitivo em que as imunorreacçães são realizadas de modo substancialmente simultâneo. Ao furo de microtitulação acima descrito contendo os re ceptores MB47 fixados em fase sólida mistura-se de modo substancialmente simultâneo a amostra de corpo fornecida e os receptores secundários marcados com enzima que imunorreagem com o segundo epitopo de apo B-100 e que não inibem substancialmente a ligação dos receptores MB47 à apo B-100. Estes segun dos receptores marcados com enzima são preferivelmente recepto res MB24.

A mistura sólido/líquido resultante é em seguida mantida e separada e a quantidade de enzima presente co mo parte de imunorreagente de tipo sanduíche ligado à fase sj5 lida é determinada da forma previamente descrita.

ensaio ELISA não competitivo acima descrito foi utilizado para examinar o teor de apo B-100 de plasmas de 20 pacientes com doença da artéria coronária (CAD), 20 paci entes com hipercolesterolemia familiar e 20 indivíduos normais.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll ‘W·

-42- ......

Como se mostra na Tabela 2 a seguir, o nível médio de apo B-100 no plasma dos indivíduos normais foi determinado como sen do 85 mg/dl com uma gama de 2 desvios padrães de +. 21 mg/dl.

Este valor está de acordo com a gama normal dos valores de apo B referidos por Curry et al., Clin. Chem 24, 280-286 (1987), e Rosseneu et al., Clin. Chem 28, 427-433 (1983) utilizando cada um imunoensaios diferentes.

Além disso, os níveis de apo B-100 no plasma em pacientes com CAD e hipercolesterolemia eram superiores ao limite sju perior da gama de dois desvios padrão encontrada em indivíduos normais. Foram referidos resultados semelhantes utilizando outras técnicas em pacientes com CAD e hipercolesterolemia por Sniderman et al., Proc. Natl Açad. Sçj. USA 77, 604-608 (1980) e Lipid Research Council, JAMA 251, 351-364 (1984).

Tabela 2

Estudos de ELISA simultâneos de Apo B-100 em Plasma Humano

Indivíduos^	Níveis	de Lipopro'	2 teína	Níveis de	Apoproteína B⁵
					ELISA
	Colest.	Colest	. Colest.	ELISA	Não- ,	RID⁸	RID⁹
	T otal⁵	HDL⁴	LDL⁵	Competi	-Compet?	1	2
Normal	186	60	111	85	82	102	69
+ DP	37	16	30	21	22	20	19
CAD	205	37	133	109	104	13Θ	84
+ DP	35	7	37	24	23	20	24
FH	331	37	270	196	204	211	136
+ DP	90	11	96	40	49	64	44

1. 0s indivíduos incluem 20 controlos normolipidémicos, saudáveis (normais); 20 indivíduos com a doença da artéria coronária definida por uma cateterização cardíaca (CAD); b 20 pa cientes com hipercolesterolemia familiar (FH).

2. Valores dados são a média + 2 desvios padrão da mâ dia (+ΌΡ) em unidades de mg/ml.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

3. Colesterol total.

4. Colesterol presente como HDL.

5. Colesterol presente como LDL.

6. Nível de apo B-100 determinado paio ensaio ELISA competitivo (Compet.) descrito na secção de Materiais e Pro cessos.

7. Nível de apo B-100 determinado pelo ensaio ELISA não competitivo (Não-Compet.) quando utilizando receptores MB47 fixados em fase sólida e receptores MB24 marcados com HRPO

I em que a amostra e receptores foram misturados de modo substa.n cialmente simultâneo.

8. Nível de apo B determinado usando o conjunto de imunodifusão radial modelo Diffu-gen RID disponível de Tago, Inc., Burlingame, Ca.

9. Nível de apo B determinado usando o conjunto de imunodifusão radial modelo M-partigen RIA disponível de Calbiochem-Behring, La Oolla, CA.

Também se examinou o efeito da diluição da amostra de fluído do corpo antes de a ensaiar para a determinação de apo B-100 para um ensaio ELISA simultâneo não competitivo. Esses . resultados, apresentados na Tabela 3 a seguir, indicam que ^r não existia diferença significativa nos níveis de apo B-100 determinados até 5 vezes a gama de diluição do plasma, isto é, 1:1000 até 1:5000.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-44Tabela 3

Estudos ELISA Simultâneos de níveis de Apo B determinados de diferentes diluições de plasma

Diluição	de Plasma	Plasma 1^	Plasma 2^	Plasma 3^
1:1000		54,4	136,6	199,0
1:2500		57,5	142,5	194,2
1:5000		53,0	126,0	178,0
Média²		55,0	135,0	190,0
D.P.³		1,88	6,83	8,98
/ò C. V.		3,4	5,0	4,7
1.	Concentra	ção de apo B	-100 no plasma	em unidades

de mg/dl.

2. Concentração média de apo B-100 no plasma para todas as três diluições.

3. Um desvio padrão.

4. Percentagem do coeficiente de variância entre os re sultados obtidos para de várias diluições.

A correlação entre os níveis de colesterol LDL e apo B-100 do plasma determinado por um ensaio de ELISA não competitivo para amostras de indivíduos normais e pacientes descri, ta acima é apresentada na Figura 7. 0 coeficiente de correlação de 0,89 e semelhante ao referido por Albers et al., Metabolism 24, 1339-1351 (1975) e Slater et al., Clin, Chem. 31, 841-845 (1985).

As concretizações dos processos de ensaio da presente invenção utilizando um suporte sólido contendo apo B-100 reagente fixado numa matriz sólida são efectuados usando os seguintes passos:

(a) Parte-se de uma amostra de fluido de corpo conter) do apo B-100 tal como atrás descrito.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

(b) Mistura-se de modo substancialmente simultâneo (1) a amostra do fluido;

(2) uma quantidade pré-determinada de moléculas receptoras MB24 ou MB47; e (3) uma quantidade pré-determinada de apo B-lOO reagente fixado em faae solida para formar uma mistura de imunorreacção de fase líquida/sólida.

Mantém-se a mistura em condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que os sítios de combinação do anticorpo das moléculas receptoras imunorreajam com (se liguem imunologicamente com) com apo B-100 reagente ou qualquer apo B-100 presente na amostra de fluido do corpo.

que

As moléculas receptoras/se ligam imunologicamente à apo B-100 presente na amostra do corpo formam um imunorreagente de fase líquida e as que se ligam à apo B-100 reagente fixado em fase sólida formam um imunorreagente de fase sólida.

(c) Determina-se em seguida a presença de imunorreagente fixado em fase sólida e determina-se assim a quantidade de apo B-100 presente na amostra por comparação da quantidade de ligação exibida por uma quantidade conhecida de MB47 ou MB24 misturado com apo B-100 fixado em fase sólida semelhante, tal como descrito a seguir. De preferência, efectua-se o ensaio de imunorreagente após se separarem os imunorreagentes de fase líquida e de fase sólida do passo (b) como por lavagem. Pode determinar-se a quantidade de apo B-100 da amostra ligada como imunorreagente de fase líquida p.e. pelo uso de anticorpos marcados que imunorreagem com as moléculas receptoras da presente invenção como por exemplo Ig anti-rato de cabra ligado com pe, roxidase ou de outra forma aqui descrita.

Numa realização particularmente preferida do ensaio de competição, fixam-se a uma matriz sólida cerca de 1 y*g a cerca de 10 pg de apo B-100 reagente, preferivelmente nas pa redes de um furo de microtitulação para formar um suporte sólido. quaisquer sítios de ligação não específicos no suporte sólido são tipicamente bloqueados com uma proteína como por

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-46exemplo BSA ou semelhante.

Faz-se em seguida reagir de modo substancialmente simultâneo uma quantidade pré-determinada de moléculas receptoras da presente invenção, por exemplo, geralmente cerca de 0,1 yug a cerca de 10 com o apo B-100 reagente fixado em fase sólida e qualquer apo B-100 presente numa amostra de fluido de corpo (que pode ser diluida) como por exemplo soro ou plasma. Isto consegue-se misturando-se de modo substanci almente simultâneo uma alíquota da amostra e as moléculas receptoras no furo de microtitulação contendo o apo B-100 rea gente fixado em fase sólida.

A mistura sólido/líquido assim obtida é mantida em cori dição de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que as moléculas receptoras presentes se liguem imu nologicamente a apo B-100 presente. Separam-se em seguida preferencialmente as fase sólida e líquida por lavagem e lavja -se tipicamente a fase sólida para assegurar a remoção de materiais não especificamente ligados.

A presença de imunorreagentes fixados em fase sólida é em seguida determinada tipicamente pela utilização de anticojç pos marcados que se ligam imunologicamente às moléculas rece£ toras da presente invenção como por exemplo IgG anti-rato de cabra marcada com peroxidase.

No ensaio ELISA competitivo, a apo B-100 presente na amostra do paciente compete com uma quantidade constante, conhecida do apo B-100 reagente para um número constante, conhe eido de sítios de combinação de anticorpo da molécula recepto ra na mistura de imunorreacção. A competição facultada pela apo B-100 da amostra resulta numa diminuição de imunorreagente fixado em fase sólida detectável; quanto maior for á dimi nuição, maior é a quantidade de apo B-100 presente na amostra do corpo em investigação.

Para se obterem quantidades relativas de apo B-100 pre sentes em plasmas de pacientes, compararam-se resultados obtidos utilizando apo B-100 presente no plasma do paciente,como

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-47competidores, com os resultados obtidos usando padrões competi tivos contendo quantidades conhecidas do apo B-100 reagente. Obteve-se uma curva padrão utilizando concentrações de LDL va riando de 32 mg/ml a 0,25 mg/ml (320 mg/dl a 2,5 mg/dl).

ensaio ELISA competitivo acima descrito foi utilizado para examinar as7amos^Stras de indivíduos normais e pacientes avaliadas por ensaios ELISA não-competitivos. Estes resultados, também apresentados na Tabela 2 acima, estão de bom acordo com os resultados obtidos pelo ensaio não-competitivo.

Examinou-se o efeito da diluição da amostra de fluido de corpo antes de ensaiar para a determinação de apo B no ensaio ELISA competitivo acima descrito. Estes resultados, apre sentados na Tabela 4 a seguir, demonstram que não existe dife rença significativa nos níveis de apo B determinados quatro vezes a gama de diluições de plasma; isto é, 1:100 até 1:400.

Tabela 4

Estudos de ELISA Competitiva	de Níveis de Apo B	Determina-
dos a Partir de Diferentes Diluiçõ	es de Plasma
Diluições de Plasma	Plasma	l¹	Plasma 2	Plasma 3
1:100	32,8		63,3	175,8
1:200	30,0		58,5	183,2
1:300	31,8		64,8	190,9
1:400	33,8		62,6	190,0
Média^	32,1		62,3	185,0
P.D.^{2 3}	1,6		2,7	7,0
/ C. V.⁴	5,0		4,3	3,8
1. Concentração	de apo	B-100	no plasma em	unidades de
mg/dl.

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll , i*^t= L '

3. Um desvio padrão.

4. Percentagem do coeficiente de variância entre os resultados obtidos para várias diluições.

Apresenta-se na Figura 8 a correlação entre níveis de colesterol LDL e apo B em plasma determinados pelo ensaio ELISA competitivo para amostras de indivíduos normais e pacientes acima descritos. 0 coeficiente de correlação de 0,92 é semelhante ao referido por Albers et al., Metabolism, 24, 1339-1351 (1975), e Slater et al., Clin Chem., 31, 841-S45 (1985), indicando assim que o ensaio ELISA competitivo prediz com precisão os níveis de colesterol LDL circulantes.

Examinou-se a correlação entre os níveis de apo B-100 obtidos utilizando o ensaio ELISA competitivo e não-competiti vo. Como se mostra na Figura 9 existe uma elevada correlação (r = 0,92) entre os resultados obtidos em cada ensaio.

Um sistema de diagnóstico, preferivelmente na forma de con junto para efectuar os mátodos de ensaio acima referidos inclui, em embalagens separadas, (a) um primeiro agente de ligação es_ pecífico em que o referido agente é (i) um receptor que imunoj? reage com apo B-100, e é escolhido do receptor segregado pelo I hibridoma HB 8746 (MB47) ou o receptor segregado pelo hibridq ma HL 8742, (MB24) e (b) um segundo agente de ligação específica/^ara assinalar a imunorreacção do referido primeiro agen te de ligação com apo B-100. De preferência, o agente de liga ção específica marcado é um receptor ligado a uma enzima. Mais preferivelmente, o agente marcado é o que resta do receptor de (a) acima, ligado a uma enzima.

Nas concretizações preferidas, o sistema inclui ainda outro contentor de apo B-100 reagente para uso como controlo e/ou antígeno alvo. São também preferidas concretizações em que o sistema inclui uma matriz sólida em que o primeiro ageri te de ligação específico ou apo B-100 reagente é fixado para formar um suporte sólido. As matrizes sólidas úteis já foram descritas anteriormente. De preferência, contudo, a matriz s.ó >

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-49lida é □ furo de uma placa de microtitulação.

São fornecidas quantidades conhecidas do agente de liga ção específico. Estas quantidades são pelo menos suficientes para efectuar um ensaio. Os agentes de ligação específicos são tipicamente fornecidos numa forma e quantidade que é concebida para ser diluída para um volume pré-determinado com água, solução salina ou um tampão como por exemplo solução S£ lina tamponada com fosfato a pH de 7,3-7,5.

Podem também incluir-se embalagens adicionais no siste ma. Estas embalagens podem conter (i) sais tampão em forma seca ou líquida, (ii) substratos enzimáticos como por exemplo ο,-fenile nodiamina e produtos semelhantes.

Exemplos de embalagens incluem garrafas ou frascos de vidro e de plástico como por exemplo de polietileno e polipro pileno; envelopes em plástico, plástico-folha de metal e piás, tico-folha de metal-papel e semelhantes. Os agentes de ligação específicos podem ser embalados numa forma líquida aquosa como por exemplo fluído ascítico ou tampão, mas preferivelmente, são fornecidos na forma anidra como por exemplo os obtidos por liofilização.

0. Sorvente de Afinidade

A presente invenção também inclui um sorvente de afinidade, de preferência esterilizado, compreendido por um receptor biologicamente activo da presente invenção fixado numa matriz sólida para formar um suporte sólido. A matriz sólida está preferivelmente em forma de partículas. Estes sorventes de. afi nidade são úteis para a remoção específica da apoproteína B-100 contendo lipoproteína (l/LDL e LDL) por imunoadsorpção do plasma de pacientes que sofrem de hipercolesterolemia.

suporte sólido pode ser numa grande variedade de materiais como por exemplo dextrano reticulado, por exemplo, Sephadex G-25, -50, -100, -200 e semelhantes disponíveis de >

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-50Pharmacia Fine Chemicals of Piscataway, N.O., agarose e agaro se recticulada, por exemplo, Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL4B e semelhantes também disponíveis de Pharmacia Fine Chemicals ou Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M, A-50M e semelhantes disponíveis de Bio-Rad Laboratories, Richmond CA, ou pérolas de poliacrilami da, por exemplo, Bio-Gel P-2, P-30, P-100, P-300 e/também dis poníveis de Bio-Rad Laboratories. Os materiais de agarose e agarose recticulada são aqui preferidos devido à sua alta porosidade e propriedades ligantes não-específicas baixas e serão usadas ilustrativamente como uma matriz sólida.

A esterilização dos receptores e da matriz sólida é ti picamente efectuada antes da ligação. Para manter a actividja de biológica, esterilizam-se habitualmente os receptores por filtração, por exemplo por passagem através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 micrometros. A esterilização da matriz depende, como se sabe bem, do tipo de matriz. Por exemplo, não se pode esterilizar Sepharose por autoclavagem, mas pode-se esterilizar quimicamente por exemplo, por tratamento com dietilpirocarbonato. Por outro lado, pode-se esterilizar

oclavagem a pH 7, 12O0C durante 20 minutos.

A matriz de Sephadex ou Sepharose é tipicamente activa da por ligação usando brometo de cianogénio por processos bem conhecidos da técnica. Lava-se em seguida a matriz activada e liga-se a receptores que imunorreagem com apo B-100 e que são segregados pelo hibridoma HB Θ742 ou HB 8746. Lava-as em seguida o receptor ligado à matriz, estando pronto para uso. Os grupos reactivos não reagidos no suporte podem ser feitos reagir com uma amina como por exemplo etanolamina ou Tris se desejado.

soruente de afinidade pode ser usado no seu estado livre roas está preferivelmente confinado numa coluna. Misfura-se em seguida o plasma de um paciente contendo apo B-100 com o sorveirte de afinidade para formar uma mistura de imunorrea£ ção. Mantém-se a mistura em condiçães de ensaio biológico du. rante um período de tempo suficiente para que os receptores fixados à matriz sólida se liguem imunologicamente a apo B-100 presente no plasma e formem um imunorreagente fixado numa ma66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-51triz sólida. Separa-se em seguida o plasma do imunorreagente fixado em matriz sólida. Pode-se em seguida introduzir o plasma com apo B-100 e reduzido em LDL e VLDL no paciente a partir do qual foi originalmente obtido.

A preparação de um sorvente de afinidade e a sua utilização para remoção de apolipoproteína B contida em lipoproteinas do plasma são descritas em Stoffel et al., Proc. Natl, Açad. Sei. USA 78, 611-615 (1981), que é incorporado por refe rência. Verificou-se que uma coluna de sorvente de afinidade preparada ligando receptores MB47 substancialmente puros a Sepharose 4B activada com CNB-4 imunoabsorvia (ligava) 3 mg de LDL por ml de suporte sólido.

II. Processos e Materiais

A. Preparação de Lipoproteínas Humanas

Isolaram-se fraeções de lipoproteínas humanas por centrifugação com as densidades seguintes: VLDL densidade (d) inferior a 1,006 g/ml; LDL, d igual a 1,025-1,050 g/ml; HDL, d igual a 1,070-1,21 g/ml, e LDS, d igual a 1,21 g/1. Em alguns casos isolou-se também LDL humano a uma d igual a 1,019-1,063 g/ml ou a 1,045-1,065 g/ml. Determinou-se a concentrai ção de proteína no plasma e em cada fraeção pela técnica de Lowry /~Loiury et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951)_/ modificada por Markwell et al., Anal. Biochem, 87, 206-210 (1978), utilizando BSA padrão.

Para cada fraeção de LDL e VLDL, foram também efectuadas estimativas do teor de apo B após a precipitação de apo B ' com tetrametilureia (TMU) usando a técnica de Kane et al., J. Clin. Invest., 56, 1622-1634, (1975) ou álcool isopropílico seguindo ensinamentos de Equsa et al., J. Lipid Res., 24, 1261-1267 (1983).

Obteve-se plasma humano, fresco, após jejum de dadores normalmente saudáveis, por plasmaforese, e ajustou-se a 0,1% de EDTA (s/v). Obtiveram-se conjuntos a partir de três ou mais dadores a menos que se diga o contrário. As lipoproteínas foram

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll >

•úk

-52isoladas por ultracentrifugação sequencial do plasma utilizari do KBr sólido para ajuste da densidade (d). As fracções de lipoproteínas incluiam VLDL, d inferior a 1,006 g/ml; IDL, d = 1,006-1,019 g/ml; LDL, d = 1,019-1,063 g/ml; e HDL, d = 1,063-1,25 g/ml.

A fracção do fundo contendo soro reduzido em lipoproteína (d superior a 1,25 g/ml) foi também recolhida.

Dialisaram-se bem as fracções num tampão de lipoproteina contendo 0,15 M NaCl, 0,3 mM de EDTA, 0,0005$ de alfa-tocoferol a um valor de pH de 7,4.

Separou-se uma fracção de chylomicron” da fracção de VLDL de um plasma reunido de pacientes não submetidos a jejum fazendo flutuar os chylomicrons através do tampão de lipopro teína com ultracentrifugação a 120 000 xg durante 40 minutos a 4BC.

Todas as lipoproteínas foram filtradas esterilmente, e armazenadas a 42C durante um período não superior a 20 dias. Analisaram-se as lipoproteínas para a determinação do teor de proteína por uma modificação do processo de Loiury, 3. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951), utilizando uma BSA padrão. Todas as concentrações em lipoprotefna são expressas com base na pro, | teína.

A composição de apoproteína de cada uma das classes de lipoproteína foi determinada por electroforese de SDS-gel de poliacrilamida. 0s ''chylomicrons'’ continham quantidades dete£ tâveis de apoproteínas, Β, E e C, enquanto o VLDL continha apo, proteínas Β, E, C e quantidades traço de apoproteína A-I.

A IDL continha apoproteínas, Β, E e C enquanto a LDL. continha somente apoproteína B. A HDL continha apoproteínas AI, AII _e C.

Durante o decurso destes estudos, as preparações de lipoproteína apresentaram uma composição consistente de apoproteína. Para controlar a proteólise potencial das apoproteínas, isolaram-se conjuntos de plasma seleccionados e armazenaram-se na presença de 1 mg/ml de sulfato de gentamicina, 0,2% de azida de sódio e 1 mM de benzamidina, 10 mM de fluorofosfato de di66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-53isopropilo, 10 ^ig/ml de inibidor da tripsina de soja.

A comparação dos padrães de coloração de apoproteínas SDS-PAGE dessas lipoproteínas, bem como das isoladas na ausên cia de antibióticos e inibidores da protease imediatamente após ultracentrifugação e após armazenagem durante até três semanas não evidenciaram proteólise. Todas as preparaçães utilizadas eram esterilizadas.

B. Produção e Cultura de Hibridoma

Utilizaram-se para imunização lipoproteínas nativas in tactas isoladas de conjuntos de plasma. Imunizaram-se quatro ratos Balb/c com quatro a cinco semanas de idade intraperitonealmente com 50 microgramas de lipoproteína em adjuvante com pleto de Freund. Foram dadas injecçães intravenosas secundárias de 50 ^g de lipoproteína em tampão de lipoproteína entre o dia 28 e o dia 33. Removeram-se os baços dos ratos imunizados 72 horas após a última injecção e prepararam-se suspensões de uma única célula em meio HT. Recolheu-se também sangue, e utilizou-se o soro como controlo positivo para cada um dos imu noensaios.

Mantiveram-se em regime de crescimento de fase logarítmi ca linhas de células de mieloma murino em culturas estacionári as em meio completo HT (Kennet et al., Curr. Tpp, Microbiol, Immunol. 81, 77-91 (1978), que aqui se incorpora por referência) contendo 0,1 mM de azaguanina. Efectuaram-se as fusões na presença de 30$ (v/v) de polietileno glicol 1000 (Sigma, St. Louis, M0) numa proporção de células de baço imunes para P3x63Ag8 de 10:1. Três dias após a fusão, colocaram-se as cé lulas numa placa de 96 furos de cultura de tecidos com 1 x .10 células viáveis por furo em meio HT contendo 0,1 mM de aminopte rina.

Alimentaram-se as células durante 7 dias após fusão com meio HT e em seguida a intervalos de aproximadamente 4-5 dias conforme a necessidade. Seguiu-se o crescimento microscopicamente e recolheram-se os sobrenadantes das culturas no dia 14

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-54para determinação da produção de anticorpos específicos de ar» tígeno por RIA de fase sólida. Os hibridomas produtores de ar» ticorpos específicos foram clonados 19 a 47 dias após fusão por diluição limitativa na presença de células de alimentação do baço de Balb/c, e os hibridomas nos furos continham colóni as simples que foram analisadas para a produção de anticorpos por RIA de fase sólida após 10 dias. Os hibridomas clonados foram cultivados num meio contendo 10$ de soro de vitela e fo ram armazenados congelados em azoto líquido.

C. Inibição da Ligação, Internalização e Degradação de LDL

Determinou-se a capacidade dos receptores anti-apo B-100 para inibirem a ligação, internalização e degradação de 12 5

I-LDL por fibroblastos humanos da seguinte maneira. Fez-se 125 a iodação de LDL com (actividade específica 200 cpm/ng) utilizando a técnica com monocloreto^áo de Bilheimer et al., 3. Clin. Invest., 56, 1420-1430 (1975).

Para permitir a interacção anticorpo-LDL, incubou-se 0,1 ml de cada sobrenadante de hibridoma (misturado e mantido) com I-LDL (concentração final de 2,5 mg/ml) em 0,4 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DME) contendo 2,5 mg/ml de soro deficiente em lipoproteína (LDS) durante doze horas a 49C. Em seguida, transferiram-se as misturas incubadas individualmente para monocamadas de fibroblastos de prepúci) humano crescidas em DME com 10$ de soro de vitela fetal (FCS) em furos com 10 milímetros de diâmetro. Os receptores de LDL destas células foram maximamente expressos por incubação anterior das cé lulas durante um período de tempo de 24 horas em DME contendo 2,5 mg/ml de LDS.

»

Após incubaçães individuais das células do sobrenadantee de fibroblastos durante seis horas a 3720, determinou-se 125 a degradação celular de I-LDL de acordo com o método de Dre von et al., 0. Lipid Res., 22, 37-46 (1981). As culturas de 125 controlo tinham 0,4 ml de DME contendo I-LDL e um dos sbguintes: a) 0,1 ml de meio de hibridoma fresco contendo 20$

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

de soro de vitela fetal; ou b) 0,1 ml de meio hibridoma obtido de furos de colónias de hibridomas que eram negativas para a produção de anticorpos específicos de apo B; c) 0,1 ml de DME contendo 2,5 mg/ml de LDS; ou d) 0,1 ml de LDL não marcado (para uma concentração de LDL não marcado final no meio de 500 yug por ml).

D. Isolamento da Imunoglobina Anti-LDL

Obtiveram-se fluídos ascíticos contendo receptores da presente invenção a partir de ratos Balb/c com dez semanas de idade que se tinham sensibilizado comO^mL de óleo mineral e se tinham injectado intraperitonealmente com 3-50x10^ células de hibridoma. 0 tempo médio para o desenvolvimento de ascite foi de 12 dias. Após clarificação por centrifugação a 15 000 xg durante uma hora a 4QC, juntaram-se os fluídos as. cíticos e armazenaram-se a -203C.

Preparou-se o anticorpo MB47 isolado por cromatografia dos fluídos ascíticos de hibridoma monoclonais numa coluna de proteína A-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatau/ay, New Jersey). Elui-se o anticorpo da coluna com ácido acéti co 0,1 M.

Prepararam-se também receptores isolados por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) num fluído ascítico de hibridoma monoclonal numa coluna permutadora aniónica Pharmacia Mono Q HR 5/5 num sistema Pharmacia FPLC usando gra diente de 0-0,5M de NaCl em 10mM Tris, pH 8,0, e seguindo as instruçães fornecidas com a coluna.

E. Caracterização dos Anticorpos de Hibridoma teor total de gama-globulina (Ig) de cada conjunto de fluído ascítico foi obtido por electroforese de amostras de 1-3 ml de tiras de acetato de celulose em 75 mM de tampão veronal, a um valor de pH de 8,6 durante 45 minutos a 200 milivolts (ml/). A percentagem de proteína total que era Ig foi quantificada por varrimento densitométrico dos géis corados

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-56com Ponceau S, e datarmi.nou-se o teor total de proteína pelo processo de Louiry modificado do modo discutido anteriormente.

Identificaram-se cadeias leves e pesadas de Ig murina por difusão dupla em agarose a 0,9$. Fizeram-se reagir 10 mi crolitros de uma diluição adequada de fluído ascítico com um volume igual de anti-soro específico anti-murino de coelho de cadeia leve e pesada adequadamente diluído (Litton Bionetics). Após difusão durante 15 horas a 203C e lavagem, identificaram -se as linhas de precipitina por coloração com azul brilhante de Coomassie R-250 a 0,5%.

) Obtiveram-se os perfis isoeléctricos de cada anticorpo monoclonal por focalização isoeléctrica de amostras de 0,01 ml de fluído ascítico em agarose a 0,8% (EF 802-300 LKB) contendo 10% de sorbitol, 2% de anfolina com um valor de pH de 5-8 (LKB) durante 150 minutos a potência constante de 3 W. Após fixação e secagem, os géis foram colorados com azul brilhante de Coomas, sie e foram fotografados.

1· Western Blotting. Separaram-se as apoproteínas por electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacril amida (SDS-PAGE) das lipoproteínas num aparelho de gel com pia ca vertical (14 x 12 x 0,15 cm) (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Prepararam-se os géis usando um tampão de | 25 mM de Tris-glicina a um valor de pH de 8,6. 0 gel da parte superior continha 1% de SDS, 3% de acrilamida e o gel inferior de processamento era um gradiente de acrilamida de 3 a 20% ou de 3 a 6% contendo 1% de SDS. As lipoproteínas foram reduzidas em lípido por ebulição durante 3 minutos num tampão de amostra de electroforese que continha 1% de dodecil sulfato de sódio, 10 mM Tris, e 0,24 mM EDTA. Os marcadores de peso molecular e. os seus pesos moleculares relativos aparentes respectivos são: fi brinogénio, 340 000; IgG, 140 000; albumina, 69 000; ovalbu mina, 43 000; inibidor da tripsina de soja, 20 500; e lisozi ma, 14 300. Submeteram-se os géis a electroforese durante apro ximadamente 18 horas a uma corrente constante de 13,5 miliamp^ res (mA).

Lavaram-se os géis em água destilada durante 10 minutos e em seguida durante 10 minutos em 25 mM Tris, 192 mM de gli-

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-57cina, pH 8,3, contendo 20/ (v/v) de metanol. A transferência para nitrocelulose (0,45 micrómetros, Millipore Corp.) foi efectuada por electroforese durante uma hora a 400 mA. Os s_í tios de ligação activos remanescentes na nitrocelulose foram saturados embebendo durante a noite em PBS contendo 3/ de BSA, 3/ de soro de cabra normal, 0,01/ de azida de sódio (solução de bloqueamento).

Os géis fixados ou as transferências de nitrocelulose foram incubados durante 18 horas a 4^C com soro de rato imune ou fluído ascítico adequadamente diluído em PBS contendo 3/ de BSA, 3/ de soro de cabra normal, 0,05/ de Tiueen-20 (polioxieti leno (20 monolaurato)). Após lavagem repetida, detectou-se uma ligação de anticorpo por uma segunda incubação de 4 horas

X 2 5 a 49C com Ig anti-imune de cabra (0,5 yU-Ci/ml) no mesmo tampão seguido de novo por lavagem extensa.

A ligaçao não específica coma nitrocelulose foi significativa mente reduzida por lavagem após incubação com o primeiro e se gundo anticorpos em PBS contendo 3/ de BSA, 0,05/ de Tween-20 e em seguida em 0,5 M LiCl contendo 0,1/ de SDS.

0s géis ou transferência da nitrocelulose foram secos e analisados por autoradiografia (X-0mat; Eastman Kodak) a -20SC, Quando adequado, coraram-se os géis com azul brilhari te de Coomassie R-250 a 0,1/ em ácido tricloroacético a 50/ ou coraram-se com prata (Bio-Rad) como descrito por Merril et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4335-4339 (1979).

F. Preparação de Fragmentos Fab

Obtiveram-se par digestão com papaína fragmentos de Fab de anticorpos de moléculas receptoras isoladas. As porçães Fc de anticorpos e anticorpos não digeridos foram removidas por passagem numa coluna de proteína A-Sepharose 4B. 0s ensaios de SDS-PAGE dos fragmentos Fab revelaram duas bandas discretas a 25 000 e 40 000 daltons. Verificou-se a imunoreactividade dos fragmentos Fab por ligação específica a LDL nos ensaios RIA de fase sólida (Milne et al., Arteriosclerosis 3, 23-30 (1983).

>

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

G. Radioimunoensaios (RIA)

1· RIA de Antíqeno Marcado com ^Χ^Ι de Fase Fluída

125

Para determinar a fracção das partículas de I-LDL ligadas por MB47 e MB24, utOizou-se m ensaio RIA. de fase fluida (Curtiss e Edgington, 0. Biol. Chem., 25, 15213-15221 (1982)). Estudaram-se duas preparaçães diferentes de LDL (d = 1,019-1,063 g/ml), uma isolada do conjunto de plasma de 10 indivíduos noj?

125 mais e uma isolada de plasma de um indivíduo normal. A I-LDL (2000 cpm/ng), preparada usando técnicas de Iodogénio (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) era precipitável com ácido tricloroacético (TCA) a 90/. Dilui-se em albumina de soro de bovino a 9% (BSA) (Sigma, St. Louis, M0) e centrifugou-se a 30 000 xg durante 15 minutos antes de cada ensaio para remo, ver material complexo. Efectuaram-se os ensaios em tubo de vidro de 12 x 75 mm em triplicado num tampão de barbital de sódio 55 mM, a um valor de pH de 8, contendo 150 mM de NaCl, 0,02% de azida de sódio, 3/ de BSA, e 1,5 mM EDTA de sódio. Adicionaram-se a 0,1 ml de I-LDL (contendo 20 ng da proteí. na LDL) 0,1 ml do tampão ou antígeno de competição e 0,1 ml de receptores MB47 isolados com concentrações crescentes diluí, dos num tampão de BSA-barbital. Após 18 horas a 4SC, mistura ram-se 0,1 ml de IgSorb (The Enzyme Co., Boston, MA). Apés duas horas de tempo de residência, adicionaram-se 2 ml de tampão de barbital sem BSA, e centrifugaram-se imediatamente os tubos a 1 500 xg durante 60 minutos. Lavaram-se os preci pitados por duas vezes com □ tampão de barbital. Determinou-se a radioactividade máxima precipitável substituindo o IgSORB com 100/ de TCA. A radioactividade mínima precipitável foi determinada na ausência de receptores de MB47. Calculou125

-se em seguida a percentagem de ligação de I-LDL.

125

2. RIA de Receptor Marcado com I de Fase Fluída

Fez-se a iodação de receptores MB47 de anticorpos in125 tactos, isolados por imunopurificação com I utilizando a técnica de Iodogénio (actividade específica 3 000 cpm/ng) (Pierce). Após diálise extensa contra PBS, mais de 95% da ra

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-59dioactiuidade era precipitada por 10% de TCA. Mais de 98% de ¹²⁵I-MB47 era ligado a uma coluna da afinidade de LDL humano. Efectuaram-se ensaios em triplicado em tubos de vidro revesti, dos com silicone de 10 x 75 mm. Adicionaram-se concentrações crescentes de I-MB47 em 0,1 ml de tampão de BSA-barbital a 100 ng de LDL humano normal, reunido, diluído em 0,2 ml de tampão de BSA-barbital. Cada tubo continha 182 fmoles de LDL apo B (assumindo um peso molecular de apo B de 550 000 daltons). Após manutenção durante 16 horas a 42C, precipitou-se quantita tivamente LDL por um antisoro de coelho reduzido em lipoproteí. na específico para LDL humano. (Apenas a fracção com densida de superior a 1,21 g/ml do antisoro de coelho foi utilizada dado que o anticorpo MB47 se liga a apo B do coelho).

Estudos preliminares estabeleceram uma concentração de antisoro de coelho deslipidado que precipitava 97% de 100 ng de 1^-EDIi humano. Após mistura do anticorpo do coelho mantiveram-se os tubos durante 16 horas a 45C e em seguida centrifugaram-se a 1 500 xg durante 50 minutos a 45C. Removeram-se os sobrenadantes e lavaram-se duas vezes os agregados obtidos com 2 ml de tampão barbital refrigerado com gelo. Determinaranj -se a ligação e a precipitação não-específicas em dois conjuntos de tubos paralelos.

No primeiro conjunto, não se adicionou LDL humana à in cubação inicial, mas adicionou-se a mesma quantidade de anticorpo secundário de coelho. No segundo conjunto de tubos, o soro de coelho não-imune (densidade superior a ouiguaLàfracçSo de 1,21 g/ml) foi substituído pelo anticorpo do soro de coelho imune.

_n idênticos

Ambos os processos produziram valores/para a ligação não-específica, que eram lineares com concentrações crescentes 125 de anticorpo I-MB47, e em todos os casos eram inferiores a 1% do total de contagens adicionadas. A ligação específica 125

I-MB47 a LDL foi obtida subtraindo a ligação não específica à ligação total. Os dados de ligação foram analisados uti lizando um programa de regressão linear para análise de Scatchard de sistemas de ligação de ligando , que davam uma estimativa da constante de afinidade de anticorpo (Ka) e concentra

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-60ção do receptor ou do epítopo (Munson et al., final. Biochem.,

107, 220-239 (1980).

3. RIA de Antigeno Fixado em Fase Sólida ensaio de análise para determinar se uma cultura de hibridoma produzia receptores da presente invenção, foi efectuado em placas de microtitulação flexíveis de poli(cloreto de vinilo) de fundo redondo (Dynatech, Inc., Alexandria, UA), como uma matriz sólida. Fixaram-se (ligaram-se), antígenos de lip£ proteína (apo B-100 reagente) às paredes internas dos furos da placa de microtitulação, misturando 0,05 ml de lipoproteína em tampão de lipoproteína e incubando as placas à temperatura ambi ente durante 3 horas para se obter uma concentração constante final de antigeno ligado, e o suporte sólido. 0s estudos preli minares de ligação directa utilizando lipoproteínas radioiodadas indicavam que existiam diferenças significativas nas efici ências com que cada uma das lipoproteínas estava ligada aos fu ros das placas de microtitulação de plástico. Assim, para se conseguir uma concentração final de antigeno ligado de 50 ng de proteína por furo, utilizou-se ULDL a 50 ^g/ml, IDL a 6,2

guida os sítios de ligação não específica misturando-se 0,25 ml de solução de bloqueamento em cada furo, mantendo a mistura durante uma hora, e em seguida separando a solução de bloqueamento dos furos, obtendo-se assim um suporte sólido com uma ca pacidade de ligação não-específica baixa.

Para o ensaio, misturaram-se 0,050 ml de antisoro, sobrenadante de cultura ou fluído ascítico diluído em PBS conterr do 3/ de BSA, 3/ de s oro normal de cabra, e 0,05% de Tu/een-20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano) nos furos para se obterem misturas de imunorreacção de fase sólida/líquida. Mantiveram-se em seguida as misturas (imunorreagidas) durante 18 horas a 490.

Após lavagem dos furos com PBS contendo 3% de BSA e 0,05% de Tween-20 para remover o material não-ligado, prepararam-se receptores ligados à fase sólida para a detecção directa, mistju rando em cada furo 10 ng de Ig anti-murina de cabra radioiodada e

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-61imunoquimicamente purificada para se obter uma segunda mistura de fase líquida/sólida. Esta mistura foi mantida durante 4 ho ras a 49C para permitir que os segundos receptores marcados se ligassem aos primeiros receptores ligados à fase sólida e fo_r massem um imunorreagente de tipo sanduíche.

Após uma lauagem final para remoção de receptores marca dos não ligados, removeram-se os furos individuais e contaram125

-se para a determinação de I, estando a quantidade detBcta125 da de I em proporção directa com a quantidade dos primeiros receptores ligados como imunorreagente de fase sólida.

Radioiodou-se enzimaticamente o segundo anticorpo imuno quimicamente purificado utilizando lactoperoxidase e glicose oxidase imobilizadas (Enzymobeads, Bio-Rad Burlingame, CA) p£ ra actividades específicas de 3-4 microCuries/micrograma.

4. RIA Competitivo de Receptores Fixados em Fase Sólida

Efectuaram-se radioimunoensaios competitivos de fase sólida (RIA) para determinação de apo B humana utilizando o anti corpo MB47. Revestiram-se os furos de poli(cloreto de vinilo) com 0,5 ml de LDL humana (apo B-100 reagente) diluída a 10 ^g/ /ml em PBS, pH 7,35, e mantiveram-se a 37BC durante duas horas.

Bloquearam-se os sítios de ligação não específica revestindo com 5% de BSA em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lavaram-se em seguida as placas utilizando tampão de lava gem PBS contendo adicionalmente 0,1% de BSA, 0,01% de azida de sódio e 0,05% de Tween-20.

Para a curva padrão utilizou-se, como apo B-100 reagen-, te, LDL fresca, preparada a partir de soros normais combinados em diluições variando de 0,4 g/ml a 97,2 g/ml. Todas as diluições foram feitas num tampão de PBS contendo 3% de BS-fl, 0,01% de azida de sódio e 0,05% de Tu/een-20. Misturaram-se as LDL p£ drões ou competidoras (0,025 ml) aos furos revestidos de LDL e em seguida 0,025 ml de tampão contendo uma quantidade fixa e limitada de anticorpo monoclonal (fluído ascítico). A conceji tração final óptima de anticorpo foi determinada a partir de estudos preliminares de diluição de anticorpos e foi ) 66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll X jj/4¹

-62escolhida coroo a quantidade de anticorpo que resulta em 50/ de ligação máxima.

Mantiveram-se as placas durante um período de tempo de cerca de 18 horas a 4^0, em seguida lavaram-se com o tampão de lavagem PBS. Quantificou-se a ligação de anticorpo do rato por mistura de 0,05 ml de lg anti-rato de cabra I imunopurifioada (450 ng/furo, 8 000 cpm/ng). Após um período de manutenção de quatro horas a 42C, lavaram-se as placas e contaram-se os furos individuais.

H. Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA) · ELISA l\lão Competitivo isolados ãs paredes de furos poliestireno (Nunc-Immuno tampão de bicarbonato de s_ó

Fixaram-se receptores MB47 de uma placa de microtitulação de Plate I) misturando 0,15 ml de um dio pH 9,0, contendo 1 y^g/ml de proteínas receptoras em cada furo. Mantiveram-se os furos 16 horas a 42C, e em seguida lja varam-se três vezes com PBS contendo 0,1/ de ΒΞΑ e 0,05/ de Tween. Bloquearam-se em seguida os sítios de ligação não-específicos residuais misturando 0,2 ml de BSA a 3/ em PBS em cada furo, mantendo a mistura durante uma hora a 239C e em seguida lavando como acima descrito. Os furos (suportes sólidos) assim preparados podem ser utilizados até um mês após a ção, quando armazenados numa c&mara húmida.

prepara

Diluíu-se a apo B-100 reagente (LDL humana) em concentrações variando de 2,0 a 0,062 yig/ml para uso luções de controlo padrão a 1:2000 em PBS.

PBS a como sjd

Diluiram-se as amostras do plasma ·

Misturaram-se 50 microlitros de padrão ou amostra nos furos em triplicado. Num período de 5 minutos, misturaram-se em cada furo 50 de PBS contendo mg/ml de receptores MB24 marcados com HRPO . Mantiveram-se as misturas de imunorre acção durante 30 minutos a 253C. Separou-se em seguida o material não ligado dos furos por lavagem como acima descrito.

Determinou-se em seguida a quantidade de imunorreagente

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-63de tipo sanduíche fixado em fase sólida contendo o marcador HRPO misturando 0,1 ml de uma solução de substrato recentemeri te preparada (água destilada contendo 3% de ^Oz e 0,67 mg/ml de £-fenilenodiamina (OPD) a cada furo. Deixou-se desenvolver a cor durante 30 minutos a 25SC. Parou-se em seguida a reacção de conversão do substrato misturando em cada furo 0,05 ml de ^0,? 4N. Determinou-se a densidade ôptica (D.0.) das soluçães a um comprimento de onda de 490 nanometros (nm) utilizando um leitor de placa de microtitulação (Dynatech, Ale xandria, VA).

2. ELISA Competitivo

Fixou-se apo B-100 reagente às paredes dos furos das placas de microtitulação de poli(cloreto de vinilo) flexível (microtest III, Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co., Oxnard, CA) como matriz sólida misturando 0,2 ml de PBS contendo 5 g/ml de LDL humana isolada em cada furo. Mantiveram-se os furos durante 16 horas a 42C, e em seguida lavaram-se três vje zes com 0,2 ml de PBS contendo 1% de BSA, 0,5% de Tween e 0,02% de aprotinina (Sigma Chemical Co.). Bloquearam-se os sítios de ligação não específicos residuais como descrito no ELISA não competitivo.

Para a curva padrão, que foi incluída em cada placa, d_i luíu-se apo B-100 reagente em PBS contendo 0,5% do plasma com quantidade de lipoproteínas reduzida para se obterem concentra çães variando de 32 mg/ml a 0,25 mg/ml.

Diluiram-se amostras do plasma 1:200 em PBS contendo 0,5% de LPDP. Misturaram-se cinquenta microlitros dos padrães ou amostras em triplicado nos furos. Em seguida durante cinco mi nutos, misturaram-se 50^x.1 de PBS contendo 3% de BSA θ cerca de 4^g/ml de receptores MB24, em cada furo. As misturas assim obtidas foram mantidas durante 18 horas a 43C. Separou-se em seguida dos produtos de imunorreacção, reagente apo B-100 MB24 fixado em fase sólida, o produto não ligado, por lavagem como acima descrito.

0s imunorreagentes de fase sólida foram preparados para ensaio misturando em cada furo 0,1 ml de PBS contendo 1% de BSA e uma quan

511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll Z ,_ri /·;

tidade eficaz de IgG anti-rato de cabra marcado com HRPO. Es. ta segunda mistura de imunorreacção foi mantida durante cerca de 1 hora a 243C e em seguida lavada como acima descrito para se obter um imunorreagente tipo sanduíche.

A quantidade de imunorreagente de tipo sanduíche fixado à fase sólida contendo o marcador HRPO foi ensaiada como descrito no ensaio ELISA competitivo.

I. Amostras de Plasma e Quantificação de Lipoproteína

Obtiveram-se amostras de plasma a partir de 20 pacientes com uma doença da artéria coronária da cateterização cardíaca laboratorial do Hospital de San Diego VA e de 20 pacientes com hipercolesterolemia familiar da Universidade da Califórnia, Clínica de San Diego. Em adição, obteve-se pias, ma de 20 indivíduos normais.

Recolheu-se o sangue em tubos contendo 1,5 mg/ml de te traacetato de etilenodiamina (EDTA), e separou-se o plasma imediatamente por centrifugação a 49C.

Mediram-se os níveis de colesterol e triglicéridos do plasma total em amostras de plasma fresco num laboratório clí, nico normalizado utilizando o analisador bicromático Abbott A3A-200, e um reagente 236691 de colesterol de alto rendimento Boehringer-Mannheim e um agente de triglicéridos de Abbott Laboratories. Mediram-se os níveis de colesterol-LDL e -HDL utilizando as técnicas descritas em Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. N5. 75-628 (NIH), 2§. ed., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974). Determinaram-se os níveis de apoproteína B usando dois equipamentos de imunodifusão radial comercialmente disponíveis: Diffu-gen RID (Tago, Inc., Burlingame, CA) que é aqui designado como RID 1 e M-Partigen RID, (Calbiochem-Behring, La Qolla, CA) que é aqui designado como RID #2.

□ . Ligação de LDL a uma Coluna de MB47-Sepharose 4B

Ligaram-se 50 miligramas de receptores MB 47 substan66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-65cialmente puros, obtidos por cromatografia de coluna com proteína A, a 12 ml de Sepharose 4B activada com brometo de cianog_é nio (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.Y.), de acordo ccm as instruções do fabricante. Posteriormente, adicionaram -se 10 mg de LDL à coluna e manteve-se durante a noite (cerca de 16 horas) a 4SC. Eluíu-se em seguida a LDL não ligada e determinou-se a proteína LDL como acima descrito.

A especificação acima feita, incluindo as concretizações específicas, pretende ser ilustrativa da presente invenção e não deve ser tomada como limitativa. Podem efectuar-se muitas outras variações e modificações sem se desviar do verdadeiro espírito e âmbito dos novos conceitos da invenção.

Claims

1 - Processo de preparação de uma molécula receptora que imunorreage com apoproteína B-100, caracterizado por compreender cultivar um hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8746 num meio de crescimento adequado.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o receptor ser um anticorpo intacto.

3 - Processo de preparação de uma molécula receptora que imunorreage com a apoproteína B-100, caracterizado por compreender cultivar um hibridoma que possui o número de ace_s so ATCC HB 8742 num meio de crescimento adequado.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o receptor ser um anticorpo intacto.

5 - Processo para ensaiar uma amostra de fluído corporal para a determinação da quantidade de apoproteína B-100 ca racterizado por compreender os passos de:

(a) partir-se de uma amostra de fluído corporal que se pretende ensaiar, (b) obterem-se moléculas receptoras em forma biologica mente activa que (i) imunorreagem com a apoproteína B-100, e (ii) são segregadas pelo hibridoma que possui o número de aces^ so ATCC HB 8746 ou hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8742;

(c) misturar-se uma quantidade conhecida da referida amostra de fluído corporal com uma quantidade predeterminada das referidas moléculas receptoras para formar uma mistura de » imunorreacção;

(d) manter-se a referida mistura em condiçães de ensaio biológico durante um período predeterminado de tempo suficiente para que as moléculas receptoras presentes na mistura se liguem imunologicamente à apoproteína B-100 presente na

66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll .r amostra para formar um imunorreagente5 e (e) determinar-se a quantidade de imunorreagente formado na referida mistura.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida amostra de fluído corporal ser plasma ou soro.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido receptor ser um anticorpo intacto.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar adicionalmente a amostra de fluído cojr poral para a determinação incluindo os seguintes passos adicio nais de:

(f) obterem-se moléculas receptoras secundárias biolo. gicamente activas que imunorreagem com a apoproteína B-100 pre sente na referida amostra corporal e que são as remanescentes de moléculas receptoras segregadas pelo hibridoma possuindo o número de acesso ATCC HB 8746 ou do hibridoma possuindo o número de acesso ATCC HB 8742; e (9) misturar-se uma quantidade predeterminada das referidas moléculas receptoras secundárias com a referida amostra de fluído corporal para se obter uma mistura de imunorrea£ ção;

(h) manter-se a referida mistura de imunorreacção em condições de ensaio biológico durante um período predetermina do de tempo suficiente para que as moléculas receptoras presentes na mistura se liguem imunologicamente à apoproteína B-1DO presente na amostra para formar um imunorreagente do ti po sanduíche.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 8 , caracterizado por o referido receptor ser um anticorpo intacto.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado por 0 referido receptor nomeado em primeiro lugar ser

66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll

-68fixado a uma matriz sólida para formar um suporta sólido; cori tendo o referido segundo receptor um marcador susceptível de sinalizar a presença do referido segundo receptor num imunorreagente; e o imunorreagente ensaiado no passo (e) ser um imunorreagente do tipo sanduíche de fase sólida contendo o re ferido marcador.

11 - Processo para ensaio de uma amostra de fluído corporal para a determinação de apoproteína B-100, caracterizado por compreender os passos de:

(a) partir-se de uma amostra de fluído corporal a ensaiar?

(b) arranjar-se um suporte sólido compreendido por uma matriz sólida possuindo nela fixado numa forma biologicamente activa um primeiro receptor que imunorreage com a apoproteína B-100 e que é segregado pelo hibridoma que possui o número de acesso ATCC HB 8746;

(c) arranjar-se um segundo receptor biologicamente aç_ tivo que imunorreage com a apoproteína B-100 e que é segregado pelo hibridoma que possui □ número de acesso ATCC HB 8742, estando o referido segundo receptor ligado a um marcador enzi, mático susceptível de sinalizar a presença do referido segundo receptor num imunorreagente5 (d) misturar de modo substancialmente simultâneo;

(i) a referida amostra corporal;

(ii) o referido suporte sólido; e (iii) o referido segundo receptor marcado para formar uma mistura de imunorreacção de fases sólida/líquida;

(e) manter-se a referida mistura em condiçães de ensaio biológico durante um período predeterminado de tempo suficiente para que o referido primeiro receptor e o referido segundo receptor marcado se liguem imunologicamente à apoproteína B-100 presente na amostra para formar o imunorreagente do tipo sanduíche de fase sólida e uma fase líquida;

(f) separar-se o referido imunorreagente de tipo san>

66 511

Ref: SCRF 72.0-EPG:ll duiche de fase sólida da referida fase líquida; e (g) determinar-se a quantidade do segundo receptor marcado no imunorreagente do tipo sanduíche de fase sólida.

12 - Processo competitivo para ensaio de uma amostra de fluído corporal para a determinação da apoproteína B-100 cara£ terizado por compreender os passos de:

(a) partir-se de uma amostra de fluído corporal a ensaiar;

(b) arranjar-se um suporte sólido compreendido por uma matriz sólida possuindo uma quantidade predeterminada do reagente com a apoproteína B-100 nele fixado;

(c) misturar-se de modo praticamente simultâneo (i) a referida amostra corporal;

(ii) o referido suporte sólido; e (iii) uma quantidade predeterminada das moléculas receptoras que imunorreagem com a apoproteína B-100 segregada pelo hibridoma com o número de acesso ATCC HB 8746 ou pelo hi bridoma com o número de acesso ATCC HB 8742 para formar uma mistura de fases sólida/líquida;

(d) manter-se a referida mistura em condiçães de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que as moléculas receptoras se liguem imunologicamente às moléculas da apoproteína B-100 do referido suporte sólido e às molé cuias da apoproteína B-100 presentes na amostra de fluído co£ poral e formarem um imunorreagente de fase sólida e um imunor, reagente de fase líquida; e (e) separar-se o referido imunorreagente de fase sóli da da referida fase líquida;

(f) misturar-se com o referido imunorreagente de fase sólida um segundo receptor biologicamente activo que imunorreage com o referido primeiro receptor para formar uma segunda mistura de imunorreacção de fase sólida/líquida, estando o re ferido segundo receptor ligado a um marcador enzimático sus

66 511

Ref: SCRF 72,D-EPG:U ceptíuel de sinalizar a presença do referido segundo receptor num imunorreagente;

(g) manter-se a referida segunda mistura durante um período de tempo suficiente para que o segundo receptor marca do se ligue imunologicamente a qualquer primeiro receptor pre sente como imunorreagente de fase sólida para formar um imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida;

(h) separar-se o referido imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida da referida fase líquida; e | (i) determinar-se a quantidade do segundo receptor marcado ligado no referido imunorreagente de tipo sanduíche de fase sólida.