FI89214B - Analysfoerfarande och diagnostiskt system foer ett markerande aemne foer abnorm lipidmetabolism - Google Patents

Description

1 89214 Määritysmenetelmä ja diagnostinen systeemi epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan osoittavalle aineelle

Esillä oleva keksintö koskee määritysmenetelmää epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan osoittavalle aineelle ja erityisesti määritysmenetelmää apolipoproteiini B-100:n suhteen määrittämiseksi apolipoproteiini A-I:een nestemäisessä verinäytteessä kuin myös diagnostista systeemiä menetelmän suorittamiseksi .

A. Ateroskleroosi ia lipoproteiinit

Ateroskleroosi on tauti, jonka yhteydessä kolesteroli ja muut lipidit keräytyessään valtimoiden seinämille muodostavat runsasmassaisia plakkeja, jotka inhiboivat veren virtausta ja voivat aiheuttaa hyytymän muodostumisen, joka voi tukkia valtimon ja aiheuttaa tukkivan tromboottisen tai em-bolisen taudin kuten sydänkohtaus tai sydänhalvaus. Jopa 50 prosenttia kaikista kuolemista Yhdysvalloissa aiheutuu ate-roskleroosista ja siihen liittyvistä komplikaatioista.

Ihmisen ateroskleroosille on tunnusomaista valikoitujen lipidien, mukaan lukien kolesteroli, ja solujen keräytyminen V valtimoiden seinämille, mikä ajan mittaan tuottaa tukkivia vaurioita. Vaikkakin ateroskleerosin etiologia johtuu monesta tekijästä, laaja kliininen, patologinen, geneettinen ja ·'· kokeellinen todistusaineisto viittaa siihen, että poikkea- •· vuudet lipoproteiinin aineenvaihdunnassa voivat myötävaikut taa ateroskleeroosin kehittymiseen. Nämä lipidit liikkuvat verenkierrossa lipidiproteiinikomplekseina, joita nimitetään . . lipoproteiineiksi.

Ateroskleroosi ja erityisesti sen sepelvaltimotautina (CAD) : tunnettu muoto on huomattava terveysongelma. Ateroskleroosi ja siihen liittyvät verenkiertotaudit aiheuttivat 983 000 kuolemaa vuonna 1983 ja yksistään CAD aiheuttaa enemmän kuolemia vuosittain kuin kaikki syövän muodot yhteensä. Yhdys- 2 89214 valloissa tapahtuu joka vuosi enemmän kuin 1 miljoona sydänkohtausta, ja yli viisisataatuhatta ihmistä kuolee tähän tautiin. Välittöminä terveydenhuoltokustannuksina CAD maksaa Yhdysvalloille enemmän kuin 60 triljoonaa dollaria vuodessa. Tämä huomattava hinta on saanut kiinnittämään huomion tapoihin, joilla voitaisiin identifioida erityiset CAD-riskipopu-laatiot niin, että tautia voidaan hallita ruokavaliolla, käyttäytymismodifikaatioilla (liikunta) ja spesifisillä terapeuttisilla aineilla.

Kolesteroliin kytkeytyvistä plasman lipoproteiinipartikke-leista on määritelty neljä pääluokkaa, joiden alkuperä on suolistossa tai maksassa. Nämä partikkelit osallistuvat neutraalien lipidien, kolesteroli ja triglyseridit mukaan lukien, kuljetukseen. Kaikki plasman lipoproteiinilajit sisältävät apolipoproteiineja liittyneinä lipidiproteiinikom-pleksiin; ja apolipoproteiinit ovat välttämättömiä näiden lipoproteiinien toiminnalle.

Ensimmäinen luokka käsittää kylomikronit. Ne muodostavat lipoproteiinien suurimman ryhmän ja sisältävät runsaasti tri-glyseridejä. Kylomikronien syntypaikka on suolessa.

Vaikka apolipoproteiinit ovat kvantitatiivisesti vähäinen osa kylomikronien massassa, apolipoproteiinien A-I, A-II ja A-IV tiedetään suuressa määrin liittyvän kylomikroneihin, ja näiden A-apolipoproteiinien on todettu syntetisoituvan suolessa. Kylomikronit sisältävät myös apolipoproteiinia B-48. Suuri osa kylomikronien A-apolipoproteiinien täydestä määrästä katoaa, ja C- ja E-apolipoproteiineja tulee näkyviin, kun kylomikroneja altistetaan plasmalle tai tiheydeltään suurelle lipoproteiinille (HDD in vitro. A-apolipoproteiinien muodostumista suolessa voivat säädellä muut tekijät kuin rasvan absorboituminen ja kylomikronien muodostuminen.

Seuraava lipoproteiinien luokka käsittää hyvin pienitiheyk-siset lipoproteiinit, VLDL. VLDL-partikkeli valmistetaan maksassa, ja se osallistuu triglyseridiaineenvaihduntaan ja 3 89214 näiden lipidien kuljettamiseen maksasta. Apolipoproteiinit apo B-100 ja apo E ovat VLDL-partikkelin pääkomponentteja.

Kolmatta lipoproteiinia nimitetään pienitiheyksiseksi lipo-proteiiniksi (LDL), ja se on VLDL:n spesifinen katabolismi-tuote. Vallitsevana apolipoproteiinina LDL-partikkelissa on apolipoproteiini B-100 eli apo B-100.

Jo klassisen Framinghamin tutkimuksen (1971) tulokset osoittivat selvää korrelaatiota CAD-riskin ja seerumin kolesterolitasojen välillä. Tämän tutkimuksen mukaisesti osoitettiin myös, että pienitiheyksinen lipoproteiini (LDL)-kolesterolin kohonneet tasot ovat yhteydessä lisääntyvään CAD-riskiin, Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial'in (1984) äskettäin suorittaman tutkimuksen mukaisesti on osoitettu, että plasman kolesterolin ja LDL-kolesterolin tasoja voidaan alentaa yhdistetyn dieetti- ja lääkeainehoidon avulla, ja että tämä plasman kolesterolin alentuminen johtaa CAD-kuolleisuuden esiintymistiheyden alentumiseen.

LDL on tärkein kolesterolia kuljettava lipoproteiini plasmassa. LDL on suurikokoinen pallomainen partikkeli, jonka öljymäisen ytimen muodostaa noin 1500 kolesterolimolekyyliä, joista jokainen on kiinnittynyt esterisidoksen välityksellä pitkäketjuiseen rasvahappoon. Tätä kolesteryyliesterien muodostamaa ydintä ympäröi kerros, joka sisältää fosfolipidiä, . ; esteröitymättömiä kolesterolimolekyylejä ja yhden ainoan apolipoproteiini B-100 -molekyylin. Fosfolipidit ovat järjestäytyneet siten, että hydrofiiliset päät ovat ulospäin sallien LDL:n olla hydratoituneessa suspensiossa veressä tai ekstrasellulaarisissa nesteissä.

Kolesteroli siirretään soluihin LDL:n pinnalla spesifisen LDL-reseptorin välityksellä ja vapautetaan LDL-partikkeleis-ta lysosomeissa, joissa se voi ohjata solun kolesterolisi-*-·*. neenvaihduntaa. Intrasellulaarisen kolesterolin kertyminen moduloi kolmea prosessia.

4 89214

Ensiksi, se alentaa solun kykyä valmistaa omaa kolesterolia katkaisemalla entsyymin, HMG CoA -reduktaasi, synteesin, joka katalysoi yhtä vaihetta kolesterolin biosynteettisellä reitillä. Entsyymin ehkäiseminen tekee solusta riippuvaisen ulkoisesta kolesterolista, joka saadaan LDL:n reseptorivä-litteisestä sisäänottamisesta.

Toiseksi, sisääntuleva LDL-peräinen kolesteroli edistää kolesterolin varastoitumista soluun aktivoimalla entsyymin, jota nimitetään lipoproteiiniasyylitransferaasiksi. Tämä entsyymi esteröi rasvahappoja ylimääräisiin kolesterolimo-lekyyleihin muodostaen kolesteryyliestereitä, jotka tallennetaan varastopisaroihin.

Kolmanneksi, ja merkittävimpänä, kolesterolin kertyminen solun sisään ohjaa takaisinkytkentämekanismia, joka saa solun lopettamaan uusien LDL-reseptorien syntetisoinnin. Solut säätelevät siten ulkoisten reseptoriensa täydennystä siten, että kolesterolia tuodaan soluun riittävästi tyydyttämään solun vaihtelevat tarpeet, mutta ei riittävästi niiden yli-kuormittamiseksi. Esimerkiksi fibroblastit, jotka lisääntyvät aktiivisesti, niin että uutta membraanimateriaalia tarvitaan, ylläpitävät LDL-reseptorien maksimaalista kokonaismäärää noin 40 000 per solu. Soluissa, jotka eivät kasva, sisääntuleva kolesteroli alkaa kumuloitua, takaisinkytken-täsysteemi vähentää reseptorituotantoa, ja reseptorien kokonaismäärä alenee jopa kymmenkertaisesti.

Toisaalta on osoitettu, että toinen kiertävä lipoproteiini, suuritiheyksinen lipoproteiini(HDL)-partikkeli, tulee näkyville tilassa, jossa kolesteroli on kohonnut, johon liittyy . alentunut ateroskleroosiriski. Apolipoproteiini A-I on ra- kenneproteiini ja HDL-partikkelin ligandi. HDL:n määrä antaa käänteisen korrelaation ateroskleroosin ennustetun esiintymis todennäköisyyden suhteen.

Suuritiheyksinen lipoproteiini (HDL) sisältää kahta tärkeää apolipoproteiinia, apolipoproteiini A-I:tä (apo A-I) ja apo- 5 89214 lipoproteiini A-II:ta (apo A-II). Apo A-I on tärkein prote-iinikoirponentti kaikkien kädellisten HDL: ssä. Kaikki HDL-partikkelit sisältävät apo A-I:tä, ja HDL:n immunokvanti-tointi on sen vuoksi merkinnyt apo A-I:n kvantitointia. Noin 80 prosenttia HDL-partikkeleista sisältää myös apo A-II:ta, mutta HDL-partikkeleita, jotka sisältävät ainoastaan apo A-II:ta, ei ole kuvattu.

Apo A-I:n eräs funktio on plasman entsyymin, lesitiinikoles-teroliasyylitransferaasin (LCAT), aktivointi. Tätä entsyymiä tarvitaan HDL:llä olevan vapaan kolesterolin esteröimiseksi maksaan kuljettamista varten. Apo A-I:n puuttuessa veren kolesteroli ei esteröidy, ja näin ollen kolesteroli ei poistu verestä. Apo A-II:n spesifistä roolia HDL-metaboliassa ei ole todettu.

Monessa tutkimuksessa on todettu, että kohonneet HDL-tasot korreloivat CAD:n alentuneen esiintymistiheyden kanssa. Jotkut tutkijat ovat pohtineet, että HDL poistaa kolesterolia perifeerisistä paikoista, kuten valtimon seinämistä, lukien sen vuoksi HDL:n ansioksi antiaterogeenisiä ominaisuuksia.

HDL-kolesterolin suuret pitoisuudet korreloivat suhteellisen normaalin lipidiaineenvaihdunnan kanssa ja sydän- ja verisuonitaudin pienemmän esiintymistiheyden ja/tai vähentyneen vakavuuden kanssa, kun taas kohonneet LDL-kolesterolin tasot liittyvät epänormaaliin lipidiaineenvaihduntaan ja lisäänty-neeseen CAD-riskiin. Hyperlipidemisten (liikaa lipidejä ve-: ressä) potilaiden ja niiden potilaiden, joilla on erityinen CAD-riski, oikean hoidon kannalta on edullista usein määrittää LDL- ja HDL-kolesterolien tasot. Tähän päivään mennessä : HDL-kolesterolimääritykset ovat olleet hankalia ja epätark koja määritettäessä veren HDL-tasoja.

B. Lipoproteiinin rakenne ia tehtävä

On tärkeätä ymmärtää, että kolesterolia ei esiinny vapaana plasmassa, vaan lipoproteiinit kuljettavat sitä kehon kudos-pisteisiin. Kolesterolia voi saada suunnatun solusynteesin 6 89214 tai ruokavalion kautta. Kolesterolia voi kuitenkin poistaa isännästä vain maksa, jossa se muutetaan sappihapoiksi ja eritetään.

Kylomikronit kuljettavat ruokavalion sisältämää kolesterolia ja triglyseridejä maksaan seuraavaa käsittelyä varten, kun taas LDL vie kolesterolin maksan ulkopuolisiin kudoksiin, mukaan lukien sepelvaltimot. Tästä johtuen lipoproteiini, LDL/apo B-100 on osallisena "pahan" kolesterolin kerrostumisessa perifeerisessä kudoksessa. Käänteisesti, lipoproteiini HDL/apo A poistaa "hyvää" kolesterolia kudoksista ja palauttaa kolesterolin maksaan erittämistä varten.

Monia systeemejä on perinteisesti kehitetty lipoproteiinien eristämiseksi ja karakterisoimiseksi. Nämä tekniikat perustuvat tavallisesti lipoproteiinipartikkelien sisältämiin fysikokemiallisiin ominaisuuksiin. Kaksi eniten käytettyä menetelmää ovat ultrasentrifugointi ja elektroforeesi.

Differentiaalisessa tiheysgradienttiultrasentrifugoinnissa hyödynnetään sitä tosiseikkaa, että lipoproteiinit ovat kevyempiä tai vähemmän tiheitä kuin plasman muut proteiinit, ja on suhteellisen helppoa, joskin aikaa vievää ja hankalaa, erottaa kylomikronit (kevyimmät lipoproteiinit), VLDL, LDL ja HDL toisistaan. Elektroforeettisista menetelmistä on ollut hyötyä seulottaessa hyperlipidemisiä potilaita. Näitä menetelmiä ei kuitenkaan ole helppo suorittaa tavallisessa kliinisessä laboratoriossa.

Voidaan myös nähdä, ettei veren kolesterolin tai triglyseri-dien yksinkertainen kvantitointi anna lääkärille sitä informaatiota, mitkä spesifiset lipoproteiinit kuljettavat näitä lipidejä ja mikä on niiden määrä.

C. Plasman lipoproteiinit

Plasman lipoproteiineista on määritelty neljä pääluokkaa; so. kylomikronit, VLDL, LDL ja HDL, ja epäilemättä näiden sisällä esiintyy alaluokkia. Kaikki lipoproteiinit syntyvät 7 89214 suolistossa tai maksassa, tai molemmissa, ja niillä näyttää olevan pseudomisellaarinen rakenne. Neutraalit lipidit, ja erityisesti kolesteroliesterit ja triglyseridit, säilyvät lipoproteiinien ytimessä liukoisessa ja pysyvässä muodossa vuorovaikutuksilla pinnan polaaristen ainesten, apolipopro-teiinien ja fosfolipidien, kanssa.

Esteröitymätön kolesteroli on myös läsnä näissä komplekseissa. Sen polaarisuus sijoittuu neutraalilipidien (kolesteryy-liesterit ja triglyseridit) ja polaarisempien apolipoprote-iinien ja fosfolipidien polarisuuksien väliin, ja sitä voidaan tavata sekä ytimessä että pinnalla.

Ulkopinta, joka sisältää apolipoproteiineja, esteröitymätön-tä kolesterolia ja fosfolipidejä, ympäröi kolesteryylieste-reitä ja triglyseridejä sisältävää, veteen liukenematonta ydintä, suojellen polaarittomia lipidejä vedelliseltä ympäristöltä. Tämä yleinen rakenteellinen käsite on vahvistettu matalakulmaisen röntgensädesironnan käsittävillä tutkimuksilla ja muilla fysikaalisilla menetelmillä, joissa on käytetty erilaisia koettimia lipoproteiinien rakenteen tutkimiseksi. Plasman lipoproteiinien tärkeä tehtävä on näin ollen plasman neutraalien lipidien liuottaminen ja kuljettami-. - nen.

D. Apolipooroteiinit

Apolipoproteiinit ovat plasman lipoproteiinien lipidivapaita proteiinikomponentteja, joita on saatu käsittelemällä eristettyjä käsittelemättömiä lipoproteiineja orgaanisilla liuottimilla, detergenteillä tai kaotrooppisilla aineilla. Lipoproteiinien mukana talteen saaduista proteiineista eivät kaikki välttämättä osallistu lipidikuljetukseen. Asiaan liittyvä esimerkki on viimeaikainen havainto, että seerumin amyloidiset A-proteiinit, akuuttivaiheen reaktantit, kulkeutuvat plasmassa sitoutuneina HDLrään. Nämä molekyylipainol-taan pienet proteiinit voivat käsittää jopa 30 prosenttia apo-HDL:stä tulehdustiloissa, mutta on epätodennäköistä, että ne osallistuvat spesifisesti lipidikuljetukseen.

θ 89214

1. ApQlipoproteiini A-X

(a) Proteiini

Apolipoproteiini A-I (apo A-I) on esillä olevaa keksintöä koskeva kiinnostuksen kohteena oleva proteiini. Apo A-I:tä käsitellään jäljempänä.

Apo A-I on kaikkien kädellisten HDL:n pääasiallinen prote-iinikomponentti, se on läsnä kaikissa HDL-partikkeleissa, ja HDL-partikkelia kohti on monta, esim. noin 7-8, apo A-I -molekyyliä. Sen on raportoitu olevan läsnä suhteellisen vähäisinä määrinä ky1omikroneissa, VLDL:ssä ja LDL:ssä, kuin myös muodostavan noin 60-80 % HDL:n kokonaisproteiinista.

Apo A-I sisältää yhden ainoan, 243-245 tähdettä sisältävän ketjun, ei sisällä kystiiniä, kysteiiniä, leusiinia tai hiilihydraattia ja esiintyy useana isomuotona. Apo A-I:n alfa-helix -pitoisuus on noin 55 % lipidivapaassa tilassa, joka kohoaa noin 75 prosenttiin fosfolipidiä sidottaessa. Tässä apolipoproteiinissa on identifioitu 11 helix-tähdettä sisältäviä toistojaksoja. On esitetty, että nämä yksiköt edustavat yksinkertaista esiaikaista ketjua, joka geenikahdentumi-sen kautta on muodostanut 22-tähteisen toistoyksikön. Näillä yksiköillä on lähellä toisiaan oleva sekvenssihomologia, ja niiden otaksutaan edustavan proteiinin lipidiä sitovia alueita.

Apo A-I on tehokas LCAT:n aktivaattori, plasman entsyymin, joka katalysoi kolesterolin ja fosfatidyylikoliinin muuttumisen kolesteryyliesteriksi ja lysofosfatidyylikoliiniksi, vastaavasti. Apo A-I:n spesifisten, lipidiä sitovien alueiden on todettu aktivoivan LCATstä, ja tämän aktiivisuuden on katsottu liittyvän lipidiä sitovaan ominaisuuteen. Kuten jo määriteltiin, maksa ja suolisto syntetisoivat apo A-I:tä, mutta niiden vastaavat myötävaikutukset kokonaispitoisuuteen plasmassa ja tekijät, jotka säätelevät apo A-I:n tuotantoa, eivät ole selvästi määriteltyjä.

9 89214

Enemmän kuin noin 90 % plasman sisältämästä apo A-I:stä on tyypillisesti liittynyt HDL:ään, vähemmän kuin noin yksi prosentti VLDL:ään ja LDL:ään, ja noin 10 % tai vähemmän on plasman lipoproteiinistä vapaan fraktion yhteydessä. Apo A-I:n määrät kussakin partikkelityypissä ovat erilaisia sen mukaan, kuka raportoi tuloksista, ja ne näyttävät riippuvan menetelmistä, joita on käytetty partikkelien erotuksessa.

(b) Apo A-I -lipoproteiinien kliininen merkitys HDL:n pääproteiinikomponentin, apo A-I:n, määrittäminen on kliinisesti tärkeää. Usean tutkimuksen tulokset ovat osoittaneet, että apo A-I -tasot laskevat henkilöillä, joilla on CAD. Tämä havainto painottaa plasman sisältämän apo A-I:n merkitystä tässä potilasryhmässä.

Usean tutkimuksen tulokset osoittavat, että mittaamalla apo A-I:n taso tarkkaan voi olla mahdollista nähdä ennalta henkilöä koskeva ennuste epänormaalille lipidiaineenvaihdunnal-le, ateroskleroosille, ja spesifisesti CAD:lie. Viimeaikaisen selvityksen tarkastelemiseksi, joka käsittää 2416 lasta, ks. Freedman et ai. (1986) New Eng. J. Med. 315:721-726. Apo A-I:n määrää yksistään ei ole kuitenkaan kyetty hyödyntämään osoittavalle aineelle epänormaalille lipidiaineenvaihdunnal-le jo pelkästään sen mittaamisen täsmällisyyteen ja tarkkuuteen liittyvän vaikeuden vuoksi. Näin ollen, vaikka suhteellisen korkeat apo A-I -tasot pyrkivät korreloimaan normaalin lipidiaineenvaihdunnan kanssa ja suhteellisen alhaiset tasot epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan ja CAD:n kanssa, selvää . rajalinjanvetoa normaalien henkilöiden ja niiden välillä, joilla tiedetään olevan CAD, ei ole tuotu esille.

Kuten aikaisemmin on määritelty, on todettu äärimmäisen vaikeaksi täsmällisesti ja tarkkaan kvantitoida apo A-I kliinisesti käyttökelpoisessa immunomäärityssysteemissä, kuten esimerkiksi radioimmunomääritys (RIA), entsyymikytkeinen immunomääritys (ELISA), elektroimmunomääritys (EIA), radiaa- li-immunodiffuusio (RID) tai immunonefelometria (INA). Ks. esi-merkiksi taulukko 1, Steinberg et ai. (1983) Clin. Chem.

ίο 8921 4 29/3:415-426. raportoitujen arvojen vaihtelusta käyttäen erilaisia menetelmiä.

Eräs näille analyyttisille vaikeuksille esitetyistä syistä on se, että apolipoproteiini A-I -molekyyli on läsnä plasmassa ja seerumissa osana suurta, biokemiallisesti heterogeenista partikkelia, jonka sisään jotkin molekyylin antigeenisistä paikoista (epitoopeista) ovat kätkeytyneet ja peittyneet. Sen seurauksena useat tutkijat ovat käyttäneet peittymisen avaavia käsittelyjä näytteilleen niin, että normaalisti kätkeytyneet epitoopit tulevat esille ja immuno-reaktion ulottuville.

Steinberg et ai. (1983) Clin. Chem. 2£:415-426 käsittelevät myös kohteen esille saattamista, käsittelemällä verinäytettä, kuten plasma tai seerumi, denaturoivilla aineilla kuten urea, tetrametyyliurea ja guanidiini, pinta-aktiivisilla aineilla kuten natriumdodekyylisulfaatti ja polyoksietyleeni (20)sorbitaanimonolauraatti (Tween 20), kuumentamalla esim. 52°C:ssa 3 tunnin ajan ja 37 C:ssa 2 tunnin ajan, ja lipidiä poistavilla orgaanisilla liuottimilla kuten esim. seoksilla etanoli ja dietyylieetteri, metanoli ja dietyylieetteri, kloroformi ja metanoli, ja vastaavilla. Muita spesifisiä esille saamiseen liittyviä käsittelyjä voi löytää julkaisuista, joita ovat raportoineet Maciejko et ai. (1982) Clin. Chem. 2£,:199-204 (pinta-aktiivinen aine); Koren et ai.

(1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95 (orgaaninen liuotin) ja Bury et ai. (1985) Clin. Chem. 11:247-251 (37°C, 2 tuntia).

Jotkut edellä olevista tutkijoista ja muut tutkijat ovat käyttäneet myös polyklonaalisia vasta-ainevalmisteita apo A-I:n heterogeenisuuden välttämisen helpottamiseksi, silloin kun sitä on plasmassa ja seerumissa. Maciejko et ai. (1982) Clin. Chem. 21:199-204; Koren et ai. (1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95; Bury et ai. (1985) Clin. Chem. 11:247-251; ja Fesmire et ai. (1984) Clin. Chem. 1Q:712-716. Polyklonaalis-ten vasta-aineiden käyttö kliinisesti käyttökelpoisessa kvantitatiivisessa immunomäärityksessä tuo tietysti mukanaan ,, 8921 4 vasta-aineaktiivisuuden eroista johtuvan haitan, joka johtuu useista eläimistä peräisin olevien seerumien käytöstä ja myös eroista immunospesifisyydessä seerumin eri erissä.

Toisaalta, lukuunottamatta tässä yhteydessä käytettyjä mo-noklonaalisia paratooppisia molekyylejä, kukaan muu tutkija ei ole kuvannut monoklonaalisia vasta-aineita, jotka immuno-reagoivat olennaisesti samalla tavalla HDL-partikkelien ja apo A-I:n kanssa, kuin myös immunoreagoivat olennaisesti kaiken sen apo A-I:n kanssa, joka on läsnä näytteen sisältämässä HDL:ssä. Curtiss et ai. (1985) J. Biol. Chem. 200: 2982-2998 raportoivat siten yhdestä monoklonaalisesta vasta-aineesta, jota merkittiin AI-7:llä, joka immunoreagoi suunnilleen samalla tavalla apo A-I:n ja HDL:n kanssa, mutta pystyi immunosaostamaan vain noin 60 % radioleimatusta apo A-I:stä tai HDListä, joiden tiedettiin olleen läsnä määritettävissä näytteissä.

2. Apolipoproteiini B-100 (a) Proteiini

Solujen LDL-reseptorit tunnistavat ja sitovat apo B -lajin, jota syntetisoidaan maksassa, ja jota nimitetään apolipoproteiini B-100:ksi (apo B-100). Sitomalla apo B-100:aa nämä reseptorit sitovat LDL-partikkeleita ja vetävät niitä pois plasmasta. LDL joutuu siinä yhteydessä solujen sisään ja hajotetaan ja se vapauttaa kolesterolinsa palvelemaan kunkin solun tarpeita. Apo B-LDL-reseptori -vuorovaikutuksella on siten huomattava merkitys LDL-kolesterolin poistamisessa verenkierrosta, ja kaikki LDL-partikkelit sisältävät apo B-10 0 j aa.

(bl_ Apo B-100 -lipoproteiinin kliininen merkitys Päinvastoin kuin apo A-I:llä ja HDLtllä, korkeat apo B:n tasot on yhdistetty epänormaaliin lipidiaineenvaihduntaan ja CAD:hen, kun taas alemmat määrät pyrkivät korreloimaan normaalitilan ja alentuneen tautiriskin kanssa. Kylomikronipar-tikkelit sisältävät tärkeätä apo B -proteiinia, jota nimitetään apo B-48:ksi, joka myös on apo B -geenin tuote (Young 12 89214 et ai. (1986) J. Biol. Chem. 261:2995-2998) ja jolla on apo B-l00:n kanssa yhteisenä vähintään yksi ristireaktiivinen epitooppi. VLDL- ja LDL-partikkelit sisältävät apo B-lOO:aa. Näistä kahdesta proteiinista apolipoproteiini B-100 (apo B-100) näyttää olevan tärkeämpi epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan ja CAD:n kannalta.

Äskettäin useat tutkijat ovat esittäneet, että plasman apo B-100 -tasot saattavat ennustaa paremmin CAD-riskin kuin plasman LDL-kolesterolitasot. Sniderman et ai. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:604-608. Samoin kuin oli asianlaita HDL:n ja apo A-I:n kanssa, mitään selvää rajalinjaa ei ole määritelty yksistään apo B-100:n tai LDL:n tasoista, joilla voidaan identifioida henkilö, jolla on epänormaali lipidiai-neenvaihdunta tai jonka CAD-riski on lisääntynyt.

Monenlaisia plasman apoproteiini B:n immunomäärityksiä on selostettu, joissa käytetään spesifisiä vasta-aineen sisältäviä antiseerumeita mukaan lukien kompetitiiviset neste- ja kiinteäfaasiset RIA:t, ELISA:t, RID:t ja muut. Näiden apo B -immunomääritysten laajalle levinneitä käyttösovellutuksia rajoittavia ongelmia ovat olleet toistettavuus, ja käytettyjen antiseerumien laatu ja spesifisyys. Katsauksia kunkin erityyppisen apo B -määrityksen metodologisista ongelmista on löydettävissä julkaisuista Currey et ai. (1978), Clin. Chem. 2^:280-286 ja Rosseneu et ai. (1983), Clin. Chem. 22:427-433.

Useat tutkijat ovat raportoineet monoklonaalisten vasta-aineiden paneelien kehittämisestä ihmisen apo B:tä vastaan käytettäväksi sen antigeenisen rakenteen ja merkityksen tutkimiseksi lipoproteiiniaineenvaihdunnassa. Esillä on lisäksi ollut selostuksia anti-apo B:n monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämisestä plasman apo B -tasojen määrittämiseksi nestefaasissa RIA-määrityksissä. Patton et ai. (1983) Clin. Chem. 22:1898-1903; Maynard et ai. (1984) Clin. Chem. 30:1620-1624 ja Young et ai. (1986) Clin. Chem. 22.:1484- 13 892 1 4 1490. Eräs ryhmä on lisäksi raportoinut anti-apo B:n mono-klonaalisten vasta-aineiden seoksen käyttämisestä radiaali-sessa plasman apo B:n immunodiffuusiomäärityksessä. Marcon-vina et ai. (1985) Clin. Chim. Acta 147:117-125. Näiden määritysmenetelmien haittapuolena kuitenkin on se, että on pakko käyttää pitkiä inkubointeja, toistuvia sentrifugointeja ja/tai radioaktiivisia materiaaleja.

3. Monoklonaaliset paratooppiset molekyylit reagensseina apo A-1:lie ia B-100:lle__

Monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sisältämien sitovien vasta-aineosien käyttäminen, so. paratooppisten molekyylien käyttäminen reagensseina apo A-I:n tai B-100:n läsnäolon määrittämiseksi ihmisen verinäytteistä on houkuttele-vaa, koska kerran aikaansaatuina sellaisia reagensseja voidaan tuottaa suhteellisen suurina määrinä tasalaatuisina ja välttää näin polyklonaalisille vasta-aineille ominainen vaihtelevuusongelma. On kuitenkin olemassa joukko tekijöitä, jotka toimivat, tietyn monoklonaalisen paratooppisen molekyylin käyttöä vastaan komponenttina sellaisissa määrityssys-teemeissä.

Käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta malliesimerkkinä monoklonaalisesta paratooppisesta molekyylistä on tunnettua, että monoklonaalinen vasta-aine voi olla liian immunospesi-finen ollakseen hyödyllinen johtuen sen kohdeantigeenin antigeenisestä heterogeenisuudesta. Tavanomaisten polyklo-naalisia vasta-aineita sisältävien antiseerumien spesifisyys esimerkiksi riippuu satojen tuhansien erilaisten vasta-aineiden yhdenmukaisuudesta, jotka sitoutuvat antigeenisiin determinantteihin peittäen suurimman osan tai kaiken anti-geeniproteiinista, mikä on todettu hyödylliseksi apo A-I -määrityksissä. Tästä johtuen pienet muutokset antigeenin rakenteessa johtuen geneettisestä polymorfismista, glykosy-laation heterogeenisuudesta tai lievästä denaturoitumisesta tai muusta reaktiosta eivät tavallisesti juuri vaikuta poly-klonaalisen vasta-aineen sitoutumiseen. Vastaavasti suurempi tai pienempi vasta-aineiden alaryhmä polyklonaalisista an- 14 89214 tiseerumeista sitoo yleensä antigeenejä, joita on modifioitu tai denaturoitu.

Päinvastaisesti monoklonaaliset vasta-aineet tavallisesti sitoutuvat yhteen antigeenimolekyylillä olevaan antigeeniseen determinanttiin (epitooppi). Jos sitä determinanttia jostain syystä muutetaan, vasta-aine voi tai ei voi jatkaa sitoutumista. Se, onko tämä ongelma vai etu, riippuu yksittäisistä olosuhteista. Jos, kuten esillä olevassa tapauksessa, monoklonaalista vasta-ainetta on tarkoitus käyttää apo-lipoproteiinin diagnostisessa määrityksessä, vähäinen antigeeninen muuntelu tuossa proteiinissa voisi aiheuttaa selvästi nähtäviä virheitä. Näin ollen, esimerkiksi Tsao et ai.

(1982) J. Biol. Chem. 2^2:15222-15228 ja Mao et ai. (1983) 2£:1890-1897 raportoivat, että jotkin monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä apo B -molekyyleille, sitoutuvat epitooppeihin, jotka eivät ilmenny kaikilla LDL-partikkeleilla. Sellaiset vasta-aineet eivät selvästikään olisi käyttökelpoisia plasman tai seerumin sisältämän kokonais-apo B-100:n kvantitoinnissa.

Apoproteiinien A-I antigeenistä heterogeenisuutta käsiteltiin edellä. Apo B-100:n heterogeenisuus on myös hyvin dokumentoitu. On todettu esimerkiksi, että apo B:n epitoopin ilmenemistä säätelevät (1) niiden yhteydessä olevien lipidien koostumus, (2) immunoreaktion lämpötila, (3) LDL:n eristys-aste luonnollisesta ympäristöstään, ja (4) yksilöiden välinen geneettinen ilmeneminen.

Toiseksi, ainutlaatuisen spesifisyytensä johdosta monoklo-naalisen vasta-aineen (Mab) tuloksekas käyttö on usein riippuvainen sen affiniteetista kohdeantigeeniin. Esimerkiksi, vaikka Mab saattaa sisältää riittävästi affiniteettia ollakseen tehokas sitomaan neste- ja kiinteäfaasista antigeeniä, silloin kun Mab itse on nestefaasissa, tuo sama vasta-aine ei ehkä ole käyttökelpoinen kiinteään faasiin sidottuna vasta-aineena, joka on tehokas sitomaan ja pidättämään antigeenin liuoksesta.

ib 8921 4

Edellä olevat ongelmat ovat yleisiä monoklonaalisten vasta-aineiden käytölle. Ne, jotka tuntevat alaa, ovat sen vuoksi todenneet, että on välttämätöntä testata ja karakterisoida monoklonaaliset vasta-aineet missä tahansa määrityssystee-missä, jossa niitä on tarkoitus käyttää. Ks. Goding, James W., Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice", Academic press, New York (1983), sivut 40-46.

Esillä oleva keksintö koskee paranneltua menetelmää epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan osoittavan aineen määrittämiseksi, kuin myös diagnostista systeemiä tyypillisesti rea-genssipakkauksen muodossa menetelmän suorittamiseksi. Sellaisessa määrityksessä määritetään apolipoproteiini B-100:n ja apolipoproteiini A-I:n määrät henkilön verinäytteen tila-vuusyksiköstä, ja apolipoproteiini B-100:n suhde apolipoproteiini A-1 reen määritetään yksiköttömänä lukuna. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esillä oleva parannus käsittää apolipoproteiini B-l00:n määrän määrittämisen ensimmäisestä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän ihmisen nestemäisen verinäytteen alikvootista sekoittamalla ensimmäinen nestemäinen näytealikvootti kiinteän kantajan kanssa, joka koostuu pääosin kiinteästä matriisista, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja ensimmäisiä monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunorea-goivat apolipoproteiini B-100:n kanssa, ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746, kiinteä-nestefaasisen seoksen muodostamiseksi. Kiinteän kantajan pinta sisältää suojattuja, epäspesifisiä, proteiinia sitovia paikkoja. Tuota seosta inkuboi-daan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka ensimmäisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n kanssa ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin, joka sisältää olen-naisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n.

« 89214

Edellä kuvaillun ensimmäisen nestemäisen näytealikvootin sisältämä apolipoproteiini B-100 sekoitetaan myös neste -faasisten, toisten monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa, joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-tal-letusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746, mutta joita ei käytetä aikaisemmissa sekoitusvaiheissa; so., monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, joita erittää toinen kahdesta edellisestä hybridoomasta, joita molekyylejä ei käytetä kiinteään faasiin sidottuina paratooppisina molekyyleinä, ja jotka ovat toiminnallisesti kytkettyinä entsyymi-indikaattoriin toisen seoksen muodostamiseksi. Tuota toista seosta inkuboidaan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka toisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan immunoreaktantin olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n kanssa. Kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka muodostuvat molempien paratooppisten molekyylien sekoittamisen ja im-munoreaktanttien muodostumisen jälkeen, erotetaan toisistaan, ja erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan, indikaattoriin sidottua apolipoproteiini B-100:a sisältävän immunoreaktantin määrä, ja siten näytteen tilavuusyksikön sisältämän apolipoproteiini B-100:n määrä määritetään.

Edullisessa suoritusmuodossa edelliset kaksi sekoitusvaihet-ta suoritetaan olennaisesti samanaikaisesti, ja kaksi inku-bointivaihetta suoritetaan yhdessä. Ensimmäiset paratooppiset molekyylit ja toiset, entsyymiin kytketyt paratooppiset molekyylit sekoitetaan siten näytteen kanssa olennaisesti samanaikaisesti, ja muodostunutta kiinteä-nestefaasista seosta inkuboidaan aika, joka molempien paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan olennaisesti kaiken näytteessä läsnä olevan apolipoproteiini B:n kanssa.

Henkilön nestemäisen verinäytteen toista näytealikvoottia, joka sisältää apolipoproteiini A-I:tä ja jota ei ole käsitelty peittymisen poistamiseksi, käytetään toisessa määrityksessä. Toinen nestemäinen näytealikvootti sekoitetaan 17 8 921 4 tässä yhteydessä kiinteän kantajan kanssa, joka käsittää pääasiallisesti kiinteän matriisin, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja kolmansia monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa, ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, kolmannen kiinteä-nestefaasisen seoksen muodostamiseksi. Kiinteän kantajan pinta sisältää jälleen suojattuja, epäspesifisiä, proteiinia sitovia paikkoja. Kolmatta kiinteä-nestefaasista seosta in-kuboidaan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka kolmansien paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan olennaisesti kaiken näytealikvoo-tissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n kanssa ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n.

Sama, toinen nestemäinen näytealikvootti, joka sisältää apolipoproteiini A-I:tä, sekoitetaan nestefaasisten, neljänsien monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa, ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, mutta joita ei käytetä aikaisemmassa sekoitusvaiheessa; so. toiset paratooppiset molekyylit . . kuin ne, joita käytettiin osana kiinteää kantajaa, ja jotka ovat toiminnallisesti kytkettyjä entsyymi-indikaattoriin neljännen seoksen muodostamiseksi. Neljättä seosta inkuboi-daan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka neljänsien, indikaattoriin kytkettyjen paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan immuno-reaktantin olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n kanssa. Kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka muodostuvat molempien edellisten paratooppisten molekyylien sekoittamisen ja immunoreaktanttien muodostumisen jälkeen, erotetaan toisistaan, ja erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan indikaattoriin sidottua apoli-poproteiini A-I:tä sisältävän immunoreaktantin määrä, ja ie 89214 siten näytteen tilavuusyksikön sisältämän apolipoproteiini A-I:n määrä määritetään.

On myös edullista, että kaksi edellistä sekoitusvaihetta suoritetaan olennaisesti samanaikaisesti, ja että edelliset kaksi inkubointivaihetta suoritetaan yhdessä. Kiinteään faasiin sidotut paratooppiset molekyylit, entsyymikytkeiset paratooppiset molekyylit ja näytealikvootti sekoitetaan siten jälleen olennaisesti samanaikaisesti yhdessä, ja niitä inkuboidaan kunnes kiinteät ja nestemäiset faasit erotetaan toisistaan.

Erityisen edullisissa suoritusmuodoissa edelliset apolipoproteiini B-100:n ja apolipoproteiini A-I:n määritykset suoritetaan käyttämällä edullisia suoritusmuotoja siten, että kussakin määrityksessä kiinteään faasiin sidotut monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, nestefaasiset, entsyymi-indikaattoriin sidotut monoklonaaliset paratooppiset molekyylit ja näytealikvootti sekoitetaan olennaisesti samanaikaisesti, ja että niitä inkuboidaan sen jälkeen ajanjakso, joka kunkin seoksen sisältämän kummankin paratooppisen molekyylin kannalta on riittävää immunoreagoimaan olennaisesti kaiken kussakin seoksessa läsnä olevan vastaavan apolipoproteiini B-100:n ja A-I:n kanssa.

Kaikissa mainituissa määrityksissä on edullista, että ensin mainitut, kiinteään faasiin sidotut monoklonaaliset paratooppiset molekyylit ovat sellaisia, joita erittää hybridoo-ma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746, ja että kolmannet, kiinteään faasiin sidotut paratooppiset molekyylit ovat sellaisia, joita erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9200.

Toinen tämän keksinnön mukainen näkökohta käsittää diagnostisen systeemin, tyypillisesti kittimuodossa. Sellainen systeemi käsittää vähintään erillisiä pakkauksia tai astioita, joissa kussakin on läsnä yhtä edellä käsitellyistä mono-klonaalisista paratooppisista molekyyleistä määränä, joka 19 892 1 4 riittää suorittamaan yhden määrityksen apo B-100 suhteesta apo A-I:een. Toinen paratooppisten molekyylien pareista, jotka immunoreagoivat apo B-l00:n kanssa, ja toinen paratooppisten molekyylien pareista, jotka immunoreagoivat apo A-I:n kanssa, ovat toiminnallisesti kytkettyjä entsyymi-in-dikattoriin.

Edullisemmin, vastaavat monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, jotka eivät ole kytkettyjä kullekin kuuluvaan indikaattoriin, ovat erikseen kytketyt kiinteäfaasisiin matriiseihin erillisten, kiinteäfaasisten kantajien muodostamiseksi .

Kunkin sellaisen kantajan pinnat sisältävät suojattuja, ei-spesifisiä, proteiineja sitovia paikkoja. Sellaisten kiinteiden kantajien kiinteät matriisit muodostavat vastaaville paratooppisille molekyyleille astian tai pakkauksen.

Tulee käsittää, että vaikka paratooppisille molekyyleille on annettu tiettyjä numeroita; so., ensimmäinen, toinen, kolmas ja neljäs, kuten on asia niitä sisältävillä pakkauksilla diagnostisissa systeemeissä, sellaisia numeroita käytetään ainoastaan identifiointitarkoituksiin, eivätkä ne osoita sitä järjestystä, jossa sellaiset paratooppiset molekyylit lisätään näytealikvoottiin, tai jolla pakkausten sisältöjä käytetään.

Samalla tavalla tulisi ymmärtää, että edellä mainituille seoksille on annettu tiettyjä samanlaisia numeroita kuin lisättäville paratooppisille molekyyleille, mutta sellaisia seoksia ei tarvitse muodostaa mainitussa järjestyksessä.

Näin ollen, esimerkiksi edellä mainitun toisen näytealikvoo-tin sekoittaminen kolmansien ja neljänsien monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa voi tapahtua ajallisesti ennen edellä mainitun ensimmäisen näytealikvootin sekoittamista ensimmäisten ja toisten paratooppisten molekyylien kanssa. Samalla tavoin, kuten jo on todettu, ensimmäiset ja 20 89214 toiset paratooppiset molekyylit voidaan sekoittaa olennaisesti samanaikaisesti.

Esillä oleva keksintö sisältää useita hyötyjä ja etuja. Huomattavana noiden hyötyjen ja etujen joukossa on se tosiseikka, että käytettäessä tämän jälkeen kuvattuja määritysmenetelmiä, voidaan saada aikaan osoittava aine epänormaalia lipidiaineenvaihduntaa varten, joka korreloi sepelvaltimotaudin (CAD) kanssa ja joka on tarkka ja luotettava.

Toinen etu ja hyöty, joka sisältyy esillä olevaan keksintöön, on se, että sen sisältämiä määrityksiä voidaan suorittaa halutun tarkasti ja täsmällisesti suhteellisen lyhyessä ajassa, esim., noin yhden tunnin ajanjakson sisällä, jos niin halutaan.

Vielä toinen esillä olevan keksinnön mukainen etu ja hyöty on se, että vaikkakin sen sisältämä menetelmä antaa käyttöön hyvin tarkkoja ja täsmällisiä apo B-100:n, apo A-I:n ja suhdetta osoittavan aineen mittauksia, nuo mittaukset saadaan toteutettua ilman radioaktiivisten aineiden käyttöä ja ilman haittoja, joita sellaisten alkuaineiden käyttö normaalisti tuottaa.

Vielä muita hyötyjä ja etuja, jotka koskevat esillä olevaa keksintöä, tulee käymään selväksi niille, jotka tuntevat alaa seuraavassa keksintöä koskevassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa.

Osan kuvauksesta muodostavissa kuvioissa:

Kuvio 1 on graafinen esitys, joka osoittaa 125I-leimattujen LDL-partikkelien prosenttiosuutta, joita monoklonaalinen vasta-aine MB47 sitoo (ordinaatta) sen molaaristen pitoisuuksien kasvaessa (abskissa; Ab-pitoisuus (MB47)) neste-faasisessa radioimmunomäärityksessä (RIA).

LDL valmistettiin 10 henkilön yhteenkerätystä plasmasta (-----) tai yhdestä normolipidemisestä henkilöstä 2i 8921 4 (_) . Plasma saatiin henkilöiden plasmaforeesin avulla, jota edelsi suunnilleen 12 tunnin paastoaika.

Kuvio 2 sisältää kaksi graafista esitystä. Esityksessä A kuvataan tunnettujen väkiomääräisten piparjuuriperoksidaa-silla leimattujen MB47 (HRP0-MB47)-molekyylien kykyä im-munoreagoida kiinteään faasiin sidotun apo B-100-reagenssin kanssa MB24-molekyylien ollessa läsnä kasvavina määrinä. Ordinaattana on suhteelliset optisen tiheyden yksiköt, kun taas abskissa on esitetty mikrogrammayksikköinä millilitraa kohti ^g/ml) leimaamatonta vasta-aineproteiinia lisättynä kilpailijana.

Vakiomäärä (20 μg) HRPO-kytkeisiä MB47-molekyylejä sekoitettiin olennaisesti samanaikaisesti kasvavien määrien kanssa leimaamattomia MB47 U)-molekyylejä tai leimaamattomia MB24 (·)-molekyylejä tai kiinteään faasiin sidottua apo B-100-reagenssia (LDL). Seoksia inkuboitiin kolmen tunnin ajan 25°C:ssa, sallien täten paratooppisten MB24- ja MB47-mole-kyylien reagoida immunologisesti apo B-100-reagenssin kanssa ja muodostaa kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin. Kiinteään faasiin sidotun leimatun MB47:n määrä määritettiin sen jälkeen kuten on kuvattu Materiaalit ja Menetelmät -jakson sisältämässä osassa Kompetitiivinen ELISA.

Esityksessä A valaistaan sitä, että leimaamattomien paratooppisten MB47-molekyylien ollessa läsnä kasvavina määrinä immunoreaktioseoksessa vastaavasti alentaa leimattujen MB47-molekyylien määrää, joka on sidottuna kiinteäfaasisena im-munoreaktanttina. Leimaamaton MB47 kilpailee näin ollen lei-• matun MB47:n kanssa LDL:stä.

Esityksessä A valaistaan myös, että kasvavat määrät leimaa-mattomia MB24-molekyylejä eivät merkitsevästi alenna leimatun MB47:n määrää, joka on sidottuna kiinteäfaasisena im-munoreaktanttina. Leimaamattomat MB24-molekyylit eivät näin f ': ollen kilpaile leimattujen MB47-molekyylien kanssa sitoutu misesta LDL:ään.

22 8921 4

Kuviossa B valaistaan sitä, että samanlaisia tuloksia saadaan käyttämällä HRPO-leimattuja MB24-molekyylejä ja leimaa-mattomia MB47-molekyylejä. Paratooppiset MB47- ja MB24-mo-lekyylit sitoutuvat sen vuoksi eri epitooppeihin, jotka sijaitsevat riittävästi erillään apo B-100:n pinnalla, mikä siten sallii molempien molekyylien sitoutua yhteen ainoaan apo B-100 -molekyyliin ilman, että ne kilpailevat steerises-ti ja estävät toistensa sitoutumista.

Kuvio 3 sisältää kaksi graafista esitystä merkittynä A ja B. Esityksessä A valaistaan kykyä, jolla tunnettu vakiomäärä (0,375 μ9/πι1) piparjuuriperoksidaasilla leimattuja AI-10 immunoreagoi kiinteään faasiin sidotun apo A-I-reagenssin kanssa leimaamattomien AI-10 (a)- ja AI-11 ()-molekyylien ollessa läsnä kasvavina määrinä. Ordinaattana on suhteellisen optisen tiheyden yksiköt, kun taas abskissa on esitetty mikrogramma(^g)-yksikköinä lisättyjä leimaamattornia kilpailevia monoklonaalisia vasta-aineita. Tämä tutkimus on samanlainen kuin kuviossa 2 käsitelty, ja sen yksityiskohtia käsitellään Materiaalit ja Menetelmät -jaksossa.

Esitys A:n mukaisesti leimaamattomien AI-10-molekyylien määrien kasvaminen immunoreaktioseoksessa alentaa vastaavasti leimatun AI-10:n määrää, joka on sidottuna kiinteäfaasisena immunoreaktanttina. Leimaamaton AI-10 kilpailee näin ollen leimatun AI-10:n kanssa apo A-I:stä.

Esityksen A mukaisesti myös leimaamattomien AI-11-molekyylien määrien lisääminen ei merkitsevästi alenna leimattujen AI-10-molekyylien määrää, jotka ovat sitoutuneina kiinteäfaasisena immunoreaktanttina. Leimaamattomat AI-11-molekyylit eivät näin ollen kilpaile leimattujen AI-10-molekyylien kanssa sitoutumisesta apolipoproteiini A-I:een.

Esityksessä B kuvataan, että samanlaisia tuloksia saadaan käyttämällä HDL:ää antigeeninä vakiomäärän (0,375 μg/ml) kanssa HRPO-leimattuja AI-10-molekyylejä ja leimaamattomia AI-11-molekyylejä () ja AI-10-molekyylejä (a). AI-10- ja 23 8921 4 AI-11 molekyylit sitoutuvat sen vuoksi eri epitooppeihin, jotka sijaitsevat riittävän erillään HDL:ää olevien apo A-I:n tai apo A-I:n pinnalla, mikä mahdollistaisi molempien monoklonaalisten vasta-ainemolekyylien sitoutumisen yhteen ainoaan apo A-I-molekyyliin ilman, että ne kilpailevat stee-risesti ja inhiboivat toistensa sitoutumista.

I. Yleistä A. Määritelmät

Ilmaisu "vasta-aine" viittaa molekyyliin, joka on jäsenenä glykosyloitujen proteiinien ryhmässä, joita nimitetään im-munoglobuliineiksi, jotka voivat spesifisesti liittyä antigeeniin. Sellainen vasta-aine yhdistyy antigeeninsa kanssa spesifisellä immunologisella sitoutumisvuorovaikutuksella antigeenin sisältämän antigeenisen determinantin ja vasta-aineen sisältämän vasta-aineen sitoutumispaikan välillä.

"Vasta-aineen sitoutumispaikka" on se vasta-ainemolekyylin sisältämä rakenteellinen osa, joka käsittää raskasketjun ja kevytketjun muuntuvia ja hypermuuntuvia alueita, jotka sitovat spesifisesti antigeenin. Käyttämällä Jernen nimistöä (1974) Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125£:373-389, vasta-aineen sitoutumispaikkaa nimitetään tavallisesti tässä yhteydessä "paratoopiksi".

Vasta-aineiden sisältämät vasta-aineiden sitoutumispaikan sisältävät (paratoopin sisältävät) polypeptidiosat ovat niitä osia vasta-ainemolekyyleissä, jotka sisältävät paratoopin ja sitoutuvat antigeeniin ja sisältävät, esimerkiksi, vasta-aineiden sisältämiä Fab-, Fab'-, F(ab')2 ja F(v)-osia. Vasta-aineiden sisältämiä Fab- ja F(ab')-osia valmistetaan pa-paiinin ja pepsiinin proteolyyttisen reaktion avulla, tässä järjestyksessä, käyttäen olennaisesti käsittelemättömiä vasta-aineita hyvin tunnetuilla menetelmillä. Katso esimerkiksi, US-patentti 4 342 566 (Theofilopoulosille ja Dixonille). Fab' vasta-aineosat ovat myös hyvin tunnettuja, ja niitä valmistetaan F(ab')-osista disulfidisidosten pelkistämisen 24 8921 4 jälkeen, jotka sidokset yhdistävät kahta raskasketjuosaa, esimerkiksi merkaptoetanolilla, ja muodostuneen proteiini -merkaptaanin alkyloinnin jälkeen reagenssilla, kuten jo-diasetamidilla. Käsittelemättömät vasta-aineet ovat edullisia, ja niitä käytetään kuvastamaan tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia ligandimolekyylejä.

Sanaa "antigeeni" on käytetty perinteisesti tarkoittamaan kokonaisuutta, jonka vasta-aine sitoo, ja tarkoittamaan myös kokonaisuutta, joka indusoi vasta-ainetuotannon. Nykyisempi käyttö rajoittaa antigeenin merkityksen sellaiseksi kokonaisuudeksi, jonka vasta-aine sitoo, kun taas sanaa "immunogee-ni" käytetään kokonaisuudesta, joka indusoi vasta-ainetuotannon. Silloin kun tässä yhteydessä käsiteltävä kokonaisuus on sekä immunogeeninen että antigeeninen, sitä nimitetään yleensä antigeeniksi.

Ilmaus "antigeeninen determinantti" viittaa antigeenin sisältämään varsinaiseen rakenneosaan, jonka vasta-aineen si-toutumispaikka sitoo immunologisesti. Jernen nimistössä antigeeninen determinantti määritellään uudelleen "epitoopik-si".

Ilmaus "biologisesti aktiivinen" viittaa ainakin prote-iinimaisen molekyylin kykyyn sitoa spesifisesti antigeeni tai spesifinen vasta-aineen sitoutumispaikka, vaikka siinä molekyylissä voi yhtä hyvin olla läsnä muuta yleistä tai vaikuttavaa kykyä.

Paratooppisen molekyylin, joka sisältää vasta-aineen sitou-tumispaikan, biologinen aktiivisuus tulee esille paratoopin (vasta-aineen sitoutumispaikka) immunologisessa reaktiossa epitooppinsa (antigeeninen determinantti) kanssa niiden sekoittamisen yhteydessä vedellisessä alustassa immunoreaktan-tin muodostamiseksi, ainakin fysiologisissa pH-arvoissa ja ionivahvuuksissa. Biologinen aktiivisuus tulee edullisesti esille biologisissa määritysolosuhteissa; so., niissä olosuhteissa, joissa tämän keksinnön mukaisesti käyttökelpoinen 25 8921 4 monoklonaalinen paratooppinen molekyyli sitoutuu epitooppiin (antigeeninen determinantti) pH-arvoalueella noin 5 - noin 9, ionivahvuuksissa kuten esimerkiksi tislatun veden ioni-vahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin ionivahvuu-teen, ja lämpötiloissa noin 4°C - noin 45°C. Tässä yhteydessä käytetyt hyödylliset monoklonaaliset paratooppiset molekyylit ovat kaikki biologisesti aktiivisia.

"ELISA" viittaa entsyymikytkeiseen immunosorbenttimäärityk-seen, jossa käytetään antigeeniä tai vasta-ainetta sidottuna kiinteään faasiin, ja entsyymivasta-aine- tai entsyymianti-geenikonjugaattia näytteessä läsnä olevan antigeenin tai vasta-aineen määrän ilmaisemiseksi. Kuvaus ELISA-tekniikasta on löydettävissä luvusta 22 teoksessa Basic and Clinical Immunology, 4. painos, D.P. Sites et ai., julkaisijana Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1982, ja US-patenttijulkaisuista 3 654 090, 3 850 752 ja 4 016 043, jotka on liitetty tässä yhteydessä viitteiksi.

"Entsyymi" viittaa proteiiniin, joka pystyy kiihdyttämään tai tuottamaan katalyyttisellä vaikutuksella jonkin muutoksen substraatissa, jolle se usein on spesifinen.

"Immunoreaktantti", tässä käytettynä, viittaa immunologisen reaktion tuotteeseen; so. siihen kokonaisuuteen, jota syntyy, kun vasta-aine tai molekyyli, joka sisältää paratoopin, sitoo immunologisesti antigeenin. Immunoreaktantti on siten molekyylien välillä muodostunut erityinen kompleksilaji.

Ilmaisuja "indikaattori", "entsyymi-indikaattori" tai "leima" käytetään tässä samaa merkitsevinä erilaisissa muodoissa viittaamaan entsyymeihin, jotka ovat suoraan osallisina ilmaistavissa olevan signaalin tuottamisessa niiden läsnäolon osoittamiseksi. Paratooppisten molekyylien ollessaan liittyneinä entsyymileimoihin, sanotaan myös joskus tässä yhteydessä olevan entsyymikytkeisiä paratooppisia molekyylejä.

26 8921 4

Ilmaisua "kokonainen vasta-aine" käytetään tässä yhteydessä erottaman solun erittämä täydellinen, koskematon molekyyli muista, pienemmistä molekyyleistä, jotka myös sisältävät biologisen aktiivisuuden kannalta välttämättömän paratoopin immunoreaktiossa epitoopin kanssa.

Esillä olevaa keksintöä koskevat paratooppiset molekyylit, jotka ovat käyttökelpoisia, ovat monoklonaalisia paratooppi-sia molekyylejä. "Monoklonaalinen vasta-aine" (Mab) on hyb-ridooman kloonien tuottama vasta-aine, joka hybridooma erittää vain yhdenlaatuista vasta-ainemolekyyliä, ja monoklonaalinen paratooppinen molekyyli on monoklonaalinen vasta-aine tai sen paratoopin sisältävä polypeptidiosa, kuten jäljempänä tulee esille. Hybridoomsolu muodostetaan yhteen-sulauttamalla vasta-ainetta tuottava solu ja myelooma- tai muu jatkuvasti lisääntyvä solulinja. Sellaisia vasta-aineita kuvasivat ensiksi Kohler ja Milstein, Nature, 256. 495-497 (1975), joka kuvaus on sisällytetty tässä viitteenä.

Ilmaisuja "monoklonaalinen paratooppinen molekyyli" ja "paratooppinen molekyyli" pelkästään, käytetään vaihtovuoroi-sesti ja kollektiivisesti tässä viittaaman molekyylilajiin, joka sisältää monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumispaikan, ja sisältää kokonaisen monoklonaalisen vasta-aineen, olennaisesti kokonaisen monoklonaalisen vasta-aineen ja vasta-aineen sitoutumispaikan sisältävän osan monoklonaalisesta vasta-aineesta. Merkinnöillä MB47, MB24, AI-10 ja AI-11 varustetut kokonaiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat tämän keksinnön mukaisia kuten ovat noiden kokonaisten vasta-aineiden osat, jotka sisältävät paratoopin. Ilmaisuja "monoklonaalinen paratooppinen molekyyli" tai "paratooppinen molekyyli" käytetään yksin tässä, kun tarkoitetaan yleistä biologisesti aktiivista molekyyliä, joka sisältää edellä olevien monoklonaalisten vasta-aineiden sisältämän paratoopin. Ilmaisuja MB47, MB24, AI-10 ja AI-li sanojen "paratooppinen molekyyli" kanssa ja ilman, käytetään silloin kun tarkoitetaan spesifisiä, kokonaisia vasta-aineitä, joita ovat 27 8921 4 tuottaneet hybridoomat ATCC HB 8742, HB 8746, HB 9200 tai HB 9201.

Sanoja "erittää" ja "tuottaa" käytetään usein vaihtovuoroi-sesti alalla koskien soluja, joista vasta-ainemolekyylejä saadaan. Solut, jotka tuottavat vasta-aineita, eivät ehkä kuitenkaan eritä noita molekyylejä ympäristöönsä. Tässä yhteydessä kiinnostuksen kohteena olevat hybridoomasolut erittävät monoklonaalisia vasta-aineita ympäristöönsä. Siitä huolimatta sellaisia soluja nimitetään tässä yhteydessä joskus "vastaaineita tuottaviksi" soluiksi, ja niiden vasta-aineiden sanotaan joskus olevan "tuotettuja" pitäytymällä alalla käytetyssä ilmaisussa. Edellisten vasta-aineiden pa-ratoopin sisältävien polypeptidiosien sanotaan tässä yhteydessä samalla tavoin olevan "tuotettuja" tai "eritettyjä", vaikka tulisi ymmärtää, että sellaisia molekyylejä valmistetaan vasta-aineista, joita itseään "tuotetaan" tai "eritetään".

Ilmaisuja "supernaatti" ja "supernatantti" käytetään vaihto-vuoroisesti tässä yhteydessä, ja ne viittaavat nestemäiseen in vitro -alustaan, jossa soluja viljellään. Monoklonaaliset vasta-aineet, joita ovat tuottaneet tässä kiinnostuksen kohteena olevat hybridoomaviljelmät, eritetään kasvualustaympä-ristöönsä. Noiden solujen kasvualustasupernaatti on sen vuoksi yksi edullinen monoklonaalisen paratooppisen molekyylin lähde, ja sitä saadaan helposti ilman hybridoomasoluja hyvin tunnetuilla tekniikoilla. Tyypillinen sellainen menetelmä on pieninopeuksinen sentrifugointi solujen laskeutta-miseksi nestemäisestä alustasta. Monoklonaalisia paratooppi-sia molekyylejä voidaan vaihtoehtoisesti saada ascites-tuu-morinesteestä (vatsaonteloneste) laboratorioeläimistä, joihin hybridoomakudosta siirrostettiin. Molempia menetelmiä kuvataan tämän jälkeen.

Ilmaisu "olennaisesti samanaikaisesti", käytettynä tässä yhteydessä koskien kolmen tai useamman antigeenin ja paratooppisen molekyylikomponentin sekoittamista immunoreak- 28 89214 tioseoksen muodostamiseksi, tarkoittaa, että kaikki komponentit ovat läsnä ja sekoitettuina yksinkertaisena seoksena noin 15 minuutin sisällä toisistaan ja edullisesti noin 5 minuutin sisällä minkä tahansa kahden komponentin sekoittamisesta.

Ilmaisu "olennaisesti kaikki", käytettynä tässä koskien im-munoreaktiota, johon ottavat osaa paratooppinen molekyyli ja sen antigeeni, joko apolipoproteiini B-100 LDL:nä tai apoli-poproteiini A-I HDL:nä, immunoreaktantin muodostamiseksi, tarkoittaa sitä, että paratooppinen molekyyli immunoreagoi vähintään noin 90-%:isesti liuoksessa läsnä olevan antigeenin kanssa immunoreaktantin muodostamiseksi, kun paratoop-pista molekyyliä on läsnä ylimäärin. Edullisessa käytännössä paratooppinen molekyyli muodostaa immunoreaktantin läsnä olevan antigeenisen molekyylin kanssa yli 95-%:isesti, kun paratooppinen molekyyli on myös läsnä ylimäärin.

B. Hybridoomat ia monoklonaaliset paratooppiset molekyylit Esillä olevassa keksinnössä käytetään kahta kahden paratoop-pisen molekyylin paria, joita erittää neljä hybridoomaa. Toinen paratooppisten molekyylien pari immunoreagoi apolipoproteiini B-100:n kanssa. Toinen pari immunoreagoi apolipoproteiini AI:n kanssa.

Hybridoomat, jotka erittävät paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apo B-100:n kanssa, kantavat laborato-riomerkintöjä HL130C2.3C5 ja V82A6.1G4, ja kokonaiset monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, joita nuo hybridoomat erittävät, ovat tavallisesti tässä nimettynä MB47 ja MB24, vastaavasti. Kumpikin hybridoomien erittämistä paratooppi-sista molekyyleistä immunoreagoi 125I-LDL:n kanssa yli noin 90-%:isesti, ja selvästi erotettavan ja erillisen apo B-100:11a olevan konservoituneen antigeenisen determinantin kanssa. Kuten havaitaan tarkastelemalla kuvion 2 sisältämiä graafisia esityksiä A ja B, paratooppiset MB47-ja MB24-molekyylit sitoutuvat kumpikin apo B-100:aan kummankaan oleellisesti inhiboimatta toisen immunoreaktiota. Kuten 29 8921 4 on osoitettu julkaisussa Young et ai., (1986) Clin. Chem. 32/8:1484-1490. MB47 reagoi ainoastaan apo B-100:n kanssa, kun taas MB24 immunoreagoi apo B-100:n kanssa, kuin myös ristireagoi apo B-48:n kanssa, ja myös apo B-26:n kanssa, joka on osa apo B-100:sta, kuten käsitellään tämän jälkeen.

Toinen hybridoomapari kantaa laboratoriomerkintöjä H91H4 2H8 ja H103D8 1D11 ja erittää paratooppisia molekyylejä, joita on merkitty AI-10 ja AI-11, vastaavasti. Kumpikin näistä paratooppisista molekyyleistä AI-10 ja AI-11 immunoreagoi apo A-I:llä olevan konservoituneen antigeenisen determinantin kanssa ja immunoreagoi l25I-HDL-partikkelien kanssa yli noin 90-%:isesti kiinteäfaasisessa ELISA-määrityksessä. Kuten havaitaan tarkasteltaessa kuvion 3 sisältämiä graafisia esityksiä A ja B, kumpikin paratooppinen molekyyli AI-10 ja AI-11 sitoutuvat apo A-I:een ja HDLrään, mutta eivät olennaisesti häiritse toistensa sitoutumista.

Kukin edellisistä neljästä hybridoomasta talletettiin American Type Culture Collectioniin (ATCC), Rockville, MD, Budapestin sopimuksen mukaisesti (The Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure).

Paratooppinen ATCC

molekyylin Talletus- Talletus -

Hybridooma merkintä_numero_päivä_ V82A6.1G4 MB24 HB 8742 6.3.85 HL130C2.3C5 MB47 HB 8746 6.3.85 H91H4.2H8 AI-10 HB 9200 16.9.86 H103D8.1D11 AI-11 HB 9201 16.9.86

Edellä olevat talletukset tehtiin Budapestin sopimuksen vaa timusten mukaisesti siten, että talletuksen tulisi kestää 30 vuotta talletuspäivästä tai 5 vuotta tallenteen viimeisen kysynnän jälkeen talletuspaikasta tai US-patentin voimassaoloaika, joka kehittyy tästä hakemuksesta, mikä tahansa aika 30 89214 on pisin. Hybridoomat tulee korvata uusilla, jos ne tulisivat elinkyvyttömiksi talletuspaikassa, ja tullaan saattamaan saataviksi yleisölle ATCCrn kautta patentin julkaisemisen yhteydessä tästä hakemuksesta.

Aikaisemmin Curtiss et ai., (1982) J. Biol. Chem., 257: 15213-15221, raportoivat 11:n apo B:lle spesifisen para-tooppisen molekyylin tuottamisesta ja karakterisoinnista, mukaan lukien MB24 merkinnällä varustetut, joita tuotti hyb-ridooma HB 8742. Hybridooma HB 8742 saatiin yhteensulautta-malla ihmisen VLDL:llä immunisoituja hiiren splenosyyttejä myeloomasolujen kanssa.

MB24:n osoitettiin immunoreagoivan VLDLrssä LDL:ssä läsnäolevan denaturoidun apo B-100:n kanssa, kuin myös LDL:ssä läsnä olevan denaturoidun apolipoproteiini B-26:n kanssa ja identifioimattoman suurimolekyylipainoisen LDL-proteiinin kanssa tuossa julkaisussa. Uudemmassa työssä osoitettiin, että se sitoi apo B-48:aa. MB24:n osoitettiin immunoreagoivan 100-%risesti esillä olevan natiivin LDL-antigeenin kanssa nestefaasisessa RIA-määrityksessä julkaisussa Tsao et ai., (1982) J. Biol. Chem. 15222-15228.

MB24-sisältöisen ascites-nesteen IgG-fraktio, jota nestettä oli muodostunut vatsaontelonsisäisestä HB 8742:n kasvusta, karakterisoitiin isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF). Kuten todettiin julkaisussa Curtiss et ai., (1982) J. Biol. Chem., 257:15213-15221. fuusio suoritettiin käyttäen P3x63Ag8-mye-loomasoluja, jotka erittävät IgGjk-immunoglobuliinia (mye-loomaproteiini). Sen vuoksi, IEF:n yhteydessä, HB 8742-as-cites-nesteessä osoitettiin ainutlaatuinen, monen proteiini vyöhykkeen muodostama kuvio, jossa esiintyi umpimähkäi-sesti sekoittuneina raskas- ja kevytketjun sisältäviä im-munoglobuliinimolekyylejä, P3x63Ag8-myelooma IgGjk-vasta-aineen ja paratooppisten MB24-molekyylien lisäksi.

Hybridooma HB 8746 tuottaa paratooppisia MB47-molekyylejä ja muodostettiin sulauttamalla yhteen LDL:llä immunisoitujen 3i 8921 4 hiirten splenosyyttejä ja P3x63Ag8.653.1-myeloomasoluja. Tuo monoklonaalinen vasta-aine ja hybridooma tuotiin esille julkaisussa Young et ai. (1986), Arteriosclerosis, 6.:178-188. Tuo muunnos myeloomasolukantalinjaeta, jota käytettiin hyb-ridooman valmistuksessa, ei eritä myeloomaproteiinia. IEF HB 8746-ascites-nesteestä tuo esille erikoisen proteiinivyöhyk-keiden muodostaman kuvion, jossa esiintyi MB47:n IgG2a-ras-kasketjuja ja kappakevytketjuja.

Edellä olevat hybridoomat voidaan näin ollen karakterisoida osaksi niiden erittämien paratooppisten molekyylien IEF-kuvion avulla. Vaikka hybridooma HB 8742 tuottaa useampaa kuin yhtä paratooppista molekyylityyppiä, tämän keksinnön mukaiset hyödylliset paratooppiset molekyylit voidaan helposti identifioida ja eristää niille tunnusomaisten kykyjen perusteella immunoreagoida apo B-100:n pinnalla sijaitsevan epitoopin (antigeeniset determinantit) kanssa.

MB24:n ja MB47:n antigeenisiä spesifisyyksiä tutkittiin määrittämällä niille tunnusomaisia kykyjä immunoreagoida apo-proteiinien kanssa, jotka saatiin kylomikroneista, VLDLrstä, LDL:stä ja HDLrstä eri määrityksissä. Näin saadut tulokset osoittivat, että MB47 ja MB24 immunoreagoivat apo B-100:n kanssa, joka saatiin LDL:stä, VLDL:stä ja IDL:stä, mutta eivät apo B-48:n kanssa VLDL:stä tai kylomikroneista, eikä HDL:n kanssa. MB47:n ja MB24:n sisältämät Fab-kappaleet sitoutuvat myös LDL:ään kiinteäfaasisessa RIA-määrityksessä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet antigeenistä hete-rogeenisuutta apo B-l00:ssa, so. jotkin apo B-l00:n epitoo-pit eivät ilmenny kaikilla LDL-partikkeleilla. Täten, sekoittaminen tiettyjen monoklonaalisten vasta-aineiden ylimäärän kanssa nestefaasisessa RIA:ssa ei johda kaikkien ra-dioleimattujen LDL (125I-LDL)-partikkelien immunologiseen sitoutumiseen.

Sen määrittämiseksi, oliko MB47-molekyylien tunnistama epi-tooppi tasaisesti ilmentynyt kaikessa LDL:ssä, MB47:n kykyä 32 8921 4 sitoutua iiranunologisesti 125I-LDL:ään nestefaasisessa RIA:ssa tutkittiin. LDL, joka oli eristetty 10 normaalin yksilön yhteenkerätystä plasmasta ja yhdestä normaalista yksilöstä, radioleimattiin, kuten tämän jälkeen on kuvattu, ja sekoitettiin biologisesti aktiivisten MB47-molekyylien kanssa im-munoreaktioseoksen muodostamiseksi. Seosta inkuboitiin biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka MB47-molekyylien kannalta on riittävä immunologisesti sitoutumaan kunkin näytteen sisältämään apo B-100:aan ja muodostamaan immunoreaktiotuote {immunoreaktantti).

Paratooppisten MB47-molekyylien ylimäärän sitoma maksimaalinen 125I-LDL-määrä määritettiin saostamalla kaikki resepto-rimolekyylit IgSORBrlla (The Enzyme Co., Boston, MA) ja kvantitoimalla saostuman sisältämät 125I-LDL:ään kytkeytyvät pulssit gammalaskijalla. Tulokset ilmaistuna prosenttiosuutena trikloorietikkahapolla (TCA) saostunutta 125l-LDL:ää ja esitettynä kuviossa 1, osoittavat, että vasta-aine sitoi olennaisesti kaiken l25I-LDL:n, mikä osoittaa, että MB47:n tunnistama ja sitoma epitooppi ilmentyy kaikissa LDL-partik-keleissa.

Tämän keksinnön mukaista määritysmenetelmää varten ensimmäisten ja toisten monoklonaalisten paratooppisten molekyylien täytyy sitoutua eri epitooppeihin apo B-100-molekyylissä, ja niiden epitooppien on sijaittava riittävän erillään siten, ettei toisen paratooppisen molekyylin sitoutuminen steerisesti estä toisen paratooppisen molekyylin sitoutumista. MB47-.n ja MB24:n kykyä inhiboida kompetitiivisesti toistensa sitoutumista kiinteään faasiin kiinnitettyyn apo B-100 -reagenssiin tutkittiin sen vuoksi.

Sen tutkimuksen tulokset, esitettynä kuviossa 2, osoittavat, että 70-kertainen ylimäärä leimaamatonta MB24:ää ei merkitsevästi inhiboi peroksidaasilla leimattua MB47:ää sitoutumasta apo B-100-reagenssiin. Samalla tavoin 70-kertainen ylimäärä leimaamatonta MB47:ää ei merkitsevästi inhiboinut peroksidaasilla leimattua MB24:ää sitoutumasta apo B-100 33 8921 4 -reagenssiin. MB24 ja MB47 sitoutuvat täten apo B-100:11a sijaitseviin eri epitooppeihin, ja nuo epitoopit ovat riittävän erillään siten, että MB24 ja MB47 koskemattomina vasta-aineina eivät inhiboi toistensa sitoutumista yksittäiseen apo B-100 -molekyyliin.

Hybridoomia, jotka tuottavat monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä Al-10 ja AI-ll, valmistettiin hiiren splenosyyt-tien kahdesta erillisestä yhteensulauttamisesta hiiren mye-loomalinjan P3x63Ag8.653 solujen kanssa. Ihmisen HDL:ää käytettiin immunogeenina. AI-10-molekyylit kuuluvat IgG2a-luokkaan, kun taas AI-11-molekyylit kuuluvat IgGl-luokkaan.

Kuten voidaan nähdä kuvion 3 tarkastelusta, sekä AI-10 että AI-ll immunoreagoivat apo A-I:n kanssa. Kuvion 3 sisältämät tulokset kuvastavat edelleen, että joko AI-10:n tai AI-ll:n immunoreaktio apo A-I:n tai HDL:n kanssa ei häiritse toisen immunoreaktiota tuon antigeenin kanssa.

Sitoutumistutkimuksia käyttäen 125I-HDL:ää ja 125I-apo-A-I:tä suoritettiin käyttämällä RIA-menetelmää, kuten yleisesti on kuvattu julkaisussa Curtiss et ai. (1985) J. Biol. Chem.

260:2982-2993. Noiden tutkimusten tulokset esitetään jäljempänä taulukossa 1 prosenttiosuuksina kokonaistrikloorietik-kahapolla (TCA) saostuvana radioaktiivisuutena.

Taulukko I

AI-10tn 1a AI-11:n immunoreaktiivisuudet

Paratooppiset Antigeenin maksimaalinen sitoutuminen, % molekyylit3·*_125I-HDL2*_125I-Apo A-I2*_ AI-10 muodossa:

Supernatantti 29,2 90,3 ..... Ascites 92,6 FPLC Ascites 86,0 70,2 34 8921 4 AI-11 muodossa:

Supernatantti 88,6 42,0

Ascites 100,0 49,0 FPLC Ascites 93,0 60,4 1) Nestefaasisia paratooppisia molekyylejä hybridoomasolu-viljelmän supernatantista (Supernatantti), hiiren ascites-nesteestä (Ascites) ja nopealla proteiinien nestekromatogra-fialla puhdistetusta ascites-nesteestä (FPLC Ascites) 2) TCA-saostuvan radioaktiivisuuden prosenttiosuus

Tulokset taulukossa I kuvastavat kokonaisen AI-10:n ja Alli: n suhteellisen suurta sitoutumista radioleimattuun HDLrään käytetyssä nestefaasisessa määrityksessä. Noista tuloksista heijastuu myös suhteellista epästabiilisuutta ja tästä johtuvaa alhaista sitoutumista itse apo A-1reen. Tuo apolipoproteiini A-I:n suhteellinen epästabiilisuus on tehnyt välttämättömäksi käyttää HDLrää sekundäärisenä standardina apo A-I -määrityksissä kuten edelleen käsitellään tämän jälkeen. Edellä olevat tulokset kuvastavat myös AI-ll:n suhteellisesti alhaisempaa sitoutumista apo A-I:een kuin HDL-partikkeleihin. Siitä huolimatta tulosten vertaileminen, jotka on saatu käyttämällä ELISA-menetelmää apo A-I:lle, tulosten kanssa, jotka on saatu muilla, vaivalloisemmilla menetelmillä, osoittavat, että ELISA-menetelmä ilmaisee kvantitatiivisesti oleellisesti kaiken määritettävissä näytteissä läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n (HDL).

C. Epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan osoittava aine Kuten aikaisemmin mainittiin, useissa tutkimuksissa on osoitettu korrelaatio korkeiden LDL-tasojen ja suhteellisen alhaisten HDL-tasojen välillä, ja epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan johtavan CAD:hen ja täten lisääntyneeseen CAD-riskiin. Epänormaalilla lipidiaineenvaihdunnalla on myös merkitystä seurattaessa taudin kulkua henkilöillä, joilla on diagnosoitu kliinisesti olleen CAD. Nuo tutkimukset eivät ole kuitenkaan antaneet käyttöön osoittavaa ainetta eivätkä selvää valmista jakolinjaa niiden henkilöiden välillä, jotka 35 8 921 4 ovat normaaleja ja niiden, joilla on epänormaali lipidiai-neenvaihdunta.

Täten esim· Kottke et ai. (1986) Mayo Clin. Proc. 61:313-320 mittasivat seerumin apolipoproteiinien A-I, A-II ja B, HDL-kolesterolin, triglyseridien tasot, ja iän, muuttujina miehillä, ja havaitsivat, että kaikkien noiden kuuden muuttujan käyttö oli tarpeen CAD-potilaiden erottamiseksi oireettomista kontrolleista. Nuo tutkijat käyttivät radioimmunomääri-tyksiä apolipoproteiinimäärityksiinsä.

Polyklonaalisia vasta-aineita, 16 tunnin vasta-aineen ja näytteen inkubointiaikaa, ja peittymisen poistamista deter-genttikäsittelyllä käytettiin Kottken et ai. mukaan apo A-I-arvojen RIA-määritykseen. Monoklonaalista vasta-ainetta käytettiin ilmoituksen mukaan apo B:n RIA-mittaukseen. Kottke et ai. raportoivat seerumin apo A-I:n keskiarvoja normaaleista ja CAD-potilaista, jotka arvot eivät peittäneet toisiaan yhden keskipoikkeaman sisällä. Heidän keskimääräiset seerumin apo B-arvonsa noiden kahden ryhmän välillä peittivät toisensa yhden keskipoikkeaman alueella. Nuo tutkijat eivät ilmoittaneet apo B ja apo A-I-arvojensa suhdetta.

Lisäksi Bentzen et ai. (1982) Clin. Chem. 2fi:1951-1956 ilmoittivat käyttäneensä beetalipoproteiinikolesterolin (LDL-kolesteroli) suhdetta alfalipoproteiinikolesteroliin (HDL-kolesteroli) osoittavana aineena osoittamaan potilaan sydän-halvaus- tai sepelvaltimotautiriskiä verrattuna HDL-koleste-rolin käyttöön pelkästään. Lipoproteiinikolesteroliarvot ovat tietenkin erilaisia LDL:stä ja apo B-100:sta tai HDL:stä ja apo A-I:stä, ja noiden tutkijoiden käyttämä mene-. . telmä, joka perustui affiniteettikromatografiaan hepariini- agaroosin päällä, eroaa suuresti tässä yhteydessä käytetystä menetelmästä.

36 8921 4 II Parannettu menetelmä

Esillä olevan keksinnön mukaisesti, apolipoproteiini B-l00:n suhdetta apolipoproteiini A-I:een nestemäisessä verinäytteessä käytetään osoittavana aineena epänormaalille lipidi -aineenvaihdunnalle henkilöillä, joilla ei ole todettu olleen tautia, kuin myös diagnosoiduilla CAD-potilailla. Heti kun CAD tai epänormaali lipidiaineenvaihdunta todetaan määritysmenetelmän avulla, henkilöä hoidetaan tyypillisesti tavanomaisella hoidolla, kuten esimerkiksi liikunta, ruokavalio tai erityiset lääkeaineet, kuten hyvin tiedetään.

Tässä menetelmässä käytetään nestemäistä verinäytettä. Näyte voi olla joko seerumi tai plasma, koska tulokset, jotka on saatu käyttämällä kumpaakin, on todettu tilastollisesti erottumattomiksi. Todellakin, jotkin tulokset, joita on selostettu tämän jälkeen, käyttäen tätä menetelmää, saatiin käyttämällä keskimääräisiä arvoja, jotka on saatu sekä seerumin että plasman määrityksistä. Riippumatta siitä, käytetäänkö seerumia vai plasmaa, nestemäinen verinäyte otetaan edullisesti henkilöiltä, jotka ovat paastonneet vähintään noin kaksitoista tuntia, kuten alalla hyvin tiedetään. Sellaista verinäytettä nimitetään "paasto"-näytteeksi.

Oli yllättävää, että voitiin saada tarkkoja ja täsmällisiä tuloksia käyttämällä nykyisiä ELISA-menetelmiä nestemäisellä verinäytteellä, kuten plasma tai seerumi, koska nuo näytemateriaalit sisältävät proteiineja, lipidejä ja muita yhdisteitä, joiden voisi odottaa häiritsevän määritystä. Katso esimerkiksi, Maggio, Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Inc.

Boca Raton, FL, 1980, sivu 65.

Tämän keksinnön mukaisessa parannetussa menetelmässä verinäyte jaetaan vähintään kahteen alikvoottiin. Toinen näyte-alikvootti käytetään apo B-100 -määritykseen ja toinen apo A-I-määritykseen.

37 8921 4

Aloittamalla apolipoproteiini B-100:n analyysillä, ensimmäinen kiinteä-nestefaasinen seos muodostetaan sekoittamalla ennalta määrätty määrä ensimmäistä nestemäistä verinäyteali-kvoottia kiinteän kantajan kanssa, joka sisältää pääasiallisesti kiinteän matriisin, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja ensimmäisiä monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apo B-100:n kanssa. Nuo kiinteään faasiin sidotut ensimmäiset monoklonaaliset paratooppi-set molekyylit ovat läsnä ylimäärin näytteessä oletettavaan apo B-l00:n määrään nähden, ja niitä erittää toinen hybri-doomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746. Ei-spesifiset proteiinia sitovat paikat tuon kiinteän kantajan pinnalla estetään ennen tuota sekoittamista.

Tuota ensimmäistä kiinteä-nestefaasista seosta inkuboidaan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka ensimmäisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n kanssa ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n.

Ensimmäisen näytealikvootin sisältämä apo B-100 sekoitetaan .. . myös nestefaasisten toisten monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-l00:n kanssa, jolloin muodostuu toinen seos. Noita toisia monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai 8746, mutta niitä ei käytetä ensin nimetyssä seoksessa. Nuo toiset paratooppiset molekyylit ovat myös toiminnallisesti kytkettyjä entsyymi - indikaattoriin.

Toista seosta inkuboidaan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka toisten, entsyymiin kytkettyjen paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan : immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken näyte alikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100-.n.

38 8921 4

Kiinteät ja nestefaasit, jotka muodostuvat molempien para-tooppisten molekyylien sekoittamisesta ja immunoreaktanttien muodostumisesta molempien paratooppisten molekyylien ja apo B-100:n välillä, erotetaan esimerkiksi huuhtelemalla, ja erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän iramunoreak-tantin määrä määritetään. Koska kumpikin kahdesta monoklo-naalisesta paratooppisesta molekyylistä immunoreagoi oleellisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apo B-l00:n kanssa, ja koska vähintään toinen paratooppisista immunoreagoi ei-ristireaktiivisen, konservoituneen epitoopin kanssa apo B-100:n pinnalla, immunoreaktantin sisältämän entsyymiin kytketyn apo B-100:n määrän määrittäminen toteuttaa näytealikvootissa läsnäolevan apo B-l00:n määrän määrittämisen. Apolipoproteiini B-100:n määrä näytteen tilavuusyksikköä kohti voidaan helposti laskea tietäen alunperin käytetyn, ennalta määrätyn määräisen nestemäisen verinäytealikvootin tilavuus.

Apolipoproteiini A-I:n määrä määritetään käyttäen toista, ennalta määrätyn määräistä nestemäistä verinäytealikvoottia. Päinvastoin kuin toisten käyttämissä menetelmissä, toista nestemäistä verinäytealikvoottia ei ole käsitelty peittymi-sen poistamiseksi kuten on tavallista apo A-I:n määrittämisessä.

Apolipoproteiini B-100:lie aikaisemmin kuvattujen vaiheiden kanssa analogisia vaiheita noudatetaan, paitsi että toiselle verinäytealikvootille käytetään kolmansia ja neljänsiä mono-klonaalisia paratooppisia molekyylejä, joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201. Noudattaen noiden aikaisemmin kuvattujen vaiheiden analogiaa edelleen, kiinteään faasiin sidotut kolmannet monoklonaaliset paratooppiset molekyylit sekoitetaan toisen verinäytteen kanssa kolmannen kiinteä-nestefaasisen seoksen muodostamiseksi, ja tuota kolmatta kiinteä-nestefaasista seosta inkuboidaan kuten edellä on kuvattu, jolloin muodostuu kiinteään faasiin sidottu immunoreaktantti, joka sisäl- 39 8921 4 tää olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apo-lipoproteiini A-I:n.

Toisen näytealikvootin sisältämä apolipoproteiini A-I sekoitetaan myös nestefaasisten neljänsien monoklonaalisten para-tooppisten molekyylien kanssa, joista mainittiin aikaisemmin, jotka eivät ole niitä, jotka ovat sitoutuneet kiinteään matriisiin, ja jotka ovat toiminnallisesti kytketyt entsyymi-indikaattoriin muodostaen neljännen seoksen. Tuota neljättä seosta inkuboidaan aikaisemmin kuvatulla tavalla ajanjakso, joka neljänsien, entsyymikytkeisten monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan immunoreaktantin olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n kanssa.

Kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka muodostuvat sekoitus-ja inkubointivaiheista, erotetaan toisistaan, ja erotetussa kiinteässä faasissa läsnä oleva entsyymi-indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini A-I:tä sisältävä immunoreaktantti määritetään, toteuttaen siten apolipoproteiini A-I:n määrän määrittämisen näytealikvootissa ja tilavuusyksikössä, kuten aikaisemmin mainittiin.

Aikaisemmin mainitut apo B-100- ja apo A-I -määritykset voidaan kumpikin suorittaa siten, että kummankin määrityksen kummatkin sekoitus- ja inkubointivaiheet suoritetaan perättäisestä tai kummankin määrityksen kaksi sekoitusvaihetta voidaan suorittaa pääasiallisesti samanaikaisesti toteuttaen kummankin määrityksen kaksi inkubointivaihetta yhdessä.

Kun vaiheet suoritetaan perättäisesti, on edullista, että kiinteään faasiin sidotut monoklonaaliset paratooppiset molekyylit sekoitetaan ja muodostunutta seosta inkuboidaan ennen entsyymi-indikaattoriin kytkettyjen paratooppisten molekyylien lisäämistä ja siinä muodostuneen seoksen inku-bointia. Silloin kun edulliset, perättäiset vaiheet toteutetaan, on lisäksi edullista, että muodostuneet kiinteät ja nestemäiset faasit erotetaan, ja kiinteä faasi huuhdellaan 40 8921 4 erottamisen helpottamiseksi ennen nestemäisten, entsyymi-indikaattoriin kytkettyjen paratooppisten molekyylien sekoittamista erotettuun kiinteään faasiin ja tuon seoksen inkubointia.

On myös merkittävää, että entsyymi-indikaattoriin kytketyt paratooppiset molekyylit voivat olla ensimmäisiä, jotka sekoitetaan sopivan näytealikvootin kanssa. Silloin kun tätä menetelmän suoritustapaa käytetään, ei ole mitään faasien erottamista ennen kiinteään faasiin sidottujen monoklonaa-listen paratooppisten molekyylien lisäämistä.

Edullisimmin sekä apolipoproteiini B-100:n että apolipopro-teiini A-I:n määrityksessä, kiinteään faasiin sidotut monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, verinäytealikvootti ja entsyymi-indikaattoriin kytketyt paratooppiset molekyylit lisätään erikseen olennaisesti samanaikaisesti, ja kutakin muodostunutta kiinteä-nestefaasista seosta inkuboidaan yhdessä. Kutakin seosta inkuboidaan täten ajanjakso, joka kahden erillisen kiinteään faasiin sidotun monoklonaalisen pa-ratooppisen molekyylin kannalta on riittävä muodostelmaan kiinteään faasiin sidottuja immunoreaktantteja olennaisesti kaiken apo B-100:n ja apo AI:n kanssa, vastaavasti, ja kahden nestefaasisen entsyymi-indikaattoriin kytketyn paratoop-pisen molekyylin kannalta myös riittävä immunoreagoimaan olennaisesti kaiken apo B-100:n ja apo AI:n kanssa, vastaavasti, molempien näytealikvooteissa. Siten muodostuneita immunoreaktantteja nimitetään kiinteään faasiin sidotuiksi kerroksellisiksi immunoreaktanteiksi. Myös nestefaasi on läsnä.

Samanlaisia tuloksia saadaan käyttämällä joirqpaakumpaa mono-klonaalista paratooppista molekyyliä kahdesta paratooppisten molekyylien joukosta kiinteään faasiin sidottuina paratoop-pisina molekyyleinä vastaavissa määrityksissä. Kuitenkin suurin osa tässä yhteydessä käsitellystä työstä suoritettiin käyttämällä molekyylejä, joita eritti hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 (MB47), sidottuina kiinteään 41 8921 4 matriisiin silloin, kun apolipoproteiini B-100:aa määritettiin, ja molekyylejä, joita eritti hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9200 (AI-10), sidottuina kiinteäfaasi-seen matriisiin silloin, kun apolipoproteiini A-I:tä määritettiin. On erityisen edullista lisäksi käyttää MB47:ää kiinteään faasiin sidottuina paratooppisina molekyyleinä, koska nuo molekyylit eivät immunoreagoi apo B-48:n kanssa, jota voi olla läsnä kylomikroneissa ei-paastotuissa verinäytteissä tai henkilöillä, joilla on epänormaalin korkeat kylomikronitasot. Sitoutuessaan kiinteään kantajaan kylomik-ronit suuresta koostaan johtuen voivat häiritä lisäksi tulevaa, olennaisesti kaiken apo B-100:n (LDL) sitoutumista, silloinkin, kun kiinteään faasiin sidottuja paratooppisia molekyylejä on ylimäärin määritettävän näytteen sisältämään apo B-100:aan nähden.

Tyypilliset kiinteät matriisit, jotka ovat käyttökelpoisia edellä olevissa menetelmissä, ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niihin lukeutuvat 96-kuoppaisten mikrotiitterilevyjen kaltainen kiinteä matriisi, joita levyjä myydään nimellä Falcon Microtest III Flexible Assay Plates (Falcon Plastics, Oxnard, CA) tai mikrotiitterilevykkeen kaltainen kiinteä matriisi, joka sisältää kaksitoista kuoppaa rivissä, kuten sellaiset levykkeet, joita myydään nimellä Immulon I ja II (Dynatech, Alexandria, VA). Mikrotiitterilevyke tai -levy on valmistettu kirkkaasta muovimateriaalista, edullisesti poly-vinyylikloridista tai polystyreenistä. Vaihtoehtoisiin kiinteisiin matriiseihin, käytettäväksi tämän keksinnön mukaisessa, edellä kuvatussa menetelmässä, lukeutuvat poly-styreenipalloset, halkaisijaltaan noin 1 mikroni - noin 5 millimetriä, joita saa Abbott Laboratories'1ta, North Chicago, IL; polystyreeniputket, -tikut tai -lavat, minkä tahansa kokoisina; ja polystyreenilateksi, jonka polystyreenipartik-kelit ovat kooltaan noin 1 mikroni, ja jotka voidaan sentri-____: fugoimalla erottaa muusta lateksista.

Kiinteä matriisi voi myös olla valmistettu monesta erilai-sesta materiaalista, kuten ristisidottu dekstraani, esim.

42 8921 4

Sephadex G-25, -50, -100, -200 ja vastaavat, joita on saatavissa Pharmacia Pine Chemicals11ta, Piscataway, NJ, aga-roosi ja ristisidottu agaroosi, esim. Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46 ja vastaavat, joita myös saa Pharmacia Fine Chemicals '1 ta.

Entsyymi-indikaattori liitetään suoraan paratooppiseen molekyyliin, joka on tämän keksinnön mukaisesti käyttökelpoinen, konjugaatin muodostamiseksi. Tulisi käsittää, että käyttökelpoiset entsyymimolekyylit, jotka on kytketty paratooppiseen molekyyliin, ovat toiminnallisesti kytketyt. Entsyymin toiminta ei näin ollen olennaisesti huonone liitoksesta tai paratooppisesta molekyylistä johtuen, kuten ei monoklonaali-sen paratooppisen molekyylin toiminta, johon entsyymi on kytketty, olennaisesti huonone liitoksesta tai entsyymin läsnäolosta johtuen.

Entsyymi-indikaattori on biologisesti aktiivinen entsyymi, kuten piparjuuriperoksidaasi (HRPO) tai glukoosioksidaasi, tai vastaavat. Kuten hyvin tiedetään, silloin kun indikaattori on entsyymi, kuten HRPO tai glukoosioksidaasi, tarvitaan lisäreagensseja sen tosiseikan visualisoimiseksi, että vasta-aineantigeenikompleksi on muodostunut. Sellaisiin li-säreagensseihin HRPO:ta varten lukeutuvat vetyperoksidi tai hapetusväriprekursori, kuten esim. diaminobentsidiini. Glu-koosioksidaasin kanssa käyttökelpoisiin lisäreagensseihin lukeutuvat glukoosi ja 2,2'-atsino-di-(3-etyylibentstiatso-liini-6-sulfonihappo) (ABTS).

Menetelmät entsyymin kytkemiseksi toiminnallisesti paratooppiseen molekyyliin konjugaatin muodostamiseksi, ovat alalla hyvin tunnettuja. Tyypillisiä menetelmiä käsitellään teoksessa Maggio, Enzyme-Immunoassay, Luku 4, Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, FL (1980), sivut 71-104.

Monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä voidaan käyttää saatuina hybridooman supernatanteista tai ascites-nesteenä.

43 8921 4

On kuitenkin edullista, että käytetään puhdistettuja para-tooppisia molekyylejä.

Useat paratooppisten molekyylien puhdistustavat ovat hyvin tunnettuja alalla, ja tyypillisesti käytetään kromatografisia tekniikoita. Tässä yhteydessä on valittu proteiinien nopea nestekromatografia (FPLC) puhdistustekniikaksi.

Entsyymikytkeiset paratooppiset molekyylikonjugaatit toimitetaan seoksiin nestefaasissa. Nuo molekyylit liuotetaan tyypillisesti vedelliseen koostumukseen. Tyypilliset koostumukset sisältävät puskurisuoloja, kuten on laita tässä yhteydessä käytetyillä tyypillisillä puhdistetuilla mono-klonaalisen vasta-aineen sisältävillä koostumuksilla, jotka sisältävät fosfaattipuskuroitua saliinia (PBS) laimentimena. Laimennettu ascites-neste on myös käyttökelpoinen.

Kuten aikaisemmin mainittiin, kiinteäfaasisen kantajan pinnalla olevat epäspesifiset proteiinia sitovat paikat on suojattu. Kiinteään faasiin sidotut paratooppiset molekyylit sidotaan täten, kuten esimerkiksi adsorboimalla tai muulla hyvin tunnetulla kiinnittämistavalla kiinteään matriisiin. Sen jälkeen sekoitetaan kiinteän faasin kanssa proteiinin vesiliuosta, joka ei ole määritystä häiritsevä, kuten esim. naudan, hevosen tai muuta seerumin albumiinia, joka ei myöskään ole kontaminoitunut ihmisen apo B-100:11a tai apo A-I:llä, sekoitetun proteiinin adsorboimiseksi paratooppisen molekyylin sisältävän kiinteän kantajan pinnalle pinnan proteiinia sitoviin paikkoihin, jotka eivät ole monoklonaalisen paratooppisen molekyylin täyttämiä.

Tyypillinen proteiinin vesiliuos sisältää noin 3 - noin 10 painoprosenttia naudan seerumin albumiinia PBS:ssä pH-arvos-sa 7,1-7,5. Proteiinin vesiliuos - kiinteäkantaja -seosta inkuboidaan tyypillisesti vähintään yhden tunnin ajanjakso 37°C:ssa, ja muodostunut kiinteä faasi huuhdellaan sen jälkeen vapaaksi sitoutumattomasta proteiinista.

44 8921 4

Nestemäinen verinäyte voi olla plasmaa tai seerumia, kuten jo mainittiin. Apo A-I -näyte laimennetaan edullisesti noin 1:2500 - noin 1:20 000, ja edullisemmin noin 1:5000, ennen käyttöä lineaaristen tulosten saamiseksi määrityksissä, joita tämän jälkeen on spesifisesti kuvattu. Apo B-100 -näyte laimennetaan edullisesti noin 1:500 - noin 1:5000, ja edullisemmin noin 1:1000. Pienemmän laimennuksen käyttö voi tuottaa liian paljon apolipoproteiiniantigeenia seokseen, ja huonontaa määritystulosten lineaarisuutta, kuin myös alentaa tai poistaa kiinteään faasiin sidotun paratooppisen molekyylin ylimäärän sekoitettuun antigeeniin nähden. Suuremman kuin 1:20 000 laimennuksen käyttö pyrkii alentamaan tarkkuutta.

Käytetyt inkubointiajat voivat vaihdella suuresti, vaikuttaen niukasti tulokseen, niin kauan kun käytetään noin 30 minuutin minimiaikaa vallitsevassa huoneen lämpötilassa (noin 20-25°C). Silloin kun on edullista käyttää 30 minuutin minimi- inkubointiaikaa, on edullista, että inkuboitavaa seosta sekoitetaan tuon ajanjakson aikana olennaisesti täydellisen immunoreaktion varmistamiseksi apolipoproteiiniantigeenin ja monoklonaalisten paratooppisten molekyylien välillä. Silloin kun käytetään pitempiä inkubointiaikoja, kuten esimerkiksi yksi tunti tai enemmän huoneen lämpötilassa, sekoitusta ei tarvita. Edullinen sekoitus voidaan helposti järjestää gyro-skooppisen sekoittajan avulla, toimintanopeudella noin 100 rpm. Jokainen menetelmän mukaisesti käytetty määritys pystytään toteuttamaan käyttämällä paratooppinen molekyyli -näyte -seoksen inkubointiaikoja noin 30 minuuttia - noin SO minuuttia vallitsevassa huoneen lämpötilassa.

Määritettävässä immunoreaktantissa läsnä olevan apolipoproteiiniantigeenin määrä määritetään sekoittamalla erotettu, entsyymiin kytkettyä apolipoproteiinia sisältävä kiinteä faasi ennalta määrätyn määrän kanssa visualisoivaa reagens-sia tai reagensseja. Silloin kun HRPO:ta käytetään osoittavana entsyymivällaineena, visualisoivia reagensseja, kuten esimerkiksi vetyperoksidia ja hapettavan värin prekursoria 45 8921 4 kuten o-fenyleenidiamiini (OPD), jotka ovat läsnä vedelli-sessä liuoksessa, sekoitetaan erotettuun kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin kanssa. Siten muodostunutta seosta inkuboidaan biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, kuten esimerkiksi noin 30 minuuttia vallitsevassa huoneen lämpötilassa värin kehittymiseksi. Värin kehittyminen pysäytetään sen jälkeen sekoittamalla pysäyttävää rea-genssia kuten esimerkiksi rikkihappoa. Koostumuksen optinen tiheys luetaan sen jälkeen, verrataan sitä standardikäyrän arvoon, ja apolipoproteiinin määrä määritetään, kuten hyvin tiedetään.

Näin ollen heti kun kiinteä kantaja ja nestemäinen verinäyte preparoidaan, jokainen määritys voidaan suorittaa vallitsevassa huoneen lämpötilassa noin tunnin kuluessa; so. 30 minuutin inkubointiaika sekoittaen seoksille, jotka ovat muodostuneet sekä paratooppisista molekyyleistä että näyteali-kvootista, ja toinen 30 minuutin inkubointiaika värin kehittymiselle. Kiinteää kantajaa ei todellakaan tarvitse valmistaa juuri ennen jokaista käyttöä, vaan paremminkin, tässä yhteydessä kuvaillun kaltaiset kantajat voidaan preparoida ja säilyttää kosteina ja peitettyinä tavallisissa jääkaappi-olosuhteissa vähintään yhden kuukauden ajanjakso ennen käyttöä.

Kussakin apo B-100- ja apo A-I-määrityksessä käytetään standardia, johon ELISA-määrityksissä saatuja optisen tiheyden arvoja verrataan noiden kahden apolipoproteiinin pitoisuuksien laskemiseksi. Kummassakin määrityksessä käytetään sekundäärisiä standardeja. So. ennemmin kuin käytettäisiin apo B-100:aa ja apo A-I:tä standardeina määrityksissä käytetään . . ihmisen LDL:ää ja HDLrää, vastaavasti, standardeina. Sekundäärisiä standardeja käytetään primääristen apolipoproteii-nien suhteellisen epästabiilisuuden johdosta säilytyksen aikana. Kottke työtovereineen huomasi myös primäärisenä standardina käytetyn puhdistetun apo A-I:n hajoamista ja käytti sekundääristä standardia RIA-määrityksissään poly- 46 8 9 2 1 4 klonaalisen seerumin kanssa koskien apo A-I:tä. Au et ai.

(1986) Clin. Chem. 22.: 1394-1397.

Sekundääriset standardit toimitetaan tyypillisesti lyofi-lisoituna LDLrnä ja HDL:nä kootusta ihmisen paastoplasmasta, ja ne liuotetaan ennen käyttöä. Kumpikin standardeista standardoidaan itsessään primäärisiä standardeja vastaan, apo B-100 LDL:nä ja apo A-I HDL:nä. Tyypillisiä menetelmiä apo-lipoproteiini B-l00:lle (LDL) ja apolipoproteiini A-I:lie (HDL) kuvataan Materiaalit ja Menetelmät -jaksossa.

III Diagnostiset systeemit

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tarkastellaan myös diagnostista systeemiä, tyypillisesti kittimuodossa, jota voidaan käyttää suoritettaessa aikaisemmin kuvattuja menetelmiä.

Systeemiin kuuluu, erillisissä astioissa, ainakin edellä kuvattuja monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä MB47 ja MB24, jotka immunoreagoivat apo B-100:n kanssa, ja AI-10 ja AI-11, jotka immunoreagoivat apo A-I:n kanssa. Toinen kummankin parin paratooppisista molekyyleistä; so. toinen MB47:stä ja MB24:stä, ja toinen AI-10:stä ja AI-ll:stä, on kytketty entsyymi-indikaattoriin konjugaatteinä. Pakkaukset sisältävät kutakin noista paratooppisista molekyyleistä määrän, joka riittää suorittamaan vähintään yhden epänormaalin lipidiaineenvaihdunnan osoittavan aineen määrityksen.

Systeemi sisältää edullisemmin kaksi kiinteää kantajaa, joista kumpikin käsittää pääasiallisesti kiinteän matriisin, johon on sidottuna monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat joko apo B-100:n tai apo A-I:n kanssa, vastaavasti, ja joiden pinnan sisältämät epäspesifiset proteiinia sitovat paikat on suojattu, kuin myös kaksi erikseen pakattua entsyymikytkeistä monoklonaalista para-tooppista molekyylikonjugaattia, jotka immunoreagoivat apo B-100:n ja apo A-I:n kanssa, vastaavasti. Samoja neljää pa-ratooppista molekyyliä käytetään kuten on käsitelty edellä.

47 8921 4

Edellä mainitun diagnostisen systeemin sisältämät kiinteä-faasiset matriisit voivat olla mitä tahansa aikaisemmin käsiteltyjä kiinteäfaasisia matriiseja, vaikka molemmat matriisit ovat edullisesti samantyyppiset. Mikrotiitterikuopat, kuten esimerkiksi edellä kuvatut 12-kuoppaiset levykkeet ja 96-kuoppaiset levyt, ovat erityisen edullisia. Kiinteillä kantajilla olevat epäspesifiset sitoutumispaikat on suojattu, kuten aikaisemmin on käsitelty.

Kiinteä matriisi muodostuu astiasta tämän suoritusmuodon mukaisille sidotuille monoklonaalisille paratooppisille molekyyleille. Tyypillisiä astioita entsyymikytkeisille monoklonaalisille paratooppisille molekyyleille ovat pikkupullot tai pullot, jotka on valmistettu lasista tai muovista, kuten polyetyleeni tai polypropyleeni.

Käyttämällä mikrotiitterilevyä tyypillisenä kiinteänä matriisina, kokonaisia monoklonaalisia vasta-aineita MB47 ja AI-10 kiinteään faasiin sidottuina monoklonaalisina para-tooppisina molekyyleinä, seerumia nestemäisenä verinäytteenä, ja kokonaisia monoklonaalisia vasta-aineita MB24 ja AI-11 kytkettynä HRPOrhon, tyypillinen, edullisempi diagnostinen systeemi' kittimuodossa sisältää seuraavaa: : a) kiinteä kantaja, jonka muodostaa pääasiallisesti mikro- tiitterilevy, johon on sitoutuneena monoklonaalinen vasta-aine MB47 määränä, joka riittää suorittamaan seeruminäyte-alikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n määrän määrittämisen, ja jonka vasta-aineen pinnan epäspesifiset proteiinia sitovat paikat on suojattu; . . b) kiinteä kantaja, jonka muodostaa pääasiallisesti mikro- tiitterilevy, johon on sitoutuneena monoklonaalinen vasta-aine AI-10 määränä, joka riittää suorittamaan seeruminäyte-: : alikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n määrän mää rittämisen, ja jonka vasta-aineen pinnan epäspesifiset proteiinia sitovat paikat on suojattu; c) erillinen pakkaus, joka sisältää vesiliuoksen, joka sisältää monoklonaalisen vasta-aineen MB24 liitettynä HRPO:- 48 8921 4 hon, jota vastaainetta on läsnä määränä, joka riittää suorittamaan seeruminäytealikvootissa läsnä olevan apo B-100:n määrän määrittämisen; ja d) erillinen pakkaus, joka sisältää vesiliuoksen, joka sisältää monoklonaalisen vasta-aineen AI-ll liitettynä HRPO:-hon, jota vasta-ainetta on läsnä määränä, joka riittää suorittamaan seeruminäytealikvootissa läsnäolevan apo A-I:n määrän määrittämisen.

Diagnostinen systeemi sisältää edullisimmin edellä olevat neljä komponenttia (a-d) ja yhden tai useamman seuraavista: (i) tunnetunpitoisen vetyperoksidilähteen; (ii) visualisoivan hapettavan värin prekursorin, kuten OPD; (iii) pysäytys-aineen liuoksen, kuten 4 N rikkihappo, värinmuodostusreakti-on lopettamiseksi; (iv) yhden tai useamman puskurin kuivassa tai nestemäisessä muodossa määrityksessä käytettäväksi; (v) materiaaleja standardivertailukäyrien tekemiseen; ja (vi) määritysten suorittamiseen tarvittavat ohjeet. Kukin välittömästi edellä luetelluista komponenteista on läsnä diagnostisessa systeemissä määränä, joka riittää suorittamaan vähintään yhden määrityksen, ja nuo komponentit ovat erikseen pakattuina, kuten on tarkoituksenmukaista.

IV Tulokset

Tuloksia, jotka on saatu käyttäen edellä kuvattua määritysmenetelmää, jota kuvataan tämän jälkeen yksityiskohtaisemmin Materiaalit ja Menetelmät -jaksossa, käsitellään jäljempänä. Kiinteinä matriiseina käytettiin 96-kuoppaisen mikrotiitte-rilevyn kuoppia. Kokonaisia monoklonaalisia vasta-aineita MB47 ja AI-10 käytettiin kiinteään faasiin sidottuina ensimmäisinä ja kolmansina monoklonaalisina paratooppisina molekyyleinä, apolipoproteiinien B-100- ja A-I-määrityksissä, vastaavasti. Epäspesifiset proteiinia sitovat paikat kiinteän kantajan pinnoilla suojattiin BSA:lla. HRPO:hon kytkettyjä kokonaisia monoklonaalisia vasta-aineita MB24 ja AI-ll käytettiin toisina ja neljänsinä monoklonaalisina paratooppisina molekyyleinä apolipoproteiinien B-100 ja A-I-määri-tyksissä, vastaavasti, OPD:n ollessa visualisoivana hapetta- 49 892 1 4 van värin prekursorina. apo B-100- ja apo A-I-määritykset suoritettiin 37 henkilölle, joilla ei ollut CAD-menneisyyttä. Niistä henkilöistä käytetään nimitystä "normaalit".

Arvot saatiin käyttäen laimennettua plasmaa tai seerumia nestemäisinä verinäytteinä. Noilla arvoilla ei todettu esiintyvän mitään tilastollisesti merkitseviä eroja kahden näytelähteen välillä, ja niiden keskimääräisyys arvioitiin käyttöä varten.

Yhdistelmä tuloksista "normaaleille" on esitettynä taulukossa 2, jäljempänä, 23 miehelle ja 14 naiselle erikseen, ja "yhdistettyinä" arvoina.

Taulukko 2

Normaalit apolipooroteiinitasot Apolipoproteiini A-I1

Miehet_Naiset_Yhdistelmä n =23 n = 14 n =37 keski- keski- = 152 keski- = 147 arvo = 143 arvo arvo S.D. = 26,5 S.D. = 10,7 S.D. = 22,0 S.D.- S.D.- = 141-163 S.D.- = 125-169 alue = 116-170 alue alue

Apolipoproteiini B-100

Miehet_Naiset_Yhdistelmä n =23 n =14 n =37 keski- keski- = 77,5 keski- = 77,8 arvo = 78,0 arvo arvo S.D. = 17,6 S.D. = 20,6 S.D. = 18,8 S.D- = 60,4-95,6 S.D.- = 56,9-98,1 S.D.- = 59,0-96,6 alue alue alue 50 8921 4

Apolipoproteiini B-100;n suhde apolipoproteiini A-I:een

Miehet1*_Naiset1)_Yhdistelmät1* n =23 n =14 n =37 keski- = 0,56 keski- = 0,51 keski- = 0,54 arvo arvo arvo S.D. = 0,16 S.D. = 0,14 S.D. = 0,15 S.D- = 0,40-0,72 S.D.- = 0,37-0,65 S.D.- = 0,39-0,69 alue alue alue 1) "n" on henkilöiden lukumäärä kussakin tutkimuksessa, "keskiarvo" on saatu keskiarvo ilmaistuna milligrammoina desilitraa kohti apo A-I:lle ja apo B-100:lie, ja yksiköttö-mänä parametrina suhteelle. "S.D." on yhden keskipoikkeaman arvo keskiarvosta. "S.D.-alue" on yhden keskipoikkeaman laajuus keskiarvon molemmin puolin. Määritykset suoritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja Menetelmät -jaksossa.

Samalla tavalla saatiin arvoja käyttäen seerumia ja plasmaa 42 miehestä, joilla identifioitiin olevan kliinisesti CAD. Noiden arvojen yhdistelmä esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3

Miesten CAD:n apolipoproteiinitasot1*

Apolipoproteiini A-I

n =42 keskiarvo = 110 S.D. = 28,8 S.D.-alue = 81,2-139

Apolipoproteiini B-100 n =42 keskiarvo = 112 S.D. = 27,8 S.D.-alue = 84,2-140 si 89214

Apolipoproteiini B-100;n suhde apolipoproteiini A-1 teen n = 42 keskiarvo = 1,08 S.D. = 0,38 S.D.-alue = 0,70-1,46 1) Katso taulukon 2 alaviite.

Tarkasteltaessa edellä olevia tuloksia, ja vertailtaessa noita tuloksia Kottken et ai. antamiin tuloksiin, (1986)

Mayo Clin. Proc., 61:313-320, monet piirteet herättävät huomiota .

Yksi piirre on se, että apo A-I:n keskiarvot normaaleilla ja CAD-potilailla edellä olevassa määrityksessä ovat samanlaisia kuin Kottken et ai. raportoimat keskiarvot. Samanlaiset keskipoikkeamat saatiin molemmille määritystyypeille.

Tämä tuloksen samankaltaisuus oli yllättävää useasta syystä. Ensiksi, Kottke työtovereineen käytti määrityksiinsä peitty-misen poistamisen detergenttikäsittelyä (Tween 20), kun taas esillä oleville nestemäisille verinäytteille ei sellaisia käsittelyjä tehty. Toiseksi, Kottke et al:n ryhmä käytti ra-dioimmunomääritystä, jota yleensä pidetään tarkempana ja täsmällisempänä kuin tässä yhteydessä käytettyä ELISA-mene-telmää. Katso Voller et ai. (1976) Bull. World Health Organ, 53: 55-65. Kolmanneksi, Kottke et ai. käyttivät polyklonaa-lisia vasta-aineita, joiden normaalisti katsotaan kykenevän parempaan immunoreaktioon suhteellisen heterogeenisen apo A-I:n kanssa, kun taas tässä yhteydessä käytettiin monoklonaa-lisia vasta-aineita. Neljänneksi, Kottken et ai. ryhmä käytti 16 tunnin inkubointiaikaa huoneen lämpötilassa polyklo-naalisten vasta-aineidensa immunoreaktioon apo A-I:n kanssa, kun taas tässä yhteydessä käytettiin 30 minuutin ajanjaksoa huoneen lämpötilassa.

52 8921 4

Toinen piirre on se, että vaikkakin apo B-l00:n keskiarvot normaaleilla ja CAD-potilailla ovat hieman pienempiä esillä olevassa määrityksessä verrattuna vastaaviin Kottken et ai. keskiarvoihin, esillä olevan määrityksen mukaiset todetut keskipoikkeamat ovat aivan vähän pienempiä kuin Kottken et ai. ilmoittamat keskipoikkeamat. Sekä Kottken et ai. menetelmässä että esillä olevassa keksinnössä käytettiin mono-klonaalisia vasta-aineita analyyseihin, vaikka Kottke et ai. käyttivät jälleen RIA-määritystä, verrattuna esillä olevan keksinnön ELISA-määritykseen.

Vertailuja tehtiin myös käyttäen kaupallisesti saatavia RID-määrityksiä apo B-100:lie tässä kuvaillun apo A-I-määrityk-sen ohella, jotta saataisiin apo B-100:n suhteet apo A-I:een. Yhteenvedot noista tuloksista, jotka käsittelevät suhteita normaaleilla ja CAD-potilailla esitetään jäljempänä taulukossa 4. Tässä tutkimuksessa käytettiin yhden verinäytteen alikvootteja kustakin 20 normaalista ja 40 CAD-poti-laasta sisäisten kontrollien tuottamiseksi.

Taulukko 4

Apolipoproteiihi B-100:n suhteita apolipoproteiini A-I:een saatuina eri menetelmillä_

Normaalit

Esillä oleva keksintö2*_RID I2'3)_RID H2'il n =20 n =20 n =20 keski- = 0,53 keski- = 0,74 keski- = 0,58 arvo arvo arvo S.D. = 0,12 S.D. = 0,23 S.D. = 0,17 S.D- = 0,41-0,65 S.D.- = 0,51-0,97 S.D.- = 0,41-0,75 alue alue alue 53 8921 4 CAD-potilaat Esillä oleva keksintö2*_RID I2'3*_RID ll2>4) n =40 n =40 n =40 keski- = 1,07 keski- = 1,26 keski- = 1,01 arvo arvo arvo S.D. = 0,39 S.D. = 0,40 S.D. = 0,43 S.D- = 0,68-1,46 S.D.- = 0,86-1,66 S.D.- = 0,58-1,44 alue alue alue 1) Arvot, jotka on saatu sekä miesten että naisten verinäytteistä.

2) Katso taulukon 2 alaviite.

3) Calbiochem-Behringin, San Diego, CA, myymää RID-kittiä käytettiin, noudattaen pakkausohjeita, plasman kanssa.

4) Tagon, Burlingame, CA, myymää RID-kittiä käytettiin, noudattaen pakkausohjeita, plasman kanssa.

5) Arvot, jotka saatiin miehiltä, joilla oli CAD-oireita.

Edellä olevien taulukon sisältämien tulosten tarkastelu osoittaa, että ei-hyväksyttävän suuria päällekkäisyyksiä saatiin suhteessa, keskipoikkeama-alueissa, kun saatiin osoittavia ainearvoja normaaleille ja CAD-potilaille, käyttäen jompaakumpaa kahdesta saatavilla olevasta RID-kitistä apo B-100- määritykseen, verrattuna esillä olevan apo B-100 -määritystä yhdessä esillä olevan apo A-I -määrityksen . . kanssa.

IV. Materiaalit ia menetelmät A. Paratooppisten molekyylien valmistaminen ja puhdistaminen 1. Anti-apo A-I -immunoglobuliinin eristäminen

Ascites-nesteitä saatiin 10 viikkoa vanhoilta Balb/c-hiiril-tä, joita oli esikäsitelty 0,3 ml :11a mineraaliöljyä, ja joihin oli ruiskutettu vatsaontelonsisäisesti 3-50xl0s hyb-ridoomasolua. Asciteksen keskimääräinen kehittymisaika oli 9 54 8921 4 päivää. Kirkastamisen jälkeen sentrifugoimalla 15000 x g 15 tuntia 23°C:ssa, ascites-nesteet kerättiin yhteen, ja niitä säilytettiin jäädytettyinä -20°C:ssa.

Eristettyjä AI-10- ja AI-11-vasta-aineita preparoitiin proteiinien nopealla kromatografiällä (FPLC) käyttäen Pharmaci-an Mono Q HR5/5 -anioninvaihtokolonnia (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), käyttäen 0-0,5 M NaCl-gradienttia 10 mM Tris-puskurissa, pH 8,0. Puhdistettuja Mabritä väke-vöitiin käyttäen Amiconin sekoitettavaa ultrasuodatusyksik-köä (Danvers, MA; PM 30 -membraani) pitoisuuteen 1 milligramma per millilitra (mg/ml), dialysoitiin PBS:ään (fos-faattipuskuroitu saliini pH 7,2) ja niitä säilytettiin -70°C:ssa.

2. Anti-apo B-100 -immunoglobuliinin eristäminen Tässä yhteydessä käyttökelpoisia anti-apo B-100 paratooppi-sia molekyylejä sisältäviä ascites-nesteitä saatiin 10 viikkoa vanhoista Balb/c-hiiristä, joita oli esikäsitelty 0,3 ml :11a mineraaliöljyä, ja joihin oli ruiskutettu vatsaonte-lonsisäisesti 3-50xl05 hybridoomasolua. Asciteksen keskimääräinen kehittymisaika oli 12 päivää. Kirkastamisen jälkeen sentrifugoimalla 15000 x g 1 tunnin ajan 4°C:ssa, ascites-nesteet kerättiin yhteen, ja niitä säilytettiin -20°C:ssa.

Eristettyä vasta-ainetta MB47 preparoitiin kromatografoimal-la monoklonaalisia hybridooma-ascites-nesteitä proteiini A-Sepharose 4B -kolonnissa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). Vasta-aine eluoitiin kolonnista 0,1-molaarisella (M) etikkahapolla.

Eristettyjä paratooppisia molekyylejä preparoitiin myös proteiinien nopealla nestekromatografiällä (FPLC) käyttäen mo-noklonaalista hybridooma-ascites-nestettä Pharmacian Mono Q HR 5/5 -anioninvaihtokolonnia Pharmacian FPLC-systeemissä käyttäen 0-0,5 M NaCl-gradienttia 10 mM Tris-puskurissa, pH

8,0, ja noudattaen kolonnin mukana toimitettuja ohjeita.

55 8921 4 B. Hvbridoomavasta-aineiden karakterisointi Jokaisen ascites-nestekokooman kokonaisgammaglobuliini (Ig)-pitoisuus saatiin elektroforesoimalla 1-3 ml näytteitä selluloosa-asetaattiliuskoilla 75 mM veronaalipuskurissa, pH-arvossa 8,6, 45 minuuttia jännitteessä 200 millivolttia (mV). Kokonaisproteiinin prosenttiosuus, joka oli Ig:tä, kvantitoitiin Ponceau S -värjättyjen geelien densitometri-sella skannauksella, ja kokonaisproteiini määritettiin modifioidulla Lowryn menetelmällä, kuten aikaisemmin on käsitelty.

Hiiren Ig:n raskas- ja kevytketjut MB47:lle ja MB24:lle identifioitiin kaksoisdiffuusiolla 0,9-prosenttisessa aga-roosissa. Kymmenen mikrolitran ascites-nesteen sopivaa laimennosta annettiin reagoida yhtä suuren tilavuuden kanssa sopivasti laimennettua kanin antihiiri raskas- ja kevytket-juspesifistä antiseerumia (Litton Bionetics, Inc. Charleston, SC). Noin 15 tunnin diffuusion 20°C:ssa ja pesun jälkeen, presipitiinijuovat identifioitiin värjäämällä 0,5-prosenttisella Coomassien briljanttisinisellä R-250.

Monoklonaalisten vasta-aineiden AI-10 ja AI-11 alaluokat identifioitiin käyttämällä kaupallisia radiaali-immunodif-fuusiokittejä, joita oli saatavilla Meloy Laboratories, Inc.'lta (Springfield, VA) tai Tago, Inc.'lta (Burlingame, CA). Ascites-neste annosteltiin kuoppaan, joka oli leikattu agaroosi-geeliin, joka sisälsi joko anti-IgGl:tä, anti-IgG2a:ta, anti-IgG2b:tä tai anti-IgM:ää. Näkyvä presipi-tiinirengas muodostui identifioidulla vasta-aineluokalla ennalta määrätyn, spesifisen ajan kuluttua kontrolloiduissa olosuhteissa. Renkaan halkaisija on verrannollinen ascites-nesteessä läsnä olevan spesifisen immunoglobuliinin pitoisuuteen. AI-10:n todettiin kuuluvan luokkaan IgG2a, ja AI-11:n todettiin kuuluvan luokkaan IgGl.

Monoklonaalisten vasta-aineiden isoelektriset profiilit saatiin fokusoimalla isoelektrisesti 0,01 ml:n näytteitä asci-tes-nestettä 0,8-prosenttisessa agaroosissa (EF 802-300, 56 8921 4 LKB-Produkter AB, Bromma, Ruotsi), joka sisälsi 10 prosenttia sorbitolia ja 2 prosenttia amfoliinia pH-arvoalueella 5-8, 150 minuuttia 3 watin vakiovirrassa. Fiksoinnin ja kuivauksen jälkeen geelit värjättiin Coomassien briljanttisini-sellä ja valokuvattiin.

C. Sandwich(kerrokselliset)-määritykset

1. Apo A-I:n (HDL) Sandwich ELISA

a. Apo A-I primääriset standardit: HDL:n ia eristetyn apolipoproteiini A-I:n kvantitointi HDL-fraktio saatiin (1,063-1,21 g/ml) ihmisen kerätystä plasmasta standardeilla ultrasentrifugointitekniikoilla, ja se dialysoitiin PBSrään. Sen jälkeen se steriilisuodatettiin 0,45 mikronin acrodisc-suodinyksikön läpi, ja sitä säilytettiin 4°C:ssa. HDL-fraktion proteiinipitoisuus määritettiin modifioidulla Lowryn proteiinimäärityksellä BSA-standardina. Kolme laimennusta HDL-fraktiosta analysoitiin rinnakkaisina, jotta varmistuisi lukemien osuminen standardikäyrän lineaariselle osalle. HDL-fraktio analysoitiin esimerkiksi laimennuksina 1:5, 1:10 ja 1:20. Proteiinipitoisuus oli tavallisesti välillä 5-10 mg/ml. Pidennettyä varastointia varten HDL-fraktio laimennettiin PBSillä proteiinipitoisuuteen 1-2 mg/ml. Laimentamisen jälkeen proteiinipitoisuus varmistettiin jälleen Lowryn määrityksellä laimennuksina 1:2, 1:5 ja 1:10. Laimennettu HDL-fraktio jaettiin sen jälkeen alikvoot-teihin, ja varastoitiin 4°C:ssa.

Eristettyä apolipoproteiini A-I:tä voidaan saada lukuisista kaupallisista lähteistä. Vaikka valmistaja tyypillisesti sisällyttää ilmoituksen proteiinipitoisuudesta ja puhtaudesta, proteiinipitoisuus varmistettiin aina Lowryn määrityksellä, ja se säädettiin, jos näiden tulosten perusteella oli tarpeen. Apo A-I -valmisteen laimennukset analysoitiin, kuten aikaisemmassa jaksossa on kuvattu. Valmiste jaettiin aiikvootteihin, ja sitä säilytettiin valmistajan esityksen mukaisesti.

57 8921 4 HDL- ja/tai apo A-I -valmisteet analysoitiin tuntemattomina näytteinä (laimennettuna 1:5000) apo A-I ELISA -määrityksessä (kuvailtu tämän jälkeen). Vähintään kaksi määrityslevyä päivää kohti, jotka sisälsivät täydellisen standardisarjan, laatukontrollit, ja HDL- ja/tai apo A-I -valmisteiden laimennukset, toteutettiin viiden päivän jakson kuluessa.

HDL:lie ja/tai apo A-I:lie saadut ELISA-arvot täsmäsivät 20 % rajoissa Lowryn proteiinimääritysarvosta. Jos arvot eivät täsmänneet asetettujen rajojen puitteissa, Lowryn määritys toistettiin ilmoitetun proteiinipitoisuuden varmistamiseksi. Jos arvot yhä olivat poikkeavia, valmisteen ikääntyminen tai kontaminoituminen osoitettiin tavallisesti, eikä sitä arvosteltu sopivaksi käytettäväksi primäärisenä standardina .

Primäärisen standardin puhtaus määritettiin myös analyyttisellä natriumdodekyylisulfaatt ipolyakryyliamidigeelielekt-roforeesilla; SDS-PAGE.

b. Apo A-I:n ELISA:n sekundäärisen standardin valmistaminen ia arvon määrääminen_ i. Lyofilisoidun standardin kootun plasman valmistaminen Tuoretta plasmaa tai seerumia kerättiin vähintään 10:Itä normolipidemiseltä koehenkilöltä, jotka olivat paastonneet yli yön. Flebotomia suoritettiin käyttäen steriilejä putkia, jotka sisälsivät dinatrium-EDTA:ta ei-traumaattisella las-kimoverenotolla. Näytteitä sentrifugoitiin 1500 x g 30 minuutin ajan 4°C:ssa, ja plasma siirrettiin puhtaisiin, tiukasti suljettuihin putkiin, ja sitä säilytettiin enintään 24 tuntia 4°C:ssa. Yhtä suuret näytemäärät yhdistettiin, ja 0,5 ml:n määrät jaettiin alikvootteihin 5 ml:n happopestyihin Wheatonin seerumiputkiin, ja lyofilisoitiin yli yön (noin 16-18 tuntia). Putket suljettiin umpeen, ja niitä säilytettiin 4° C:ssa.

ii. Lyofilisoidun kootun plasmastandardin uudelleenliuotus Ampullien annettiin saavuttaa huoneen lämpötila ennen liuo- 5B 8921 4 tusta. Alumiinirengas ja korkki poistettiin poistaen hitaasti vakuumi ampullista. Käyttämällä tarkkuuspipettiä kuivatut, yhteenkerätyt standardit liuotettiin 0,5 ml:aan kahdesti tislattua vettä annostelemalla vesi hitaasti ampullien seinämille. Korkit vaihdettiin, ja ampulleja pyörresekoitet-tiin nopeasti 3-4 kertaa, ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa vähintään 30 minuuttia. Standardia ei vortex-sekoitettu tai sekoitettu voimallisesti, vaan pyörresekoitet-tiin kevyesti täydellisen liukenemisen varmistamiseksi.

iii» Apo A-I -sekundääristandardin arvon määrääminen Lyofilisoidun sekundääristandardin apo A-I -arvo määritetään apo A-I ELISA:11a käyttäen primääristä standardia (joko HDL tai apo A-I) kalibroijana. ELISA-määritysmenetelmä kuvataan tässä.

Lyofilisoitu sekundääristandardi määritettiin tuntemattomana näytteenä kolmena rinnakkaisena vähintään kahdella määritys -levyllä päivää kohti vähintään 10 päivän ajan, mikä tuotti vähintään 20 arvoa (kolmen rinnakkaisen keskiarvo). Kaikista saaduista sekundääristandardin arvoista otettiin keskiarvo, ja apo A-I:n arvo milligrammoina desilitraa kohti (mg/dl) määrättiin.

Kun arvon määrääminen oli tehty, sekundääristandardia käytettiin standardikäyrän konstruointiin, joka määritettiin Selmalla ELISA-levyllä primäärisen standardikäyrän kanssa, täydellisen kontrollisarjan kanssa. Primääriset ja sekundääriset standardikäyrät määritettiin vähintään kahdella 96-kuoppaisella levyllä päivää kohti 5 päivän ajanjakson kuluessa.

Heti kun sekundääristandardin arvon määrääminen oli hyväksytty, standardikäyrät konstruoitiin ja määritettiin samalla ELISA-levyllä yhdessä sillä hetkellä yleisesti hyväksytyn, lyofilisoidun standardierän kanssa viiden päivän ajanjakson kuluessa (2 määrityslevyä päivää kohti).

59 8921 4 c. Määritys, yleisesti

Eristettyjä AI-10-molekyylejä kiinnitettiin polystyreenisen mikrotiitterilevyn kuoppien seinämille (Nunc-Immuno Plate l; Irving Scientific, Santa Ana, CA) lisäämällä 0,15 ml nat-riumbikarbonaattipuskuria, pH 9,0, joka sisälsi 5 mikro-grammaa AI-10:tä millilitraa kohti (^g/ml), kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 18 tuntia 4°C:ssa, ja pestiin sen jälkeen 3 kertaa PBSrllä, joka sisälsi 0,1 prosenttia BSA:ta ja 0,05 % polyoksietyleeni(20)sorbitaanimonolauraattia (Tween 20). Jäljelle jääneet, epäspesifiset sitoutumispaikat suojattiin sen jälkeen lisäämällä 0,2 ml PBS:ää, joka sisälsi 10 prosenttia BSA:ta kuhunkin kuoppaan, inkuboimalla seosta 1 tunti 37°C:ssa, sen jälkeen huuhdelleen. Siten preparoituja kuoppia voidaan käyttää enintään noin kuukauden verran valmistamisen jälkeen, silloin kun niitä säilytetään kosteutetussa kaapissa.

Ihmisen HDL:ää laimennettiin PBSrään pitoisuusalueelle 1,0-0,031 μg/ml standardikontrolliliuoksina käytettäväksi. Kuten aikaisemmin mainittiin, standardina käytetään mieluummin ihmisen HDL:ää kuin ihmisen apo A-I:tä näissä määrityksissä, koska apo A-I:n on todettu olevan suhteellisen epästabiili varastoitaessa, kun taas HDL näyttää olevan suhteellisesti varastostabiilimpi. Plasma(tai seerumi-)näytteet laimennettiin PBSrään 1:5000.

50 mikrolitraa (μΐ) standardia tai näytettä lisättiin kuoppiin triplikaattina. Noin 5 minuutin sisällä sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ PBSrää, joka sisälsi HRPO-leimattuja paratooppisia AI-11-molekyylejä. Immunoreak-tioseoksia inkuboitiin 30 minuutin ajanjakso 25°C:ssa. Kuopista erotettiin sen jälkeen sitoutumaton materiaali pesemällä kuten edellä on kuvattu.

Kiinteään faasiin kiinnitetyn kerroksellisen (sandwich), HRPO-leiman sisältävän immunoreaktantin määrä määritettiin sen jälkeen lisäämällä 0,1 ml juuri valmistettua substraat- 60 8921 4 tiliuosta (tislattu vesi, joka sisälsi 3 prosentttia H202:ta ja 0,67 mg/ml o-fenyleenidiamiinia (OPD)) d. Vaiheittainen apo A-I HDL sandwich -ELISA Seuraavat vaiheet toteutettiin suoritettaessa apolipoprote-iini A-I:n sandwich-ELISA-määritystä. Kaupalliset kontrollit liuotettiin käyttökuntoon tislatulla vedellä pakkauksen sisältämien ohjeiden mukaan. Kontrolleja pyörresekoitettiin kevyesti ja inkuboitiin 20-30 minuuttia huoneen lämpötilassa täydellisen liukenemisen varmistamiseksi.

(i) Näytteet ia kontrollit Näytteet ja kontrollit laimennetaan PBSrään 1:5000. Sarja-laimentaminen voidaan tehdä seuraavasti: 20 μΐ näytettä + 1,98 ml PBS:ää (1:100); 40 μΐ edellistä laimennusta + 1,96 ml PBS:ää (1:5000).

(ii) Standardin laimentaminen

Eristetty apo A-I (HDL) -standardi laimennetaan PBS:ään tasoon 4 μ9/πι1. Sen jälkeen tehdään kaksinkertaiset sarjalai-mennukset tasoon 0,031 μg/ml. Esimerkiksi käyttäen HDL-valmistetta, jonka merkintä on 860527, joka sisälsi 868 μί/πιΐ 4 μg/ml = 46 μΐ + 9,954 ml PBS (1:217); 2 μ9/πι1 = 1 ml edellistä + 1 ml PBS:ää; ja jatketaan kaksinkertaisia laimentamisia tasoon 0,031 μ9/πι1.

(iii) HRPO-leimatun AI-ll:n laimentaminen AI-11 HRPO -konjugaattivasta-aineen laimennusta 1:5000 PBS:ssä käytetään. Seuraavat laimennukset voidaan tehdä: 20 μΐ + 1,98 ml PBS (1:100); ja 240 μΐ edellistä + 11,76 ml PBS (1:5000).

Peitetään foliolla valolta suojaamiseksi. Tämä määrä riittää kahdelle levylle.

(iv) 3-prosenttinen vetyperoksidi 30-prosenttinen vetyperoksidi (H202) laimennetaan tislattuun veteen 1:10.

ei 8921 4 (v) o-fenvleenidiamiinisubstraatti

Liuotetaan 1 o-fenyleenidiamiini(OPD)-tabletti (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 15 ml:aan tislattua vettä. Lisätään 62,5 μΐ 3-prosenttista H202:ta. Peitetään foliolla valolta suojaamiseksi. Valmistetaan substraatti tuoreena joka kerta juuri ennen käyttöä.

e. Määritysmenettely i. Temperoidaan vasta-aineeseen sidottua ELISA-levyä vallitsevassa huoneen lämpötilassa (20-22°C) vähintään 20 minuuttia. Levy poistetaan pussista ja käännetään kuopissa olevan jäännöspuskurin poistamiseksi. Kuopat täytetään 300 μΐ-.lla huuhtelupuskuria (PBS, joka sisältää 0,1 % BSA:ta ja 0,05 % Tween 20:a, pH 7,2) ja inkuboidaan 10 minuutin ajanjakso. Levy käännetään puskurin poistamiseksi ja kuivataan kuivaksi paperipyyhkeen päällä. Kuopat eivät saa olla tyhjinä enempää kuin 10 minuuttia määrityksen aikana.

ii. Kuoppiin lisätään 50 μΐ standardia tai näytettä tripli-kaattina rinnakkaisena.

0 μg/ml standardi on 50 μΐ PBS:ää.

Standardikuoppiin lisätään 50 μΐ laimennettuja HDL-standardeja (0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,50, 1,0 μg/ml).

Lisätään 50 μΐ laimennettuja kontrolleja ja potilasnäytteitä niille kuuluviin kuoppiin.

iii. Kaikkiin kuoppiin lisätään HRPO-kytkeistä vasta-ainetta 50 μΐ/kuoppa.

iv. Levy kääritään alumiinifolioon ja laitetaan gyrosekoit-tajalle (noin 100 rpm) 30 minuutin ajaksi vallitsevassa huoneen lämpötilassa (noin 20-25°C).

v. Levy pestään täyttämällä kuopat huuhtelupuskurilla, 300 μΐ/kuoppa ja käännetään sen jälkeen puskurin poistamiseksi. Toistetaan kaksi kertaa vielä siten, että pesuja on 62 8 921 4 kaikkiaan kolme. Levy kuivataan kuivaksi paperipyyhkeen päällä kolmannen pesun jälkeen. Levyn ei anneta kuivua.

vi. Lisätään juuri valmistettua OPD-substraattia 100 μΐ/kuoppa. Värin annetaan kehittyä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia.

vii. Reaktio pysäytetään lisäämällä 50 μΐ 4 N rikkihappoa kaikkiin kuoppiin. O.D. luetaan aallonpituudessa 492 nm.

2. Apo B-100:n sandwich-ELISA

a. Plasmakoosteen kerääminen ja preparointi sekundääristan- dardin lyofilisointia varten_

Tuoretta plasmaa kerätään 10 normaalilta yksilöltä, jotka ovat paastonneet yli yön. (Koehenkilöiden annetaan juoda mustaa kahvia tai teetä.)

Flebotomia suoritetaan käyttäen steriiliä vakuumiputkea, joka sisältää dinatrium-EDTA:ta, ei-traumaattisella laski-monpistotekniikalla. Näytteitä sentrifugoidaan 1500 x g 30 minuutin ajan 4°C:ssa. Plasma siirretään puhtaisiin, tiiviisti suljettuihin putkiin ja niitä säilytetään enintään 24 tuntia.

Yhdistetään yhtä suuret määrät plasmanäytteitä. Määrä jaetaan 0,5 ml:n alikvootteihin kromihapolla pestyihin Wheato-nin 5 ml:n ruskeisiin seerumipulloihin (VWR Scientific Division, Univar, San Francisco, CA; VWR no 223778). Kumitulpat asetetaan pulloihin siten, ettei enempää kuin 6,35 mm tulpasta mene pullon sisään. Pullot asetetaan sen jälkeen altaille, jotka on poistettu lyofilisaattorin Shelf-yksiköstä .

b. Plasmakoosteen lvofilisointi standardia varten

Lyofilisointiin käytetty systeemi oli FTS Systems'in Dura-Stop Shelf Unit yhdessä Dura-Dry Condenser Unit'in kanssa (FTS Systems, Inc., Stone Ridge, NY).

63 8 9 2 1 4 i. Jäähdytetään Dura-Stop Shelf-yksikkö -50°C:een.

ii. Plasmanäytteet jäädytetään asettamalla näyteallas esi-jäähdytettyyn Shelf-yksikköön. Muutaman näyteampullin sisään asetetaan lämpöparilyijydetektorit lämpötilamuutosten seuraamiseksi .

iii. Heti, kun läirqpöparilyijydetektorit osoittavat, että näytteet ovat jäätyneet -50°C:een, (suunnilleen 30 minuuttia, aika vaihtelee näytteiden lukumäärästä riippuen) käännetään päälle jäähdytys Dura-Dry Condenser-yksikössä.

iv. Kun saavutetaan maksimaalisesti alhaisin lämpötila, käännetään vakuumipumppu päälle.

v. Heti kun vakuumipaine saavuttaa tason 200 mikronia tai alle, lisätään Shelf-yksikön lämpötilaa -20°C:een.

vi. Näytteet jätetään tähän lämpötilaan suunnilleen 20 tunniksi, jossa pisteessä lämpötila nostetaan -lO°C:een.

vii. 30 minuutissa nostetaan lämpötila -5°C:een. Lämpötilan .. lopullinen nosto 4°C:een suoritetaan 30 minuuttia myöhemmin.

viii. Shelf-yksikön kannatin nostetaan sen jälkeen kumitulppien työntämiseksi pullojen suille. Vakuumi poistetaan sen jälkeen kammiosta, ja näytteet poistetaan.

ix. Käytetään Wheatonin käsipihtejä (Wheaton no 224303; VWR Scientific, Division of Univar, San Francisco, CA) Wheatonin alumiinitiivisteiden varmistamiseksi (VWR Scientific, VWR 226-355) näyteampulleissa. Näytteitä säilytetään sen jälkeen 4°C:ssa käyttöön saakka.

c. Uudelleenliuotus ia stabiilisuus i. Uudelleenliuotus 64 8921 4

Lyofilisoitujen plasmastandardien tulisi olla huoneen lämpötilassa ennen uudelleenliuotusta. 30 minuutin minimiaikaa huoneen lämpötilassa ehdotetaan.

Poistetaan alumiinirengas ja tulppa varovaisesti vapautettaessa vakuumi hitaasti ampullista. Käyttämällä tarkkuus-pipettiä, lyofilisaatti liuotetaan käyttökuntoon 0,5 ml:11a deionisoitua vettä. Vesi annostellaan hitaasti ampullin seinämille. Tulppa vaihdetaan, ampullia pyörresekoitetaan nopeasti 3-4 kertaa ja jätetään seisomaan huoneen lämpötilaan vähintään 30 minuutiksi. Myöskään tätä standardia ei vortex-sekoiteta tai sekoiteta voimakkaasti, vaan pyörresekoitetaan liuoksen aikaansaamiseksi.

30 minuutin kuluttua ampullia pyörresekoitetaan kevyesti ennen käyttöä.

ii. Stabiilisuus

Standardia säilytetään 2-8°C:n välillä ennen ja jälkeen käyttökuntoon liuottamisen. Liuotettu standardi on pysyvä 4 viikon ajan siten säilytettynä.

d. Arvon määrääminen

(i) Kompetitiivinen ELISA

Lyofilisoidun standardin arvon määrääminen määritetään kom-petitiivisessa vertailu-ELISA-määrityksessä käyttäen primääristä LDLrää. Joustavat polyvinyylikloridiset mikrotiitte-rilevyt (Falcon, Microtest III) pinnoitettiin 16 tunnin aikana 4°C:ssa 200 μ1:1ΐ3 PBS:ää, joka sisälsi 5 Mg/ml LDL:ää. Kuopat pestiin sen jälkeen 3 kertaa 200 μ1:1^ PBS:ää, joka sisälsi 1 % BSA:ta, ja 0,5 % Tweeniä. Jäljelle jääneet si-toutumispaikat estettiin 200 μΐ-.lla. 3 % BSA:ta PBS:ssä yhden tunnin ajan 25°C:ssa.

Kuopat pestiin sen jälkeen jälleen 3 kertaa käyttäen samaa pesupuskuria. Standardikäyrää varten, joka sisällytettiin jokaiselle levylle, LDL-apo B-100 -standardia laimennettiin 65 8921 4 PBS:ään, joka sisälsi 0,5 % lipoproteiinivapaata plasmaa (LPDP), jotta saataisiin LDL-pitoisuuksia alueelle 32-0,25 μ9/ιη1. Jokaisessa määrityksessä käytettiin kolmea erilaista kontrollia: D.Isolab Lipotype Control (Akron, Ohio), 2) kolme tasoa Tago Inc.'in Apolipoprotein B Reference Sera Controls (Burlingame, CA), ja 3) Omega Lipid Fraction Control Serum (Cooper Biomedical, Malvern, PA). Kukin kontrolli valmistettiin valmistajan antamien ohjeiden mukaisesti.

Plasmanäytteet ja kontrollit laimennettiin 200-kertaisesti LPDP/PBS-laimennuspuskuriin. 50 ^l:aa standardeja, kontrolleja ja tuntemattomia pipetoitiin kuoppiin, minkä jälkeen lisättiin välittömästi 50 μΐ määrätynpitoista MB24-ascites-nestettä (2000-kertainen laimennus 3-%:iseen BSA/PBS:ään). Levyjä inkuboitiin sen jälkeen 18 tuntia 4°C:ssa. Kaikki määritykset tehtiin triplikaattina. Kuoppien pesun jälkeen jälleen kuoppiin lisättiin 100 μΐ HRPO-konjugoitua vuohen antihiirilgG:ta, joka oli laimennettu 4000-kertaisesti l-%:iseen BSA/PBS:ään, inkuboitiin tasan yksi tunti 25°C:ssa, sitten pestiin jälleen. Substraattiliuos sisälsi 3 % H202:ta ja 0,67 mg/ml o-fenyleenidiamiinia (OPD) (Cat no 2781, Sigma) laimennettuna tislattuun veteen. Sata mikrolit-raa vastavalmistettua substraattiliuosta, joka sisälsi 3 % H202:ta ja 0,67 mg/ml o-fenyleenidiamiinia (OPD) tislatussa vedessä, lisättiin kaikkiin kuoppiin, ja värin annettiin kehittyä 30 minuutin ajan 25°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 4N H2S04:ää, ja liuoksen optinen tiheys (O.D.) määritettiin aallonpituudessa 490 nm käyttäen 96-kuoppaisen mikrotiitterilevyn lukulaitetta (Dynatech MR600; Alexandria, VA).

(ii) Apo B-100:n sandwich-ELISA

Seuraava vaihe on käyttää lyofilisoitua standardia suorassa sandwich-määrityksessä. Polystyreeniset mikrotiitterilevyt (Nunc-Immuno Plate I) päällystettiin 150 μ1:1ΐΆ natriumbi-karbonaattipuskuria, pH 9,0, joka sisälsi 1 μg/ml puhdistettua MB47:ää, 16 tunnin ajan 4°C:ssa. Levyt pestiin 3 kertaa PBS:llä, joka sisälsi 0,1 % BSA:ta, 0,05 % Tweeniä, ja sen 66 8 9 2 1 4 jälkeen suoritettiin estäminen 3-prosenttisella BSA:lla täsmälleen kuten kuvattiin kompetitiivisessä määrityksessä. Lyofilisoitu LDL-apo B-standardi laimennettiin 1:200 LPDP/PBS:ään (laimennuspuskuri) pitoisuuksiin alueella 0,125-4,0 /ig/ml. Samoja kontrolleja, kuin mitä edellä on kuvattu kompetitiiviselle ELISA:lie, käytettiin tässä määrityksessä. Plasmanäytteet ja kontrollit laimennettiin 1000-kertaisesti laimennuspuskuriin. 50 μΙζ^Λ standardeja, kontrolleja ja tuntemattomia lisättiin kuoppiin triplikaattina. Sen jälkeen pipetoitiin välittömästi 50 μΐ PBS:ää, joka sisälsi määrätyn pitoisuuden HRPO:hon kytkettyä MB24:ää. Levyjä inkuboitiin täsmälleen 30 minuuttia 25°C:ssa, ne pestiin, ja 100 μΐ OPD-substraattiliuosta lisättiin 30 minuutin ajaksi, inkuboitiin 25°C:ssa. Värinkehitys lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 4N H2S04:ää, ja levyt luettiin mikrolevylukijalla kuten kompetitiivisessä ELISA:ssa.

D. Kompetitiivinen ELISA

Apo B-100 -reagenssi, LDL:n muodossa, kiinnitettiin joustavan polyvinyylikloridisen mikrotiitterilevyn kuoppien seinämille (Microtest III, Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co., Oxnard, CA) kiinteänä matriisina, lisäämällä 0,2 ml PBS:ää, joka sisälsi 5 μg/ml ihmisen eristettyä LDL:ää, jokaiseen kuoppaan.

Kuoppia inkuboitiin 16 tunnin ajan 4°C:ssa, ja ne pestiin sen jälkeen 3 kertaa 0,2 ml:11a PBS:ää, joka sisälsi 1 % BSA:ta, 0,5 prosenttia Tweeniä ja 0,02 % aprotiniinia (Sigma (Chemical Co., St. Louis, MO). Jäljelle jääneet epäspesifiset sitoutumispaikat estettiin, kuten on kuvattu ei-kompe-titiivisessa ELISA:ssa.

Epäspesifiset sitoutumispaikat estettiin pinnoittamalla 3-prosenttisella BSA:lla PBS:ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Levyjä pestiin sen jälkeen PBS-pesupuskurilla, joka lisäksi sisälsi 0,1 prosenttia natriumatsidia ja 0,05 prosenttia Tween-20.

67 8921 4

Standardikäyrää varten, joka sisällytettiin jokaiselle levylle, LDL-reagenssia laimennettiin PBS:ään, joka sisälsi 0,5 % lipoproteiinivapaata plasmaa (LPDP), jotta saataisiin käyttöön pitoisuuksia alueella 32 mg/ml - 0,25 mg/ml.

Plasmanäytteet laimennettiin 1:200 PBS:ään, joka sisälsi 0,5 % LPDPrtä. 50 μΐ standardeja tai näytteitä lisättiin kuoppiin triplikaattina. Noin 5 minuutin sisällä sen jälkeen 50 μΐ PBS:ää, joka sisälsi 3 % BSArta ja noin 4 μg/ml MB24 paratooppisia molekyylejä, lisättiin jokaiseen kuoppaan. Siten muodostettuja seoksia inkuboitiin noin 18 tunnin ajan 4°C:ssa. Sitoutumaton materiaali erotettiin sen jälkeen kiinteään faasiin kiinnitetyistä MB24-apo B-100 -reagenssi-immunoreaktiotuotteista pesemällä, kuten edellä on kuvattu.

Kiinteäfaasisia immunoreaktantteja valmistettiin määritystä varten lisäämällä 0,1 ml PBS:ää, joka sisälsi 1 % BSArta ja tehokas määrä HRPO-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG:tä jokaiseen. Tätä toista immunoreaktioseosta inkuboitiin noin yhden tunnin ajan 24°C:ssa, ja sitä pestiin sen jälkeen kuten edellä on kuvattu sandwich-immunoreaktantin muodostamiseksi.

HRPO-leiman sisältävän, kiinteään faasiin kiinnitetyn sandwich- immunoreaktant in määrä määritettiin kuten on kuvattu kompetitiivisessa ELISA-määrityksessä.

E. Plasmanäytteet ia liooproteiinin kvantitointi Plasmanäytteitä saatiin 20 potilaalta, joilla oli sepelvaltimotauti, sydänkatetrointilaboratoriosta San Diegon, VA, sairaalasta. Plasmaa saatiin lisäksi 37 normaalilta koehenkilöltä.

Veri kerättiin putkiin, jotka sisälsivät 1,5 mg/ml etyleeni-diamiinitetra-asetaattia (EDTA), ja plasma erotettiin välittömästi sentrifugoimalla 4°C:ssa.

Plasman kokonaiskolesteroli ja -triglyseridit määritettiin tuoreista plasmanäytteistä standardoidussa kliinisessä labo- 68 8921 4 ratoriossa käyttämällä Abbott'in ABA-200 bikromaattista analysaattoria, ja Boehringer-Mannheimin suuritehoista kolesteroli reagens s ia 236691 ja Abbott Laboratories 1 in triglyseri-dien A-gent'ia. LDL-ja HDL-kolesteroli määritettiin käyttämällä tekniikkaa, jota on kuvattu julkaisussa Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. no. 75-628 (NIH), 2. painos., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974). Apoproteiini B-tasot määritettiin käyttäen kahta kaupallisesti saatavaa ra-diaalisen immunodiffuusion kittiä: Diffu-gen RID (Tago,

Inc., Burlingame, CA), jota tässä nimitetään RID I:ksi, ja M-Partigen RID, (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA), jota tässä nimitetään RID II:ksi.

F. Nestefaasinen 125I-leimatun antigeenin RIA

MB47:n ja MB24:n sitomien 125I-LDL-partikkelien fraktion määrittämiseksi käytettiin nestefaasista RIA-määritystä, noudattaen Tsaon et ai. yleisiä menetelmiä (1982) J. Biol.

Chem. 257:15222-15228. Kahta erilaista LDL-valmistetta (d = 1,019-1,063 g/ml) tutkittiin, toinen eristettynä 10 normaalin koehenkilön kootusta plasmasta ja toinen eristettynä yhden normaalin koehenkilön plasmasta.

125I-LDL (2000 cpm/ng), joka oli valmistettu käyttäen Iodo-gen-tekniikkaa (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), oli 90-prosenttisesti trikloorietikkahapolla (TCA) saostuvaa. Tuo koostumus laimennettiin 9-prosenttiseen naudan seerumin albumiiniin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO) ja sentrifugoitiin 30 000 x g 15 minuuttia ennen jokaista määritystä kompleksisen materiaalin poistamiseksi.

Määritykset suoritettiin 12 x 75 mm:n lasiputkissa tripli-kaattina 55 mM natriumbarbitaalipuskurissa, pH-arvossa 8, joka sisälsi 150 mM NaClra, 0,02 % natriumatsidia, 3 % BSA: -ta ja 1,5 mM natrium-EDTA:ta. 0,1 mitään 125I-LDL:ää (sisältäen 20 nanogrammaa (ng) LDL-proteiinia) lisättiin 0,1 ml puskuria tai kilpailevaa antigeeniä ja 0,1 ml eristettyjä MB47-reseptoreja kasvavina pitoisuuksina laimennettuina BSA- 69 8921 4 barbitaalipuskuriin. 18 tunnin kuluttua 4°C:ssa 0,1 ml IgSorb'ia lisättiin (The Enzyme Co., Boston, MA). Kahden tunnin inkubointiajan jälkeen lisättiin 2 ml BSA-vapaata barbitaalipuskuria, ja putkia sentrifugoitiin välittömästi 1500 x g 60 minuutin ajan. Muodostuneet saostumat pestiin kahdesti barbitaalipuskurilla.

Määritykset, joissa käytettiin AI-10:tä ja AI-ll:tä, suoritettiin samalla tavalla, kuten käsittelivät Tsao et ai. edellä ja Curtiss ja Edgington (1985) J. Biol. Chem. 260:2982-2993. Täten, 0,1 mlraan radiojodattua antigeeniä (HDL tai apolipoproteiini A-I) lisättiin 0,1 ml fosfaatti-puskuroitua saliinia, pH 7,2, ja 0,1 ml erilaisia laimennuksia hiiren hybridooman kasvualustaa tai ascites-nestettä laimennettuna 1:50 hiiren normaaliin seerumiin. Kaikki puskurit sisälsivät myös 5 % dekstraania (moolipaino 40 000).

18 tunnin kuluttua 4°C:ssa, lisättiin 0,1 ml saostavaa toista vasta-ainetta (vuohen antihiiri-IgG-seerumi). Neljän tunnin inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa lisättiin 2 ml kylmää PBS:ää, ja putkia sentrifugoitiin 2000 x g 30 minuuttia 4°C:ssa. Supernatantit dekantoitiin, ja 125I-aktiivisuus määritettiin pelleteistä gammalaskijassa.

Maksimaalinen saostuva radioaktiivisuus määritettiin korvaamalla IgSORB (MB47:lle) tai toinen vasta-aine (AI-10:lie ja AI-11:lie) 100 %:lla TCA:ta. Minimaalinen saostuva radioaktiivisuus tai epäspesifinen sitoutuminen (NSB) määritettiin korvaamalla spesifiset hybridoomavasta-aineet asiaan kuulumattomalla hybridoomavasta-aineella samasta raskasketjuluo-kasta.

Tulokset laskettiin: prosentti sitoutunutta 125I-antigeeniä =

Keskiarvo-NSB x 100 TCA-NSB

jossa kaavassa KESKIARVO = keskimääräinen saostunut radioaktiivisuus tietyn määrän spesifistä vasta-ainetta ollessa 70 8921 4 läsnä, ja TCA on maksimaalinen TCA-saostuva radioaktiivisuus .

D. Kompetitiivinen immunoentsymometrinen määritys AI-10:lie ia AI-ll;lle_

Joustavat polyvinyylikloridiset mikrotiitterilevyt päällystettiin noin 18 tunnin ajan (yli yön) 4°C:ssa 0,2 ml:11a fosfaattipuskuroitua saliinia (PBS), joka sisälsi 5 Mg/ml joko HDL:ää tai puhdistettua apo A-I:tä. Kuopat pestiin kolme kertaa 0,3 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1,0 g BSA:ta ja 0,5 ml Tween 20:tä litraa kohti. Jäljelle jääneet sitoutu-mispaikat kuopissa suojattiin inkuboimalla 0,2 ml PBS:ää, joka sisälsi 30 mg BSA:ta litraa kohti, kuopissa yhden tunnin ajan vallitsevassa lämpötilassa (20-25°C:ssa). Kuoppia pestiin sen jälkeen kolme kertaa huuhtelupuskurilla. Levyt käytettiin välittömästi.

PBS:ää (0,05 ml), joka sisälsi 0,375 μg/ml AI-10:tä konju-goituna piparjuuriperoksidaasin kanssa, inkuboitiin esipääl-lystetyissä kuopissa 0,05 ml:n kanssa PBS:ää, joka sisälsi 0-8,0 μg/ml konjugoitumatonta monoklonaalista AI-10- tai konjugoitumatonta monoklonaalista AI-11-vasta-ainetta. Inku-bointiaika oli kolme tuntia vallitsevassa lämpötilassa (20-25°C). Kuopat pestiin sen jälkeen kolme kertaa huuhtelu-puskurilla, ja 0,1 ml PBS:ää, joka sisälsi o-fenyleenidi-amiinisubstraattia, lisättiin kaikkiin kuoppiin, ja niitä inkuboitiin 30 minuuttia vallitsevassa lämpötilassa. Väri-reaktio lopetettiin lisäämällä 0,05 ml 4N H2S04:ää kaikkiin kuoppiin, ja jokaisen kuopan optinen tiheys (O.D.) määritettiin aallonpituudessa 490 nanometriä (nm), käyttäen Dyna-techin 96-kuoppaisen levyn lukijaa.

Apo A-I:llä päällystetyn levyn tulokset esitetään kuviossa 3A, ja tulokset HDL:llä päällystetyllä levyllä esitetään kuviossa 3B. Leimaamattornien AI-11-molekyylien 21-kertainen lisääntyminen ei merkitsevästi aiheuttanut kilpailua perok-sidaasilla leimattujen AI-10-molekyylien kanssa sitoutumisesta HDL:ään tai apo A-I:een. Tutkimus on toistettu käyttä- 7i 8921 4 en peroksidaasileimattua AI-liitä leimaamattornien AI-10:n ja AI-li:n kanssa samoissa pitoisuuksissa olennaisesti samoin tuloksin.

Esillä olevaa keksintöä on kuvattu kiinnittäen huomiota edullisiin suoritusmuotoihin. Alaa tunteville on selvää, että modifikaatioita ja/tai variaatioita voidaan tehdä koskien esille tuotua kohteena olevaa asiaa poikkeamatta keksinnön mukaisesta alasta, jota tässä yhteydessä on esitetty.

Claims (13)

72 8 92 1 4

1. Menetelmä osoittavan aineen määrittämiseksi epänormaalille lipidiaineenvaihdunnalle, joka menetelmä käsittää vaiheet ihmisen apolipoproteiini B-100:n ja apolipoproteiini A-I:n määrän määrittämiseksi verinäytteen tilavuusyksikössä ja apolipoproteiini B-100:n suhteen määrittämiseksi apolipoproteiini A-I:een näytteessä, tunnettu siitä, että (a) määritetään läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n määrä ensimmäisestä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän nestemäisen verinäytteen alikvootista henkilöltä siten, että: {i) sekoitetaan mainittu ensimmäinen nestemäinen näyteali-kvootti kiinteän kantajan kanssa, joka koostuu pääasiallisesti kiinteästä matriisista, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja ensimmäisiä monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746, ensimmäisen kiin-teä-nestefaasisen seoksen muodostamiseksi, mainitun kantajan pinnan sisältäessä suojattuja, epäspesifisiä sitoutumispaik-ko j a; (ii) inkuboidaan mainittua ensimmäistä kiinteä-nestefaasista seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka mainittujen ensimmäisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan näyteali-kvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n kanssa ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken mainitussa näytealikvoo-tissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n; (iii) sekoitetaan mainitun ensimmäisen nestemäisen näyte- alikvootin sisältämä apolipoproteiini B-100 nestefaasisten toisten monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-l00:n kanssa, joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 ja HB 8746, mutta joita ei käytetä vaiheessa (a) (i), ja jotka ovat toiminnallisesti kytketyt entsyymi- indikaattoriin, toisen seoksen muodostamiseksi; 73 8921 4 (iv) inkuboidaan mainittua toista seosta biologisissa määri -tysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka mainittujen toisten, indikaattoriin kytkettyjen paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken näytealikvootin sisältämän apolipoproteiini B-100:n; (v) erotetaan kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka ovat seurausta edellisistä vaiheista (a) (i-iv); ja (vi) määritetään erotetussa kiinteässä faasissa läsnäolevan indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän immunoreaktantin määrä, ja siten näytteen tilavuusyksi-kon sisältämän apolipoproteiini B-100:n määrä; (b) määritetään toinen mainitun nestemäisen verinäytteen alikvootti, joka sisältää apolipoproteiini A-I:tä, ja jota ei ole käsitelty peittymistä poistavasti, läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n suhteen siten, että: (i) sekoitetaan mainittu toinen nestemäinen näytealikvootti kiinteän kantajan kanssa, joka koostuu pääasiallisesti kiinteästä matriisista, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja kolmansia monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa, ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, kolmannen, kiinteä-nestefaasisen seoksen muodostamiseksi, jonka mainitun kiinteän kantajan pinta sisältää suojattuja epäspesifisiä sitoutumispaikkoja; (ii) inkuboidaan mainittua kolmatta, kiinteä-nestefaasista seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka on mainittujen kolmansien paratooppisten molekyylien kannalta riittävä immunoreagoimaan näytealikvoo-tissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n kanssa ja muodostamaan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin, joka sisältää olennaisesti kaiken näytealikvootin sisältämän apolipoproteiini Ä-I:n; (iii) sekoitetaan mainitun toisen nestemäisen näytealikvootin sisältämä apolipoproteiini A-I nestefaasisten, neljänsien monoklonaalisten paratooppisten molekyylien kanssa, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa, joita 74 8921 4 erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, mutta joita ei käytetä vaiheessa (b) (i), ja jotka ovat toiminnallisesti kytketyt entsyymi - indikaattoriin neljännen seoksen muodostamiseksi; (iv) inkuboidaan mainittua neljättä seosta biologisissa mää-ritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka mainittujen neljänsien, indikaattoriin kytkettyjen paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä muodostamaan immunoreaktan-tin olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnäolevan apoli-poproteiini A-I:n kanssa; (v) erotetaan kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka ovat seurausta vaiheista (b) (i-iv); ja (vi) määritetään erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini A-I:tä sisältävän immunoreaktantin määrä, ja siten näytteen tilavuusyksikön sisältämän apolipoproteiini A-I:n määrä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut sekoitusvaiheet (a) (i) ja (a) (iii) suo ritetaan olennaisesti samanaikaisesti, ja mainitut inkuboin-tivaiheet (a) (ii) ja (a) (iv) suoritetaan yhdessä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka ovat läsnä vaiheen (a) (ii) jälkeen, erotetaan ennen vaihetta (a) (i- ii), ja että mainitun ensimmäisen nestemäisen alikvootin sisältämä apolipoproteiini B-100, joka sekoitetaan vaiheessa (a) (iii), on läsnä kiinteään faasiin sidotussa immunoreak-tantissa, joka muodostuu vaiheessa (a) (ii).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteät ja nestemäiset faasit, jotka ovat läsnä vaiheen (b) (ii) jälkeen, erotetaan ennen vaihetta (b) (iii), ja että mainitun toisen, nestemäisen alikvootin sisältämä apolipoproteiini A-I, joka alikvootti sekoitetaan vaiheessa (b) (iii) , on läsnä kiinteään faasiin sidotussa immunoreaktantissa, joka muodostuu vaiheessa (b) (ii). 75 8921 4

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut sekoitusvaiheet (b) (i) ja (b) (iii) suoritetaan olennaisesti samanaikaisesti ja että mainitut in-kubointivaiheet (b) (ii) ja (b) (iv) suoritetaan yhdessä.

6. Menetelmä osoittavan aineen määrittämiseksi epänormaalille lipidiaineenvaihdunnalle, joka menetelmä käsittää vaiheet ihmisen apolipoproteiini B-100:n ja apolipoproteiini A-I:n määrän määrittämiseksi verinäytteen tilavuusyksikössä ja apolipoproteiini B-100:n suhteen määrittämiseksi apolipoproteiini A-1reen nähden näytteessä, tunnettu siitä, että (a) määritetään läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n määrä ensimmäistä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän nestemäisen verinäytteen alikvootista henkilöltä siten, että: {i) muodostetaan ensimmäinen kiinteä-nestefaasinen seos sekoittamalla olennaisesti samanaikaisesti mainittu ensimmäinen nestemäinen näytealikvootti kiinteän kantajan kanssa, joka koostuu pääasiallisesti kiinteästä matriisista, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja, ensimmäisiä monoklo-naalisia paratboppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa ja joita erittää toinen hyb-ridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746, ja toisia monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka ovat toiminnallisesti kytketyt entsyymi-indikaattoriin ja joita erittää jompikumpi hybridoomista, joiden ATCC HB-talletusnumerot ovat 8742 tai 8746, mutta eivät ole ensimmäisiä paratooppisia molekyylejä, jotka ovat sitoutuneet kiinteään matriisiin, mainitun kantajan pinnan sisältäessä suojattuja, epäspesifisiä sitoutumispaikkoja; (ii) inkuboidaan mainittua ensimmäistä kiinteänestefaasista seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka mainittujen ensimmäisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä ja mainittujen, indikaattoriin kytkettyjen toisten paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunoreagoimaan olennaisesti kaiken näyteali-kvootissa läsnä olevan apolipoproteiini B-100:n kanssa kiinteään faasiin sidotun sandwich-immunoreaktantin ja nestemäisen faasin muodostamiseksi; 76 8921 4 (iii) erotetaan kiinteät ja nestemäiset faasit; ja (iv) määritetään erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini B-100:aa sisältävän sandwich-immunoreaktantin määrä, ja siten näytteen tila-vuusyksikön sisältämän apolipoproteiini B-l00:n määrä; (b) määritetään toinen mainitun nestemäisen verinäytteen alikvootti, joka sisältää apolipoproteiini A-I:tä ja jota ei ole käsitelty peittymistä poistavasta, läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n suhteen siten, että: (i) muodostetaan toinen kiinteä-nestefaasinen seos, sekoittamalla olennaisesti samanaikaisesti mainittu toinen nestemäinen näytealikvootti kiinteän kantajan kanssa, joka koostuu pääasiallisesti kiinteästä matriisista, joka sisältää kiinteään faasiin sidottuja kolmansia monoklonaalisia para-tooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, ja neljänsiä monoklonaalisia paratooppisia molekyylejä, jotka ovat toiminnallisesti kytketyt entsyymi-indikaattoriin, ja joita erittää jompikumpi hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201, eivätkä ole kiinteään faasiin sidottuja kolmansia paratooppisia molekyylejä, mainitun kantajan pinnan sisältäessä suojattuja epäspesifisiä sitoutu-mispaikkoja; (ii) inkuboidaan mainittua toista kiinteä-nestefaasista seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka mainittujen kolmansien paratooppisten molekyylien ja mainittujen indikaattoriin liitettyjen neljänsien paratooppisten molekyylien kannalta on riittävä immunorea-goimaan olennaisesti kaiken näytealikvootissa läsnä olevan apolipoproteiini A-I:n kanssa kiinteään faasiin sidotun sandwich-immunoreaktantin ja nestefaasin muodostamiseksi; (iii) erotetaan kiinteät ja nestemäiset faasit; ja (iv) määritetään erotetussa kiinteässä faasissa läsnä olevan, indikaattoriin kytkettyä apolipoproteiini A-I:tä sisältävän sandwich-immunoreaktantin määrä, ja siten näytteen tilavuusyksikön sisältämän apolipoproteiini A-I:n määrä. 7? 89214

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuja ensimmäisiä paratooppisia molekyylejä erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuja kolmansia paratooppisia molekyylejä erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9200.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu inkubointi biologisissa määritysolosuh-teissa vaiheissa (a) (ii) ja (b) (ii) on kestoltaan noin 30 minuuttia - noin 60 minuuttia vallitsevassa huoneen lämpötilassa .

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu inkubointi on kestoltaan noin 30 minuuttia, ja se suoritetaan sekoittaen.

11. Diagnostinen systeemi, joka sopii käytettäväksi määritettäessä apolipoproteiini B-100:n suhdetta apolipoproteiini A-I:een nestemäisessä verinäytteessä, tunnettu siitä, että systeemi käsittää: a) ensimmäisen astian, joka sisältää paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-l00:n kanssa ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletus-numerot ovat HB 8742 tai HB 8746; b) toisen astian, joka sisältää paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa, joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8742 tai HB 8746, mutta eivät sisälly ensimmäiseen astiaan ja ovat toiminnallisesti liitetyt entsyymi-indikaat-toriin; c) kolmannen astian, joka sisältää paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa ja joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 9200 tai HB 9201; ja d) neljännen astian, joka sisältää paratooppisia molekyylejä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini A-I:n kanssa ja 78 8921 4 joita erittää toinen hybridoomista, joiden ATCC-talletusnu-merot ovat HB 9200 tai HB 9201, mutta jotka eivät sisälly kolmanteen astiaan, ja jotka ovat toiminnallisesti liitetyt entsyymi- indikaattoriin; kunkin mainituista paratooppisista molekyyleistä ollessa läsnä määränä, joka riittää suorittamaan mainitun apolipo-proteiinien suhteen yhden määrityksen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen diagnostinen systeemi, tunnettu siitä, että vastaavat monoklonaaliset paratooppi-set molekyylit, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n ja apolipoproteiini A-I:n kanssa, jotka molekyylit eivät ole liitetyt mainittuun vastaavaan indikaattoriin, ovat kukin erikseen sidottuina kiinteäfaasiseen matriisiin erillisten kiinteiden kantajien muodostamiseksi, mainittujen kantajien pintojen sisältäessä suojattuja epäspesifisiä si-toutumispaikkoja.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen diagnostinen systeemi, tunnettu siitä, että monoklonaaliset paratooppiset molekyylit, joita erittävät hybridoomat, joiden ATCC-talletusnume-rot ovat HB 8746 ja HB 9200, ovat sitoutuneet mainittuihin erillisiin kiinteisiin matriiseihin. 79 8921 4