DK174932B1 - Apolipoprotein B-specifikke monoklonale antistoffer og hybridomaer, som producerer disse antistoffer - Google Patents

Description

DK 174932 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår generelt nye hybri-domaer og nærmere bestemt hybridomaer, der producerer receptormolekyler, som immunoreagerer med apolipoprotein B-100, de således producerede receptormolekyler samt diagnostiske » 5 metoder og systemer, hvorved disse receptormolekyler anven- „ des.

Lipoproteiner er de primære bærere af plasma-chole-sterol og triglycerider. De er micelleformige lipid-protein--komplekser, der indeholder protein (betegnet apoprotein) 10 og polære lipider anordnet i en overfladefilm, der omgiver en neutral lipidkerne (af triglycerid og cholesterylester). Lipoproteiner blev oprindelig identificeret på basis af deres densiteter målt ved ultracentrifugering. Der er således fire hoved-densitetsklasser: chylomicroner, lipoproteiner 15 med meget lav densitet (VLDL), lavdensitets-lipoproteiner (LDL) og højdensitets-lipoproteiner (HDL).

Sideløbende med fremskridtene inden for teknologien ---vedrørende—ul-traeentrifugeseparationer-er--der— sket—en—yder-__________.

ligere underopdeling af LDL- og HDL-densitetsklasserne i 20 yderligere underklasser med større homogenitet. F.eks. kan LDL opløses i et lipoprotein med mellemliggende densitet (IDL) og en LDL2-underklasse. Imidlertid er selv disse underklasser sammensat af funktionelt heterogene populationer af lipoproteinpartikler på grund af deres forskellige apo-25 proteinindhold.

Otte hoved-apoproteiner, A-I, A-II, AIV, B, C-I, C-II, C-III og E, er blevet isoleret, og af gruppen af mindre ' apoproteiner, der kan udvindes i større mængder fra visse densitetsklasser, kan de fleste også findes i andre densi-30 tetsklasser. Således indeholder de fleste LDL-partikler kun apo-B, men nogle få partikler indeholder også andre apoproteiner, og dette er årsagen til spormængderne af apo-C--I, apo-C-ll, C-III og apo-E, som er til stede i denne densitetsklasse.

35 I nogle tilfælde er specifikke funktioner blevet tilskrevet bestemte apoproteiner. F.eks. bliver en form af DK 174932 B1 2 apo B, der syntetiseres i leveren og betegnes. apo-B-100, genkendt og bundet af cellulære LDL-receptorer. Ved binding af apo-B-100 binder disse receptorer LDL-partikler og fjerner dem fra plasmaet. LDL optages derved i cellerne og nedbrydes, 5 hvorved der dannes cholesterol, som tjener til at opfylde , cellernes behov. Apo B-LDL-receptorvekselvirkningen spiller „ således en væsentlig rolle ved fjernelsen af LDL-cholesterol fra blodbanen.

En anden form af apo B, der betegnes apo B-48, gen-10 kendes ikke af LDL-receptoren. Denne apo B-form, som kun er 48% så stor som apo B-100, syntetiseres hos mennesker kun af tyndtarmen. Lipoproteiner indeholdende apo B-48, såsom chylomicroner og chylomicron-rester, bindes ikke til LDL-receptoren.

15 Selv om disse to former af apo B synes at være under separate genetiske kontroller (der er beskrevet en enkelt patient, som syntetiserer apo B-48, men ikke apo B^IOO), har immunologiske undersøgelser vist, at apoproteinerne B--100 og B-48 har fælles antigene determinanter. Mindst tre 20 forskningsgrupper har rapporteret dannelse af i alt 7 forskellige monoklonale antistoffer, som bindes til både apo B-100 og apo B-48. Resultaterne, som er rapporteret af disse forskere, tyder stærkt på, at apo B-48 og apo B-100 er strukturelt beslægtede proteiner, dvs. at apo B-48 kan udgøre en 25 del af apo B-100-proteinet. Der er også blevet rapporteret tegn på, at apo B-48 og apo B-100 ikke findes på samme lipo-proteinpartikel, hvilket tyder på, at der eksisterer separate apo B-partikler. '

Fornylig har flere forskere foreslået, at plasmanive-30 auer af apo B kan give en bedre forudsigelse af risikoen for coronararteriesygdom (CAD) end plasma-LDL-cholesterol-niveauer, jf. Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 604-608 (1980). Da arteriosclerotisk karsygdom og dens komplikationer fortsat er en af de førende årsager til død 35 og invaliditet i den vestlige verden, har der længe været behov inden for den biomedicinske industri for bestemmelses- 3 DK 174932 B1 systemer, der kan identificere personer med risiko for CAD.

Mange typer af immunobestemmelser af plasma-apoprotein B, hvorved der anvendes antisera indeholdende specifikt antistof, er blevet beskrevet, herunder kompetitive væs-5 kefase- og fastfase-radioimmunobestemmelser (RIA), enzym-bundne immunosorbensbestemmelser (ELISA), radiale immunodif-fusionsbestemmelser og andre. Problemer, som begrænser udbredt anvendelse af disse apo B-immunobestemmelser, har været reproducerbarheden og kvaliteten og specificiteten af 10 de anvendte antisera. Gennemgange af de metodologiske problemer ved hver af de forskellige typer af apo B-besteramelser findes i Currey et al., Clin. Chem 24., 280-286 (1978) og Rosseneu et al., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983).

Flere forskere har rapporteret udvikling af paneler 15 af monoklohale antistoffer mod humant apo B til anvendelse ved undersøgelse af dets antigene struktur og rolle ved lipoproteinmetabolisme. Endvidere har der været rapporter ------------om—an vendel s e_af__an.ti-apo__B-monoklonale antistoffer til__ ______ måling af plasma-apo B-niveauer ved væskefase-RIA, jf. Patton 20 et al., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) og Maynard et al.,

Clin. Chem.30. 1620-1624 (1984). Desuden har en gruppe rapporteret anvendelse af en blanding af anti-apo B-monoklonale antistoffer ved en radial immunodiffusionsbestemmelse for plasma-apo B, jf. Marconvina et al., Clin. Chem. Acta 147.

25 117-125 (1985). Imidlertid har disse bestemmelsesmetoder den ulempe, at det er nødvendigt at anvende langvarige in-kuberinger, gentagen centrifugering eller anvendelse af ‘ radioaktive materialer.

Anvendelsen af monoklonale antistoffer som reagenser 30 til bestemmelse af tilstedeværelsen af apo B-100 i humane kropsvæskeprøver er attraktiv, fordi sådanne reagenser, når de først er tilvejebragt, kan produceres i relativt store mængder med ensartet kvalitet. Der er imidlertid et antal faktorer, som modvirker anvendelsen af et bestemt monoklonalt 35 antistof som komponent i et apo B-100-bestemmelsessystem.

For det første er det kendt, at et monoklonalt anti- •4 DK 174932 B1 stof kan være for immunospecifikt til at være anvendeligt på grund af den antigene heterogenitet af mål-antigenet.

F.eks. afhænger specificiteten af konventionelle antisera indeholdende polyklonalt antistof af en samstemmighed af 5 hundredetusindvis af forskellige antistoffer, der bindes til antigene determinanter, som dækker det meste eller det hele af et antigent protein. Som resultat heraf vil små ændringer i strukturen af antigenet på grund af genetisk polymorfi, glycosyleringsheterogenitet eller let denature-10 ring sædvanligvis have ringe effekt på binding af polyklonalt antistof. På lignende, måde vil en større eller mindre undergruppe af antistoffer af polyklonale antisera sædvanligvis binde antigener, der er blevet modificerede eller denaturerede.

15 I modsætning hertil bindes monoklonale antistoffer sædvanligvis til én antigen determinant (epitop) på antigenmolekylet. Hvis denne determinant af en eller anden grund er ændret, er det ikke sikkert, at antistoffet fortsat bindes. Om dette er et problem eller en fordel afhænger af de 20 individuelle omstændigheder. Hvis det monoklonale antistof som i det foreliggende tilfælde skål anvendes ved en diagnostisk bestemmelse af et apoprotein, kan en mindre antigenvariation i dette protein forårsage store fejl.

Den antigene heterogenitet af apoprotein B-100 er 25 veldokumenteret. F.eks. har det vist sig, at epitop-ekspres-sion på apo B moduleres af (1) sammensætningen af de associerede lipider, (2) temperaturen ved immunoreaktionen, (3) graden af isolering af LDL fra dets naturlige omgivelser, , og (4) genetisk ekspression mellem individer.

30 For det andet, på grund af deres enestående specifi citet, er den vellykkede anvendelse af et monoklonalt antistof (MoAb) ofte afhængig af dets affinitet til målantigenet.

Medens f.eks. et monoklonalt antistof kan have tilstrækkelig affinitet til at være anvendeligt ved binding af væske- og 35 fastfase-antigen, medens det monoklonale antistof selv er i væskefase, behøver det samme antistof ikke at være anven- 5 DK 174932 B1 deligt som fastfase-bundet antistof, som er anvendeligt til at binde og "udtrække" antigenet fra opløsningen.

De ovennævnte problemer er generelle for anvendelsen af monoklonale antistoffer. Det er derfor blevet erkendt, 5 at det er afgørende at afprøve og karakterisere monoklonale antistoffer i ethvert bestemmelsessystem, hvori de skal anvendes, jf. James W. Goding, Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice.", side 40-46, Academic Press, New York (1983).

10 I et aspekt angår den foreliggende opfindelse hybri- domaet betegnet HL130C2.3C5, der har ATCC-deponeringsnummeret HB 8746. Dette hybridoma og dets receptormolekyler betegnes også MB47 i den foreliggende beskrivelse.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse 15 receptormolekyler, der immunoreagerer med apoprotein B-100 og udskilles af hybridoroaet ATCC HB 8746.

I endnu et aspekt angår den foreliggende opfindelse hybridomaet betegnet V82A6.1G4, der har ATCC-deponeringsnummeret HB 8742. Dette hybridoma og dets receptormolekyler 20 betegnes også MB24 i den foreliggende beskrivelse.

I endnu et aspekt angår den foreliggende opfindelse receptormolekyler, der reagerer med apoprotein B-100 og udskilles af hybridomaet ATCC HB 8742.

I et andet aspekt angår opfindelsen en cellekultur, 25 der omfatter (a) et hybridoma ifølge opfindelsen, (b) receptormolekyler, der udskilles af hybridomaet, og som immuno-Λ reagerer med apoprotein B-100, og (c) et kulturmedium for hybridomaet.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen en frem-30 gangsmåde til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for tilstedeværelsen af apoprotein B-100, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, 35 (b) tilvejebringelse af receptormolekyler i biologisk aktiv form, der (i) immunoreagerer med apoprotein B-100, og 6 DK 174932 B1 (ii) udskilles af enten hybridoma HB 8746 eller hybridoma HB 8742, (c) blanding af kropsvæskeprøven med receptormolekylerne, 5 (d) bibeholdelse af blandingen under biologiske be stemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at receptormolekylerne immunologisk binder apoprotein B-100, som er til stede i prøven, til dannelse af en immunoreaktant, og 10 (e) bestemmelse af den dannede mængde immunoreaktant.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for apoprotein B-100, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: 15 (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, (b) tilvejebringelse af en fast bærer, der omfatter en fast matriks, hvortil der i biologisk aktiv form er bundet en første receptor, der immunoreagerer med apoprotein B-100 20 og udskilles af hybridomaet med ATCC-deponeringsnumroeret HB 8746, (c) tilvejebringelse af en biologisk aktiv anden receptor, der immunoreagerer med apoprotein B-100 og udskilles af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, 25 hvor den anden receptor er bundet til en enzymmærkning, der er i stand til at vise tilstedeværelsen af den anden receptor i en immunoreaktant, (d) i det væsentlige samtidig blanding af: (i) kropsprøven, 30 (ii) den første receptor og (iii) den mærkede anden receptor til dannelse af en fastfase/væskefase-immunoreaktionsblan-ding, e) bibeholdelse af blandingen under biologiske bestem- 35 melsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at den første receptor og den mærkede anden 7 DK 174932 B1 receptor immunologisk binder apoprotein B-100, som er til stede i prøven, til dannelse af en fastfase-sandwich-im-munoreaktant, (f) fraskillelse af fastfase-sandwich-immunoreaktanten 5 fra væskefasen, og (g) bestemmelse af mængden af mærket andet antistof bundet i den dannede fastfase-sandwich-immunoreaktant.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en kompetitiv fremgangsmåde til undersøgelse af en kropsvæs-10 keprøve for apoprotein B-100, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, (b) tilvejebringelse af en fast bærer, der omfatter 15 en fast matriks, hvortil der er bundet en forudbestemt mængde reagens-apoprotein B-100, (c) i det væsentlige samtidig blanding af ^ kropsprøven, - (ii) den faste bærer og 20 (iii) en forudbestemt mængde receptormolekyler, der immunoreagerer med apoprotein B-100, som udskilles af enten hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746 eller hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742 til dannelse af en fastfase/væskefase-blanding, 25 (d) bibeholdelse af blandingen under biologiske be stemmelsesbetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at receptormolekylerne immunologisk bindes til apoprotein B-100-molekyler af den faste bærer og apoprotein B--100-molekyler, som er til stede i kropsvæskeprøven, og 30 danner en fastfase-immunoreaktant og en væskefase-immunore-aktant, (e) fraskillelse af fastfase-immunoreaktanten fra væskefasen, (f) blanding af fastfase-immunoreaktanten med en 35 biologisk aktiv anden receptor, der immunoreagerer med den første receptor til dannelse af en anden fastfase/væskefase- .

8 DK 174932 B1 -imraunoreaktionsblanding, hvor den anden receptor er bundet til en enzymmærkning, der kan vise tilstedeværelsen af den anden receptor i en imraunoreaktant, (g) bibeholdelse af den anden blanding under biologi-5 ske bestemmelsesbetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at den mærkede anden receptor bindes immunologisk til den første receptor, der er til stede som fastfase-im-munoreaktant, til dannelse af en fastfase-sandwich-immuno-reaktant, 10 (h) fraskillelse af fastfase-sandwich-immunoreaktanten fra væskefasen, og (i) bestemmelse af mængden af mærket anden receptor, .som er bundet i fastfase-sandwich-immunoreaktanten.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse 15 en cellekultur, der omfatter: (a) hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746, (b) receptormolekyler udskilt af hybridomaet, der immunoreagerer med apoprotein B-100, og (c) et kulturmedium for hybridomaet.

20 I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en sammensætning, der omfatter: (a) hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, (b) receptormolekyler udskilt af hybridomaet, der immunoreagerer med apoprotein B-100> og 25 (c) et kulturmedium for hybridomaet.

I et andet aspekt angår den foreliggende opfindelse et diagnostisk system til bestemmelse af mængden af apo B--100 i en kropsprøve, hvilket system omfatter: (a) et biologisk aktivt, første specifikt bindende 30 middel, der omfatter receptormolekyler, som (i) immunoreagerer med apoprotein B-100, og (ii) enten er receptormolekyler udskilt af hybridomaet ATCC HB 8746 eller receptormolekyler udskilt af hybridomaet ATCC HB 8742, og (b) et biologisk aktivt, mærket andet specifikt bin-35 dende middel til at vise immunoreaktionen af det første bindende middel med apo B-100.

9 DK 174932 B1

Et affinitetsbindende middel i fast matriks, der omfatter en fast matriks bundet til biologisk aktive receptormolekyler, der immunoreagerer med apoprotein B-100 og er valgt blandt: 5 (a) receptormolekyler udskilt af hybridomaet HB 8746, (b) receptorroolekyler udskilt af hybridomaet ATCC HB 8742, og (c) en blanding af receptormolekylerne fra (a) og (b).

10 Den foreliggende opfindelse har flere fordele.

En fordel ved den foreliggende opfindelse er, at hybridomaerne ifølge opfindelsen kan anvendes til at producere relativt store mængder af receptorer med ensartet kvalitet, der immunoreagerer med apo B-100.

15 En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at receptorerne ifølge opfindelsen bl.a. er anvendelige til bestemmelse af mængden af cholesterolbærende apo B-100 i -----------------en—kropsvæskeprøve-.-----------

En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, 20 at receptorerne ifølge opfindelsen kan anvendes ved enzym-bundne immunosorbens-bestemmelser af apo B-100 ved metoder, der ikke kræver centrifugeringsprocedurer.

En anden fordel er, at bestemmelsesmetoderne ifølge opfindelsen kan gennemføres på relativt kort tid.

25 Andre fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den følgende beskrivelse af opfindelsen, tegningen og kravene.

Figur 1 på tegningen er et fotografi af et Western Blot-bestemmelse-autoradiografi, der viser evnen af MB47-30 og MB2 4-receptormolekyler til at immunoreagere med apo B--100 og apo B-48 fra delipiderede chylomicroner og VLDL.

VLDL og chylomicroner delipideres og underkastes SDS-poly-acrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af 3-6 %'s gradient geler. 60 μg VLDL-protein og 20 μg chylo-35 micron-protein underkastes elektroforese på baner af gelen, hvorved proteinerne i hvert præparat adskilles efter størrel- 10 DK 174932 B1 se. Synliggørelse af det elektroforetiske mønster af proteinbånd ved farvning af gelen med 0,1 % Coomassie Blue viser apo B-100- og apo B-48-bånd i chylomicroner og VLDL. Proteinbåndene bindes derefter til nitrocellulosepapir ved elektro-5 foretisk overføring til dannelse af en fast bærer. Apopro-tein-antigenerne bundet til den faste bærer immunoreageres derefter hver for sig med immunorensede MB47- og MB24-recep-tormolekyler. Monoklonale MB47- og monoklonale MB24-receptor-molekyler, som er bundet immunologisk til fastfase-bundet 10 antigen, påvises ved anvendelse af 125I-mærket gede-anti--muse-Ig og autoradiografi.

Bane A viser, at monoklonalt MB24 immunoreagerer med apo B-100 og apo B-48 fra VLDL (V) og chylomicroner (C).

Bane B viser, at monoklonalt MB47 immunoreagerer med apo B-15 -100 fra V og C, men ikke med apo B-48 fra hverken V eller C. Bane C er en negativ kontrol, der viser, at et monoklonalt antistof, som er specifikt for røde blodlegemer fra får, ikke immunoreagerer med noget tilstedeværende antigen. Bane D er en anden negativ kontrol, der viser, at et immunorenset 20 polyklonalt antiserum over for phenyl-Ø-O-glycosid ikke genkender nogen tilstedeværende antigener. Bane E er en positiv kontrol, der viser, at et immunorenset kanin-polyklo-nalt antiserum mod humant LDL-apoprotein genkender både apo B-100 og apo B-48 i både V og C.

25 Figur 2 er en graf, der viser procentdelen af 125j_ -mærkede LDL-partikler bundet (ordinaten) ved stigende molære koncentrationer af monoklonalt antistof MB47 (abscissen, Ab-koncentration (MoAb)) ved en væskefase-radioimmunobestem-melse (RIA).

30 LDL fremstilles ud fra poolet plasma fra 10 personer (----) eller fra en normolipidemisk person (_) .

Plasma fås ved plasmaferese af personer efter en ca. 12 timers fasteperiode.

Figur 3 er et søjlediagram, der viser graden af in-35 hibering af antistof MB47 (åbne søjler: MB47) og overskydende umærket humant LDL (skraverede søjler: LDL) på binding, 11 DK 174932 B1 inkorporering og nedbrydning af 125I-humant LDL ved hjælp af dyrkede humane fibroblaster. Fibroblast-monolag dyrkes i 35 mm's brønde i DME indeholdende 10% kalvefosterserum. Fibroblast-LDL-receptorer stimuleres ved ca. 24 timers for-5 inkubering af fibroblasterne med vækstmedium indeholdende 2,5 mg/ml lipoproteinfrit serum (LDS) (DME-LDS). DME-LDS indeholdende 2,5 Mg/ml 125I-LDL og enten 20 volumenprocent ovenstående væske fra MB47-hybridomakultur eller et 200 ganges overskud af umærket LDL (slutkoncentration 500 Mg/ml) 10 blandes og holdes (inkuberes) i ca. 16 timer ved 4*C før anbringelsen på fibroblast-monolagene.

Bestemmelsen af bindingen, inkorporeringen og nedbrydningen gennemføres hver gang som tredobbelt bestemmelse og udtrykkes som procentdel af kontrolværdier, der bestemmes i 15 fraværelse af monoklonal receptor MB47. Inhiberingen af specifik binding, inkorporering og nedbrydning ved hjælp af monoklonal receptor MB47 er sammenlignelig med den, der fås med et 200 ganges overskud af umærket LDL.

Figur 4 omfatter to grafer, der viser evnen af mono-20 valente Fab-fragmenter af monoklonalt antistof MB47 til at inhibere binding og nedbrydning af 125I-humant LDL ved hjælp af humane fibroblaster. Individuelle medier indeholdende stigende mængder af MB47-Fab-fragmenter og en konstant mængde 125I-LDL (2,5 Mg/ml) blandes og holdes (inkuberes) i et 25 tidsrum på ca. 15 timer ved 4*C før anbringelsen på fibroblast-monolagene. Fab-koncentrationen udtrykkes som det molære forhold Fab/LDL i hvert medium (idet der antages en molekylvægt af Fab på 40.000 dalton og en molekylvægt af apo B på 550.000 dalton).

30 Bindingen og nedbrydningen udtrykkes som procentdel af kontrolværdier i fraværelse af MB47-Fab-fragmenter. Alle bestemmelser gennemføres som dobbeltbestemmelser. Et overskud af umærket LDL (slutkoncentration 500 Mg/ml) giver mere end 95%'s inhibering af 125I-LDL-binding (figur 4A) og -nedbryd-35 ning (figur 4B). Lignende resultater fås ved tre undersøgelser roed forskellige Fab-præparater af monoklonal receptor 12 DK 174932 B1 MB47.

Figur 5 omfatter to grafer. Grafen A viser evnen af en kendt konstant mængde peberrodsperoxidase-mærkede MB47--receptorer (HRPO-MB47) til at immunoreagere med fastfase-5 -bundet reagens-apo B-100 i nærværelse af stigende mængder af MB24-receptormolekyler. Ordinaten i relative optiske tæthedsenheder, medens abscissen er i enheden μg/ml af umærket antistofprotein tilsat som kompetitor.

En konstant mængde' (20 μg) af HRPO-koblede MB47-recep-10 torer blandes i det væsentlige samtidig med stigende mængder af umærkede MB47-receptorer (·) eller umærkede (MB24-recep-torer (1) og fastfase-bundet reagens-apo B-100 (LDL). Blandingerne holdes i 3 timer ved 25*C, hvorved receptorerne får lov til immunologisk at binde reagens-apo B-100 og danne 15 en fastfase-immunoreaktant. Mængden af fastfase-bundet mærket MB47 bestemmes derefter som ved den kompetitive ELISA beskrevet i afsnittet "materialer og metoder".

Graf A viser, at tilstedeværelsen af stigende mængder af umærkede MB47-receptorer i immunoreaktionsblandingen 20 tilsvarende nedsætter mængden af mærkede MB47-receptorer bundet som fastfase-immunoreaktant. Umærket MB47 konkurrerer således med mærket MB47 om LDL.

På den anden side viser grafen A også, at stigende mængder af umærkede MB24-receptorer ikke væsentligt nedsætter 25 mængden af mærket MB47, der bindes som fastfase-immunoreaktant. Umærket MB24 konkurrerer således ikke med mærket MB47 om bindingen til LDL.

Grafen B viser, at der opnås lignende resultater ved anvendelse af HRPO-mærkede MB24-receptorer og umærkede MB47-30 -receptorer. MB47- og MB24-receptorer bindes således til forskellige epitoper, der er tilstrækkelig adskilt på overfladen af apo B-100 til at muliggøre binding af begge receptorer til et enkelt apo B-100-molekyle uden sterisk konkurrer ing med og inhibering af binding.

35 Figur 6 omfatter to grafer. Grafen A viser bindingen af 125I-mærket B-47 til LDL ved en væskefase-RlA. Ordinaten 13 DK 174932 B1 er i enhederne femtomol (fmol) bundet B-47, medens abscissen er i enhederne nanomol (nm) af det iblandede antistof.

Immunorenset monoklonalt antistof MB47 ioderes med 125j ve(j anvendelse af iodogen-metoden til en specifik ak-5 tivitet på 3000 tællinger pr. minut pr. nanogram (cpm/ng).

Efter omfattende dialyse mod phosphatpufret saltopløsning (PBS) kan over 95% af radioaktiviteten udfældes med 10%' s trichloreddikesyre (TCA). Mere end 98% af 125I-MB47 bindes til en LDL-søjle. Bestemmelserne gennemføres som tredobbelte 10 bestemmelser i 10x75 mm siliconeovertrukne glasrør. Stigende koncentrationer af 125I-MB47 i 0,1 ml kvægserumalbumin-bar-bital-puffer (BSA-barbital) (pH-værdi 8,0) sættes til 100 ng poolet normolipidæmisk humant LDL fortyndet i 0,2 mol BSA-barbital-puffer. Hvert rør indeholder 182 fmol af LDL-15 -apo B (idet der antages en molekylvægt af apo B på 550.000 dalton).

Efter inkubering (sammenblanding og bibeholdelse) i --------et—tidsrum—på—1.6—tlroer_v_ed_4-·C udfældes LDL kvantitativt af____________ et lipoproteinfrit kanin-antiserum, der er specifikt for 20 humant LDL (der anvendes kun den fraktion af kanin-antiserum, der har en densitet (d) på over 1,21 g/ml, fordi monoklonalt antistof MB47 binder kanin-apolipoprotein B)-

Foreløbige undersøgelser viser en koncentration af delipideret kanin-antiserum, der udfælder mere end 98% af 25 100 ng 125I-humant LDL. Efter tilsætning af kanin-antiserum inkuberes rørene i ca. 16 timer ved 4*C.

De ovenstående væsker fjernes, og de fremkomne pellets vakses to gange med 2 ml iskold barbitalpuffer (pH-værdi 8,0). IKke-specifik binding og udfældning bestemmes i to 30 sæt af parallelle rør. I det første sæt tilsættes der ikke humant LDL ved den første inkubering, men tilsættes den samme mængde andet kanin-antistof. I det andet sæt af rør anvendes der kanin-ikke-immunserum (fraktion med d større end 1,21 mg/ml) i stedet for kanin-immunserum-antistof.

35 Begge metoder giver i det væsentlige identiske værdier for ikke-specifik binding, der er lineær med stigende kon- 14 DK 174932 B1 centrationer er 125I-MB47 monoklonalt antistof, og i alle tilfælde er mindre end 1% af den totale tilsatte radioaktivitet. Specifik ^25I-MB47-binding til LDL fås ved at trække den ikke-specifikke binding fra den totale binding. Bin-5 dingsresultaterne analyseres ved anvendelse af et lineært regressionsprogram for Scatchard-analyse af ligandbindingssystemer, der giver et estimat af antistofaffinitetskonstan-ten (Ka) og receptor- eller epitopkoncentrationen.

Ka af 125I-MB47 for LDL bestemmes derved til 10 3,82xl0^M_1. Ekstrapolering af linien til betingelser med et uendelig stort overskud af antistof giver et estimat på 212 frool (35 ng) af 125I-MB47 bundet af 182 fmol (100 ng) af LDL, når molekylvægten af apo B antages at være 550.000 dalton. Disse resultater er vist i grafen B i denne figur, 15 hvor ordinaten er i enheder af forholdet mellem bundet (B) og frit (F) antistof (B/F), medens abscissen er i enheder fmol bundet antistof (fmol MB47).

Figur 7 viser korrelationen mellem mængden af LDL--cholesterol i mg/dl i prøven bestemt ved Lipid Research 20 Clinic Procedures. HEW Publication No. 75-628 (NIH), 2. udg. , Wash., D.C. Gov. Print. Off. (1974), og mængden af apo B-100 i mg/dl i prøven bestemt ved anvendelse af den ikke-kompetitive ELISA beskrevet i afsnittet "materialer og metoder".

25 Korrelationskoefficienten, r=0,89, bestemt ved

Spearman-Rank-korrelationstesten for ikke-parametriske data [Sokal et al., Biometry. 2. udg., W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 561-616 (1981)] viser en signifikant korrelation mellem niveauerne af apo B-100 bestemt ved den ikke-30 kompetitive ELISA beskrevet i den foreliggende beskrivelse og LDL-cholesterolniveauerne i 60 humane plasmaprøver.

Fig. 8 ligner fig. 7 og viser en signifikant korrelation, r=0,92, mellem niveauerne af apo B-100 som bestemt ved en kompetitiv ELISA-metode ifølge opfindelsen og LDL-35 -cholesterolniveauerne i de samme 60 humane prøver.

Fig. 9 viser den signifikante korrelation, r=0,92, 15 DK 174932 B1 son bestemt ved Spearman-Rank-korrelationstesten mellen resultaterne opnået ved anvendelse af den ikke-kompetitive ELISA (ordinaten) og den kompetitive ELISA (abscissen) med de samme 60 humane prøver son anvendt i fig. 7 og 8.

5 I. Generel beskrivelse.

A. Definitioner

Udtrykket "antistof" refererer til et receptormolekyle, der er et medlen af en familie af glycolsylerede proteiner, der betegnes immunoglobuliner, og son kan kombineres 10 specifikt ned et antigen.

Et "antistofkombineringssted" er den strukturelle del af et antistofmolekyle, der udgøres af tung og let kæde variable og hypervariable regioner, der specifikt binder antigen.

15 Udtrykket ’•antigen*' er blevet anvendt historisk til at betegne en helhed, der bindes af et antistof og også til at betegne en helhed, der fremkalder produktion af antistoffet. I den nu mere gængse betydning begrænses Betydningen af "antigen" til den helhed, der bindes af et antistof, 20 medens udtrykket "immunogen" anvendes om den helhed, der fremkalder antistof produkt ion. Hvor en helhed, som diskuteres i den foreliggende beskrivelse, både er immunogen og antigen, vil den generelt blive betegnet som et antigen.

"Antigen determinant" refererer til den faktiske 25 strukturdel af antigenet, der bindes immunologisk af antistofkombineringssted. Udtrykket anvendes også ensbetydende med "epitop".

Udtrykket "biologisk aktiv" refererer i det mindste til evnen til specifikt at binde ligand eller specifikt 30 bindende middel, selv om anden generel eller effektor-evne også kan være til stede.

Udtrykket "kompleks" som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer til produktet, der dannes, når et specifikt bindende middel bindes til en mål-ligand. Eksempler 35 på komplekser er immunoreaktanter, protein A bundet til et antistof, og lignende.

16 DK 174932 B1 "ELISA" refererer til en enzymbundet immunosorbensbe-stemmelse, der anvender et antistof eller et antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen- eller enzym-antistof--konjugat til påvisning og mængdebestemmelse af mængde af 5 antigen eller antistof, der er til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-metoden findes i kapitel 22 i 4. udg. af Basic and Clinical Immunology. D.P. Sites et al.. Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982) og i US-patent-skrift nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043.

10 "Enzym" refererer til et protein, der ved katalytisk indvirkning er i stand til at fremskynde eller give en vis ændring i et substrat, for hvilket det ofte er specifikt.

"Epitop" refererer til den del af et molekyle, der genkendes specifikt af et antistofkombineringssted. Den 15 betegnes også som en determinant eller en antigen determinant.

"Idiotoper" eller "idiotypiske determinanter" er antigene determinanter på de variable og hypervariable dele af et antistof molekyle, der kan genkendes af et kombinerings-20 sted af andre antistoffer. Idiotoper deles sædvanligvis i to typer, de bindingssted-associerede determinanter og de ikke-bindingssted-associerede determinanter. Samlingen af idiotoper på et antistofmolekyle udgør dets idiotype. Det antages, at et antistofkombineringssted dannet af et hybri-25 doma har et enkelt singulært sæt af idiotoper, dvs. en singulær antistofkombineringssted-idiotype.

"Immunoreaktant" som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer til produktet af en immunologisk reaktion, dvs. den helhed, der dannes, når en ligand bindes 30 immunologisk af et receptormolekyle. En "immunoreaktant" er en særlig type af "kompleks".

Ordet "isoleret" som anvendt i den foreliggende beskrivelse i sammenhæng med receptormolekyler betyder, at i det væsentlige kun én art af antistofkombineringssteder er 35 til stede.

Udtrykkene "mærkningsmiddel", "indikerende gruppe" 17 DK 174932 B1 eller "mærkning" anvendes ensbetydende i den foreliggende beskrivelse til at‘omfatte enkelte atomer og molekyler, der enten direkte eller indirekte er involveret i tilvejebringelsen af et påviseligt signal, der viser tilstedeværelsen 5 af en immunoreaktant. Ethvert mærkningsmiddel kan bindes til eller inkorporeres i en receptor eller anvendes separat, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene eller sammen med yderligere reagenser. Sådanne indikerende grupper eller mærkninger er i sig selv velkendte inden for immunoke-10 mien og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse i det omfang de anvendes med i øvrigt hidtil ukendte receptorer, metoder og/eller systemer.

"Ligand" refererer til et molekyle, der indeholder en strukturel del, der bindes af en specifik receptor, f.eks.

15 et antigen, der bindes af en receptor.

Udtrykket "receptor" anvendes i den foreliggende beskrivelse til at betegne et biologisk aktivt molekyle, der immunologisk bindes til (eller med)- et antigen. £n sådan-------- binding sker typisk med en affinitet på ca. 105 til ca.

20 1010 liter pr. mol (M-1) og er en specifik vekselvirkning mellem epitopen på antigenet og antistofkombineringsstedet på receptoren.

Et receptormolekyle ifølge den foreliggende opfindelse er ethvert intakt antistof, i det væsentlige intakt 25 antistof eller en polypeptiddel af et antistof (f.eks. et Fab-fragment) indeholdende en antistofkombineringssted-idio-type, såsom i ascitesvæske eller ovenstående væske fra vævskultur.

Ordet "receptor" anvendes også i den foreliggende 30 beskrivelse om molekyler på celleoverflader, der binder andre molekyler. Celleoverfladereceptorer er altid i den foreliggende beskrivelse betegnet med navnet på den bundne helhed foran ordet "receptor" for at undgå enhver tvetydighed. Et eksempel på en cel leoverflade-" receptor" er den 35 ovenfor beskrevne LDL-receptor.

Den biologiske aktivitet af et receptormolekyle viser 18 DK 174932 B1 sig ved den immunologiske reaktion af receptoren med dens antigene ligand ved blanding af disse i et vandigt medium til dannelse af en immunoreaktant, i det mindste ved fysiologiske pH-værdier og ionstyrker. Den biologiske aktivitet 5 forekommer fortrinsvis under biologiske bestemmelsesbetingelser, dvs. sådanne betingelser, hvor receptormolekylerne ifølge opfindelsen bindes til den antigene ligand inden for et pH-værdiområde på ca. 5 til ca. 9, ved ionstyrker, såsom ionstyrken af destilleret vand til ionstyrken af ca. 1M 10 natriumchloridopløsning, og ved temperaturer på ca. 4*c til ca. 45’C. Alle de i den foreliggende beskrivelse beskrevne receptormolekyler er biologisk aktive.

Antistofkombineringssted-idiotype-holdige polypeptid-dele (antistofkombineringssteder) af antistoffer er de dele 15 af antistofmolekyler, der indeholder kombineringssted-idio-toperne og bindes til liganden, og som omfatter Fab-,

Fab'-, F(ab')2" og F(v)-delene af antistofferne. Fab- og F(ab') 2-delene af antistoffer er velkendte og fremstilles ved proteolytisk omsætning af papain hhv. pepsin med i det 20 væsentlige intakte antistoffer ved velkendte metoder, jf. f.eks. US-patentskrift nr. 4.342.566. Fab'-antistofdele er også velkendte og fremstilles ud fra F(ab')2-dele efterfulgt af reduktion af disulfidbindingerne, der forbinder de to tung kæde-dele, f.eks. med mercaptoethanol, og efterfølgende 25 alkylering af det fremkomne protein-mercaptan med et sådant reagens som iodacetamid. Intakte antistoffer foretrækkes og anvendes sammen med Fab-dele som illustrerende for de mono-klonale receptormolekyler ifølge opfindelsen.

Udtrykkene "udskille" og "producere" anvendes ofte 30 ensbetydende om celler, hvorfra der fås antistofmolekyler. Celler, der producerer antistoffer, behøver imidlertid ikke at udskille disse molekyler i deres omgivelser. De her omhandlede hybridoma-celler udskiller monoklonale antistoffer i deres omgivelser. Ikke desto mindre betegnes sådanne celler 35 ofte i den foreliggende beskrivelse som "antistofproducerende" celler, og deres antistoffer anføres at blive "produ- 19 DK 174932 B1 ceret" i overensstemmelse med den måde, hvorpå udtrykket anvendes inden for teknikken.

Udtrykket "specifikt bindende middel" som anvendt i den foreliggende beskrivelse refererer til en molekylær 5 helhed, der er i stand til selektivt at binde en ligand. Eksempler på specifikke bindende midler er receptorer, komplementfragmenter, protein A og lignende.

Udtrykket "i det væsentlige rent" som anvendt i den foreliggende beskrivelse i sammenhæng med receptormolekyler 10 betyder, at der inden for påvisningsgrænserne kun foreligger en art af antistofkombineringssted som effektivt bindende middel for apo B-100. Selv om et i det væsentlige rent receptormol ekylepræparat kan indeholde mere end én art af antistofkombineringssteder, udviser et sådant præparat således 15 en enkelt bindingsaffinitet til apo B-100. F.eks. indeholder ovenstående væsker fra vævskultur, der er produceret ved hjælp af et hybridoma ifølge opfindelsen, typisk myelom--proteiner“~samt~receptorer~i'f®Tge~opf in'delsen^-Et- receptor-molekyle i i det væsentlige ren form betegnes typisk et 20 "monoklonalt antistof", fordi sådanne præparater fremstilles under anvendelse af monoklonale hybridomakulturer.

Udtrykket "i det væsentlige samtidig" som anvendt i den foreliggende beskrivelse i sammenhæng med sammenblandingen af tre eller flere antigen- og receptorkomponenter til 25 dannelse af en immunoreaktionsblanding betyder, at alle komponenter er til stede og blandet i en enkelt blanding inden for ca. 15 minutter og fortrinsvis inden for ca. 5 minutter efter blandingen af to af disse komponenter.

30 B. Hvbridomaer og monoklonale receptorer

Den foreliggende opfindelse angår et hybridoma med laboratoriebetegnelsen HL130C2.3C5, der producerer receptormolekyler, som: (a) immunoreagerer med en bevaret antigendeterminant 35 på apoprotein B-100, (b) kompetitivt inhiberer bindingen af apoprotein B- 20 DK 174932 B1 100 til LDL-receptor, og (c) har en affinitetskonstant til LDL på ca. 3,82 x 109M_1 ved en kompetitiv væskefase-ligevægts-radioimmunobe-stemmelse (RIA). Disse receptormolekyler betegnet sædvanlig-5 vis B47.

Den foreliggende opfindelse angår også et hybridoma med laboratoriebetegnelsen V82A6.1G4, der producerer receptormolekyler, som immunoreagerer med en apoprotein B-100-antigendeterminant og har en affinitetskonstant til LDL på 10 ca. 3,0 x 109 M-1 ved en kompetitiv fastfase-ligevægts-RIA.

Disse receptormolekyler betegnes i sædvanligvis MB24.

Hybridomaerne HL130C2.3C5 og V82A6.1G4 er deponeret hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, den 6. marts 1985 under de følgende ATCC-deponeringsnumre: 15 Receptor- ATCC-depone-

Hvbridoma betegnelse rinqsnummer V82A6.1G4 MB24 HB 8742 HL130C2.3C5 MB47 HB 8746 20

Hybridomaerne ifølge opfindelsen dannes ved at fusionere en antistofproducerende celle og en myeloma-cellelinie. Sådanne receptorproducerende celler blev først beskrevet af Kohier og Milstein, Nature, 256. 495 (1975). Receptorer fås 25 typisk fra den ovenstående væske af hybridoma-cellekulturer, fortrinsvis monoklonale cellekulturer, eller alternativt fra ascitesvæske eller andre kropsvæsker, der fås fra ikke-humane varmblodede værtsdyr, fortrinsvis sådanne, der er histokompatible eller "immunocompromised", hvori hybridoma-30 cellerne er indført og dyrket.

Ifølge en anden udførelsesform angår den foreliggende opfindelse således en cellekultur, der omfatter (a) et hybridoma ifølge opfindelsen, (b) receptormolekyler, der udskilles af hybridomaet, og som immunoreagerer med apoprotein 35 B-100, og (c) et kulturmedium for hybridomaet. Medier, som er anvendelse til fremstilling af disse sammensætninger, er 21 DK 174932 B1 både velkendte og kommercielt tilgængelige og omfatter syntetiske kulturmedier, indavlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbecco's minimale essentielle medium (DMEM, Dulbecco et al., Virol 396 (1959)) suppleret 5 med 4,5 g/liter glucose, 20 mM glutamin og 20% kalvefoster-serum. Et eksempel på en indavlet musestamme er Balb/c.

Ifølge en anden udførelses form angår den foreliggende receptorerne, betegnet MB47 og HB24, der produceres af hy-bridomaerne betegnet henholdsvis HB 8746 og HB 8742, og 10 immunoreagerer med apoprotein B-100. En receptor ifølge opfindelsen kan således fremstilles ved at dyrke et passende hybridoma ifølge opfindelsen i et egnet medium og udvinde receptoren fra mediet.

Tidligere har Curtiss et al., J. Biol. Chem. 257.

15 15213 (1982), beskrevet produktion og karakterisering af 11 apo B-specifikke receptormolekyler, inklusive molekylet betegnet MB24, der produceres af hybridoma HB 8742. Hybridoma _____ ____________HB 8742 er tilvejebragt som beskrevet mere deltaljeret i_____________ afsnittet "materialer og metoder" ved fusionering af milt-20 celler fra mus, der er immuniseret med humant VLDL.

IgG-fraktionen af MB24-holdig ascitesvæske dannet ved intraperitoneal vækst af HB 8742 karakteriseres ved isoelektrisk fokusering (IEF). Som anført af Curtiss et al.

(se ovenfor) gennemføres fusionen med P3x63Ag8-myelomceller, 25 der udskiller IgG^k-immunoglobulin. Ved IEF udviser HB 8742-ascitesvæske derfor et særligt mønster af mange proteinbånd, der repræsenterer tilfældigt blandede immunoglobulinmolekyler indeholdende tung og let kæde ud over P3x63Ag8-myelom-IgGLlk-antistof og receptor MB24.

30 Hybridoma HB 8746 producerer MB47-receptormolekyler og dannes ved fusionering af miltceller af mus immuniseret med LDL og P3x63Ag8.653.1-myelomceller. Denne varietet af udgangs-myelomet udskiller ikke et myelomprotein. IEF af HB 8746-ascitesvæske viser et særligt mønster af proteinbånd, 35 der repræsenterer IgG2a tung og kappa-let kæde. Således kan begge hybridomaer ifølge opfindelsen delvis karakteriseres 22 DK 174932 B1 ved IEF-mønsteret af receptor-molekylerne, som de producerer.

Selv om V82A6.lG4-hybridomaet ifølge opfindelsen pro-ducerer mere end en type af receptormolekyler, kan receptormolekylerne ifølge opfindelsen let identificeres og isoleres 5 ved hjælp af deres individuelle evner til at immunoreagere med apo B-100-antigene determinanter. De antigene specificiteter af MB24 og MB47 er undersøgt ved bestemmelse af deres individuelle evner til at immunoreagere med apoproteiner udvundet fra chylomicroner, VLDL, LDL og HDL ved Western 10 blot-bestemmelsen, er beskrevet nedenfor.

De således opnåede resultater viser, at MB47 og MB24 immunoreagerer med apo B-100 udvundet fra LDL, VLDL og chylomicroner, men ikke roed apo B-48 fra VLDL eller chylomicroner. Evnen af både MB47 og MB24 til hver for sig at immuno-15 reagere med apo B-100 fra chylomicroner og VLDL er vist i fig. 1.

1. Karakterisering af apo B-100-antiaendeterminant im-rounoloaiskbundet af MB47 20 Tidligere undersøgelser har demonstreret antigen heterogenitet af apo B-100. Dette betyder, at visse apo B-100-epitoper ikke udtrykkes af alle LDL-partikler. Således medfører blanding med et overskud af visse monoklonale antistoffer ved en væskefase-RIA ikke immunologisk binding af 25 alle radiomærkede LDL-partikler (125I-LDL).

For at bestemme, om epitopen genkendt af MB47-recep-tormolekyler er ensartet udtrykt af alt LDL, undersøges evnen af MB47 til at binde immunologisk til *25I-LDL ved en væskefase-RIA. LDL isoleret fra poolet plasma fra 10 normale 30 personer og fra en enkelt normal person radiomærkes som beskrevet nedenfor og blandes med biologisk aktive MB47-receptormolekyler til dannelse af en immunoreaktionsblanding. Blandingen holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at 35 MB47-receptormolekylerne bindes immunologisk til apo B i hver prøve og danner et immunoreaktionsprodukt (immunoreak- 23 DK 174932 B1 tant).

Den maksimale mængde 125I-LDL bundet af et overskud af MB47-receptormolekyler bestemmes ved udfældning af alle receptormolekyler med IgSORB (The Enzyme Co., Boston, MA) 5 og bestemmelse af ^2^I-LDL-associerede tællinger i bundfaldet i en -r-tæller. Resultaterne, udtrykt som procentdel af 125I-LDL udfældet af trichloreddikesyre (TCA) og vist i fig. 2, demonstrerer, at i det væsentlige alt 125I-LDL bindes af antistof, hvilket viser, at epitopen genkendt og bundet af 10 MB47 udtrykkes af alle LDL-partikler.

2. Kompetitiv inhiberina af bindingen af aoo B-100 til LDL-receptor ved hiælp af MB47

Apoprotein B-100 er hoved-apoproteinet i humant og 15 andet pattedyr-LDL, og det medierer binding af LDL til fibro-blast-LDL-receptoren. Tidligere undersøgelser har vist den centrale rolle af LDL-receptoren ved pattedyr-lipoprotein- -----------metabolisme—Da—LDL=partikler_isoler.et_fra—mange-dyrearter________ bindes specifikt til det humane LDL-receptorbindende domæne, 20 må bindingsstedet på apo B-100-molekylet være bevaret under evolutionen og således udtrykkes af LDL-partikler fra alle dyrearter.

For at undersøge, om MB47-receptormolekyler immuno-reagerer med en antigen determinant placeret i det LDL-re-25 ceptorbindende domæne af humant apo B-100, undersøges evnen af MB47 til at inhibere binding af 125I-LDL til den cellulære LDL-receptor. Dette gennemføres ved at blande MB47-receptor-molekyler, i form af hele antistofmolekyler, med 12®I-LDL til dannelse af en immunoreaktionsblanding. Immunoreaktions-30 blandingen holdes derefter under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at MB47-receptormolekylerne immunologisk binder det tilstedeværende 125I-LDL og danner en iramunoreaktant.

Derefter anbringes den immunoreaktantholdige immuno-35 reaktionsblanding over humane fibroblaster, der eksprimerer fibroblast-LDL-receptorer.

24 DK 174932 B1

Kulturerne holdes derefter i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at fibroblast-LDL-receptorerne specifikt binder eventuelle LDL-receptorbindende steder, som er tilgængelige på 125I-LDL-MB47-immunoreaktionsproduk-. 5 tet. Det antages, at sådan cellulær receptor-LDL-veksel-virkning inhiberes, hvis receptormolekylerne som eksemplificeret af MB47 immunoreagerer med en apo B-100-antigen determinant, hvis struktur også er involveret i LDL-receptorbin-ding.

10 Resultaterne af denne undersøgelse, der er vist i fig. 3, viser, at MB47-receptormolekyler inhiberer cellulær receptormedieret binding, inkorporering og nedbrydning af humant 125I-LDL ved hjælp af humane fibroblaster i et omfang, der er sammenligneligt med det, der fås med et 200 ganges 15 overskud af umærket LDL.

For at undersøge muligheden for, at MB47-receptorer bindes til en epitop nær apo B-receptordomænet og på grund af deres størrelse sterisk hindrer bindingen af apo B til LDL-receptoren, undersøges også evnen af Fab-fragmenter af 20 MB47-antistofmolekyler til at inhibere optagelse og nedbrydning af humant LDL ved den ovenfor beskrevne fibroblast-bestemmelse.

Som vist i fig. 4 blokerer MB47-Fab-fragmenter signifikant specifik cellulær binding og nedbrydning af LDL.

25 Da MB47-Fab-fragmenter er væsentlig mindre end intakte MB47-antistofmolekyler, antages det, at epitopen genkendt af MB47-antistofkombineringsstedet er indeholdt i det LDL-re-céptorbindende domæne på LDL apo B-100. Antistof MB24 har ikke egenskaberne af antistof MB47 og inhiberer ikke binding 30 og nedbrydning af 125I-LDL ved hjælp af dyrkede fibroblaster.

3. Sterisk inhiberina

Ved nogle udførelsesformer for bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen skal den første og den anden receptor 35 binde til forskellige epitoper af apo B-100-molekylet, og disse epitoper skal være tilstrækkelig adskilt, således at 25 DK 174932 B1 bindingen af én receptor ikke sterisk inhiberer bindingen af den anden receptor. Evnen af MB47 og MB24 til kompetitivt at inhibere den immunologiske binding af hinanden til fast-fase-bundet reagens-apo B-100 er derfor undersøgt.

5 Resultaterne af denne undersøgelse, der er vist i fig. 5, viser, at et 70 ganges overskud af umærket MB24 ikke signifikant inhiberer peroxidasemærket MB47 i at binde til reagens-apo B-100. På lignende måde inhiberer et 70 ganges overskud af umærket MB47 ikke signifikant MB24 i at 10 binde til reagens-apo B-100. MB24 og MB47 bindes således til forskellige epitoper på apo B-100, og disse epitoper er tilstrækkeligt adskilt, således at MB24 og MB47 som intakte antistoffer ikke inhiberer bindingen af hinanden til et enkelt apo B-100-molekyle.

15 4. Støkiometri oa affinitet af MB47-bindinq til apo B-100

Ti! bestemmelse af antallet af antigene determinant-steder pr. apo B-100-molekyle på LDL, der genkendes af MB47-20 receptormolekyler, anvendes en antistof-mærket RIA. Ved denne bestemmelse renses (isoleres) MB47-receptormolekyler fra ascitesvæske og radiomærkes (125i-MB47) ved velkendte metoder, der er beskrevet mere detaljeret i afsnittet "metoder og materialer".

25 Som vist i fig. 6A blandes stigende mængder af 125I- MB47 med en fast mængde apo B-100 i form af LDL i separate reaktionsblandinger. Blandingerne holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at 125I-MB47-receptormolekylerne immuno-30 logisk bindes til apo B-100 (LDL) og danner en immunoreak-tant. Tilstedeværelsen af immunoreaktant bestemmes derefter ved kvantitativ udfældning af LDL (bundet og frit) under anvendelse af kanin-antiserum, som er specifikt for humant LDL, og påvisning af mængden af 125I-MB47, der er til stede 35 som immunoreaktant, ved τ-tælling.

Den specifikke immunologiske binding af 125I-MB47- 26 DK 174932 B1 receptorinolekyler er xnættelig som vist i fig. 6A. Endvidere er en Scatchard-afsætning af bindingsresultaterne opnået ved disse undersøgelser lineær (fig. 6B), hvilket tyder på ensartethed af MB47-bindingssteder på LDL-partikler.

5 Desuden findes den tilsyneladende affinitetskonstant (Ka) af MB47 til humant apo B-100 i form af LDL som vurderet ved antistof-mærket RIA til at være 3,82xl09M_1. Scatchard-analyse viser også, at et maksimum på 212 frool af 125I-MB47-antistof bindes til 182 fmol LDL, hvilket viser, at kun et 10 MB47-molekyle bindes til hvert molekyle af apo B-100. Dette betyder, at MB47 bindes til en enkelt singulær antigen determinant på apo B-100.

Den gennemsnitlige affinitetskonstant af MB47 til apo B-100 vurderes også ved den ovenfor beskrevne antigen-15 mærkede RIA. Ved denne kompetitive ligevægts-væskefase-RIA giver umærket apo B-100 til stede som LDL fuldstændig fortrængning af 125I-LDL. Den beregnede affinitetskonstant af MB47-receptormolekyler til stede som helt intakt antistof for LDL ved denne bestemmelse er 4xlO®M”"1, hvilket er i god 20 overensstemmelse med Ka bestemt ved den antistof-mærkede bestemmelse, der er beskrevet ovenfor.

C. Bestemmelsesmetoder

Receptormolekylerne ifølge opfindelsen er særlig 25 anvendelige til bestemmelse af tilstedeværelsen og mængden af apoprotein B-100 i en kropsvæskeprøve, såsom blod, serum eller plasma.

I en udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til bestemmelse af mængden af apoprotein 30 B-100 i en kropsprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter føl gende trin: (a) Tilvejebringelse af en kropsprøve, der skal vindersøges. Typisk tilvejebringes en sådan prøve som en afmålt mængde eller kendt mængde af blod eller mere foretrukket 35 plasma eller serum. Metoder til tilvejebringelse af prøver af blod, plasma og serum er velkendte og vil ikke blive 27 DK 174932 B1 diskuteret yderligere i den foreliggende beskrivelse.

(b) Tilvejebringelse af receptormolekyler i en biologisk aktiv form, der (i) immunoreagerer med apoprotein B-100 og (ii) udskilles af enten hybridomaet med ATCC-depone- 5 ringsnummeret HB 8746 eller hybridomaet med ATCC-deponerings-nummeret HB 8742 og er til stede i en mængde, der er effektiv til gennemførelse af bestemmelsen.

Ved foretrukne udførelsesformer er receptoren et intakt antistof eller et Fab-fragment.

10 Den effektive mængde af receptormolekyler kan blandt andet variere med den bestemmelsesmetode, der anvendes i det enkelte tilfælde, således som det er velkendt. Velkendt er ligeledes den lethed, hvormed den effektive mængde kan bestemmes af fagmanden ved anvendelse af standard-laborato-15 riemetoder.

(c) Blanding af kropsvæskeprøven med receptormolekylerne fra trin (b) til dannelse af en immunoreaktionsblan- -----------ding------------------------------------:------------------- (d) Blandingen holdes under biologiske bestemmelses-20 betingelser i et forudbestemt tidsrum fra minutter til timer, f.eks. ca. 10 minutter til ca. 16-20 timer, der er tilstrækkeligt til, at antistofkombineringsstederne på receptormole-kylérne immunologisk binder apoprotein B-100 i kropsprøven og danner en immunoreaktant (første kompleks). Biologiske 25 bestemmelsesbetingelser er sådanne, der bibeholder den biologiske aktivitet af receptormolekylerne ifølge opfindelsen og omfatter et temperaturområde på ca. 4 til ca. 45*C, et pH-værdiområde fra ca. 5 til ca. 9 og en ionstyrke fra ionstyrken af destilleret vand til ionstyrken af ca. 1 M natri-30 umchloridopløsning. Metoder til optimering af sådanne betingelser er velkendte.

(e) Bestemmelse af mængden af eventuel immunoreaktant, der er dannet, og dermed mængden af apo B-100, der er til stede i prøven.

35 Ved foretrukne udførelsesformer forberedes kropsvæ skeprøven fra trin (a) yderligere til bestemmelse ifølge 28 DK 174932 B1 trin (e) i de følgende trin: (f) Tilvejebringelse af biologisk aktive andre receptormolekyler, der udskilles af det hybridoma, der ikke anvendes i trin (b), 5 (g) Blanding af en forudbestemt mængde af de andre receptormolekyler med kropsvæskeprøven til dannelse af en immunoreaktionsblanding, (h) Bibeholdelse af blandingen af den anden receptor og kropsvæskeprøven på lignende måde som beskrevet i trin 10 (d) til dannelse af en sandwich-immunoreaktant (andet kom pleks) , der indeholder et MB47-molekyle og et MB24-molekyle, der er immunologisk bundet til et apo B-100 molekyle.

De ovenfor beskrevne generelle bestemmelsesmetoder kan således som det er velkendt gennemføres ved anvendelse 15 af forskellige procedurer. Selv om der ved de mere specifikke bestemmelsesmetoder, der er beskrevet nedenfor, anvendes fastfase-procedurer, er opfindelsen således ikke begrænset til disse.

Fastfast-bestemmelsesprocedurer kan gennemføres ved 20 anvendelse af enten receptormolekyler eller antigen bundet til en fast matrix til dannelse af en fast bærer.

Ved disse udførelsesformer, hvor den faste bærer indeholder receptoren fra trin (b), er blandingen fra trin (c) en fastfase/væske-blanding, og immunoreaktanten . fra 25 trin (d) er en fastfase-immunoreaktant, der indeholder krops-prøve-apo B-100.

Ved disse udførelsesformer, hvor den faste bærer indeholder reagens-apo B-100, er blandingen fra trin (c) også en fastfase/væskefase-blanding, men den kropsprøve-apo B-30 100-holdige immunoreaktant fra trin (d) er en væskefase-immunoreaktant. Reagens-apo B-100 er biologisk aktivt, dvs. antigent apo B-100, der er tilvejebragt fra en anden kilde end den, der bliver undersøgt, typisk i form af isoleret LDL.

35 Bestemmelsen af mængden af apo B-100 bundet som im munoreaktant i trin (d) kan gennemføres direkte eller in- 29 DK 174932 B1 direkte ved velkendte bestemmelsesmetoder. Der kan f.eks. anvendes homogene bestemmelsessystemer som de, der beskrives i US patentskrift nr. 4.536.479, 4.233.401, 4.233.402 og 3.996.345.

5 Ved foretrukne fastfase-udførelsesformer præpareres kropsvæsken yderligere til bestemmelsen ved anvendelse af et mærket specifikt bindende middel. Typen og specificiteten af det mærkede specifikke bindende middel afhænger, således som det er velkendt, af den anvendte metode og det anvendte 10 system.

Ved de foretrukne fastfase-udførelsesformer, hvor den faste bærer indeholder en receptor fra trin (b), dvs. en receptor ifølge opfindelsen, præpareres mængden af fast-fase-bundet apo B-100 til bestemmelse ved følgende trin: 15 (i) Tilvejebringelse af biologisk aktive mærkede andre receptormolekyler, der binder til apoprotein B-100, som er til stede i kropsprøven, til dannelse af en immuno-reaktant. Mærkningen af den mærkede anden receptor er i stand til at vise tilstedeværelsen af den mærkede anden 20 receptor i en immunoreaktant.

Ved særlig foretrukne udførelsesformer immunoreagerer de mærkede andre receptormolekyler med en anden apo B-100-epitop, der er forskellig fra den epitop, med hvilken fast-fase-receptormolekylerne reagerer, og ikke i væsentligt 25 omfang hindrer fastfasereceptormolekylerne i at reagere med apo B-100. Fortrinsvis er de mærkede andre receptormolekyler sådanne molekyler, der udskilles af det hybridoma, der ikke anvendes i trin (b), dvs. de nævnte receptormolekyler er ikke valgt som første receptormolekyler.

30 Metoder til bestemmelse af, om et receptormolekyle vil inhibere (interfere med) den immunologiske binding til det samme antigen af et andet receptormolekyle, er velkendte og beskrives mere detaljeret nedenfor.

(j) Blanding af en forudbestemt mængde af de mærkede 35 andre receptormolekyler med kropsvæskeprøven til dannelse af en immunoreaktionsbiånding.

30 DK 174932 B1

Den således dannede blanding kan være en væskeformig blanding, som når trin (i) gennemføres før trin (b), eller den kan være en faststof/væske-blanding, når den mærkede anden receptor er iblandet i det væsentlige samtidig med 5 eller efter trin (b). Når trin (i) gennemføres før eller i det væsentlige samtidig med trin (b), iminunor eager er de mærkede andre receptormolekyler med en anden apo B-100-epi-top, der er forskellig fra den epitop, med hvilken fastfase-receptormolekylerne reagerer., og hindrer ikke i det væsent-10 lige de fastfastbundne receptormolekyler i at immunoreagere med apo B-100.

Ved foretrukne udførelsesformer gennemføres trin (i) i det væsentlige samtidig med trin (b) eller efter trin (c) .

15 (k) Den således dannede blanding af den mærkede anden receptor og kropsvæskeprøve bibeholdes på en måde, der ligner den i trin (d) beskrevne, til dannelse af en immunoreak-tant.

De fastfase-bundne receptormolekyler og de andre 20 receptormolekyler er således immunologisk bundet til apo B-100, der er til stede i kropsvæskeprøven, og danner derved en fastfase-bundet sandwich-immunoreaktant, der indeholder mærkning bundet som del deraf, dvs. en fastfase-sandwich-immunoreaktant, der indeholder en mærkning, dannes, når et 25 molekyle af apo B-100 iramunoreagerer med både et fastfase-bundet receptormolekyle og et mærket andet receptormolekyle.

Ved foretrukne udførelsesformer bliver eventuelle mærkede andre receptormolekyler, der ikke danner en del af den fast-fasebundne immunoreaktant (dvs. sådanne, der ikke bindes 30 immunologisk til apo B-100, som selv er bundet til fastfase-receptormolekyler) skilt fra immunoreaktanten, fortrinsvis ved vaskning, før bestemmelsen af mængden af mærket anden receptor, der er til stede som immunoreaktant.

Bestemmelsen af mængden af immunoreaktant dannet i 35 trin (e) gennemføres ved bestemmelse af mængden af mærket anden receptor, der er bundet som en del af immunoreaktanten, 31 DK 174932 B1 der indeholder apo B-100. Dette udgør en direkte bestemmelse af mængden af apo B-100 i prøven. Denne mængde kan være nul, hvilket viser, at der ikke er apo B-100 til stede i prøven inden for påvisningsgrænserne. Metoder til bestemmelse 5 af mængden af mærket anden receptor afhænger af den anvendte mærkning, og sådanne mærkninger og bestemmelsesmetoder er velkendte.

Ved de foretrukne fastfase-udførelsesformer, hvor den faste bærer indeholder reagens-apo B-100, præpareres 10 mængden af immunoreaktant dannet i trin (d) til bestemmelse ved følgende trin: (l) Iblanding af et biologisk aktivt mærket specifikt bindende middel, fortrinsvis et receptormolekyle, der bindes til eventuelle receptormolekyler anvendt i trin (b) til 15 stede som fastfase-immunoreaktant til dannelse af et kompleks, fortrinsvis en anden immunoreaktant. Mærkningen af ____________det mærkede specifikke bindende middel er i stand til at __ vise tilstedeværelsen af det mærkede specifikke bindende middel i et kompleks. Ved foretrukne udførelsesformer for 20 disse bestemmelsestyper gennemføres trinene (i) til (k) efter trin (d).

(m) Blanding af en forudbestemt mængde af det mærkede specifikke bindende middel med kropsvæskeprøven til dannelse af en reaktionsblanding, fortrinsvis en immunoreaktionsblan- 25 ding.

(n) Den således dannede blanding af mærket specifikt bindende middel og første immunoreaktant bibeholdes på lignende måde som beskrevet i trin (d) til dannelse af et kompleks.

30 Det således dannede fastfase-kompleks indeholder en mærkning bundet som del deraf. Ved foretrukne udførelsesformer bliver eventuelt mærket specifikt bindende middel, der ikke er bundet som del af fastfase-komplekset, skilt fra komplekset, fortrinsvis ved vaskning, før bestemmelsen 35 af tilstedeværelsen af fastfase-bundet mærkning.

Bestemmelsen af mængden af immunoreaktant dannet i 32 DK 174932 B1 trin (e) gennemføres ved at bestemme mængden af mærkning, der er stede som del af komplekset. Dette giver en indirekte bestemmelse af mængden af apo B-100, der er til stede i prøven.

5 Mærkningen af proteiniske antigener og specifikke bindende midler er velkendte. F.eks. kan receptorer produceret af hybridomaer mærkes ved metabolisk inkorporering af radioisotopholdige aminosyrer, der er tilvejebragt som en komponent i vævskulturmediet, jf. f.eks. Galfré et al., 10 Meth. Enzymol 73, 3-46 (1981).

Metoderne til .proteinkonjugering eller -kobling ved hjælp af aktiverede funktionelle grupper er særlig anvendelige og medfører en mærkning, der er covalent bundet til antigen eller specifikt bindende middel, jf. f.eks. Aurame-15 as, et al., Scand. J. Immunol. Vol. 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) og US patentskrift nr. 4.493.795. Desuden kan sted-rettet koblingsreaktion gennemføres således, at mærkningen ikke i væsenlig grad intefererer med den biologiske aktivitet af et antigen eller en receptor, jf. f.eks. Rodwell et al., Bio-20 tech. 3, 889-894 (1985).

Mærkningsmidlet kan være et fluorescerende mærkningsmiddel, der bindes kemisk til antistoffer eller antigener uden at denaturere dem til dannelse af et fluorochrom (farvestof) , der er et anvendeligt immunofluorescens-sporstof.

25 Egnede fluorescerende mærkningsmidler er fluorochromer, såsom fluoresceinisocyanat (FIC), fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-diroethylamin-l-naphthalensulfonylchlorid (DANSC), tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) , lissamin, rhodamin-8200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse 30 af immunofluorescens-analysemetoder findes i DeLuca, “Immunofluorescence Analysis" i Antibody As A Tool. Marchalonis et al., eds. J. Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231, 1982.

Ved foretrukne udførelsesformer er den indikerende gruppe et enzym, såsom peberrodsperoxidase (HRPO), glucose-35 oxidase eller lignende. Når den principale indikerende gruppe er et enzym, såsom HRPO eller glucoseoxidase, er yderligere 33 DK 174932 B1 reagenser nødvendige for at synliggøre, at der er dannet et receptor-ligand-kompleks (immunoreaktant). Sådanne yderligere reagenser for HRPO omfatter hydrogenperoxid og et oxidationsfarvestof-forstadium, såsom diaminobenzidin. Et yderligere 5 reagens, der er anvendeligt sammen med glucoseoxidase, er 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthioazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive elementer er også anvendelige mærknings-midler og anvendes illustrativt i den foreliggende beskrivelse.

10 Et eksempel på et radiomærkningsmiddel er et radioak tivt grundstof, der udsender tt-stråling. Elementer, som selv udsender -r-stråler, såsom ·*-24Ι, 125I, 128I, 131I, ^32l og 51Cr udgør en klasse af indikerende grupper af t-stråleudsendende radioaktive elementer. Særlig foretrukket er 125I.

15 En anden gruppe af anvendelige indikerende grupper er sådanne elementer som 13-C, 18F, 0g 13jjr der selv udsender posi-troner. De således udsendte positroner bevirker udsendelse af -r-stråler ved sammenstød med elektroner, som er til stede i dyrets krop. Anvendelige er også /3-emittere, såsom 13Ί-χη- 20 dium.

Bestemmelsesmetoderne og -systemerne ifølge den foreliggende opfindelse kan således udnytte eller omfatte en receptor ifølge opfindelsen bundet til en fast matrix til dannelse af en fast bærer.

25 Antigenet eller receptoren bindes typisk til den faste matrix ved adsorption fra et vandigt medium, selv om flere adsorptionsmetoder såvel som andre bindingsmetoder, der er velkendte af fagmanden, kan anvendes. Eksempler på sådanne metoder er omsætning af receptoren eller antigenet 30 med den reaktive carboxylfunktionalitet, der fås ved omsætning af cyanogenbromid med glucoseholdige matrixer, såsom tværbundet dextrose eller cellulose, glutaraldehyd-binding som diskuteret nedenfor i sammenhæng med latexpartikler og lignende.

35 Anvendelige faste matrikser er velkendte. Sådanne materialer omfatter tværbundet dextran, der kan fås under 34 DK 174932 B1 navnet "Sephadex" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ), agarose, polystyrenperler med en diameter på ca. 1 Mm til ca. 5 mm, der kan fås fra Abbott Laboratories, North Chicago, IL, polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet poly-5 acrylamid, nitrocellulose eller polyamidbaserede væv, såsom ark, strimler eller blade, eller rør, plader eller brøndene af en raikrotiterplade, såsom de, der er fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid.

Latexpartikler, som er anvendelige ved bestemmelser 10 af agglutinationstypen, er også anvendelige faste matrikser. Sådanne materialer leveres af Japan Synthetic Rubber Company,

Tokyo, Japan, og beskrives som carboxyfunktionelle partikler dispergeret i en anionisk sæbe. Typiske lots af sådanne partikler har en gennemsnitlig diameter på 0,308 Mm og har 15 en gennemsnitlig fordeling af carboxyfunktionelle grupper på ca. 15 til ca. 30 kvadrat-ångstrøm pr. carboxygruppe.

Før anvendelsen omsættes partiklerne med en diamin, såsom 1,3-diamino-2-propanol, til dannelse af en mangfoldighed af amidbindinger med carboxygrupperne på partiklerne 20 under bibeholdelse af frie aminogrupper. De frie aminogrupper omsættes derefter med et dialdehyd, såsom glutaraldehyd, og receptoren eller antigenet til dannelse af Schiff-base-reak-tionsprodukter. Schiff-base-reaktionsprodukterne reduceres derefter med et vandopløseligt reduktionsmiddel, såsom na-25 triumborhydrid, til tilvejebringelse af en anvendelig fast bærer.

Det vil forstås af en fagmand, at der er adskillige metoder til fastfase-immunobestemmelse, der kan anvendes ved den foreliggende opfindelse. Eksempler på sådanne anven-30 delige fastfase-bestemmelser omfatter enzymmultiplicerede immunobestemmelsesmetoder (EMIT) og fluorescens-immunbestemmelser (FIA) foruden de specifikt omtalte RIA og ELISA. Imidlertid betragtes enhver metode, der medfører en påviselig omsætning af apoprotein B-100 med receptormolekyler ifølge 35 opfindelsen, som en del af opfindelsen. Ved hver af disse bestemmelsesmetoder kan der anvendes enkelt- eller dobbelt- 35 DK 174932 B1 -antistofmetoder, hvorved et indikerende middel anvendes til at vise immunoreaktionen og derved bindingen af eventuelt apoprotein B-100, der skal bestemmes, med en receptor ifølge opfindelsen. Eksempelvise metoder er f.eks. forklaret i 5 Maggio, Enzyme Immunoassay. CRC Press, Cleveland, OH (1981); og i Goldman, Fluorescent Antibody Methods. Academic Press,

New York, NY (1980).

En udførelsesform for en specifik metode til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for apo B-100 under anvendelse 10 af en fastfase-bundet receptor ifølge opfindelsen er en ikke-kompetitiv ELISA, hvorved immunoreaktioneme gennemføres successivt. Ved en sådan bestemmelse bindes en portion af MB47-receptorer, f.eks. i almindelighed ca. 1 til ca. 500 μg, til de indre vægge af en mikrotiterbrønd til dannelse 15 af en fast bærer.

Eventuelt tilstedeværende apo B-100 i den tilvejebragte kropsprøve immunoreageres derefter med de fastfase-bundne -------------receptoren. _Dette_gennemføres ved at blande en kendt mænade._____________ f.eks. ca. 10 til ca. 200 μΙ^βΓ prøve (der kan være for-20 -fortyndet), såsom serum eller plasma, i mikrotiterbrønden med de fastfase-bundne receptorer til dannelse af en fast-fase/væskefase-blanding. Blandingen holdes under biologiske besteromelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at apo B-100, som er til stede i prøven, 25 bindes immunologisk til receptormolekylerne og danner en fastfase-immunoreaktant. Den faste fase og den flydende fase adskilles derefter og den faste fase skylles typisk for at sikre fjernelse af ikke-specifikt bundne materialer.

Apo B-100, der er til stede som fastfase-immunoreak-30 tant (dvs. apo B-100 bundet til fastfase-bundne MB47-recep-torer), immunoreageres derefter med enzymmærkede andre receptormolekyler. Dette gennemføres ved at blande en forudbestemt mængde, f.eks. ca. 0,1 til ca. 10 μg enzymmærkede andre receptormolekyler i en vandig pufferopløsning, fortrinsvis 35 peberrodsperoxidasemærkede (HRPO-mærkede) MB24-receptorer, til dannelse af en anden fastfase/væske-blanding. Den anden 36 DK 174932 B1 blanding holdes som beskrevet ovenfor, hvorved der dannes en fastfase-immunoreaktant-"sandwich", der består af MB47--receptor, apo B-100 og enzymmærkede MB24-receptorer.

Efter fraskillelse af væskefasen fra den faste fase 5 som ovenfor beskrevet blandes en portion chromogent substrat, såsom o-phenylendiamin (OPD) for HRPO, i mikrotiter-brønden indeholdende fastfase-immunoreaktanten til dannelse af en tredie fastfase/væskefase-blanding. Denne blanding holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forud-10 bestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at eventuelt enzym, der er til stede som immunoreaktant, omdanner en proportional mængde substrat til farvet produkt. Den optiske tæthed af den fremkomne farvede opløsning måles derefter og sammenlignes med resultater opnået under anvendelse af op-15 løsninger, der indeholder kendte mængder af reagens-apo B--100.

Evnen af den ikke-kompetitive successive ELISA beskrevet ovenfor og beskrevet mere detaljeret i afsnittet "materialer og metoder" til påvisning af apo B-100 i en 20 kropsvæskeprøve er undersøgt. Ved disse undersøgelser tjener portioner af lipoproteinfrit humant plasma (LDP), hvori der er blandet kendte mængder af reagens-apo B-100, som kontrol--kropsvæskeprøver.

Resultaterne af denne undersøgelse, der er vist i 25 tabel I, demonstrerer, at den ovenfor beskrevne metode nøjagtigt kan bestemme klinisk relevante mængder af apo B-100, som er til stede i en kropsvæskeprøve.

DK 174932 B1 37

Tabel I

Ikke-komoetitive successive ELISA-undersøaelser af aoo B--100 i humant plasma.

5 Prave1 Faktisk2 _Ref.3 MB47/MB244 MB24/B185 B Lav 40 32+44,3 42,6±5,0 31,7 B Normal 80 71±103 82,3±11,8 54,7 B Høj 150 126±180 149±24,7 119 10 T Lav 22,3 12,6117 16,2+0,62 15,4;9,0 T Normal 44,8 25,4149,2 36,119,4 22,9;19,7 T Haj 89,5 64,01101 77,417,4 34,9;36,3 15 A 73 82,9111,7 66,4 AM 76 67,118,1 46,8;61,0 B 86,5 69,814,6 68,5;90,5 C 145 12913,8 147,173 D 109 81,017,4 76,3,-98,2 20 K 95 98,4116,5 77,5,*88,9 R 60 64,217,5 51,3;52,9

Pool 81,3 78,516,8 54,7,-65,9

Cl 40,1 47,916,7 47,0,-68,7 C2 74,8 88,6113,2 81,3,-98,2 25 C3 70,4 64,514,8 64,5;82,9 C4 39,9 56,7+6,6 ~4'875T58T0 45

Klinisk lave, normale og haje apoprotein B-100- 30 -holdige kontroloplasninger fås fra Johnson & Johnson Biotechnology Center, Inc., La Jolla, CA (B) og Tago, Inc., Burlingame, CA (T). Plasmaprøver fås fra klinisk normale personer (betegnet ved et eller to bogstaver og ved C1-C4), og den såkaldte "pool" repræsenterer en blanding af 10 sådan-35 ne prøver.

2

Faktisk apoprotein B-100-koncentration som bestemt ved den totale mængde protein sat til prøven. Alle koncentrationer anført i tabellen er i enheden mg/dl.

3

Koncentrationen af apoprotein B-100 som bestemt ved 40 anvendelse af referencebestemmelsen (Ref.), der er beskrevet nedenfor. Værdierne er anført som middelværdien i 3 gange standardafvigelsen.

4

Apoprotein B-100-koncentrationer (middelværdi ± 3 5 standardafvigelser) opnået ved anvendelse af fastfase-bundne 38 DK 174932 B1 MB47-receptorer og HRPO-mærkede MB24-receptorer ved den ikke-kompetitive successive ELISA som ovenfor beskrevet.

5) Apoprotein B-100-koncentrationer (resultater af gen tagelsesforsøg er anført) opnået ved anvendelse af fastfase-5 -bundne MB24-receptorer og HRPO-mærkede B18-receptorer (Curtiss et al., J. Biol. Chem., 257. 15213-15221 (1982)) ved den ikke-kompetitive ELISA, hvorved immunoreaktioner gennemføres successivt, idet fastfase-immunoreaktanten dannes først.

10 En anden udforelsesform for en specifik metode til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for apo B-100 er en ikke--kompetitiv ELISA, hvor immunoreaktionerne gennemføres i det væsentlige samtidig. Til den ovenfor beskrevne mikroti-terbrønd indeholdende fastfase-bundne MB47-receptorer sættes 15 i det væsentlige samtidig den tilvejebragte kropsprøve og enzymmærkede andre receptorer, der iromunoreagerer med en anden apo B-100-epitop og i det væsentlige ikke hindrer bindingen af MB47-receptorer til apo B-100. Sådanne enzymmærkede andre receptorer er fortrinsvis MB24-receptorer.

20 Den fremkomne fastfase/væskefase-blanding bliver derefter holdt, adskilt, og mængden af enzym, der er til stede som en del af den fastfasebundne immunoreaktant-sand-wich, bestemmes som ovenfor beskrevet.

Den ovenfor beskrevne ikke-kompetitive ELISA anvendes 25 til at undersøge apo B-100-indholdet i plasma fra 20 patienter roed coronararteriesygdom (CAD), 20 patienter med familiær hypercholesterolæmi og 20 normale personer. Som vist i tabel II nedenfor bestemmes det gennemsnitlige plasroa-apo B-100--niveau hos de normale personer til 85 mg/dl med en 2 ganges 30 standardafvigelse på ±21 mg/dl. Denne værdi stemmer nært overens med det normale område af apo B-værdier, der rapporteres af Curry et al., Clin. Chem. 24. 280-286 (1987), og Rosseneu et al., Clin. Chem. 28. 427-433 (1983), der har anvendt forskellige immunobestemmelser.

35 Endvidere er plasma-apo B-100-niveauerne hos patien ter med CAD og hypercholesterolæmi højere end den øvre grænse 39 DK 174932 B1 på 2 gange standardafvigelsen, der findes for normale personer. Lignende resultater ved anvendelse af andre metoder for CAD- og hypercholesterolæmi-patienter er blevet rapporteret af Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USÅ 5 2Zf 604-608 (1980) og Lipid Research Council, JAMA 251.

351-364 (1984).

DK 174932 B1 «ο

Tabel 11

Underseaelser ved samtidig TIIS* af a do B-100 l hunant plasma Personer^ Lipoproteinniveauer^ Apoprotein B-niveauer^

Ikke·

Total^ HDL* LDL5 Konpet.® koctpet.^ rid® RID9 chol. chol. chol. ELISA ELISA nr. 1 nr. 2 normal 186 60 111 85 82 102 69 iSD 37 16 30 21 22 20 19 CAD 205 37 133 109 104 138 84 * 35 . 7 37 24 23 20 24 FH 331 37 270 196 204 211 136 i 90 11 96 40 49 64 44 1) Personerne omfatter 20 normolipidemiske sunde kontroller (normale), 20 personer med coronarar-teriesygdom defineret ved hjertekatheterisering (CAD), ag 20 persener mad famliar hypercholesterol -mi (FH).

2) De anførte verdier er middel verdie« ±2 standardafvigelser fra middelverdien i enheden mg/dl.

3) Totalt cholesterol.

4} Cholesterol til stede som HDL.

5) Cholesterol til stede som LDL.

6) Apo B-100-niveau som bestemt ved den koopetitive ELISA beskrevet i afsnittet "materialer og metoder".

7) Apo B-100-niveau som bestemt ved »kke-kcmpetitiv ELISA mier erøndblse af fastfasebmke »47-- receptorer og HRPO-m>rkede MB24-receptorer, hvorved prøven og receptorerne blandes i det visentlige samtidigt.

8) Apo B-niveau bestemt mder anvendelse af radial-innunodiffieicns-settet model Oiffu-gen RID fra Tago, Inc., Burlingame, CA.

9) Apo B -niveau bestemt under anvendelse af radial-inminodiffusions-sattet model H-Partigen RIA I

fra Calbiochem-Behring, La Jolla, CA.

41 DK 174932 B1

Virkningen af at fortynde kropsvæskeprøven før undersøgelse af denne for apo B-100 ved en ikke-kompetitiv samtidig ELISA-metode er også undersøgt. Resultaterne, som er anført i tabel III nedenfor, viser, at der ikke er nogen 5 signifikant forskel i de bestemte Apo B-100-niveauer over et område af plasmafortyndinger på en faktor 5, dvs. 1:1000 til 1:5000.

Tabel III

10 Undersøgelser ved samtidig ELISA af apo B-niveauer bestemt på forskellige fortyndinger af plasma

Plasma- fortvndinq Plasma 1* Plasma 21 Plasma 31 1:1000 54,4 136,6 199,0 15 1:2500 57,5 142,5 194,2 1:5000 53,0 126,0 178,0 M.v.2 55,0 135,0 190,0 S.D.3 1,88 6,83 8,98 20 % C.V.4 3,4 5,0 4,7 1) Plasma-apo B-100-koncentration i enheden mg/dl- 2) Gennemsnitlig plasma-apo B-100-koncentration for alle 3 fortyndinger.

25 3) Én standardafvigelse.

4) Variantskoefficient i procent mellem resultaterne opnået for de forskellige fortyndinger.

Korrelationen mellem LDL-cholesterol og plasma-apo 30 B-100-niveauer som bestemt ved en ikke-kompetitiv ELISA for prøver fra normale personer og patienter som ovenfor beskrevet er vist i fig. 7. Korrelationskoefficienten på 0,89 er nær den værdi, der er rapporteret af Albers et al., Metabolism 24. 1339-1351 (1975) og Slater et al., Cl in. Chem.

35 31, 841-845 (1985).

Udførelsesformer for bestemmelsesmetoderne ifølge 42 DK 174932 B1 opfindelsen, hvorved der anvendes en fast bærer indeholdende reagens-apo B-100 bundet til en fast matriks, gennemføres under anvendelse af følgende trin: a) En kropsvæskeprøve indeholdende apo B-100 til-5 vejebringes som ovenfor beskrevet, b) i det væsentlige samtidig blandes 1) væskeprøven, 2) en forudbestemt mængde af enten MB24- eller MB47--receptormolekyler, og 10 3) en forudbestemt mængde fastfase-bundet reagens- -apo B-100, til dannelse af en væskefase/fastfase-immunoreak-tionsblanding.

Blandingen holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de anti-15 stofkombinerende steder på receptormolekyleme immunoreagerer med (binder immunologisk til) enten reagens-apo B-100 eller eventuelt tilstedeværende apo B-100 i kropsvæskeprøven. Receptormolekylerne, som immunologisk binder apo B-100, som er til stede i kropsvæskeprøven, danner en væskefase-im-20 munoreaktant, og receptormolekylerne, der binder fastfase--bundet reagens-apo B-100, danner en fastfase-immunoreaktant.

(c) Tilstedeværelsen af den fastfase-bundne immuno-reaktant bestemmes derefter, og mængden af apo B-100, som er til stede i prøven, bestemmes derved ved sammenligning af 25 omfanget af binding, som udvises af en kendt mængde MB47 eller MB24, der er blandet med lignende fastfase-bundet apo B-100, som ovenfor omtalt. Fortrinsvis gennemføres immuno-reaktantbestemmelsen efter adskillelse af væskefase- og fastfase-immunoreaktant i trin (b) , f.eks. ved vaskning.

30 Mængden af prøve-apo B-100, der er bundet som væskefase-immunoreaktant, kan bestemmes ved anvendelse af mærkede antistoffer, der immunoreagerer med receptormolekylerne ifølge opfindelsen, såsom peroxidase-bundet gede-anti-muse-Ig, eller som i øvrigt beskrevet i den foreliggende beskri-35 velse.

Ved en særlig foretrukken udførelsesform for den 43 DK 174932 B1 kompetitive bestemmelse bindes ca. 1 μg til ca. 10 pg reagens-apo B-100 til en fast matriks, fortrinsvis væggene af en mikrotiterbrønd, til dannelse af en fast bærer. Eventuelle ikke-specifikke bindende steder på den faste bærer blokeres 5 typisk med et protein, såsom BSA eller lignende.

En forudbestemt mængde receptormolekyler ifølge opfindelsen, f.eks. generelt ca. 0,1 μg til ca. 10 μg, immunorea-geres i det væsentlige samtidig med det fastfase-bundne reagens-apo B-100 og eventuelt tilstedeværende apo B-100 i 10 en kropsvæskeprøve (der kan være fortyndetj, såsom serum eller plasma. Dette gennemføres ved i det væsentlige samtidig blanding af en portion af prøven og receptormolekylerne i mikrotiterbrønden indeholdende fastfase-bundet reagens-apo B-100.

15 Fastfase/væskefase-blandingen, der dannes på denne måde, holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at de tilstedeværende ------—reeeptormo-1-eky-ler—immunologisk—binder—til.s.tedeværende_apo___________ B-100. Den faste og den flydende fase bliver derefter for-20 trinsvis skilt, f.eks. ved vaskning, og den faste fase skylles typisk for at sikre fjernelse af ikke-specifikt bundne materialer.

Tilstedeværelsen af fastfase-bundne immunoreaktanter bestemmes derefter typisk ved anvendelse af mærkede antistof-25 fer, som immunologisk binder receptormolekylerne ifølge opfindelsen, såsom peroxidasemærket gede-anti-muse-IgG.

Ved den kompetitive ELISA konkurrerer apo B-100, som er til stede i patientprøven, med en konstant kendt mængde reagens-apo B-100 om et konstant kendt antal receptormoleky-30 le-antistofkombinerende steder i immunoreaktionsblandingen. Konkurrencen tilvejebragt af prøve-apo B-100 medfører en formindskelse af påviselig fastfase-bundet immunoreaktant.

Jo større formindskelsen er, desto større er den tilstedeværende mængde apo B-100 i kropsprøven, der undersøges.

35 Til tilvejebringelse af relative mængder apo B-100, som er til stede i patientplasma, sammenlignes resultater 44 DK 174932 B1 opnået ved anvendelse af apo B-100 til stede patientplasma som kompetitorer med resultater opnået ved anvendelse af kompetitive standarder indeholdende kendte mængder af rea-gens-apo B-100. Der tilvejebringes en standardkurve ved 5 anvendelse af LDL-koncentrationer fra 32 til 0,25 mg/ml (320 til 2,5 mg/dl).

Den kompetitive ELISA anvendes til at undersøge de samme normale prøver og patientprøver, som er vurderet ved ikke-kompetitiv ELISA. Disse resultater, som også er anført 10 i tabel II ovenfor, stemmer nært overens med resultaterne opnået ved den ikke-kompetitive bestemmelse.

Virkningen af at fortynde kropsvæskeprøven før bestemmelsen af apo B deri ved den ovenfor beskrevne kompetitive ELISA er undersøgt. Resultaterne, som er anført i tabel IV 15 nedenfor, viser ingen væsentlig forskelig i apo B-niveauerne bestemt over et plasmafortyndingsområde på 4 gange, dvs.

1:100 til 1:400.

Tabel IV

Undersøgelser ved kompetitive ELISA af apo B-niveauer bestemt 20 ud fra forskellige plasmafortvndinaer Plasmafortynding Plasma l·^· Plasma 2 Plasma 3 1:100 32,8 63,3 175,8 1:200 30,0 58,5 183,2 25 1:300 31,8 64,8 190,9 1:400 33,8 62,6 190,0 Μ.V.2 32,1 62,3 185,0 S.D3 1,6 2,7 7,0 % C.V.4 5,0 4,3 3,8 30 _ 1) Plasma-apo B-100-koncentration i enheden mg/dl.

2) Gennemsnitlig plasma-apo B-100-koncentration for alle 3 fortynd inger.

3) Én standardafvigelse.

35 4) Procentisk varianskoefficient mellem resultaterne opnået for de forskellige fortyndinger.

45 DK 174932 B1

Korrelationen mellem LDL-cholesterol og plasma-apo--B-niveauer som bestemt ved kompetitiv ELISA for de ovenfor beskrevne prøver fra normale personer og patienter er vist i fig. 8. Korrelationskoefficienten på 0,92 ligger nær den 5 værdi, der er rapporteret af Albers et al., Metabolism. 24.

1339-1351 (1975), og Slater et al., Clin. Chem.. 31. 841-845 (1985), hvilket viser, at den kompetitive ELISA giver en nøjagtig forudsigelse af cirkulerende LDL-cholesterol-nive-auer.

10 Korrelationen mellem apo B-100-niveauer opnået ved anvendelse af kompetitiv og ikke-kompetitiv ELISA er undersøgt. Som vist i fig. 9 er der en høj korrelation (r=0,92) mellem resultaterne opnået ved de to bestemmelser.

Et diagnostisk system, fortrinsvis i form af et sæt, 15 der er anvendeligt til gennemførelse af de ovennævnte bestemmelsesmetoder, omfatter, i separate pakninger, (a) et første specifikt bindende middel, hvor det nævnte middel er -------------(i-)—en—receptor,—der—i-mmunoreagerer med—apo—B—1-00—©g—er--------- valgt blandt receptoren udskilt af hybridoma HB 8746 (MB47) 20 eller receptoren udskilt af hybridoma HB 8742 (MB24) og (b) et mærket andet specifikt bindende middel til at vise im-munoreaktionen af det nævnte første bindende middel med apo B-100. Fortrinsvis er det mærkede specifikke bindende middel en receptor bundet til et enzym. Mere fortrukket er det 25 mærkede middel den af de to receptorer, der ikke er anvendt i (a) ovenfor, bundet til et enzym.

Ved foretrukne udførelsesformer omfatter systemet endvidere en anden beholder med reagens-apo B-100 til anvendelse som kontrol og/eller mål-antigen. Også foretrukne er 30 udførelsesformer, hvorved systemet omfatter en fast matriks, hvortil det første specifikke bindende middel eller reagens--apo B-100 bindes til dannelse af en fast bærer. Anvendelige faste matrikser er allerede beskrevet. Den faste matriks er dog fortrinsvis brønden af en mikrotiterplade.

35 Der tilvejebringes kendte mængder af de specifikke bindende midler. Disse mængder er i det mindste tilstræk- 46 DK 174932 B1 kelige til gennemførelse af én bestemmelse. De tilvejebragte specifikke bindende midler leveres typisk i form og en mængde, der er beregnet til at blive fortyndet til et foreskrevet volumen med vand, saltvand eller en puffer, såsom phosphat-5 pufret saltvand med en pH-værdi på 7,3-7,5.

yderligere pakninger kan også være inkluderet i systemet. Sådanne pakninger kan indeholde (i) puffersalte i tør form eller væskeform, (ii) enzyrosubstrater, såsom o-phenylen-diamin, og lignende.

10 Eksempler på pakninger omfatter flasker eller glas fremstillet af glas og plast, såsom polyethylen og polypropylen, kuverter af plast, plast/metalfolie, plast/metal-folie/papir og lignende. De specifikke bindende midler kan pakkes i en vandig væskeform, f.eks. i ascitesvæske eller 15 puffer, men de leveres fortrinsvis i en tørret form, såsom den der fås ved frysetørring.

D. Af f in itets-sorptionsmidler

Den foreliggende opfindelse angår også et affinitets--sorptionsmiddel, fortrinsvis sterilt, der omfatter en bio-20 logisk aktiv receptor ifølge opfindelsen bundet til en fast matriks til dannelse af en fast bærer. Den faste matriks har fortrinsvis partikelforra. Sådanne affinitets-sorptions-midler er anvendelige til specifik fjernelse af apoprotein B-100-holdigt lipoprotein (VLDL og LDL) ved imraunoadsorption 25 fra plasma fra patienter, der lider af hypercholesterolæmi.

Den faste bærer kan være et udvalg af materialer, såsom tværbundet dextran, f.eks. "Sephadex G-25, -50, -100, -200" og lignende, der fås fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., agarose og tværbundet agarose, f.eks.

30 "Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL4B" og lignende, der også kan fås fra Pharmacia Fine Chemicals, eller "Bio-gel A-0,5M, A--1,5M, A-50M" og lignende, der fås fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, eller polyacrylamidperler, f.eks. "Bio-gel P--2, P-30, P-100, P-300" og lignende, der også fås fra Bio-35 -Rad Laboratories. Agarose og tværbundne agarosematerialer foretrækkes ved den foreliggende opfindelse på grund af 47 DK 174932 B1 deres høje porøsitet og deres lave ikke-specifikt bindende egenskaber, og de vil blive anvendt son eksenpel på en fast natriks.

Sterilisation af receptorerne og den faste natriks 5 gennenføres typisk før samnenbindingen. Til bibeholdelse af biologisk aktivitet steriliseres receptorerne sædvanligvis ved filtrering, f.eks. ved passage gennen et 0,22 μη nitrocellulosefilter. Sterilisationen af natriksen afhænger, således som det er velkendt, af matriksens type. F.eks. kan 10 "Sepharose" ikke steriliseres ved autoklavering, nen det kan steriliseres kemisk, f.eks. ved behandling med diethyl-pyrocarbonat. På den anden side kan tværbundet "Sepharose" steriliseres ved autoklavering ved en pH-værdi på 7 og 120*C i 20 minutter.

15 "Sephadex"- eller "Sepharose"-matriksen aktiveres typisk til sammenbinding ved anvendelse af cyanogenbromid ved velkendte metoder. Den aktiverede matriks vaskes derefter _________ og bindes til receptorer der immunoreagerer—med_apo_B=X00------------ og udskilles af hybridoma HB 8746 eller hybridoma HB 8742.

20 Den matriks-bundne receptor vaskes derefter og er klar til anvendelse. Ikke-reagerede reaktive grupper på bæreren kan omsættes med en amin, såsom ethanolamin eller tris, hvis det ønskes.

Affinitets-sorptionsmidlet kan anvendes i løs til-25 stand, men er fortrinsvis indesluttet i en søjle. Plasma fra en patient indeholdende apo B-100 blandes derefter med affinitets-sorptionsmidlet til dannelse af en immunoreak-tionsblanding. Blandingen holdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, 30 at receptorerne bundet til fast matriks immunologisk binder apo B-100, som er til stede i plasmaet, og danner en ira-munoreaktant bundet til fast matriks. Plasmaet skilles derefter fra immunoreaktanten bundet til fast matriks. Plasmaet, der er befriet for apo B-100 (LDL og VLDL) på denne måde, 35 kan derefter indføres i patienten, fra hvilken det oprindeligt blev udtaget.

48 DK 174932 B1

Fremstillingen af et affinitets-sorptionsmiddel og dets anvendelse til fjernelse af apolipoprotein B-holdige lipoproteiner fra plasma er beskrevet af Stoffel et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 611-615 (1981). En affinitets-5 -adsorptionsmiddel-søjle fremstillet ved at binde i det væsentlige rene MB47-receptorer til CNB4-aktiveret nSepharose 4BM har vist sig at immunoadsorbere (binde) 3 mg LDL pr. ml fast bærer.

II. Materialer og metoder.

10 A. Fremstilling af humane lipoproteiner

Humane lipoproteinfraktioner isoleres ved centrifugering ved følgende densiteter: VLDL, densitet (d) mindre end 1,006 g/ml; LDL, d lig med 1,025-1,050 g/ml; HDL, d lig med 1,070-1,21 g/ml; og LDS, d lig med 1,21 g/ml. I nogle 15 tilfælde isoleres humant LDL også ved d = 1,019-1,063 g/ml eller 1,045-1,065 g/ml. Proteinkoncentrationen af plasma og hver fraktion bestemmes ved Lowry-metoden [Lowry et al., J.

Biol. Chem. 193. 265-275, (1951)] som modificeret af Markwell et al., Anal. Biochem. 87. 206-210 (1978), idet der anvendes 20 en BSA-standard.

For hver LDL- og VLDL-fraktion vurderes apo B-indhol-det også efter udfældning af apo B med tetramethylurinstof (TMU) ved anvendelse af metoden ifølge Kane et al., J. Clin. Invest.. 56. 1622-1634, (1975) eller isopropylalkohol ved 25 anvendelse af metoden ifølge Equsa et al., J. Lipid Res..

24, 1261-1267 (1983).

Frisk fastende humant plasma fås fra normale sunde donorer ved plasmafarese og indstilles til 0,1% EDTA (s/v).

Pools dannet ud fra tre eller flere donorer anvendes, med 30 mindre andet er anført. Lipoproteinerne isoleres ved successiv ultracentrifugering af plasmaet under anvendelse af fast kaliumbromid til indstilling af densiteten (d). Lipopro-teinfraktionerne omfatter VLDL med en densitet mindre end 1,006 g/ml, IDL med en densitet på 1,006-1,019 g/ml, LDL 35 med en densitet på 1,019-1,063 g/ml, og HDL med en densitet på 1,063-1,25 g/ml.

49 DK 174932 B1

Bundfraktionen indeholdende lipoproteinfrit serum (d større end 1,25 g/ml) opsamles også.

Fraktionerne dialyseres grundigt mod lipoproteinpuffer indeholdende 0,15 M natriumchlorid, 0,3 mM EDTA, 0,0005% a-5 -tocopherol, ved en pH-værdi på 7,4.

En chylomicron-fraktion skilles fra VLDL-fraktionen af ikke-fastende poolet plasma ved at føre chylomicronerne gennem lipoproteinpuffer med ultracentrifugering ved 120.000 g i 40 minutter ved 4*C.

10 Alle lipoproteiner sterilfiltreres og opbevares ved 4*C i ikke mere end 20 dage. Lipoproteinerne analyseres for proteinindhold ved en modifikation af metoden ifølge Lowry, J. Biol. Chem. 193. 265-275 (1951), idet der anvendes en BSA-standard. Alle lipoproteinkoncentrationer udtrykkes på 15 proteinbasis.

Apoproteinsammensætningen af hver af lipoproteinklas-serne vurderes ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Chylomicronerne indeholder påviselige mængder af apoproteinerne __ __ B, E og C, medens VLDL indeholder apoproteinerne B, E, C og 20 spormængder af apoprotein A-I.

I DL indeholder apoproteinerne B, E og C, medens LDL kun indeholder apoprotein B. HDL indeholder apoproteinerne AI, All og C.

Under forløbet af disse undersøgelser udviser lipopro-25 teinpræparaterne en ensartet apoproteinsammensætning. Til kontrol for eventuel proteolyse af apoproteiner isoleres udvalgte plasmapools og opbevares i nærværelse af 1 mg/ml gentamycinsulfat, 0,2% natriumazid og 1 mM benzamidin, 10 mM diisopropylfluorphosphat, 10 Mg/ml sojabønnetrypsinin-30 hibitor.

Sammenligning af SDS-PAGE-apoprotein-farvningsmønstre af disse lipoproteiner samt sådanne, der er isoleret i fraværelse af antibiotika og proteaseinhibitorer umiddelbart efter centrifugering og efter opbevaring i op til 3 uger 35 viser ingen tegn på proteolyse. Alle de anvendte præparater er sterile.

50 DK 174932 B1 B. Hybridomafremstillina oa -dyrkning

Intakte native lipoproteiner isoleret fra poolet plasma anvendes til immunisering. Balb/c-mus med en alder på 4-5 uger immuniseres intraperitonealt med 50 μg lipopro-5 tein i komplet Freund's adjuvans. Sekundære intravenøse injektioner af 50 Mg lipoprotein i lipoproteinpuffer indgives mellem dag nr. 28 og 33. Miltene fjernes fra de immuniserede mus 72 timer efter den sidste injektion, og enkeltcellesuspensioner fremstilles i HT-medium. Blodet opsamles også, og 10 serummet anvendes som en positiv kontrol til hver af im-munobestemmelserne.

Muse-myelom-cellelinierne holdes i logaritmisk vækstfase i stationære kulturer i komplet HT-medium [Kennet et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81. 77-91 (1978)] indehol-15 dende 0,1 mM azaguanin. Fusionerne gennemføres i nærværelse af 30 volumenprocent polyethylenglycol 1000 (Sigma, St.

Louis, MO) ved et forhold mellem immune miltceller og P3x63Ag8 på 10:1. Tre dage efter fusionen udplades cellerne i 96-brønds-vævskulturplader med lxlO5 levedygtige celler 20 pr. brønd i HT-medium indeholdende 0,1 mM aminopterin.

Cellerne fødes 7 dage efter fusion med HT-medium og med ca. 4-5 dages intervaller derefter efter behov. Væksten følges mikroskopisk og den ovenstående væske fra kulturen opsamles på dag nr. 14 til bestemmelse af antigenspecifik 25 antistofproduktion ved en fastfase-RIA. Specifikke antistofproducerende hybridomaer klones 19-47 dage efter fusionen ved grænsefortynding i nærværelse af Balb/c-milt-fødeceller, og hybridomaer i brønde indeholdende enkeltkolonier screenes for antistofproduktion ved fastfase-RIA efter 10 dage. De 30 klonede hybridomaer dyrkes i medium indeholdende 10% kalveserum og opbevares frosset i flydende nitrogen.

C. Inhiberina af LDL-bindina. -inkorporering og -nedbrydning

Evnen af anti-apo B-100-receptorer til at inhibere 35 binding, inkorporering og nedbrydning af 125I-LDL af humane fibroblaster vurderes på følgende måde. LDL ioderes med 51 DK 174932 B1 125I (specifik aktivitet 200 cpm/ng) ved anvendelse af iod-monochlorid-metoden ifølge Bilheimer et al., J. Clin. Invest.. 56. 1420-1430 (1975).

For at muliggøre antistof-LDL-vekselvirkning inkuberes 5 0,1 ml af hver hybridoma-supernatant (blandes og holdes) med 125I-LDL (slutkoncentration 2,5 mg/ml) i 0,4 ml af Dul-becco's minimale essentielle medium (OME) indeholdende 2,5 mg/ml lipoproteinfrit serum (LDS) i 12 timer ved 4*C. Derefter overføres de individuelt inkuberede blandinger til mono-10 lag af humane forhudsfibroblaster dyrket i DME med 10% kalve-fosterserum (FCS) i brønde med en diameter på 10 mm. LDL--receptorer af disse celler er blevet eksprimeret maksimalt ved forudgående inkubering af disse celler i et tidsrum på 24 timer i DME indeholdende 2,5 mg/ml LDS.

15 Efter individuelle inkuberinger af ovenstående væske og fibroblastceller i 6 timer ved 37*C vurderes den cellulære nedbrydning af ^25I-LDL ved metoden ifølge Drevon et -----------------a l.,—J-i—L-i-p-i-d—Re s^r,—22^—3 7^4 6 (1981) . Kon t rol kul turer ~har 0,4 ml DME indeholdende ^^I-LDL og en af følgende: a) 0,1 20 ml frisk hybridoma-medium indeholdende 20% kalvefosterserum, eller b) 0,1 ml hybridoma-medium fra brønde af hybridomako-lonier, der er negative for apo B-specifik antistofproduktion, c) 0,1 ml DME indeholdende 2,5 mg/ml LDS, eller d) 0,1 ml umærket LDL (for at bringe slutkoncentrationen af 25 umærket LDL i mediet op på 500 μg/ml).

D. Isolering af anti-LDL-immunoalobin

Ascitesvæsker indeholdende receptorer ifølge opfindelsen fås fra 10 uger gamle Balb/c-mus, der er forbehandlet med 0,3 ml mineralolie og har modtaget intraperitoneale 30 injektioner med 3-50xl05 hybridomaceller. Det gennemsnitlige tidsrum til udvikling af ascites er 12 dage. Efter klaring ved centrifugering ved 15.000 g i 1 time ved 4*C pooles ascitesvæskerne og opbevares i frosset tilstand ved -20*C.

Isoleret antistof MB47 fremstilles ved chromatografi 35 af ascitesvæskerne af monoklonalt hybridoma på en protein A-"Sepharose 4B"-søjle (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, 52 DK 174932 B1

New Jersey). Antistoffet elueres fra søjlen med 0,1 M eddikesyre.

Isolerede receptorer fremstilles også ved hurtig protein-væskechromatografi (FPLC) af en ascitesvæske af 5 monoklonalt hybridoma på en Pharmacia Mono Q HR 5/5 anionbyt-tersøjle i et Pharmacia FPLC system under anvendelse af en 0-0,5 M natriumchloridgradient i 10 mM tris, pH-værdi 8,0, idet anvisningerne, som leveres med søjlen, følges.

E. Karakterisering af hvbridoma-antistoffer 10 Det totale indhold af τ-globulin (Ig) i hver pool af ascitesvæske bestemmes ved elektroforese af 1-3 ml's prøver på celluloseacetatstrimler i 75 mM veronal-puffer ved en pH-værdi på 8,6 i 45 minutter og 200 mV. Procentdelen af det totale protein, som er Ig, bestemmes kvantitativt ved 15 densitometrisk scanning af Ponceau S-farvede geler, og det totale protein bestemmes ved de modificerede Lowry-metoder som ovenfor beskrevet.

Murine Ig tunge og lette kæder identificeres ved dobbelt diffusion i 0,9% agarose. 10 μΐ af en passende for-20 tynding ascitesvæske omsættes med et lige så stort volumen passende fortyndet kanin-anti-muse tung og let kæde-specifikke antisera (Litton Bionetics) . Efter diffusion i ca. 15 timer ved 20*C og vaskning identificeres præcipitin-linier ved farvning med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250.

25 Isoelektriske profiler af hvert monoklonalt antistof fås ved isoelektrisk fokusering af 0,01 ml's prøver af as-citesvæskerne i 0,8% agarose (EF 802-300 LKB) indeholdende 10% sorbitol, 2% ampholin i et pH-værdiområde på 5-8, (LKB) i 150 minutter ved en konstant effekt på 3 W. Efter fiksering 30 og tørring farves gelerne med Coomassie brilliant blue og fotograferes.

1. Western Blotting

Apoproteiner adskilles ved natriumdodecylsulfat-poly-acrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) af lipoproteinerne i 35 et apparatur med lodret gel (14x12x0,15 cm) (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Gelerne fremstilles 53 DK 174932 B1

under anvendelse af en 25 mM tris-glycin-puffer med en pH-vaerdi på 8,6. Den øvre gel indeholder 1% SDS, 3% acrylamid, og den nedre gel er enten en 3-20%'s eller 3-6%'s acrylamid-gradient indeholdende 1% SDS. Lipoproteinerne delipideres 5 ved kogning i 3 minutter i elektroforese-prøvepuffer, der indeholder 1% natriumdodecylsulfat, 10 mM tris og 0,24 mM EDTA. Molekylvægtsmarkører og deres respektive tilsyneladende relative molekylvægte er følgende: fibrinogen 340.000, IgG

140.000, albumin 69.000, ovalbumin 43.000, sojabønnetrypsin-10 inhibitor 20.500, og lysozym 14.300. Gelerne underkastes elektroforese i ca. 18 timer ved en konstant strøm på 13,5 mA.

Gelerne vaskes i destilleret vand i 10 minutter og derefter i 10 minutter i 25 mM tris, 192 mM glycin, pH-værdi 15 8,3, indeholdende 20 volumenprocent methanol. Overføring til nitrocellulose (0,45 μιη, Millipore Corp.) gennemføres ______ _______ved elektroforese i 1 time ved 100 mA. Tilbageværende aktive bindingssteder på nitrocellulosen mættes ved gennemblødning natten over i PBS indeholdende 3% BSA, 3% normal gedeserum, 20 0,01% natriumazid (blokeringsopløsning).

De fikserede geler eller nitrocellulose-overføringerne inkuberes i 18 timer ved 4*C med enten immunt museserum eller ascitesvæske, der er passende fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA, 3% normalt gedeserum, 0,05% "Tween-20" (poly-25 oxyethylen-(20)-monolaurat). Efter gentagen vaskning påvises antistofbinding ved en anden 4-timers inkubering ved 4*C med 125I-gede-anti-immun-Ig (0,5 μ<3ί/ιη1) i den samme puffer, igen efterfulgt af omfattende vaskning.

Ikke-specifik binding til nitrocellulosen reduceres 30 betydeligt ved vaskning efter inkubering med både det første og andet antistof i PBS indeholdende 3% BSA, 0,05% "Tween--20" og derefter i 0,5 M lithiumchlorid indeholdende 0,1% SDS.

Gelerne eller nitrocelluloseoverføringerne tørres og 35 analyseres ved autoradiografi (X-Omat; Eastman Kodak) ved —20*C. I påkommende tilfælde farves gelerne med enten 0,1% 54 DK 174932 B1

Coomassie brilliant blue R-250 i 50% trichloreddikesyre eller med sølv-farvning (Bio-Rad) som beskrevet af Merril et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76. 4335-4339 (1979).

5 F. Fremstilling af Fab-fraqmenter

Fab-fragmenter af isolerede receptormolekyler antistof dannes ved nedbrydning med papain. Antistof-Fc-delene og ikke-nedbrudte antistoffer fjernes ved passage over en protein A-"Sepharose 4B"-søjle. SDS-PAGE af Fab-fragmenterne 10 viser to diskrete bånd på 25.000 og 40.000 dalton. Immuno-reaktiviteten af Fab-fragmenterne bekræftes ved specifik binding til LDL ved en fastfase-RIA (Milne et al., Arteriosclerosis 3. 23-30 (1983)).

15 G. Radioimmunobestemmelser (RIAl 1. Væskefase-RIA med 12^I-mærket antigen Til bestemmelse af brøkdelen af 125I-LDL-partikler bundet af MB47 og MB24 anvendes en væskefase-RIA (Curtiss og Edgington, J. Biol. Chem.. 25. 15213-15221 (1982)]. To 20 forskellige LDL-præparater (d=l,019-1,063 g/ml) undersøges, et isoleret fra poolet plasma fra 10 normale personer og et isoleret fra plasma fra en normal person. 125I-LDL (2000 cpm/ng), fremstillet ved anvendelse af iodogen-metoden (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), er 90% trichloreddikesyre 25 (TCA)-udfældeligt. Det fortyndes i 9% kvægserumalbumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO) og centrifugeres ved 30.000 g i 15 minutter før hver bestemmelse til fjernelse af komplekst materiale. Bestemmelserne gennemføres i 12 x 75 mm glasrør som tredobbelte bestemmelser i 55 mM natriumbarbitalbuffer 30 ved en pH-værdi på 8 indeholdende 150 mM natriumchlorid, 0,02% natriumazid, 3% BSA og 1,5 mM natrium-EDTA. Til 0,1 ml 12^I-LDL (indeholdende 20 ng LDL-protein) sættes 0,1 ml puffer eller konkurrerende antigen og 0,1 ml af stigende koncentrationer af isolerede MB47-receptorer fortyndet i 35 BSA-barbitalpuffer. Efter 18 timer ved 4*C iblandes 0,1 ml "IgSorb" (The Enzyme Co., Boston, MA). Efter 2 timers hol- 55 DK 174932 B1 detid tilsættes 2 ml BSA-fri barbitalpuffer, og rerene centrifugeres omgående ved 1500 g i 60 minutter. Bundfaldene vaskes to gange med barbitalpuffer. Den maksimale udfældelige radioaktivitet bestemmes ved at erstatte "IgSORB" med 100% 5 TCA. Den minimale udfældeiige radioaktivitet bestemmes i fraværelse af MB47-receptorer. Den procentiske mængde bundet 125I-LDL beregnes derefter.

2. Væskefase-RIA med ^-2^I-mærket receptor 10 Intakte antistof MB47-receptorer, isoleret ved im- munorensning, ioderes med 125I ved anvendelse af iodogen--metoden (specifik aktivitet 3000 cpm/ng) (Pierce). Efter omfattende dialyse mod PBS er over 95% af radioaktiviteten udfældelig med 10%'s TCA. Mere end 98% af 125I-MB47 bindes 15 til en affinitetskolonne med humant LDL. Bestemmelserne gennemføres som tredobbelte bestemmelser i 10 x 75 mm sili-coneovertrukne glasrør. Stigende koncentrationer af 125I--MB47 i 0,1 ml BSA-barbitalpuffer sættes til Τ(ΚΓ ng^pooletf normalt humant LDL fortyndet i 0,2 ml BSA-barbitalbuffer.

20 Hvert rør indeholder 182 fmol LDL-apo B (under antagelse af en molekylvægt af apo B på 550.000 dalton). Efter bibeholdelse i 16 timer ved 4eC udfældes LDL kvantitativt ved hjælp af et lipoproteinfrit kanin-antiserum, der er specifikt for humant LDL (kun fraktionen med en densitet over 1,21 g/ml 25 af kanin-antiserummet anvendes, fordi antistof MB47 binder kanin-apo B).

Foreløbige undersøgelser viser en koncentration af delipideret kanin-antiserum, der udfælder 97% af 100 ng af 125j-humant LDL. Efter iblanding af kanin-antistoffet holdes 30 rørene i 16 timer ved 4*C og centrifugeres derefter ved 1500 g i 50 minutter ved 4”C. Den ovenstående væske fjernes, og de fremkomne pellets vaskes to gange med 2 ml iskold barbitalpuffer. Ikke-specifik binding og udfældning bestemmes i to sæt af parallelle rør.

35 I det første sæt tilsættes der ikke humant LDL ved den første inkubering, men tilsættes den samme mængde kanin- 56 DK 174932 B1 -andet-antistof. I det andet sæt af rør anvendes der ikke--immunt kaninserum (fraktion med densitet større end eller lig med 1,21 g/ml) i stedet for immun-kaninserum-antistof.

Begge metoder giver identiske værdier for ikke-speci-5 fik binding, der er lineær med stigende koncentrationer af 125I-MB47-antistof og i alle tilfælde er mindre end 1% af den totale tilsatte mængde radioaktivitet. Specifik -MB47-binding til LDL fås ved at trække ikke-specifik binding fra total binding. Bindingsresultaterne analyseres ved an-10 vendelse af et lineært regressionsprogran for Scatchard- -analyse af ligandbindingssystemer, der giver et estimat af antistof-affinitetskonstanten (Ka) og receptor- eller epitop-koncentrationen (Munson et al.. Anal. Biochem.. 107. 220--239 (1980)).

15 3. RIA med fastfase-bundet antigen

En screeningbesteromelse til undersøgelse, af, om en hybridomakultur producerer receptorer ifølge opfindelsen, gennemføres i fleksible rundbundede polyvinylchlorid-mi-20 krotiterplader (Dynatech, Inc., Alexandria, VA) som fast matrix. Lipoprotein-antigener (reagens apo B-100) bindes til de indre vægge af mikrotiterpladebrøndene ved iblanding af 0,05 ml lipoprotein i lipoproteinpuffer og inkubering af pladerne ved stuetemperatur i 3 timer til tilvejebringelse 25 af en konstant slutkoncentration af bundet antigen og den faste bærer. Foreløbige undersøgelser af direkte binding under anvendelse af radioioderede lipoproteiner viser, at der er væsentlige forskelle i de virkningsgrader, hvormed hver af lipoproteinerne bindes til plast-mikrotiterbrøndene.

30 Til opnåelse af en slutkoncentration af bundet antigen på 50 ng protein/brønd anvendes der derfor VLDL ved 50 Mg/ml, I DL ved 6,2 /ig/rol, LDL ved 4,4 μg/ml og HDL ved 24 μg/ml, Ikke-specifikke bindende steder blokeres derefter ved iblanding af 0,25 ml blokeringsopløsning i hver brønd, bibehol-35 delse af blandingen i 1 time og derefter fraskillelse af blokeringsopløsningen fra brøndene, hvorved der dannes en 57 DK 174932 B1 fast bærer med lav ikke-specifik bindingsevne.

Til bestemmelsen blandes 0,050 ml antiserum, ovenstående væske fra kultur eller ascitesvæske fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA, 3% normal gedeserum og 0,05% "Tween-5 -20” (polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat) i brøndene til dannelse af fastfase/væskefase-immunoreaktionsblandin-ger. Blandingerne holdes derpå (immunoreageres) i 18 timer ved 4*C.

Efter vaskning af brøndene med PBS indeholdende 3% 10 BSA og 0,05% "Tween-20” til fjernelse af ikke-bundet materiale behandles de fastfase-bundne receptorer til direkte påvisning ved iblanding af 10 ng immunokemisk renset og radioioderet gede-anti-muse-Ig i hver brønd til dannelse af en anden fastfase/væskefase-blanding. Denne blanding holdes 15 i 4 timer ved 4*C for at gøre det muligt for de mærkede andre receptorer at binde de fastfase-bundne første receptorer og danne en sandwich-immunoreaktant.

Efter en slutvaskning til fjernelse af ikke-bundne mærkede receptorer fjernes de individuelle brønde og tælles 20 for «Si, idet mængden af påvist 125I er direkte proportional med mængden af de første receptorer, der er bundet som fast-fase-immunoreaktant.

Det immunokemisk rensede andet antistof radioioderes enzymatisk under anvendelse af immobiliseret lactoperoxidase 25 og glucoseoxidase (Enzymobeads, Bio-Rad Burlingame, CA) til specifikke aktiviteter på 3-4 μCi/μg.

4. Kompetitiv RIA med fastfase-bundet receptor

Kompetitive fastfase-radioimmunobestemmelser (RIA) 30 for humant apo B gennemføres under anvendelse af antistof MB47. Polyvinylchloridbrønde overtrækkes med 0,5 ml humant LDL (reagens-apo B-100) fortyndet til 10 μg/ml i PBS, pH--værdi 7,35, og holdes i 2 timer ved 37·C. Ikke-specifikke bindingssteder blokeres ved overtrækning med 5%. BSA i PBS i 35 30 minutter ved stuetemperatur. Pladerne vaskes derefter med PBS-vaskepuffer, der yderligere indeholder 0,1% BSA, 58 DK 174932 B1 0,01% natriumazid og 0,05% "Tween 20".

Frisk humant LDL, fremstillet ud fra poolet normalt plasma, anvendes som reagens-apo B-100 til standardkurven i fortyndinger fra 0,4 Mg/ml til 97,2 pg/ml. Alle fortyndinger 5 foretages i en PBS-puffer indeholdende 3% BSA, 0,01% natriumazid og 0,05% "Tween 20". Standard-LDL eller kompeti-' torer (0,025 ml) blandes i de LDL-overtrukne brønde efter fulgt af 0,025 ml puffer indeholdende en fast og begrænsende mængde monoklonalt antistof (ascitesvæske). Den optimale 10 slutkoncentration af antistof bestemmes ud fra forudgående antistoffortyndingsundersøgelser og vælges som den mængde antistof, der medfører 50% af den maksimale binding.

Pladerne holdes i et tidsrum på ca. 18 timer ved 4°C, hvorefter de vaskes roed PBS-vaskespuffer. Museantistof-15 -binding bestemmes derefter kvantitativt ved iblanding af 0,05 ml 125I-immunoreriset gede-anti-muse-Ig (450 ng/brønd, 8000 cpm/ng) . Efter en holdetid på 4 timer ved 4*C vaskes pladerne, og de individuelle brønde underkastes tælling.

20 H. Enzvmbundet immunosorbensbestemmelse (ELISA)

1. Ikke-komnetitiv ELISA

Isolerede MB47 receptorer bindes til væggene af poly-styren-mikrotiterpladebrønde (Nunc-Immuno Plate I) ved blanding af 0,15 ml af en natriumhydrogencarbonatpuffer, pH-25 -værdi 9,0, indeholdende 1 Mg/ml receptorprotein i hver brønd. Brøndene holdes i 16 timer ved 4*C og vaskes derefter tre gange roed PBS indeholdende 0,1% BSA og 0,05% "Tween". Tilbageværende ikke-specifikke bindende steder blokeres derefter ved blanding af 0,2 ml 3%'s BSA i PBS i hver brønd, 30 bibeholdelse af blandingen i 1 time ved 23°C og derefter vaskning som ovenfor beskrevet. Brøndene (de faste bærere), der er fremstillet på denne måde kan anvendes i op til ca.

1 måned efter fremstillingen, når de opbevares i et fugtigt kammer.

35 Reagens-apo B-100 (humant LDL) fortyndes i PBS til koncentrationer fra 2,0 til 0,062 /ig/ml til anvendelse som 59 DK 174932 B1 standardkontrolopløsninger. Plasmaprøverne fortyndes 1:2000 i PBS.

50 μΐ standard eller prøve blandes i brøndene i tre eksemplarer. Indenfor ca. 5 minutter derefter blandes 50 μΐ 5 PBS indeholdende mg/ml HRPO-mærkede MB24-receptorer i hver brønd. Immunoreaktionsblandingerne holdes i 30 minutter ved 25’C. Ikke-bundet materiale skilles derefter fra brøndene ved vaskning som ovenfor beskrevet.

Mængden af fastfasebundet sandwich-immunoreaktant 10 indeholdende HRPO-mærkning bestemmes derefter ved blanding af 0,1 ml frisk fremstillet substratopløsning (destilleret vand indeholdende 3% hydrogenperoxid og 0,67 mg/ml o-pheny-lendiamin (OPD)) i hver brønd. Farven får lov at udvikle sig i 30 minutter ved 25*C. Substratomdannelsesreaktionen 15 standses derefter ved iblanding af 0,05 ml 4N hydrogenper-oxidopløsning i hver brønd. Den optiske tæthed (O.D.) af opløsningerne bestemmes ved 490 nm under anvendelse af en Dynatech MR600 (Dynatech, Alexandria, VA) mikrotiterplade- " -læser.

20

2. Kompetiv ELISA

Reagens-apo B-100 bindes til væggene af mikrotiter-pladebrønde af fleksibelt polyvinylchlorid (Microtest III,

Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co., Oxnard, CA) som 25 fast matrix ved blanding af 0,2 ml PBS indeholdende 5 μ%/ια1 isoleret humant LDL i hver brønd. Brøndene holdes i 16 timer ved 4'C og vaskes derefter tre gange med 0,2 ml PBS indeholdende 1% BSA, 0,5 % ’'Tween" og 0,02% aprotinin (Sigma Chemical Co.). Tilbageværende ikke-specifikke bindende steder 30 blokeres som beskrevet ved den ikke-kompetitive ELISA.

Til standardkurven, som er inkluderet på hver plade, fortyndes reagens-apo B-100 i PBS indeholdende 0,5% lipo-proteinfrit plasma (LPDP) til tilvejebringelse af koncentrationer fra 32 til 0,25 mg/ml.

35 Plasmaprøver fortyndes 1:200 i PBS indeholdende 0,5% LPDP. 50 μΐ af standarderne eller prøverne blandes i tre 60 DK 174932 B1 eksemplarer i brøndene. Indenfor ca. 5 minutter derefter blandes 50 μΐ PBS indeholdende 3% BSA og ca. 4 pg/ml MB24--receptorer i hver brønd. De således dannede blandinger holdes i ca. 18 timer ved 4*C. Det ikke-bundne materiale 5 skilles derefter fra de fastfase-bundne MB24-reagens-apo B--100-immunoreaktionsprodukter ved vaskning som ovenfor beskrevet .

Fastfase-immunoreaktanterne behandles til bestemmelse ved blanding af 0,1 ml PBS indeholdende 1% BSA og en effektiv 10 mængde HRPO-mærket gede-anti-muse-IgG i hver brønd. Denne anden immunoreaktionsblanding holdes i ca. 1 time ved 24*C og vaskes derefter som beskrevet ovenfor til dannelse af en sandwich-immunoreaktant.

Mængden af fastfasebundet sandwich-immunoreaktant 15 indeholdende HRPO-mærkning bestemmes som beskrevet ved den kompetitive ELISA.

1. Plasmaprøver oa lipoprotein-mænadebestemmelse

Plasmaprøver fås fra 20 patienter med coronararterie-sygdom fra hjertekatheteriseringslaboratoret på San Diego 20 VA Hospital og fra 20 patienter med familiær hypercholeste-rolæmi fra en University of California, San Diego-klinik. Desuden fås plasma fra 20 normale personer.

Blod opsamles i rør indeholdende 1,5 mg/ml ethylen-diamintetraacetat (EDTA), og plasmaet separeres omgående 25 ved centrifugering ved 4*C.

Totalt plasmacholesterol og -triglycerider måles på friske plasmaprøver i et standardiseret klinisk laboratorium under anvendelse af en Abbott ABA-200 bichromatisk analysator og Boehringer-Mannheim højeffektivt cholesterolreagens 30 236.691 og Abbott Laboratories triglycerid-midlet. LDL- og HDL-cholesterol måles ifølge metoder, der er beskrevet i Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. No. 75-628 (NIH), 2. ed., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974). Apoprotein B-niveauer bestemmes under anvendelse af to kommercielt 35 tilgængelige radialimmunodiffusionssæt: "Diffu-gen RID" (Tago, Inc., Burlingame, CA), betegnet RID nr. 1 og "M-Par- 61 DK 174932 B1 tigen RID", (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA) betegnet RID nr. 2.

J. LDL-bindina til en MB47-llSepharose 4B"-søile 5 50 mg af i det væsentlige rene MB47-receptorer. der er tilvejebragt ved protein A-søjlechromatografi, bindes til 12 ml cyanogenbromidaktiveret "Sepharose 4Bn (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.Y.) ifølge producentens instruktioner. Derefter sættes 10 mg LDL til søjlen og holdes 10 natten over (ca. 16 timer) ved 4*C. Det ikke-bundne LDL elueres og undersøges for LDL-protein som ovenfor beskrevet.

Claims (5)

1. Hybridoma med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746 eller HB 8742.

2 Old (χοιυ) uo-cqeaquaouo^-qY

9-OU z-01 8-01 6-0 U oi-Ol n-Ot i-1-1-1-V------~ / J / / / * • ____ ____ O o DK 174932 B1 FIG. 3 80 Γ BINDING INKORPO- NEDBRYD- RERING N1NG *—i O n c 60 - O 5 40 - CJ o M _ 6 20 - _ __ Q - ί ί i _____ ________ LDL Ab47 LDL Ab47 LDL Ab47 _ LDL-Niveau ved kompatitiv ELISA vs. PIG. i Apo B-niveau ved direkte ELISA. 5 6001-- tr> 5 500 - HS 400 - Ά 300 - V 200 - S ,nn " °0 100 200 300 400 Apo B-niveau ved direkte ELISA (mg/dl) DK 174932 B1 i 100 - +> C “ 0 * 80 - - *w T 1 60- \ λ \

40. V 01 \ 12(>: 1 -i-*— - 100 - H 0 u — -P c; _Λ S 80- ._ 1 60- \ I«: \ I 20- m “ * 0'-1-1- 1 10 Molært forhold FAB/LDL FIG. 4 j Evne af umærket MB24 og MB47 til at konkurrere med peroxidase-mærket MB24 og MB47 om binding til LDL ved en fastfase-bestemmelse. ! i 2.Qr*Éåf é-*-*-A --_-._ ^ * A. HRP0MB47 ρ μρρη up?d , c . •umærketW47 J HRPO Μ824 # Α umærke " \ A j . 1.0i> d X “V i ^----! 0 ^ 1 * —*-*1*1-;-1 i__I ) i_I_1_1_ 2 6 10 14 18 22 26 30 2 6 10 14 18 22 Tilsat umærket antistof (Mg/ml) FIG. js i i j i i j DK 174932 B1 FIG. 6A 125 Væskefase-LDL- I-B47-binding 200 i-— ------

2. Receptor, der (a) immunoreagerer med apoprotein

5 B-100 og (b) udskilles af hybridomaet med ATCC-deponerings nummeret HB 8746 eller HB 8742.

3. Receptor ifølge krav 2, som er et intakt antistof.

4. Fremgangsmåde til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for mængden af apoprotein B-100, kendeteg- 10 net ved, at den omfatter følgende trin: (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, (b) tilvejebringelse af receptormolekyler i en biologisk aktiv form, der (i) immunoreagerer med apoprotein B- 15 -100 og (ii) udskilles af hybridomaet med ATCC-deponerings nummeret HB 8746 eller af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, (c) blanding af en kendt mængde af kropsvæskeprøven med en forudbestemt mængde af receptormolekylerne til dan- 20 nelse af en immunoreaktionsblanding, (d) bibeholdelse af blandingen under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at receptormolekylerne, som er til stede i blandingen immunologisk binder apoprotein D-100, som er 25 tilstede i prøve, til dannelse af en immunoreaktant, og (e) bestemmelse af mængden af immunoreaktant dannet i blandingen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4,kendetegne t ved, at kropsvæskeprøven enten er plasma eller serum.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4,kendeteg ne t ved, at kropsvæskeprøven endvidere forberedes til bestemmelse ved inkludering af følgende yderligere trin: (f) tilvejebringelse af biologisk aktive andre receptormolekyler, der immunoreagerer med apoprotein B-100, som 35 er til stede i kropsprøven, og som er de receptormolekyler udskilt af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746 DK 174932 B1 eller hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, der ikke anvendes i trin (b), og (g) blanding af en forudbestemt mængde af de nævnte andre receptorroolekyler med kropsvæskeproven til dannelse 5 af en immunoreaktionsblanding, (h) bibeholdelse af immunoreaktionsblandingen under biologiske bestemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at receptormolekylerne, som er til stede i blandingen, immunologisk binder apoprotein ΒΙΟ -100, som er til stede i proven, til dannelse af en sandwich- -immunoreaktant.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den førstnævnte receptor er bundet til en fast matrix til dannelse af en fast bærer, at den anden receptor 15 indeholder en mærkning, der kan vise tilstedeværelsen af den anden receptor i en immunoreaktant, og at immunoreaktanten, der bestemmes i trin (e), er en fastfase-sandwich-immunore-----------aktant-—der—indeholder-den—nævnte—mærkning-;--------------------

8. Diagnostisk system til bestemmelse af mængden af 20 apo B-100 i en kropsprøve, kendetegnet ved, at det omfatter: (a) et biologisk aktivt første specifikt bindende middel, der omfatter receptormolekyler, som (i) immunorea-gerer med apoprotein B-100 og (ii) enten er receptormole- 25 kylerne udskilt af hybridoma ATCC HB 8746 eller receptormolekylerne udskilt af hybridoma ATCC HB 8742, og (b) et biologisk aktivt mærket andet specifikt bindende middel til at vise immunoreaktionen af det første bindende middel med apo B-100.

9. Bestemmelsessystem ifølge krav 8, kende tegnet ved, at det mærkede andet specifikke bindende middel er de receptormolekyler udskilt af hybridoma ATCC HB 8746 eller udskilt af hybridoma ATCC HB 8742, der ikke anvendes i trin (a).

10. Bestemmelsessystem ifølge krav 8, kende tegnet ved, at det første specifikke bindende middel DK 174932 B1 er bundet til en fast matrix til dannelse af en fast bærer.

11. Sterilt affinitetssorptionsmiddel omfattende biologisk aktivt receptormolekyler, der immunoreagerer med . apoprotein B-100 og er valgt blandt: 5 (a) receptormolekyler udskilt af hybridoma HB 8746, (b) receptormolekyler udskilt af hybridoma ATCC HB 8742, og (c) en blanding af receptormolekylerne nævnt under (a) og (b), 10 hvor receptormolekylerne er bundet til en fast matrix til dannelse af en fast bærer.

12. Metode til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for apoprotein B-100, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: 15 (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, (b) tilvejebringelse af en fast bærer, der omfatter en fast matrix, hvortil der i biologisk aktiv form er bundet en første receptor, der immunoreagerer med apoprotein B-100 20 og udskilles af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746, (c) tilvejebringelse af en biologisk aktiv anden receptor, der immunoreagerer med apoprotein B-100 og udskilles af hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, 25 hvor den anden receptor er bundet til en enzymmærkning, der er i stand til at vise tilstedeværelsen af den anden receptor i en immunoreaktant, (d) i det væsentlige samtidig blanding af: (i) kropsprøven, 30 (ii) den faste bærer og (iii) den mærkede anden receptor til dannelse af en fastfase/væskefase-immunoreaktionsblan-ding, (e) bibeholdelse af blandingeh under biologiske be- 35 stemmelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at den første receptor og den mærkede DK 174932 B1 anden receptor immunologisk binder apoprotein B-100, som er til stede i prøven, til dannelse af en fastfase-sandwich-immunoreaktant og en væskefase, (f) fraskillelse af fastfase-sandwich-immunoreaktanten 5 fra væskefasen, og (g) bestemmelse af mængden af mærket anden receptor bundet i fastfase-sandwich-immunoreaktanten.

13. Kompetitiv metode til undersøgelse af en kropsvæskeprøve for apoprotein B-100, kendetegnet ved, 10 at den omfatter følgende trin: (a) tilvejebringelse af en kropsvæskeprøve, der skal undersøges, (b) tilvejebringelse af en fast bærer, der omfatter en fast matrix med en forudbestemt mængde reagens-apoprotein

15 B-100 bundet dertil, (c) i det væsentlige samtidig blanding af (i) kropsprøven, (ii) den faste bærer og (iii) en forudbestemt mængde af receptormolekyler, 20 der immunoreagerer med apoprotein B-100 og udskilles af enten hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8746 eller hybridomaet med ATCC-deponeringsnummeret HB 8742, til dannelse af en fastfase/væskefase-blanding, (d) bibeholdelse af blandingen under biologiske be-25 stemmelsesbetingelser i et tilstrækkeligt tidsrum til, at receptormolekylerne immunologisk binder til apoprotein B--100-molekyler på den faste bærer og til apoprotein B-100--molekyler, som er til stede i kropsvæskeprøven og danner en fastfase-immunoreaktant og en væskefase-immunoreaktant, og 30 (e) fraskillelse af fastfase-immunoreaktanten fra væskefasen, (f) blanding af fastfase-immunoreaktanten med en biologisk aktiv anden receptor, der immunoreagerer med den første receptor til dannelse af den anden fastfase/væskefase-35 -immunoreaktionsblanding, hvor den anden receptor er bundet til en enzymmærkning, der i stand til at vise tilstedeværel- DK 174932 B1 sen af den anden receptor i en immunoreaktant, (g) bibeholdelse af den anden blanding i et tilstrækkeligt tidsrum til, at den mærkede anden receptor immunologisk binder til eventuel første receptor, der til stede som 5 fastfase-immunoreaktant, til dannelse af en fastfase-sand-wich-immunoreaktant, (h) fraskillelse af fastfase-sandwich-immunoreaktanten fra væskefasen, og (i) bestemmelse af mængden af mærket anden receptor 10 bundet i fastfase-sandwich-immunoreaktanten. i l f)ig. I A B C D E VC V C VC VC VC ______ . j__ ___________....__ * ΑροΒ-ΙΟΟ-^ Φ 1 # Apo B-48 -► ^ i r-* ' ! i

5 G ^ 160 - n - / o o φ 120 - / Ό L c . /O JQ / ^ 80 f o I e A «η r 40 1 o -1-—1--—1-1-1—- 0 10 20 30 40 50 60 [B-47] nM FIG. 6B 125 Scatchard-afbildning af LDL- I-B47-binding 0.2 i-- o ω 0.1 - \ α ° VVi cPVp 0-1-1-1-1-1_i_i_ 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 Bundet (fmol B47) DK 174932 B1 FIG. 8 6001-1 -500 - Ϊ400 - _ 11^ S 300 - >5^ I200 ' ¥ 100 - * °0 100 200 300 Apo B-niveau ved kompatitiv ELISA (mg/dl) FLG. 9 r-H Ό \ D> f400 i- j,.„- *. ^ 200 - . > I 100 - o oL^_-1-1-ri^L- < 0 100 200 300 Apo B-niveau ved kompatitiv ELISA (mg/dl)