NO172596B - Apolipoprotein b-spesifikke monoklonale antistoffer produsert av to nye hybridomer, anvendelse av disse og diagnostiske systemer inneholdende disse - Google Patents
Apolipoprotein b-spesifikke monoklonale antistoffer produsert av to nye hybridomer, anvendelse av disse og diagnostiske systemer inneholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- NO172596B NO172596B NO873271A NO873271A NO172596B NO 172596 B NO172596 B NO 172596B NO 873271 A NO873271 A NO 873271A NO 873271 A NO873271 A NO 873271A NO 172596 B NO172596 B NO 172596B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- apo
- ldl
- antibody
- antibodies
- binding
- Prior art date
Links
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 title description 2
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 claims abstract 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 54
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 claims description 43
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 claims description 43
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 31
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 29
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 25
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 25
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 7
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 53
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 131
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 100
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 100
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 65
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 description 63
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 60
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 60
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 37
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 33
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 33
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 32
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 30
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 30
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 28
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 25
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 24
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 24
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 19
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 18
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 18
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 18
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 14
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 14
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 14
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 14
- 101800001976 Apolipoprotein B-48 Proteins 0.000 description 12
- 102400000352 Apolipoprotein B-48 Human genes 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 8
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 8
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 6
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000007982 barbital buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 5
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 4
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 3
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- AVQQQNCBBIEMEU-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylurea Chemical compound CN(C)C(=O)N(C)C AVQQQNCBBIEMEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018655 Apolipoproteins C Human genes 0.000 description 2
- 108010027070 Apolipoproteins C Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101000889953 Homo sapiens Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 2
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000045903 human LPA Human genes 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000000444 normolipidemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRCSNYKNBODDIM-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-n,n-dimethylethanamine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].O1CCOC2=CC(OCC[NH+](C)C)=CC=C21 VRCSNYKNBODDIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 108010076807 Apolipoprotein C-I Proteins 0.000 description 1
- 102000011772 Apolipoprotein C-I Human genes 0.000 description 1
- 108010024284 Apolipoprotein C-II Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010004942 Chylomicron Remnants Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- QZRGKCOWNLSUDK-UHFFFAOYSA-N Iodochlorine Chemical compound ICl QZRGKCOWNLSUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011365 complex material Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229940113116 polyethylene glycol 1000 Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- IVIIAEVMQHEPAY-UHFFFAOYSA-N tridodecyl phosphite Chemical compound CCCCCCCCCCCCOP(OCCCCCCCCCCCC)OCCCCCCCCCCCC IVIIAEVMQHEPAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
To hybridomer som produserer reseptorer inneholdende antistoff-bindingssteder som immunoreagerer med apolippprotein B-100, er beskrevet, såvel som anvendelsesområder for reseptorene, sammensetninger og diag-nostiske systemer som innbefatter reseptorene.
Description
Foreliggende oppfinnelse angår generelt nye hybridomer, og nærmere bestemt hybridomer som produserer antistoffer som immunoreagerer med apolipoprotein B-100, således fremstilte antistoffer såvel som diag-nostiske metoder og systemer under anvendelse av antistoffene .
Lipoproteiner er de primære bærere av plasmacholesterol og triglycerider. De er micéllære lipid-protein-komplekser som inneholder protein (angitt som apoprotein)
og polare lipider organisert i en overflatefilm som omgir en nøytral lipid- (triglycerid og cholesterylester) kjerne. Lipoproteinene ble opprinnelig identifisert basert på deres egen-densiteter som målt ved ultrasentrifugering. Følgelig er det fire hoved-densitetsklasser: chylomikroner, lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet (LDL) og lipoproteiner med høy densitet (HDL).
Parallelt med utviklingen innen ultrasentrifugal-separasjonsteknologien har det skjedd en ytterligere under-deling av LDL- og HDL-densitetsklassene i ytterligere underklasser med større homogenitet. Eksempelvis kan LDL opp-løses i et mellomliggende densitets-lipoprotein (IDL) og en LDL2 underklasse. Selv disse underklasser er imidlertid sammensatt av funksjonelt heterogene populasjoner av lipoproteinpartikler på grunn av deres varierte apoprotein-innhold.
Åtte hoved-apoproteiner A-I, A-II, A-IV, B, C-I,
C-II, C-III og E, er blitt isolert, og blant gruppen av mindre apoproteiner som kan gjenvinnes i større mengder fra visse densitetsklasser, kan de fleste også finnes i andre densitetsklasser. Således inneholder de fleste LDL-partikler bare apo B, men noen få partikler inneholder også andre apoproteiner, og dette forklarer spormengder av apo C-I, apo C-II, C-III og apo E tilstedeværende i denne densitetsklasse.
I enkelte tilfeller er spesifikke funksjoner blitt tilegnet bestemte apoproteiner. Eksempelvis gjenkjennes og bindes en art av apo B syntetisert i leveren, angitt som apo B-100, av cellulære LDL-reseptorer. Ved binding av apo B-100 binder disse reseptorer LDL-partikler og ekstra-herer dem fra plasmaet. LDL tas derved inn i cellene og brytes ned og avgir sitt cholesterol for å tjene hver celles behov. Apo B-LDL-reseptorinteraksjon spiller således en hovedrolle ved fjerning av LDL-cholesterol fra blodstrømmen.
En annen art av apo B, angitt som apo B-48, gjenkjennes ikke av LDL-reseptoren. Denne apo B-art, som bare er 48% så stor som apo B-100, syntetiseres i mennesker bare av tarmen. Lipoproteiner inneholdende apo B-48, slik som chylomikroner og chylomikronrester, bindes ikke til LDL-reseptoren.
Selv om disse to arter av apo B synes å være under separat genetisk kontroll (en enkelt pasient er blitt beskrevet hvis kropp danner apo B-48, men ikke apo B-100), har immunologiske studier vist at apoproteiner B-100 og B-4 8 deler antigeniske determinanter. Minst tre forskergrupper har rapportert utvikling av totalt syv forskjellige monoklonale antistoffer som bindes til den ene eller andre av apo B-100 og apo B-48. Dataene rapportert av disse forskere, antyder sterkt at apo B-48 og apo B-100 er struk-turelt beslektede proteiner, dvs. at apo B-48 kan represen-tere en del av apo B-100-proteinet. Bevis er også blitt rapportert for at apo B-48 og apo B-100 ikke finnes på samme lipoproteinpartikler, hvilket antyder at separate apo B-partikler eksisterer.
Nylig har flere forskere antydet at plasmanivåer av apo B mer kan være årsak til risiko for koronar arteriesykdom (CAD) enn plasma LDL-cholesterolnivåer. Sniderman . et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77, 604-608 (1980).. Fordi arteriosklerotisk vaskulær sykdom og dens komplika-sjoner fortsatt er den ledende årsak til død og svekkelse i vesten, har det vært et lenge følt behov innen den bio-medisinske industri for testsystemer som muliggjør identi-fisering av individer med risiko for CAD.
Mange typer av immunobestemmelser for plasma-apoprotein B som gjør bruk av spesifikke antistoff-holdige antisera, er blitt rapportert, innbefattende konkurrerende fluidumfase og fast fase radioimmunobestemmelser (RIA), enzymkjedede immunosorbantbestemmelser (ELISA), radial immunodiffusjonsbestemmelser og andre. Problemer som begrenser en bred anvendelse av disse apo B-immunobestemmelser, har vært reproduserbarhet og kvalitet og spesifisitet av de anvendte antisera. Sammendrag av de metodologiske problemer for hver av de forskjellige typer av apo B-bestemmelser finnes i Currey et al., Clin. Chem. 24, 280-286 (1978) og Rosseneu et al., Clin. Chem. 28.' 427-433
(1983) .
Flere forskere har rapportert om utvikling av felt av monoklonale antistoffer mot humant apo B for anvendelse ved studering av dets antigeniske struktur og rollen i lipoproteinmetabolisme. Enn videre er det blitt rapportert om anvendelse av anti-apo B-monoklonale antistoffer for å måle plasma apo B-nivåer i fluidum-fase RIA. Patton et al., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) og Maynard et al., Clin. Chem. 30, 1620-1624 (1984) . I tillegg har en gruppe rapportert om anvendelse av en blanding av anti-apo B-monoklonale antistoffer i en radial immunodiffusjonsbestemm-else for plasma apo B. Marconvina et al., Clin. Chim. Acta 147, 117-125 (1985). Disse bestemmelsesteknikker lider imidlertid av nødvendigheten av langvarige inkuberinger, gjentatt sentrifugering eller anvendelse av radioaktive materialer.
Anvendelse av monoklonale antistoffer som reagenser for bestemmelse av nærvær av apo B-100 i humane kroppsvæske-prøver er attraktiv fordi slike reagenser, så snart disse er erholdt, kan produseres i relativt store mengder med ensartet kvalitet. Imidlertid er det er utall faktorer .som strider mot bruk av et bestemt monoklonalt antistoff som komponent i et apo B-100 bestemmelsessystem.
For det første hersker det innen faget den oppfatning at et monoklonalt anstistoff kan være for immunospesifikt til å være anvendbart på grunn av den antigeniske heterogenitet av dets målantigen. Eksempelvis avhenger spesifisiteten av konvensjonelle monoklonale antistoff-holdige antisera av en samstemmighet av hundretusener forskjellige antistoffer som bindes til antigeniske determinanter som dekker mesteparten eller alle av et antigenisk protein.
Små forandringer i strukturen av antigenet på grunn av genetisk polymorfisme, heterogenitet av glycosylering eller ubetydelig denaturering, vil som et resultat ha liten effekt på polyklonal antistoffbinding. På lignende måte vil en større eller mindre delmengde av antistoffer fra poly-klonale antisera vanligvis binde antigener som er blitt modifisert eller denaturert.
Monoklonale antistoffer bindes vanligvis derimot til en antigenisk determinant (epitope) på antigenmolekylet. Hvis, av en eller annen grunn, denne determinant forandres, kan eller kan ikke antistoffet fortsette å bindes. Hvorvidt dette er et problem eller en fordel, avhenger av de individuelle omstendigheter. Hvis, som i foreliggende til-felle, det monoklonale antistoff skal anvendes i en diagnostisk bestemmelse med hensyn til et apoprotein, vil en liten antigenisk variasjon i dette protein kunne forårsake store feil.
Den antigeniske heterogenitet av apoprotein B-100
er vel dokumentert. Eksempelvis er epitopeekspresjon på
apo B blitt funnet å være modulert av (1) sammensetningen av de assosierte lipider, (2) temperaturen på immunoreaksjonen, (3) graden av isolering av LDL fra dets naturlige miljø og (4) genetisk ekspresjon mellom individer.
På grunn av deres unike spesifisitet avhenger på
den annen side en vellykket anvendelse av et monoklonalt antistoff (MoAb) ofte av dets affinitet med hensyn til mål-antigenet. Mens f.eks. et MoAb kan ha tilstrekkelig affinitet til å være anvendbart ved binding av væske og fast fase-antigen mens MoAb i seg selv er i væskefase, kan det samme antistoff ikke være anvendbart som et fast fase-festet antistoff som er anvendbart ved binding til og "trekking" av antigenet ut av løsningen.
De ovenfor angitte problemer er generiske med hensyn til anvendelse av monoklonale antistoffer. Fagmannen har derfor erkjent at det er vesentlig å teste og karakterisere monoklonale antistoffer i ethvert bestemmelsessystem hvori de skal anvendes. Se Goding, James W., Monoclonal Anti-bodies: "Principles and Practice", sider 40-46, Academic Press, New York (1983).
En side ved oppfinnelsen angår et monoklonalt antistoff, som er kjennetegnet ved at det er et intakt antistoff som (a) immunoreagerer med apoprotein B-100, og (b) utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnr. HB 8746, eller utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnr. HB 8742.
En annen side ved oppfinnelsen angår hybridomer, som er kjennetegnet ved at de har ATCC deponeringsnr. HB 8746 og HB 8742, og som fremstiller det ovenfor angitte anstistoff. Dette hybridom og dets antistoffer er også angitt her som MB47 og M24.
En ytterligere side ved oppfinnelsen angår anvendelse av det ovenfor angitte antistoff for bestemmelse av en kropps-prøve med hensyn til mengden av apoprotein B-100, eller som steril affinitetssorbant.
En annen side ved oppfinnelsen angår et diagnostisk system for bestemmelse av mengden av apo B-100 i en kropps-prøve, som er kjennetegnet ved at det omfatter: (a) et biologisk aktivt, første spesifikt bindingsmiddel som omfatter antistoffer som (i) immunoreagerer med apoprotein B-100, og (ii) er enten antistoffene utskilt av hybridomet ATCC HB 8746 eller antistoffer utskilt av hybridomet ATCC HB 8742; og (b) et biologisk aktivt, merket, andre spesifikt bindingsmiddel for signalisering av immunoreaksjonen mellom første bindingsmiddel og apo B-100.
En fordel ved oppfinnelsen er at hybridomene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å produsere i relativt store mengder og med ensartet kvalitet, antistoffer - som immunoreagerer med apo B-100.
En annen fordel ved oppfinnelsen er at antistoffene ifølge oppfinnelsen blant annet er anvendbare for bestemmelse av mengden av cholesterolbærende apo B-100 i en kroppsvæske-prøve.
En fordel ved foreliggende oppfinnelse er at antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i enzymkjedede immunosorbentbestemmelser for apo B-100 i formater som ikke krever sentrifugeringsprosedyrer.
En annen fordel er at bestemmelsesmetodene ifølge
oppfinnelsen kan fullføres i løpet av relativt kort tid.
Andre fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå for fagmannen fra den etterfølgende beskrivelse av oppfinnelsen, tegningene og de etterfølgende krav.
Figur 1 er et fotografi av en Western Blot analyse-autoradiograf hvori MB47-og MB24-antistoffers evne til å immunoreagere med apo B-100 og apo B-48 erholdt fra delipiderte chylomikroner og VLDL, er vist. VLDL og chylomikroner ble delipidert og underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av 3-6% gradientgeler. 60 mikrogram (ug) VLDL-protein og 20 ug chylomikronprotein ble kjørt på alternerende spor av gelen, og proteinene av hvert preparat ble derved separert i henhold til størrelse. Visualisering av det elektroforetiske mønster av proteinvann ved beising av gelen med 0,1% Coomassie blue viste apo B-100-og apo B-12-bånd i chylomikroner og VLDL'. Proteinbåndene ble deretter festet ved elektroforetisk overføring til nitrocellulosepapir under dannelse av en fast bærer. De bærer-festede apoprotein-antigener ble deretter separat immunoreagert med immunorenset MB47- og MB24-antistof f er. Monoklonale MB47-
og monoklonale MB24-antistoffer immunologisk bundet
til det fast fase-festede antigen, ble påvist under anvendelse av <125>I-merket geite-anti-muss-Ig og autoradiografi.
Felt A illustrerer at monoklonalt MB24 immunoreagerer med apo B-100 og apo B-48 fra VLDL (V) og chylomikroner (C). Felt B illustrerer at monoklonalt MB47 immunoreagerer med apo B-100 fra V og C, men ikke med apo B-48 fra enten V eller C. Felt C er en negativ kontroll som viser at et monoklonalt antistoff spesifikt for røde saueblodceller, ikke immunoreagerer med noe tilstedeværende antigen. Felt D er en annen negativ kontroll som viser at et immunorenset polyklonalt antiserum overfor fenyl-3-0-glucosid ikke gjenkjenner noen tilstedeværende antigener. Felt E er en positiv kontroll som viser at et immunorenset polyklonalt kaninantiserum mot humant LDL-apoprotein gjenkjenner både apo B-100 og apo B-48 i både V og C.
125
Figur 2 er en kurve som viser prosenten av I-merkede LDL-partikler bundet (ordinat) av økende molar-kcnsentrasjoner av monoklonalt antistoff MB47 (abscisse;
Ab-konsentrasjon (MoAb) i en væskefase-radioimmunobestemm-else (RIA).
LDL ble fremstilt fra oppsamlet plasma fra 10 personer (----) eller fra en normolipidemisk person ( Plasma ble erholdt ved plasmafarese av personer etter en ca. 12 timers fasteperiode.
Figur 3 er en stavkurve som viser graden av inhiber- ■ ing med antistoff MB47 (åpne staver: MB47) og overskudd
125
umerket humant LDL (skraverte staver: LDL) av I-human LDL-binding, internalisering og nedbrytning med dyrkede humane fibroblaster. Fibroblastmonolag ble dyrket i 35 ml brønner i DME inneholdende 10% kalvefosterserum.
Fibroblast-LDL-reseptorer ble stimulert ved ca.
24 timers preinkubering av fibroblastene med vekstmedium
inneholdende 2,5 milligram pr. milliliter (mg/ml) lipoprotein-fattig serum (LDS) (DME-LDS). DME-LDS inneholdende 2,5 mikrogram pr. milliliter (ug/ml) <125>I-LDL og enten 20% MB4 7 hybridom kultursupernatant (v/v) eller et 200-gangers overskudd av umerket LDL (sluttkonsentrasjon, 500 ug/ml) ble blandet og opprettholdt (inkubert) i ca. 16 timer ved 4°C før de ble anbragt på fibroblastmonolagene.
Bestemmelse av binding, internalisering og nedbrytning ble utført in triplo og er uttrykt som en prosent av kontrollverdiene som ble bestemt i fravær av monoklonalt antistoff MB47. Inhibering av spesifikk binding, internalisering og nedbrytning med monoklonalt" antistoff MB47 var sammenlignbar med den bevirket med et 200-gangers overskudd av umerket LDL.
Figur 4 inneholder to kurver som viser evnen til monovalente Fab-fragmenter av monoklonalt antistoff MB47 til å inhibere <125>I-human LDL-binding og nedbrytning med humane fibroblaster. Individuelle media inneholdende økende mengder
125 av MB47-Fab-fragmenter og en konstant mengde av I-LDL (2,5 pm/ml), ble blandet og opprettholdt (inkubert) i et tidsrom på ca. 15 timer ved 4°C før de ble anbragt på fibroblastmonolagene. Fab-konsentrasjonen er uttrykt som det molare forhold av Fab/LDL tilstedeværende i hvert medium (idet man antar en molekylvekt (MW) av Fab til å være
40.000 dalton og en molekylvekt av apo B til 550.000 dalton).
Binding og nedbrytning er uttrykt som prosenten av kontrollverdier i fravær av MB47-Fab-fragmenter. Alle bestemmelser ble utført in duplo. Overskudd av umerket LDL (sluttkonsentrasjon, 500 ug/ml) bevirket mere enn 95%
125
inhibering av I-LDL-binding (felt A) og nedbrytning
(felt B). Lignende resultater ble erholdt i tre studier
med forskjellige Fab-preparater av monoklonaltantistoff MB47.
Figur 5 inneholder to kurver. Kurve A illustrerer evnen av en kjent, konstant mengde av pepperrotperoxydase-merkede MB4 7- (HRPO-MB47) .antistoffer., til å immunoreagere med fast fase-festet reagens apo B-100 i nærvær av økende mengder MB24-antistoffer. Ordinaten er i relative optiske densitetsenheter, mens abscissen er i enheter på mikrogram pr. milliliter av umerket antistoffprotein tilsatt som (ug/ml) konkurrent.
En konstant mengde (20 ug) HRPO-koplet MB47-anti-- - stoff ble hovedsakelig samtidig blandet med økende mengder av umerkede MB47- (•) eller umerkede MB24- (A) antistoffer og fast fase-festet reagens apo B-100 (LDL). Blandingene ble opprettholdt i 3 timer ved 25°C som derved tillot antistoffene å immunologisk binde reagenset apo B-100 og danne en fast fase immunoreaktant. Mengden av fast fase-bundet, merket MB47 ble deretter bestemt som i den konkurrerende ELISA beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Kurve A illustrerer at nærvær av økende mengder umerkede MB47-antistoffer i immunoreaksjonsblandingen til-svarende reduserer mengden av merkede MB47-antistoffer bundet som fast fase immunoreaktant. Således konkurrerer umerket MB47 med merket MB47 med hensyn til LDL.
På den annen side illustrerer kurve A også at økende mengder av umerkede MB24-antistoffer ikke signifikant reduserer mengden av merket MB47 bundet som fast fase immunoreaktant. Således konkurrerer umerket MB24 ikke med merket MB47 med hensyn til binding til LDL.
Kurve B illustrerer at lignende resultater erholdes under anvendelse av HRPO-merkede MB24- antistoffer og umerkede MB47-antistoffer. MB47- og MB24-antistoffer- bindes derfor
til forskjellige epitoper som er tilstrekkelig separert på overflaten av apo B-100 slik at det tillates binding av
begge antistoffer til et enkelt apo B-100 molekyl uten
sterisk konkurrering med og inhibering av binding.
Figur 6 inneholder to kurver. Kurve A representerer 125
bindingen av I-merket B-47 til LDL i en fluidumfase RIA. Ordinaten er i enheter på femtomol (fmol) bundet, mens abscissen er i enheter på nanomol (nM) av tilblandet antistoff.
Immunorenset, monoklonalt antistoff MB47 ble jodert 125
med I under anvendelse av jodogenteknikken til en spesifikk aktivitet på 3000 slag pr. minutter pr. nanogram (cpm/ng). Etter grundig dialyse mot fosfatbufret saltvann (PBS) var over 95% av radioaktiviteten utfellbar med 10%
125
trikloreddiksyre (TCA). Mere enn 98% av I-MB47 ble bundet til en LDL-kolonne. Bestemmelser ble utført in triplo i 10x75 ml (mm) siliconbelagte glassrør. Økende konsentrasjoner av <125>I-MB47 i 0,1 ml kvegserumalbumin-barbital-(BSA-barbital) buffer (pH-verdi 8,0) ble tilsatt til 100 ng
oppsamlet, normolipidemisk, humant LDL fortynnet i 0,2 ml BSA-barbitalbuffer. Hvert rør inneholdt 182 fmol LDL apo B.
(idet man antok en molekylvekt for apo B på 550.000 dalton).
Etter inkubering (blanding og opprettholdelse) i
et tidsrom på 16 timer ved 4°C ble LDL kvantitativt utfelt med et lipoprotein-fattig kanin-antiserum spesifikt for humant LDL. [Bare den fraksjon av kanin-antiserumet som hadde en densitet (d) på mer enn 1,21 g/ml, ble anvendt fordi monoklonalt antistoff MB47 binder kanin-apolipoprotein
B].
Preliminære studier fastslo en konsentrasjon av delipidert kanin-antiserum som utfelte mer enn 9 8% av 100 ng 125 ... I-humant LDL. Etter tilsetning av kanin-antiserumet ble rørene inkubert i 16 timer ved 4°C.
Supernatantene ble fjernet, og pelletene ble vasket to ganger med 2 ml iskald barbitalbuffer (pH-verdi 8,0). Ikke-spesifikk binding og utfelling ble bestemt i to sett av parallelle rør. I det første sett ble ikke noe humant LDL tilsatt til begynnelsesinkuberingen, men samme mengde kanin-antistoff ble tilsatt. I det andre sett av rør ble ikke-immunt kaninserum (d større enn 1,21 mg/ml fraksjon) anvendt istedenfor det immune kaninserum-antistoff.
Begge metoder ga hovedsakelig identiske verdier for ikke-spesifikk binding som var lineær med økende konsentra-125
sjoner av I-MB47 monoklonalt antistoff, og var i alle tilfeller mindre enn 1% av de totalt tilsatte slag. Spesifikk I-MB47-binding til LDL ble erholdt ved å subtrahere den ikke-spesifikke binding fra den totale binding. Bind-ingsdatane ble analysert under anvendelse av et lineært regresjonsprogram for Scatchard-analyse av ligandbindings-systemer som ga et overslag over antistoffaffinitets-konstanten (Ka) og antistoff - eller epitopekonsentrasjonen.
Ka av <125>I-MB47 for LDL ble derved bestemt til å være 3,82x10 9 M -1. Ekstrapolering av linjen til en tilstand med uendelig antistoffoverskudd ga et overslag på
212 fmol (35 ng) av <125>I-MB47 bundet med 182 fmol (100 ng) LDL når molekylvekten av apo B antas å være 550.000 dalton.
Disse data er vist i kurve B i denne figur, hvori ordinaten er i enheter av forholdet av bundet (B) til fritt (F) (B/F)-antistoff, mens abscissen er i enheter av fmol bundet antistoff (fmol av MB47).
Figur 7 illustrerer korrelasjonen mellom mg LDL-cholesterol pr. desiliter (dl) av prøve bestemt ved Lipid Research Clinic Procedures, HEW-publikasjon nr. 75-628 (NIH), 2. utgave, Wash., D.C. Gov. Print. Off. (1974), og mg apo B-100 pr. dl prøve bestemt under anvendelse av den ikke-konkurrerende ELISA beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Korrelasjonskoeffisienten, r=0,89, bestemt ved Spearman Rank Correlation-testen for ikke-parametriske data [Sokal et al., Biometry, 2. utg., W. H. Freeman Co.,
San Fransisco, CA. 561-616 (1981)], indikerer en signifikant korrelasjon mellom nivåene av apo B-100 bestemt ved den her beskrevne ikke-konkurrerende ELISA og LDL-cholesterol-nivåene i 60 humane plasmaprøver. Figur 8 er lik figur 7 og illustrerer en signifikant korrelasjon, r=0,92, mellom nivåene av apo B-100 som bestemt ved en konkurrerende ELISA-metode og LDL-cholesterolnivåene i de samme 60 humane prøver. Figur 9 illustrerer den signifikante korrelasjon, r=0,92, som bestemt ved Spearman Rank Correlation-testen, mellom resultatene erholdt under anvendelse av ikke-konkurrerende ELISA (ordinat) og konkurrerende ELISA (abscisse) på de samme 60 humane prøver anvendt i figur 7
og 8.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I. Generell diskusjon
A. Definisjoner
Uttrykket "antistoff" angir et reseptormolekyl som er et medlem av en familie av glycosylerte proteiner kalt immunoglobuliner som kan spesifikt binde et antigen.
Et "antistoff-bindingssted" er den strukturelle
del av et antistoffmolekyl omfattet av tunge og lette kjede-
variable og hypervariable regioner som spesifikt binder antigen.
Ordet "antigen" har vært anvendt historisk for å betegne en enhet som bindes av et antistoff, og også for å betegne den enhet som fremkaller produksjon av antistoff. Nyere bruk begrenser betydningen av antigen til den enhet som bindes av et antistoff, mens "immunogen" anvendes for den enhet som fremkaller antistoffproduksjon. Hvor en enhet diskutert her både er immunogenisk og antigenisk, vil den generelt bli angitt som et antigen.
"Antigenisk determinant" angir den aktuelle strukturelle del av antigenet som immunologisk bindes av et antistoff-bindingssted. Uttrykket anvendes også om hverandre med "epitope".
Uttrykket "biologisk aktiv" angir i det minste evnen til spesifikt å binde ligand eller spesifikt bindingsmiddel selv om annen generell eller effektorevne også kan være til stede.
Ordet "kompleks" som anvendt her, angir det produkt som dannes når et spesifikt bindingsmiddel bindes til en målligand. Eksempler på komplekser er immunoreaktanter, protein A bundet til et antistoff og lignende.
"ELISA" angir en enzymkjedet immunosorbentbestemmelse som gjør bruk av et antistoff eller antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen eller enzym-antistoffkonjugat for å påvise og kvantifisere mengden av antigen eller antistoff tilstedeværende i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 22 i den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publications of Los Altos, CA,
i 1982, og i U.S. patentskrifter nr. 3.654.090; 3.850.752 og 4.016.043.
"Enzym" angir et protein som er i stand til å akselerere eller produsere ved en katalytisk virkning en viss forandring i et substrat for hvilket det ofte er spesifikt.
"Epitope" angir den del av et molekyl som spesifikt
gjenkjennes av et antistoff-bindingssted. Den kalles også determinant eller antigenisk determinant.
"Idiotoper" eller "idiotypiske determinanter" er antigeniske determinanter på de variable og hypervariable deler av et antistoffmolekyl som kan gjenkjennes av et bindingssted på andre antistoffer. Idiotoper er vanligvis oppdelt i to typer, de som er bindingssted-assosierte determinanter og de som er ikke-bindingssted-assosierte. Samlingen av idiotoper på et antistoffmolekyl utgjør dets idiotype. Det er antatt at et antistoff-bindingssted dannet av et hybridom, utviser et enkelt, unikt sett av idiotoper, dvs. en unik antistoff-bindingssted-idiotype.
"Immunoreaktant" som anvendt her, angir produktet av en immunologisk reaksjon, dvs. den enhet som produseres når en ligand immunologisk bindes av et reseptormolekyl.
En "immunoreaktant" er en bestemt type av "kompleks".
Ordet "isolert" som anvendt her i relasjon til reseptormolekyler, betyr at hovedsakelig bare én art av antistoff-bindingssted er til stede.
Uttrykkene "merkende middel", "indikerende gruppe" eller "merke" anvendes om hverandre for å innbefatte enkle atomer og molekyler som enten direkte eller indirekte er involvert i produksjo.nen av et påvisbart signal for å indikere nærvær av en immunoreaktant. Ethvert merkende middel kan kjedes til eller inkorporeres i en reseptor eller anvendes separat, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene eller i forbindelse med ytterligere reagenser. Slike indikerende grupper eller merker er i seg selv velkjente innen immunokjemi.
"Ligand" angir et molekyl som inneholder en struk-turell del som er bundet av en spesifikk reseptor, f.eks.
et antigen som er bundet av en reseptor.
Uttrykket "reseptor" anvendes her for å indikere et biologisk aktivt molekyl som immunologisk bindes til (eller med) et antigen. En slik binding finner typisk sted med en affinitet på IO<5> til IO<10> liter pr. mol (M_1) og er en spesifikk interaksjon av epitopen av antigenet med det antistoff-bindende sted av reseptoren.
Et reseptormolekyl ifølge oppfinnelsen er et hvilket som helst intakt antistoff, hovedsakelig intakt antistoff eller en polypeptiddel av et antistoff inneholdende et antistoff-bindingssted (f.eks. et Fab-fragment) slik som i ascites-væske eller vevdyrkningssupernatant.
Ordet "reseptor" anvendes også her for molekyler på celleoverflater som binder andre molekyler. Celleoverflate-reseptorer benevnes her alltid med navnet på den bundne enhet foran ordet "reseptor" for å unngå enhver tvetydighet. Et eksempel på celleoverflate-"reseptor" er den tidligere beskrevne LDL-reseptor.
Biologisk aktivitet av et reseptormolekyl vises ved den immunologiske reaksjon av reseptoren med dets antigeniske ligand ved blanding av disse i et vandig medium under dannelse av en immunoreaktant, i det minste ved fysiologiske pH-verdier og ionestyrker. Fortrinnsvis oppstår biologisk aktivitet under biologiske bestemmelsesbetingelser, dvs.-
de betingelser hvori reseptormolekylet ifølge oppfinnelsen bindes til den antigeniske ligand innen et pH-område på fra 5 til 9, ved ionestyrker slik som den av destillert vann til den av ca. en molar natriumklorid, og temperaturer på 4°C til 45°C. Alle de her beskrevne reseptormolekyler var biologisk aktive.
Polypeptiddeler inneholdende antistoff-bindingssted-idiotype (antistoffbindende steder) av antistoffer er de deler av antistoffmolekyler som inneholder bindingssted-idiotoper og bindes til liganden, og innbefatter Fab,
Fab', F (ab1) 2 0<? F (v)-deler av antistoffene. Fab- og F(ab<1>)2_deler av antistoffer er velkjente innen faget og fremstilles ved den proteolyttiske reaksjon av papain og pepsin på hovedsakelig intakte antistoffer ved velkjente metoder. Se eksempelvis U.S. patentskrift 4.342.566. Fab'-antistoffdeler er også velkjente og produseres fra Ffab'^-deler etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som kjeder de to tunge kjededeler slik som med mercaptoethanol, og alkylering av det resulterende proteinmercaptan med et reagens slik som jodacetamid. Intakte antistoffer er foretrukne og anvendes sammen med Fab-deler som illustra-tive eksempler på monoklonale reseptormolekyler ifølge oppfinnelsen.
Ordene "utskille" og "produsere" anvendes ofte om hverandre innen faget angående celler fra hvilke antistoffmolekyler . erholdes . Celler som produserer antistoffer, kan imidlertid ikke utskille disse molekyler inn i deres omgivelser. Hybridomacellene som her er av interesse, utskiller monoklonale antistoffer inn i deres omgivelser. Ikke desto mindre er slike celler ofte her angitt som "antistoff-produserende" celler, og deres antistoffer angis å være "produsert" i overensstemmelse med frasen angitt innen faget.
Uttrykket "spesifikt bindingsmiddel" som anvendt her, angir en molekylær enhet som er i stand til selektivt <■■. binde en ligand. Eksempler på spesifikke bindingsmidler er reseptorer, komplementfragmenter, protein A og lignende.
Uttrykket "hovedsakelig rent" som anvendt her i relasjon til reseptormolekyler, betyr at - innen påvisbare grenser - bare én art av antistoff-bindingssted er til stede som et effektivt bindingsmiddel for apo B-100. Selv om et hovedsakelig rent reseptormolekylpreparat således kan inneholde mer enn én art av antistoff-bindingssted, utviser et slikt preparat en enkel bindingsaffinitet for apo B-100. Eksempelvis inneholder vevkultursupernatanter produsert av et hybridom ifølge oppfinnelsen, typisk myelomaproteiner såvel som reseptorer ifølge oppfinnelsen. Et reseptormolekyl i hovedsakelig ren form betegnes typisk som et "monoklonalt antistoff" av fagmannen, fordi slike produseres under anvendelse av monoklonale hybridomkulturer.
Uttrykket "hovedsakelig samtidig" som anvendt her
i relasjon til blanding av 3 eller flere antigen-og reseptorkomponenter under dannelse av en immunoreaksjonsblanding, betyr at alle komponenter er til stede og blandet
i en enkel blanding innen 15 minutter, og fortrinnsvis innen 5 minutter etter blanding av to av komponentene.
B. Hybridomer og monoklonale antistoffer
Foreliggende oppfinnelse angår et hybridom med laboratoriebetegnelsen HL130C2.3C5 som produserer antistoffer som: (a) immunoreagerer med en bevart antigenisk determinant på apoprotein B-100; (b) konkurrerende inhiberer bindingen av apoprotein B-100 til LDL-reseptor; og (c) har en affinitetskonstant for LDL på ca.
3,82x10 9M -1i en væskefase, konkurrerende likevekts-radioimmunobestemmeIse (RIA). Disse reseptormolekyler angis vanligvis som MB47.
Foreliggende oppfinnelse angår også et hybridom
med laboratoriebetegnelsen V82A6.1G4 som produserer reseptormolekyler som immunoreagerer med en apoprotein B-100 antigenisk determinant og som har en affinitetskonstant for LDL på ca. 3,0x10 9 M -1 i fast fase r konkurrerende like-vekt —RIA. Disse reseptormolekyler angis vanligvis som MB24.
Hybridom HL130C2.3C5 og V82A6.1G4 ble deponert ved the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, den 6. mars 1985, under følgende ATCC deponeringsnummere:
De ovenfor angitte ATCC-deponeringer ble foretatt i henhold til "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Pur-poses of Patent Procedure".
Hybridomene ifølge oppfinnelsen ble dannet ved fusjon av en antistoff-produserende celle og en myeloma-cellelinje. Slike reseptorproduserende celler ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256, 495 (1975). Reseptorer erholdes typisk fra supernatantene av hybridoma-cellekulturer, fortrinnsvis monoklonale cellekulturer, eller alternativt fra ascitesvæske eller annen kroppsvæske erholdt fra ikke-humane, varmblodige vertsdyr, fortrinnsvis de som er histoforenlige eller immunoforlikte, i hvilke hybridomcellene ble innført og dyrket.
En annen utførelsesform omfatter en
cellekultur omfattende (a) et hybridom ifølge oppfinnelsen; (b) antistoffer som utskilles av det hybridom som immunoreagerer med apoprotein B-100; og (c) et dyrknings-medium for hybridomet. Anvendbare media for fremstilling av disse sammensetninger er både velkjente innen faget og kommersielt tilgjengelige, og innbefatter syntetiske dyrk-ningsmedia, innavlede mus og lignende. Et eksempel på syntetisk medium er Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. _8, 396 (1959)) supplert med 4,5 g/l glucose, 20 mm glutamin og 20% kalvefosterserum.
Et eksempel på en innavlet musestamme er Balb/c.
I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen antistoffene, betegnet som MB47 og MB24, som produseres av hybridomene betegnet som HB 8746 og HB 8742, og som immunoreagerer med apoprotein B-100. Således kan et antistoff ifølge oppfinnelsen fremstilles ved dyrkning i et egnet medium av et egnet hybridom ifølge oppfinnelsen og gjenvinn-ing, av reseptoren fra mediet.
Tidligere har Curtiss et al., J. Biol. Chem., 257, 15213 (1982), rapportert om produksjon og karakterisering av 11 apo B-spesifikke antistoffer innbefattende den betegnet MB24 produsert av hybridom HB 8742. Hybridom
HB 8742 ble erholdt, som beskrevet mer i detalj i avsnittet Materialer og metoder, ved fusjon av splenocytter fra mus immunisert med humant VLDL.
IgG-fraksjonen av MB24-holdig ascitesvæske utviklet fra intraperitoneal vekst av HB 8742, ble karakterisert ved isoelektrisk fokusering (IEF). Som angitt i Curtiss et al., supra, ble fusjonen utført med P3x63Ag8-mylelomaceller som utskiller et IgG^k immunoglobulin. Etter IEF utviste HB 8742 ascitesvæske derfor et unikt mønster av multiple proteinbånd som representerer vilkårlig blandede tung- og lett-kjede-holdige immunoglobulinmolekyler i tillegg til P3x63Ag8 myeloma IgG^k-antistoff og reseptor MB24.
Hybridom HB 8746 produserer MB47-antistoffer
og ble dannet ved fusjon av splenocytter fra mus immunisert med LDL og P3x63Ag8.653.1 myelomaceller. Denne variant av modermyelomaen utskiller ikke et myelomaprotein. IEF av HB 8746 ascitesvæske viser et unikt mønster av proteinbånd som representerer IgG2a tunge og kappa lettkjeder. Begge hybridomér ifølge oppfinnelsen kan således karakteriseres delvis ved IEF-mønsteret av de antistoffer de produserer.
Selv om V82A6.lG4-hybridomet ifølge oppfinnelsen produserer mer enn én type av reseptormolekyl, kan antistoffene ifølge oppfinnelsen lett identifiseres og isoleres ved deres individuelle evne til å immunoreagere med apo B-100 antigeniske determinanter. De antigeniske spesi-fisiteter av MB24 og MB47 ble undersøkt ved bestemmelse av deres individuelle evne til å immunoreagere med apoproteiner erholdt fra chylomikroner, VLDL, LDL og HDL i Western blot-bestemmelsen som beskrevet i det etterfølgende.
De således erholdte data, indikerte at MB47 og MB24 immunoreagerer med apo B-100 erholdt fra LDL, VLDL og chylomikroner, men ikke med apo B-48 fra VLDL eller chylomikroner. MB47 og MB24's evne til individuelt å immunoreagere med apo B-100 fra chylomikroner og VLDL er vist i figur 1.
1. Karakterisering av apo B- 100 antigenisk determinant, immunologisk bundet av MB47
Tidligere studier har demonstrert antigenisk heterogenitet i apo B-100. Dvs. at noen apo B-100-epitoper ikke uttrykkes av alle LDL-partikler. Blanding med et overskudd av visse monoklonale antistoffer i en fluidumfase-RIA resulterer således ikke i immunologisk binding av alle radio-
merkede LDL (<125>I-LDL)-partikler.
For å bestemme hvorvidt epitopen gjenkjent av MB47-antistoffene ble ensartet uttrykt av alt LDL, ble MB47's evne til immunologisk å bindes til <125>I-LDL i en fluidumfase-RIA undersøkt. LDL isolert fra oppsamlet plasma fra 10 normale personer og fra en enkelt normal person,
ble radiomerket som beskrevet i det etterfølgende og ble blandet med biologisk aktive MB47-antistoffer under dannelse av en immunoreaksjonsblanding. Blandingen ble opprettholdt under biologiske bestemmelsesbetingelser i en på forhånd bestemt tid tilstrekkelig for at MB47-antistoffene immunologisk kunne bindes til apo B i hver prøve og danne et immunoreaksjonsprodukt (immunoreaktant) .
125
Den maksimale mengde av I-LDL bundet av et overskudd av MB47-antistoffer, ble bestemt ved utfelling av alle antistoffer med IgSORB (The Enzyme Co.,
125
Boston, MA) og kvantifisering av <125> I-LDL-assosierte slag
i utfellingen i en gammateller. Resultatene, uttrykt som
125
en prosent av I-LDL utfelt med trikloreddiksyre (TCA)
125
og vist i figur 2, viser at hovedsakelig alt I-LDL var bundet av antistoff, hvilket indikerer at epitopen gjenkjent og bundet av MB47, er uttrykt av alle LDL-partikler.
2. Konkurrerende inhibering av bindingen av apo B-100 til LDL- reseptor av MB47
Apoprotein B-100 er hoved-apoprotein i humant LDL
og annet LDL fra pattedyr, og det formidler binding av LDL til fibroblast-LDL-reseptoren. Tidligere studier har skissert den sentrale rolle av LDL-reseptoren i pattedyr-lipoproteinmetabolismen. Det faktum at LDL-partikler isolert fra multiple, animalske arter bindes spesifikt til det humane LDL-reseptor-bindende område, viser at bindingsstedet på
apo B-100-molekylet må utviklingsmessig være bevart og således uttrykt av LDL-partikler fra alle dyrearter.
For å undersøke hvorvidt MB47- antistoffer immunoreagerer med en antigenisk determinant lokalisert innen LDL-reseptor-bindingsområdet av humant apo B-100, ble
MB47's evne til å inhibere binding av <1>25I-LDL til den. cellulære LDL-reseptor undersøkt. Dette ble utført ved blanding av MB47- antistof fer, i form av hele antistoff-125
molekyler, med I-LDL under dannelse av en immunoreaksjonsblanding. Immunoreaksjonsblandingen ble deretter opprettholdt under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at MB47-antistoffene fikk immunologisk binde tilstedeværende 125
I-LDL og danne en immunoreaktant.
Den immunoreaktant-holdige immunoreaksjonsblanding ble deretter lagt over humane fibroblaster som uttrykker fibroblast-LDL-reseptorer. Kulturene ble deretter opprettholdt i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at fibroblast-LDL-reseptorene spesifikt kunde binde ethvert LDL-reseptor-bindingssted tilgjengelig på <125>I<->LDL-MB47-immunoreaksjonsproduktet. Det antas at en slik cellulær reseptor-LDL-interaksjon inhiberes hvis antistoffer slik som eksemplifisert ved MB47, immunoreagerer med en apo B-100 antigenisk determinant hvis struktur også er involvert i LDL-reseptorbinding.
Resultatene av denne studie, vist i figur 3, indikerer at MB47- antistoffer inhiberte cellulære reseptor-formidlet binding, internalisering og nedbrytning
125
av humant I-LDL med humane fibroblaster i en grad som var sammenlignbar med den som bevirkes av et 200-gangers overskudd av umerket LDL.
For å undersøke muligheten for at MB47-antistoffer bindes til en epitope tilstøtende til apo B-reseptor-området, og grunnet deres størrelse, sterisk hindrer bindingen av apo B til LDL-reseptoren, ble Fab-fragmenter av MB47-antistoffmolekylers kapasitet til å inhibere humant LDL-opptak og nedbrytning også undersøkt ved den ovenfor beskrevne fibroblastbestemmelse.
Som vist i figur 4, blokkerte MB47-Fab-fragmenter signifikant spesifikk, cellulær binding og nedbrytning av LDL. Fordi MB47-Fab-fragmenter er betydelig mindre enn intakte MB47-antistoffmolekyler, er det antatt at den epitope som gjenkjennes av MB47-antistoff-bindingsstedet,
er inneholdt innen LDL-reseptor-bindingsområdet på LDL
apo B-100. Antistoff MB24 har ikke de samme egenskaper som antistoff MB47 og inhiberer ikke bindingen og nedbrytningen
125
av I-LDL med dyrkede fibroblaster.
3. Sterisk inhibering
For enkelte utførelsesformer av bestemmelses-metoden må første og andre antistoffer bindes til forskjellige epitoper av apo B-100-molekylet, og disse epitoper må være tilstrekkelig separert slik at bindingen av et antistoff ikke sterisk inhiberer bindingen av det andre antistoff. MB47 og MB24's evne til konkurrerende å inhibere den immunologiske binding av hverandre til et fast fase-festet apo B-100-reagens, ble derfor undersøkt.
Resultatene av denne studie, vist i figur 5, indikerer at et 70-gangers overskudd av umerket MB24 ikke signifikant inhiberte peroxydase-merket MB47 fra binding til apo B-100-reagens. På lignende måte inhiberte ikke et 70-gangers overskudd av umerket MB 47 signifikant peroxydase-merket MB24 fra å bindes til apo B-100-reagens. Således bindes MB24 og MB47 til forskjellige epitoper på apo B-100, og disse epitoper er tilstrekkelig separert slik at MB24
og MB47 som intakte antistoffer ikke inhiberer bindingen av hverandre til et enkelt apo B-100-molekyl.
4. Støkiometri og affinitet av MB47- binding til
apo B- 100
For å bestemme antall antigeniske determinantsteder pr. apo B-lOO-molekyl på LDL som ble gjenkjent av MB47-antistoffer, ble en antistoff-merket RIA anvendt. I
denne bestemmelse ble MB47-antistoffer renset (isolert)
fra ascitesvæske og ble radiomerket ( 125I-MB47) etter de velkjente metoder som er beskrevet mer i detalj i avsnittet Metoder og materialer.
125
Som vist i figur 6A, ble økende mengder av I-MB47 blandet med en bestemt mengde apo B-100 i form av LDL i separate reaksjonsblandinger. Blandingene ble opprettholdt under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd
125
bestemt tidsrom tilstrekkelig for at I-MB47-antistoffene fikk immunologisk bindes til apo B-100 (LDL) og danne en immunoreaktant. Nærvær av immunoreaktant ble deretter bestemt ved kvantitativ utfelling av LDL (bundet og fritt) under anvendelse av et kanin-antiserum som er spesifikt for humant LDL, og påvisning av mengden av <125>I-MB47 tilstedeværende som immunoreaktant ved gammatelling.
125
Den spesifikke immunologiske binding av I-MB47-antistoffer var mettbar som vist i figur 6A. En Scatchard-kurve av bindingsdataene erholdt i disse studier, var enn videre lineær (figur 6B), som antyder ensartethet av MB47-bindingssteder på LDL-partikler.
I tillegg ble den tilsynelatende affinitetskonstant (Ka) av MB47 for humant apo B-100 i form av LDL, bestemt ved antistoff-merket RIA, funnet å være 3,82x10 9 M—1 Scatchard-analyse viste at et maksimum på 212 fmol av
125
I-MB47-antistoff ble bundet til 182 fmol LDL, hvilket indikerer at bare ett MB47-molekyl bindes til hvert molekyl av apo B-100. Dvs. at MB47 bindes til en enkel, unik, antigenisk determinant på apo B-100.
Den midlere affinitetskonstant av MB47 for apo B-100 ble også bestemt ved den ovenfor beskrevne antigen-merkede RIA. I denne konkurrerende, likevekts-fluidumfase RIA ga umerket apo B-100 tilstedeværende som LDL, full fortreng-125
ning av I-LDL. Den beregnede affinitetskonstant av MB47-reseptormolekyler til stede som helt, intakt antistoff for
9 -1
LDL i denne bestemmelse, var 4x10 M , hvilket var i god overensstemmelse med den Ka som ble bestemt ved den ovenfor beskrevne antistoff-merkede bestemmelse.
C. Bestemme1sesmetoder
Antistoffene ifølge oppfinnelsen er særlig anvendbare for bestemmelse av nærvær og mengde av apoprotein B-100 i en kroppsvæskeprøve slik som blod, serum
eller plasma.
I en utførelsesform omfatter en metode for bestemmelse av en kroppsprøve med hensyn til mengden av apoprotein B-100, følgende trinn: (a) Tilveiebringelse av en kroppsprøve som skal bestemmes. Typisk tilveiebringes en slik prøve som en opp-målt mengde eller en kjent mengde av blod og fortrinnsvis plasma eller serum. Metoder for tilveiebringelse av blod-prøver, plasma og serum, er velkjente innen faget og vil ikke bli ytterligere diskutert her. (b) Tilveiebringelse av antistoffer i biologisk aktiv form som (i) immunoreagerer med apoprotein B-100 og (ii) utskilles av enten hybridomet med ATCC deponeringsnr.
HB 8746 eller hybridomet med ATDD deponeringsnr. HB 8742,
og tilstedeværende i en mengde som er effektiv for utførelse av bestemmelsen.
I foretrukne utførelsesformer er antistoffet et intakt antistoff eller et Fab-fragment.
Den effektive mengde av antistoffer kan avvike
bl.a. med den bestemte bestemmeIsesmetode som anvendes, hvilket er velkjent. Også velkjent er den enkelhet med hvilken den effektive mengde kan bestemmes under anvendelse av standard laboratorieteknikker av fagmannen.
(c) Blanding av kroppsvæskeprøven med anti-
stoffene fra trinn (b) under dannelse av en immuno-reaks jonsblanding.
(d) Blandingen opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom fra minutter til timer slik som ca. 10 minutter, til biologiske bestemmelser i en på forhånd bestemt tid på 16-20 timer som er tilstrekkelig for at antistoff-bindingsstedene av antistoffene kan immunologisk binde apoprotein B-100
i kroppsprøven og danne en immunoreaktant (første kompleks). Biologiske bestemmelsesbetingelser er de som opprettholder den biologiske aktivitet av antistoffene ifølge oppfinnelsen, og innbefatter et temperaturområde på fra 4°C til 45°C, et pH-verdiområde på fra 5 til 9, og en ionestyrke varierende fra den av destillert vann til den av ca. 1 molar
natriumklorid. Metoder for optimalisering av slike betingelser er velkjente innen faget.' (e) Mengden av enhver immunoreaktant som dannes, bestemmes, og derved mengden av apo B-100 tilstedeværende i prøven.
I foretrukne utførelsesformer prepareres kropps-væskeprøven fra trinn (a) ytterligere for bestemmelse i henhold til trinn (e) ved følgende trinn: (f) Tilveiebringelse av biologisk aktive andre antistoffer utskilt av den gjenværende av det ene eller andre hybridom i trinn (b); (g) Blanding av en på forhånd bestemt mengde av de andre antistoffer med kroppsvæskeprøven under dannelse av en immunoreaksjonsblanding. (h) Opprettholdelse av den andre antistoff/kropps-væskeprøve-blanding på en lignende måte med den som er beskrevet i trinn (d) under dannelse av en sammensatt immunoreaktant (andre kompleks) som inneholder ett MB47-molekyl og ett MB24-molekyl immunologisk bundet til ett apo B-100-molekyl.
De ovenfor beskrevne, generelle bestemmelsesmetoder kan utføres, hvilket er velkjent innen faget, under anvendelse av et utall av forskjellige formater. Mens således de mere spesifikke bestemmelsesmetoder som er beskrevet i det etterfølgende gjør bruk av fast fase-formater, er oppfinnelsen ikke begrenset til slike.
Fast fasé-bestemmelsesformater kan utføres under anvendelse av enten antistoffer eller antigen festet til en fast rnatriks under dannelse av en fast bærer. De ut-førelsesf ormer hvori den faste bærer inneholder antistoffet fra trinn (b), er blandingen ifølge trinn (c) en fast/væske-faseblanding, og immunoreaktanten ifølge trinn (d) er en fast fase-immunoreaktant inneholdende apo B-100 kroppsprøve.
I de utførelsesformer hvori den faste bærer inneholder apo B-100-reagens, er blandingen fra trinn (c) også en fast/væskeblanding, men immunoreaktanten inneholdende apo B-100-kroppsprøve fra trinn (d), er en væskefase-immunoreaktant. Apo B-100-reagens er biologisk aktivt, dvs. antigenisk apo B-100 som er tilveiebragt fra en kilde som er forskjellig fra den som skal bestemmes, typisk i form av isolert LDL.
Bestemmelse av mengden av apo B-100 bundet som immunoreaktant i trinn (d), kan utføres, direkte eller indirekte, ved bestemmelsesteknikker velkjente innen faget. Eksempelvis kan homogene bestemmelsessystemer slik som de
som er beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 4.536.479, 4.233.401, 4.233.402 og 3.996.345, anvendes.
I foretrukne fast fase-utførelsesformer prepareres kroppsvæsken ytterligere for bestemmelse ved anvendelse av et merket, spesifikt bindingsmiddel. Typen og spesifisiteten av det merkede spesifikke bindingsmiddel avhenger av den anvendte metode og format, hvilket er velkjent innen faget.
I foretrukne fast fase-utførelsesformer hvori den faste bærer inneholder et antistoff fra trinn (b), dvs. et antistoff ifølge oppfinnelsen, fremstilles mengden av fast fase-bundet apo B-100 for bestemmelsen etter følgende trinn: (i) Tilveiebringelse av biologisk aktive merkede andre antistoffer som bindes til apoprotein B-100 tilstedeværende i kroppsprøven under dannelse av en immunoreaktant. Markøren av det merkede andre antistoff er i stand til å signalisere nærvær av det merkede andre antistoff i en immunoreaktant.
I særlig foretrukne utførelsesformer immunoreagerer de merkede andre antistoffer med en andre apo B-100-
epitope som er forskjellig fra den epitope med hvilken
fast fase- anstistoffene reagerer, og inhiberer hovedsakelig ikke fast fase- antistoffene fra å reagere med
apo B-100. Fortrinnsvis er de merkede andre anti-
stoffer de som utskilles av den gjenværende av det ene eller andre hybridom fra trinn (b), dvs. de beskrevne antistoffer som ikke ble valgt som første antistoffer.
Metoder for bestemmelse av hvorvidt et "anti-
stoff vil inhibere (interferere med) den immunologiske
binding til det samme antigen av det annet antistoff,
er velkjent innen faget og er beskrevet mer i detalj i det etterfølgende.
(j) Blanding av en på forhånd bestemt mengde av de merkede andre antistoffer med kroppsvæskeprøven under dannelse av en immunoreaksjonsblanding.
Den således dannede blanding kan være en væskebland-ing slik som når trinn (i) utføres før trinn (b), eller den kan være en fast/væskeblanding når det merkede andre antistoff blandes hovedsakelig samtidig med eller etter trinn (b). Når trinn (i) utføres før eller hovedsakelig samtidig med trinn (b), immunoreagerer de merkede andre antistoffer - med en andre apo B-100-epitope som er forskjellig fra den epitope med hvilken fast fase-anti-
stoffene reagerer og inhiberer hovedsakelig ikke de fast fase-bundne antistoffer fra å immunoreagere med apo B-100.
I foretrukne utførelsesformer utføres trinn (i) hovedsakelig samtidig med trinn (b) eller etter trinn (c).
(k) Den således dannede, merkede andre antistoff/ kroppsvæskeprøveblanding opprettholdes på en lignende måte som den som er beskrevet i trinn (d), under dannelse av en immunoreaktant.
De fast fase-bundne antistoffer og andre
antistoffer, bindes således immunologisk til apo B-100 tilstedeværende i kroppsvæskeprøven og danner derved en fast fase-bundet sammensatt immunoreaktant som inneholder markør bundet som en del derav. Dvs. at en fast fase-sammensatt immunoreaktant som inneholder en markør, dannes når et molekyl apo B-100 immunoreagerer med både et fast fase-bundet antistoff og et merket andre anti-
stoff. I foretrukne utførelsesformer separeres ethvert merket andre antistoff som ikke danner en del av den fast fase-bundne immunoreaktant (dvs. de som ikke immunologisk bindes til apo B-100 som i seg selv bindes til fast fase-antistoffer) fra immunoreaktanten, fortrinnsvis ved vasking, før bestemmelse med hensyn til mengden av merket
andre antistoff tilstedeværende som immunoreaktant.
Bestemmelse av mengden av immunoreaktant dannet i henhold til trinn (e), utføres ved bestemmelse av mengden av merket andre antistoff bundet som en del av den immunoreaktant som inneholder apo B-100. Dette gir en direkte bestemmelse av mengden av apo B-100 i prøven. Denne mengde kan være null, og derved indikere at ikke noe apo B-100 er til stede i prøven, innen de grenser som kan påvises.
Metoder for bestemmelse av mengden av et merket andre antistoff avhenger av den markør som anvendes, og slike mar-kører og bestemmelsesmetoder er velkjente innen faget.
I foretrukne fast fase-utførelsesformer hvori den faste bærer inneholder apo B-100-reagens, fremstilles mengden av immunoreaktant dannet i trinn (d) for bestemmelsen, etter følgende trinn: (1) Blanding av et biologisk aktivt merket, spesifikt bindingsmiddel, fortrinnsvis et antistoff, som bindes til ethvert antistoff anvendt i trinn (b) tilstedeværende som fast fase-immunoreaktant, under dannelse av et kompleks, fortrinnsvis en andre immunoreaktant. Markøren av det merkede, spesifikke bindingsmiddel er i stand til å signalisere nærvær av merket, spesifikt bindingsmiddel i et kompleks. I foretrukne utførelsesformer av disse bestemm-elsestyper utføres trinn (i)-(k) etter trinn (d). (m) Blanding av en på forhånd bestemt mengde av det merkede, spesifikke bindingsmiddel med kroppsvæskeprøve under dannelse av en reaksjonsblanding, fortrinnsvis en immunoreaksjonsblanding.
(n) Det således dannede, merkede, spesifikke bindingsmiddel/ første immunoreaktantblanding opprettholdes på lignende måte som beskrevet i trinn (d), under dannelse av et kompleks.
Det således dannede fast fase-kompleks inneholder markøren bundet som en del derav. I foretrukne utførelses-former separeres ethvert merket, spesifikt bindingsmiddel som ikke er bundet som en del av fast fase-komplekset fra komplekset, fortrinnsvis ved vasking, før bestemmelse med hensyn til nærvær av fast fase-bundet markør.
Bestemmelse av mengden av immunoreaktant dannet i henhold til trinn (e), utføres ved bestemmelse av mengden av tilstedeværende markør som en del av komplekset. Dette gir en indirekte bestemmelse av mengden av apo B-100 tilstedeværende i prøven.
Merking av proteinaktige antigener og spesifikke bindingsmidler er velkjente innen faget. Eksempelvis kan antistoffer produsert av hybridomer, merkes ved metabolisk inkorporering av radioisotop-holdige aminosyrer tilveiebragt som en komponent i vevdyrkningsmediet. Se f.eks. Galfré et al., Meth. Enzymol. 73.' 3-46 (1981).
Teknikkene med proteinkonjugering eller kopling gjennom aktiverte, funksjonelle grupper er særlig anvendbare og resulterer i en markør som er covalent bundet til antigen eller spesifikt bindingsmiddel. Se f.eks. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol. vol. 8, suppl. 1_, 7-23 (1978) og U.S. patentskrift 4.493.795. I tillegg kan sted-rettet koplings-reaksjon utføres slik at markøren ikke i vesentlig grad interfererer med den biologiske aktivitet av et antigen eller antistoff, se f.eks. Rodwell et al., Biotech. _3* 889-894 (1985).
Markørene kan være et fluorescent markeringsmiddel som kjemisk bindes til antistoffer eller antigener uten å denaturere disse, under dannelse av et fluorokrom (farge-stoff) som er et anvendbart immunofluorescent sporstoff. Egnede fluorescente markeringsmidler er fluorokromer slik som fluorescein-isocyanat (FIC), fluorescein-isothiocyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-nafthalensulfonylklorid (DANSC), tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200 sulfonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunofluorescensanalyseteknikker finnes i DeLuca, "Immunofluorescence Analysis" i Antibody As A Tool, Marchalonis et al., red. J. Wiley & Sons, Ltd.,
s. 189-231, 1982.
I foretrukne utførelsesformer er den indikerende gruppe et enzym slik som pepperrotperoxydase (HRPO), glucoseoxydase eller lignende. Hvor den prinsipale, indikerende gruppe er et enzym slik som HRPO eller glucoseoxydase, er ytterligere reagenser nødvendige for å visualisere det faktum at et reseptor-ligandkompleks (immunoreaktant) er blitt dannet. Slike ytterligere reagenser for HRPO innbefatter hydrogenperoxyd og en oxydasjons-fargeforløper slik som diaminobenzidin. Et ytterligere reagens som er anvendbart med-glucoseoxydase, er 2,2<1->azino-di-(3-ethyl-benz-thiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).
Radioaktive elementer er også anvendbare markeringsmidler og anvendes eksempelvis her.
Et eksempel på et radiomarkeringsmiddel er et radioaktivt element som produserer gammastråleemisjoner. Elementer som i seg selv utstråler gammastråler, slik som ^ I, ^1,
128 131 132 51
I, I, I og Cr, representerer en klasse av gamma-stråleemis jons-produserende , radioaktivt element-indikerende
125
grupper. Særlig foretrukket er I. En annen gruppe av anvendbare indikerende grupper er slike elementer som ^C,
I o "I C "I *3
F, 0 og N som i seg selv utstråler positroner. De således utstrålte positroner produserer gammastråler når de støter på elektroner tilstedeværende i dyrets legeme. Også anvendbar er en beta-utstråler slik som indium.
Bestemmelsesmetodene og systemene ifølge oppfinnelsen kan således anvende eller være omfattet av et antistoff ifølge oppfinnelsen festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer.
Antigenet eller antistoffet bindes typisk til den faste matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium selv om flere adsorpsjonsmetoder, såvel som andre festemetoder velkjente innen faget, kan anvendes. Eksempler på slike metoder er omsetning av antistoffet eller antigenet med den reaktive carboxylfunksjonalitet dannet ved omsetning av cyanogenbromid med glucose-holdige matriser slik som tverrbundet dextrose eller cellulose, glutaraldehyd,
som diskutert i det etterfølgende i forbindelse med latex-partikler og lignende.
Anvendbare, faste matriser er velkjent innen faget.
Slike materialer innbefatter tverrbundet dextran tilgjengelig under varemerket Sephadex<®>, agarose, kuler av polystyren med en diameter på 1 mikron til 5 mm, polyvinylklorid, polystyren, tverrbundet polyacrylamid, nitrocellulose eller nylonbaserte materialer slik som plater, remser eller puter, eller rør, plater eller brønner av en mikrotiterplate slik som de som fremstilles fra polystyren eller polyvinylklorid.
Latéxpartikler som er anvendbare ved ågglutinering-typebestemmelser, er også anvendbare faste matriser. Slike materialer er beskrevet som carboxy-funksjonelle partikler dispergert i en anionisk såpe. Typiske prøver av slike partikler har en midlere diameter på 0,308 mikrometer (u)
og har en midlere carboxy-funksjonell gruppefordeling på
15 til 30 kvadrat Ångstrom pr. carboxygruppe.
Før bruk omsettes partiklene med et diamin slik som 1,3-diamino-2-propanol, under dannelse av et flertall av amidbindinger med partikkelcarboxygruppene mens fri amingrupper opprettholdes. De fri amingrupper omsettes deretter med et dialdehyd slik som glutaraldehyd, og antistoffet eller antigenet under dannelse av Schiff-base-reaksjonsprod-ukter. Schiff-base-reaksjonsproduktene reduseres deretter med et vannløselig reduksjonsmiddel slik som natriumbor-hydrid under dannelse av en anvendbar, fast bærer.
Fagmannen vil forstå at det er utallige metoder for fast fase-immunobestemmelser som kan anvendes her. Eksempler på anvendbare fast fase-bestemmelser innbefatter multiple enzym-immunobestemmelsesteknikker (EMIT) og fluor-escens-immunbestemmelser (FIA) i tillegg til de spesifikt diskuterte RIA- og ELISA-teknikker. Imidlertid betraktes enhver metode som resulterer i en påvisbar reaksjon mellom apoprotein B-100 og antistoffer ifølge oppfinnelsen, som en del av oppfinnelsen. Hver av disse bestemmelsesmetoder kan anvende enkle eller doble antistoffteknikker hvori et indikerende middel anvendes for å signalisere immunreaksjonen og derved bindingen av ethvert apoprotein B-100 som skal undersøkes med en reseptor ifølge oppfinnelsen. Eksempler på teknikker kan finnes forklart i Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981); og i
Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press,
New York, NY (19 80).
En utførelsesform av en spesifikk metode for bestemmelse av en kroppsvæskeprøve med hensyn til apo B-100 under anvendelse av et fast fase-festet antistoff ifølge oppfinnelsen er en ikke-konkurrerende ELISA hvori immuno-reaks jonene utføres sekvensvis. I en slik bestemmelse festes en aliquot av MB47-antistoffer, eksempelvis generelt 1 til 500 ug, til de indre vegger av en mikrotiterbrønn under dannelse av en fast bærer.
Ethvert apo B-100 tilstedeværende i den tilveiebragte kroppsprøve, immunoreageres deretter med de fast fase-festede antistoffer. Dette utføres ved blanding av en kjent mengde, f.eks. 10 til 200 mikroliter (ml) av prøve (som kan fortynnes på forhånd) slik som serum eller plasma i mikro-titerbrønnen med de fast fase-festede antistoffer under dannelse av en fast/væskefaseblanding. Blandingen opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at ethvert apo B-100 tilstedeværende i prøven, kan immunologisk bindes til antistoffene og danne en fast fase-immunoreaktant. De faste og væskeformige faser separeres deretter, og den faste fase skylles typisk for å sikre fjerning av ikke-spesifikt bundne materialer.
Apo B-100 tilstedeværende som fast fase-immunoreaktant (dvs. apo B-100 bundet til fast fase-festede MB47-antistoffer) immunoreageres deretter med enzym-merkede andre reseptormolekyler. Dette utføres ved blanding av en på forhånd bestemt mengde, f.eks. 0,1 til 10 ug av enzym-merkede andre reseptormolekyler i vandig bufferløsning, fortrinnsvis pepperrotperoxydase (HRPO)-merkede MB24-reseptorer, under dannelse av en andre fast/væskeblanding. Den andre blanding opprettholdes som beskrevet ovenfor, under dannelse av en fast fase-immunoreaktant-"sammensetning" bestående av MB4 7-antistoff, apo B-100 og enzym-merkede MB24-antistof f er.
Etter separering av væskefasen fra den faste fase som tidligere beskrevet, blandes en aliquot av kromogent substrat slik som o-fenylendiamin (OPD) for HRPO i mikro-titerbrønnen inneholdende fast fase-immunoreaktanten under dannelse av en tredje fast/væskeblanding. Denne blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at ethvert enzym tilstedeværende som immunoreaktant, omdanner en pro-porsjonal mengde av substrat til et farget produkt. Den optiske densitet av den resulterende, fargede løsning måles deretter og sammenlignes med resultater erholdt under anvendelse av løsninger inneholdende kjente mengder av apo B-100-reagens.
Evnen til den ikke-konkurrerende sekvensvise ELISA som ovenfor beskrevet, og beskrevet mere i detalj i avsnittet Materialer og metoder, til å påvise apo B-100 i en kroppsvæskeprøve, ble undersøkt. I disse studier tjener aliquoter av lipoproteinfattig, humant plasma (LDP) til hvilke det var blandet kjente mengder av apo B-100-reagens, som kontroll-kroppsvæskeprøver.
Resultatene av denne studie, vist i tabell 1, viser at.den ovenfor beskrevne metode nøyaktig kan bestemme klinisk relevante mengder av apo B-100 tilstedeværende i en kroppsvæskeprøve.
En annen utførelsesform av en spesifikk metode for bestemmelse av en kroppsvæskeprøve med hensyn til apo B-100 er en ikke-konkurrerende ELISA hvori immunoreaksjonene utføres hovedsakelig samtidig. Til den ovenfor beskrevne mikroriterbrønn inneholdende fast fase-festede MB47-antistoffer, blandes hovedsakelig samtidig den tilveiebragte kroppsprøve og enzym-merkede andre reseptorer som immunoreagerer med en andre apo B-100-epitope og inhiberer ikke hovedsakelig bindingen av MB47-antistoffer til apo B-100. Slike enzym-merkede andre reseptorer er fortrinnsvis MB24-antistoffer.
Den resulterende faste/væskeblanding opprettholdes deretter, separeres, og mengden av tilstedeværende enzym som en del av den fast fase-bundne immunoreaktantsammensetning bestemmes som tidligere beskrevet.
Den ovenfor beskrevne ikke-konkurrerende ELISA ble anvendt for å undersøke apo B-100-innholdet i plasma fra 20 pasienter med koronar arteriesykdom (CAD), 20 pasienter
med familiær hypercholesterolemia og 20 normale personer.
Som vist i etterfølgende tabell 2, ble det midlere plasma
apo B-100-nivå av normale personer bestemt til å være 85 milligram/desiliter (mg/dl) med et 2 standard awiksområde på 21 mg/dl. Denne verdi er i nær overensstemmelse med det normale område av apo B-100-verdier som er rapportert av Curry et al., Clin. Chem. 24, 280-286 (1987) og Rosseneu et al., Clin. Chem. 28.' 427-433 (1983), hver under anvendelse av forskjellige immunobestemmelser.
Plasma apo B-100-nivåer i pasienter med CAD og hypercholesterolemia var enn videre høyere enn den øvre grense av det 2 standard awiksområde som finnes for normale." Lignende resultater under anvendelse av andre teknikker
for CAD og hypercholesterolemia-pasienter er blitt rapportert av Sniderman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77,
604-608 (1980) og Lipid Resarch Council, JAMA 251, 351-364
(1984).
Effekten av fortynning av kroppsvæskeprøven før bestemmelse med hensyn til apo B-100 ved en ikke-konkurrerende samtidig ELISA-metode ble også undersøkt. Disse resultater, vist i etterfølgende tabell 3, indikerer at det ikke var noen signifikant forskjell i apo B-100-nivåene bestemt over et 5-dobbelt område av plasmafortynninger, dvs. 1:1000 til 1:5000.
Korrelasjon mellom LDL-cholesterol og plasma
apo B-100-nivåer som bestemt ved en ikke-konkurrerende ELISA for de ovenfor beskrevne, normale prøver og pasient-prøvene, er vist i figur 7. Korrelasjonskoeffisienten på 0,89 er lik den som er rapportert av Albers et al., Metabolism 24, 1339-1351 (1975) og Slater et al., Clin. Chem. 31, 841-845 (1985).
Utførelsesformer av bestemmelsesmetodéne
under anvendelse av en fast bærer inneholdende apo B-100-reagens festet til en fast matriks, ble utført under anvendelse av følgende trinn:
(a) En kroppsvæskeprøve inneholdende apo B-100,
ble tilveiebragt som ovenfor beskrevet.
(b) Hovedsakelig samtidig blanding av
(1) væskeprøven; (2) en på forhånd bestemt mengde av enten MB24-eller MB47- antistoffer; og (e) en på forhånd bestemt mengde av fast fase-festet apo B-100-reagens under dannelse av en væske/fast fase-immunoreaksjonsblanding.
Blandingen opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrom tilstrekkelig for at antistoff-bindingssteder av reseptormolekylene får immunoreagere med (immunologisk bindes til) enten apo B-100-reagenset eller ethvert apo B-100 tilstedeværende i kroppsvæskeprøven. antistoffene som immunologisk binder apo B-100 tilstedeværende i kroppsprøven, danner en væskefase-immunoreaktant, og de som binder det fast fase-festede apo B-100-reagens, danner en fast fase-immunoreaktant. (c) Nærvær av den fast fase-festede immunoreaktant bestemmes deretter, og mengden av apo B-100 tilstedeværende i prøven, bestemmes deretter ved sammenligning av graden av binding som utvises av en kjent mengde MB47 eller MB24 blandet med lignende fast fase-festet apo B-100 som diskutert i det etterfølgende. Fortrinnsvis utføres immuno-reaktantbestemmelsen etter at væskefase-immunoreaktanten og fast fase-immunoreaktanten fra trinn (b) er separert, slik som ved vasking. Mengden av apo B-100-prøve bundet som væskefase-immunoreaktant, kan bestemmes slik som ved anvendelse av merkede antistoffer som immunoreagerer med antistoffene ifølge oppfinnelsen, slik som peroxydase-kjedet geite-anti-mus lg, eller som ellers beskrevet her.
I en særlig foretrukket utførelsesform av konkurr-eringsbestemmelsen festes 1 ug til 10 ug av apo B-100-reagens til en fast matriks, fortrinnsvis veggene av en mikrotiterbrønn, under dannelse av en fast bærer. Ethvert ikke-spesifikt bindingssted på den faste bærer blokkeres typisk med et protein slik som BSA eller lignende.
En på forhånd bestemt mengde av antistoffer
ifølge oppfinnelsen, f.eks. generelt 0,1 ug til 10 ug, immunoreageres hovedsakelig samtidig med det fast fase-festede apo B-100-reagens og ethvert apo B-100 tilstedeværende i en kroppsvæskeprøve (som kan være fortynnet) slik som serum eller plasma. Dette utføres ved hovedsakelig samtidig blanding av en aliquot av prøve og ansti-
stoffene i mikrotiterbrønnen inneholdende fast fase-festet apo B-100-reagens.
Den således dannede, faste/væskeblanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrom tilstrekkelig til at de tilstedeværende antistoff ex-
får immunologisk binde tilstedeværende apo B-100. Den faste fasen og væskefasen separeres deretter fortrinnsvis slik som ved vasking, og den faste fase skylles typisk for å sikre fjerning av ikke-spesifikt bundne materialer.
Nærvær av fast fase-bundne immunoreaktanter bestemmes deretter typisk under anvendelse av merkede antistoffer som immunologisk binder antistoffene ifølge oppfinn=
eisen, slik som peroxydase-merket geite-anti-muse-IgG.
I den konkurrerende ELISA konkurrerer apo B-100 tilstedeværende i pasientprøven med en konstant, kjent mengde av apo B-100-reagens med hensyn til et konstant, kjent antall reseptormolekyl-antistoff-bindingssteder i immunoreaksjonsblandingen. Konkurransen tilveiebragt av apo B-100-prøven, resulterer i en reduksjon av påvisbar fast fase-bundet immunoreaktant, og jo større reduksjonen er, jo større er mengden av apo B-100 tilstedeværende i den kroppsvæske som undersøkes.
For å oppnå relative mengder av apo B-100 tilstedeværende i pasientplasmaer, ble resultater erholdt under anvendelse av apo B-100 tilstedeværende i pasientplasma som konkurrenter, sammenlignet med resultater erholdt under anvendelse av konkurrerende standarder inneholdende kjente mengder av apo B-100-reagens. En standardkurve ble fremstilt under anvendelse av LDL-konsentrasjoner varierende fra 32 mg/ml til 0,25 mg/ml.
Den ovenfor beskrevne, konkurrerende ELISA ble anvendt for å undersøke de samme normale prøver og pasient-prøver vurdert ved ikke-konkurrerende ELISA. Disse resultater, som også er vist i tabell 2, er i nær overensstemmelse med de resultater erholdt ved den ikke-konkurrerende bestemmelse.
Effekten av fortynning av kroppsvæskeprøven før bestemmelsen med hensyn til apo B i den ovenfor beskrevne, konkurrerende ELISA, ble undersøkt. Disse resultater,
vist i tabell 4, viser ingen signifikant forskjell i apo B-nivåene bestemt over et 4-dobbelt område av plasmafortynninger, dvs. 1:100 til 1:400.
Korrelasjon mellom LDL-cholesterol og plasma-
apo B-nivåer som bestemt ved den konkurrerende ELISA med hensyn til normale prøver og pasientprøver beskrevet ovenfor, er vist i figur 8. Korrelasjonskoeffisienten på 0,92 er lik den som er rapportert av Albers et al., Metabolism, 24, 1339-1351 (1975) og Slater et al., Clin. Chem., 31, 841-845 (1985), som således indikerer at den konkurrerende ELISA nøyaktig forutsier sirkulerende LDL-cholesterolnivåer.
Korrelasjonen mellom apo B-100-nivåer erholdt under anvendelse av den konkurrerende og ikke-konkurrerende ELISA, ble bestemt. Som vist i figur 9, var det en høy korrelasjon (r=0,92) mellom resultatene erholdt i .hver bestemmelse.
Et diagnostisk system, fortrinnsvis i form av et sett, som er anvendbart for utførelse av de ovenfor angitte bestemmelsesmetoder, innbefatter, i separate pakker, (a) et første spesifikt bindingsmiddel hvori angitte middel er (i) et antistoff som immunoreagerer med apo B-100 og er valgt fra antistoffet utskilt av hybridomet HB 8746 (MB47) eller antistoffet utskilt av hybridomet HB 8742, (MB24) og (b) et merket andre spesifikt bindingsmiddel for signalisering av immunoreaksjonen mellom angitte første bindingsmiddel med apo B-100. Fortrinnsvis er det merkede, spesifikke bindingsmiddel et antistoff kjedet til.et enzym. Fortrinnsvis er det merkede middel den gjenværende av det ene eller andre antistoff fra (a) , kjedet til et enzym.
I foretrukne utførelsesformer innbefatter systemet ytterligere en annen beholder med apo B-100-reagens for anvendelse som kontroll og/eller målantigen. Også foretrukket er utførelsesformer hvori systemet innbefatter en fast matriks til hvilken det første spesifikke bindingsmiddel eller apo B-100-reagens er festet under dannelse av en fast bærer. Anvendbare faste matriser er allerede beskrevet. Fortrinnsvis er imidlertid den faste matriks brønnen av en mikrotiterplate.
Kjente mengder av de spesifikke bindingsmidler tilveiebringes. Disse mengder er minst tilstrekkelige til å utføre en bestemmelse. De tilveiebragte, spesifikke bindingsmidler tilføres typisk i en form og mengde som er beregnet på å bli fortynnet til et foreskrevet volum med vann, saltvann eller en buffer slik som fosfatbufret saltvann ved pH 7,3-7,5.
Ytterligere pakker kan også være innbefattet i systemet. Slike pakker kan inneholde (i) buffersalter i tørr eller væskeform, (ii) enzymsubstrater slik som o-fenylendiamin og lignende.
Eksempler på pakker innbefatter glass og plast slik som polyethylen og polypropylenflasker eller ampuller;, plast, plast-metallfolie, plast-metallfolie-jiapirkonvolutter og lignende. De spesifikke bindingsmidler kan forpakkes i en vandig væskeform slik som i ascites eller buffer, men fortrinnsvis tilføres de i tørket form slik som den som erholdes ved lyofilisering.
D. Affinitetssorbanter
En affinitetssorbant, fortrinnsvis steril, omfatter et biologisk aktivt antistoff ifølge oppfinnelsen festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer. Den faste matriks er fortrinnsvis i partikkelform. Slike affinitets-sorbenter er anvendbare for spesifikk fjerning av apoprotein B-100-holdig lipoprotein (VLDL og LDL) ved immunoadsorpsjon fra plasma av pasienter som lider av hypercholesterolemia.
Den faste bærer kan være et vidt antall av materialer slik som tverrbundet dextran, f.eks. Sephadex<®> G-25, -50, -100, -200 og lignende, agarose og tverrbundet agarose, f.eks. Sepharose<®> 6B, CL6B, 4B, CL4B og lignende, eller "Bio-Gel" A-0,5M, A-1,5M, A-50M og lignende, eller poly-acrylamidperler, f.eks. "Bio-Gel" P-2, P-30, P-100, P-300 og lignende. Agarose og tverrbundne agarosematerialer er foretrukket her på grunn av deres høye porøsitet og lave ikke-spesifikke bindingsegenskaper, og vil illustrativt anvendes som en fast matriks.
Sterilisering av reseptorene og den faste matriks utføres typisk før kjeding. For å opprettholde biologisk aktivitet steriliseres reseptorene vanligvis ved filtrering, f.eks. ved passasje gjennom et 0,22 mikrometers nitro-cellulosefilter. Sterilisering av matriksen avhenger av typen av matriks, hvilket er velkjent innen faget. Eksempelvis kan ikke Sepharose<®> steriliseres ved autoklavering, men den kan steriliseres kjemisk, f.eks. ved behandling med diethylpyrocarbonat. På. den annen side kan tverrbundet Sepharose<®> steriliseres ved autoklavering ved pH 7, 120°C i 20 minutter.
Sephadex<®> eller Sepharose<®->matriksen aktiveres typisk for kjeding under anvendelse av cyanogenbromid etter velkjente metoder innen faget. Den aktiverte matriks vaskes deretter og kjedes til antistoffer som immunoreagerer med apo B-100 og utskilles av hybridom HB 8746 eller hybridom HB 8742. Det matriks-kjedede antistoff vaskes deretter og
er klar for bruk. Uomsatte, reaktive grupper på bæreren kan omsettes med et amin slik som ethanolamin eller Tris,
om ønsket.
Affinitetssorbanten kan anvendes i sin løse tilstand, men rommes fortrinnsvis i en kolonne. Plasma fra en pasient inneholdende apo B-100, blandes deretter med affinitetssorbanten under dannelse av en immunoreaksjonsblanding. Blandingen opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tidsrom tilstrekkelig for at de fast matriks-festede antistoffer immunologisk får binde apo B-100 tilstedeværende i plasma og danne en fast matriks-festet immunoreaktant. Plasmaet separeres deretter fra den fast matriks-festede immunoreaktant. Det således dannede apo B-100 (LDL og VLDL)-fattige plasma kan deretter innføres i en pasient fra hvilken det opprinnelig ble erholdt.
Fremstilling av en affinitetssorbant og dens anvendelse for fjerning av apolipoprotein B-holdige lipoproteiner fra plasma, er beskrevet i Stoffel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_8, 611-615 (1981) . En af f initets-adsorbant-kolonne fremstilt ved kjeding av hovedsakelig rene MB47-reseptorer til CNB4-aktivert Sepharose<®> 4B, ble funnet å
immunoadsorbere (binde) 3 mg LDL pr. ml fast bærer.
II. Materialer og metoder
A. Fremstilling av humane lipoproteiner
Humane lipoproteinfraksjoner ble isolert ved sentrifugering ved følgende densiteter: VLDL, densitet (d) mindre enn 1,006 g/ml; LDL, d lik 1,025-1,050 g/ml; HDL, d lik 1,070-1,21 g/ml og LDS, d lik 1,21 g/l). I enkelte tilfeller ble humant LDL også isolert ved d lik 1,019-1,063 g/ml eller ved 1,045-1,065 g/ml. Proteinkonsentrasjonen av plasma og hver fraksjon ble bestemt ved Lowry-teknikken [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)] som modifisert av Markwell et al., Anal. Biochem. 8_7, 206-210
(1978) , under anvendelse av en BSA-standard.
For hver LDL- og VLDL-fraksjon ble overslag over apo B-innholdet også foretatt etter utfelling av apo B med tetramethylurea (TMU) under anvendelse av teknikken ifølge Kane et al., J. Clin. Invest., 56, 1622-1634, (1975))
eller isopropylalkohol etter teknikken ifølge Equsa et al., J. Lipid Res., 24, 1261-1267 (1983).
Friskt, fastet, humant plasma ble erholdt fra normalt friske givere ved plasmaforese og ble justert til 0,1% EDTA (s/v). Ansamlinger fra tre eller flere givere ble anvendt med mindre annet er angitt. Lipoproteinene ble isolert ved sekvens-ultrasentrifugering av plasmaet under anvendelse av fast KBr for densitets- (d) justering. Lipoproteinfraksjonene innbefattet VLDL, d mindre enn 1,006 g/ml; IDL, d = 1,006-1,019 g/ml; LDL, d = 1,019-1,063 g/ml og HDL, d = 1,063-1,25 g/ml.
Bunnfraksjonen inneholdende lipoprotein-fattig serum (d større enn 1,25 g/ml), ble også oppsamlet.
Fraksjonene ble dialysert grundig mot lipoproteinbuffer inneholdende 0,15 M NaCl, 0,3 mM EDTA, 0,0005% alfa-tocoferol ved en pH-verdi på 7,4.
En chylomikronfraksjon ble separert fra VLDL-fraksjonen av ikke-fastet, ansamlet plasma ved at chylomikronene fikk sveve gjennom lipoproteinbuffer med ultra-
sentrifugering ved 120.000xg i 40 minutter ved 4°C.
Alle lipoproteiner ble filter-sterilisert og lagret ved 4°C i ikke mer enn 20 dager. Lipoproteinene ble analysert med hensyn til proteininnhold ved en modifikasjon av metoden ifølge Lowry, J. Biol. Chem. 193, 265-275
(1951) under anvendelse av en BSA-standard. Alle lipo-proteinkonsentrasjoner er uttrykt på basis av protein.
Apoproteinsammensetningen i hver av lipoprotein-klassene ble bestemt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Chylomikronene inneholdt påvisbare mengder av apoproteiner B, E og C, mens VLDL inneholdt apoproteiner B, E, C og spormengder av apoprotein A-I.
IDL inneholdt apoprotein B, E og C, mens LDL: inneholdt bare apoprotein B. HDL inneholdt apoprotein AI, All og C.
Under forløpet av disse studier utviste lipoprotein-preparatene en ensartet apoproteinsammensetning. For å kontrollere for potensiell proteolyse av apoproteiner, ble utvalgte plasmaansamlinger isolert og lagret i nærvær av 1 mg/ml gentamycinsulfat, 0,2% natriumazid og 1 mM benz-amidin, 10 mM diisopropylfluorfosfat, 10 ug/ml soyabønne-trypsininhibitor.
Sammenligning^ av SDS-PAGE apoprotein-beisede mønstere av disse lipoproteiner, såvel som de isolert i fravær av antibiotika og proteaseinhibitorer umiddelbart etter ultrasentrifugering og etter lagring i opptil 3 uker, viste ingen tegn på proteolyse. Alle preparater som ble anvendt, var sterile.
B. Hybridomproduksjon og dyrkning
Intakte, naturlige lipoproteiner isolert fra oppsamlet plasma, ble anvendt for immunisering. Balb/c-mus som var 4 til 5 uker gamle, ble immunisert intraperitonealt med 50 mikrogram lipoprotein i Freunds fullstendige adjuvans. Sekundære, intravenøse injeksjoner på 50 ug lipoprotein i lipoproteinbuffer ble gitt mellom dag 28 og 33. Miltene ble fjernet fra de immuniserte mus 72 timer etter siste injeksjon, og enkle cellesuspensjoner ble fremstilt i HT-medium. Blod ble også oppsamlet, og serumet ble anvendt som en positiv kontroll for hver av immunobestemmelsene.
De murine myelomacellelinjer ble opprettholdt i log-fasevekst i stasjonære kulturer i fullstendig HT-medium [Kennet et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 01, 77-91
(1978), inneholdende 0,1 mM azaguanin. Fusjoner ble utført i nærvær av 30% (v/v) polyethylenglycol 1000 i et forhold mellom immune miltceller og P3x63Ag8 på 10:1. 3 dager ettér fusjon ble cellene strøket ut i 96-brønners vevkultur-plater til 1x10 5 levende celler/brønn i HT-medium inneholdende 0,1 mM aminopterin.
Cellene ble matet i 7 dager etter fusjon med HT-medium og ved 4-5 dagers intervaller deretter etter behov. Veksten ble fulgt mikroskopisk, og kultursupernatanter ble oppsamlet på dag 14 for bestemmelse av antigen-spesifikk antistoffproduksjon ved en fast fase-RIA. Spesifikk antistof f-produserende hybridomer ble klonet 19 til 47 dager etter fusjon ved begrensende fortynning i nærvær av Balb/c miltmateceller, og hybridomene i brønnene inneholdende enkle kolonier, ble screenet med hensyn til antistoffproduksjon ved fast fase-RIA etter 10 dager. De klonede hybridomer ble kultivert i medium inneholdende 10% kalveserum og ble lagret fryst i flytende nitrogen.
C. Inhibering av LDL- binding, internalisering og nedbrytning
Anti-apo B-100-reseptorers evne til å inhibere
125
binding, internalisering og nedbrytning av I-LDL av humane fibroblaster, ble bestemt på følgende måte. LDL ble
125
jodert med I (spesifikk aktivitet 200 cpm/ng) under anvendelse av jod-monokloridteknikken ifølge Bilheimer et al., J. Clin. Invest., 56, 1420-1430 (1975).
For å tillate antistoff-LDL-interaksjon ble 0,1 ml av hver hybridomsupernatant inkubert (blandet og opprett-125
holdt) med I-LDL (sluttkonsentrasjon 2,5 mg/ml) i 0,4 ml Dulbeccos minimale essensielle medium (DME) inneholdende
2,5 mg/ml lipoprotein-fattig serum (LDS) i 12 timer ved 4°C. Deretter ble de individuelt inkuberte blandinger over-ført til humane forhud-fibroblastmonolag dyrket i DME med 10% kalvefosterserum (FCS) i 10 millimeter-diameter brønner.
LDL-reseptorer av disse celler var blitt maksimalt uttrykt ved tidligere inkubering av disse celler i et tidsrom på
24 timer i DME inneholdende 2,5 mg/ml LDS.
Etter individuelle inkuberinger av supernatant og fibroblastceller i 6 timer ved 37°C ble den cellulære nedbrytning av <125>I-LDL bestemt i henhold til metoden ifølge Drevon et al., J. Lipid Res., 22./ 37-46 (1981). Kontroll-125
kulturer hadde 0,4 ml DME inneholdende I-LDL og en av følgende: a) 0,1 ml friskt hybridommedium inneholdende 20% kalvefosterserum; eller b) 0,1 ml hybridommedium fra brønner av hybridomkolonier som var negative med hensyn til apo B-spesifikk antistoffproduksjon; c) 0,1 ml DME inneholdende 2,5 mg/ml LDS; eller d) 0,1 ml umerket LDL (for å bringe den sluttelige, umerkede LDL-konsentrasjon i mediet til 500 ug pr. ml).
D. Isolering av anti- LDL- immunoglobulin
Ascites-væsker inneholdende antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble erholdt fra 10 uker gamle Balb/c-mus som var blitt behandlet med 0,3 ml mineralolje og injisert intraperitonealt med 3-50x10^ hybridomceller. Den midlere tid for utvikling av ascites var 12 dager. Etter klaring ved sentrifugering ved 15.000xg i 1 time ved 4°C ble ascitesvæskene oppsamlet og lagret fryst ved -20°C.
Isolert antistoff MB47 ble fremstilt ved kromatografi av de monoklonale hybridom-ascitesvæsker på en protein A-Sepharose<®> 4B-kolonne. Antistoff ble eluert fra kolonnen med 0,1 molar (M) eddiksyre.
Isolerte antistoffer ble også fremstilt ved hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) av en monoklonal hybridom-ascitesvæske på en Pharmacia Mono Q HR 5/5 anionbytter-kolonne i et Pharmacia FPLC-system under anvendelse av en 0-0,5M NaCl-gradient i 10 mM Tris, pH 8,0, og ved å følge
de retningslinjer som fulgte med kolonnen.
E. Karakterisering av hybridom- antistoffer
Det totale gammaglobulin- (lg) innhold av hver ansamling av ascitesvæske ble erholdt ved elektroforese av 1-3 ml prøver av celluloseacetatremser i 75 mM veronalbuffer ved en pH-verdi på 8,6 i 45 minutter ved 200 millivolt (mV). Den prosent av det totale protein som var lg, ble kvantifisert ved densitometrisk scanning av Ponceau. S-beisede geler, og totalt protein ble bestemt ved de modifiserte Lowry-metoder som tidligere diskutert.
Murine lg tunge og lette kjeder ble identifisert ved dobbelt diffusjon i 0,9% agarose. 10 mikroliter av en egnet fortynning av ascites-væske ble omsatt med et likt volum av egnet, fortynnet kanin-anti-murin tungkjedede og lettkjedede-spesifikke antisera. Etter diffusjon i ca. 15 timer ved 20°C og vasking ble precipitinlinjer identifisert ved beising med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250.
Isoelektriske profiler for hvert monoklonalt antistoff ble erholdt ved isoelektrisk fokusering av 0,01 ml prøver av ascitesvæskene i 0,8% agarose (EF 802-300 LKB) inneholdende 10% sorbitol, 2% amfolin innen et pH-område på 5-8, (LKB) i 150 minutter ved en konstant styrke på 3 watt. Etter fiksering og tørking ble gelene beiset med Coomassie brilliant blue og ble fotografert.
1. Western blotting - Apoproteiner ble separert
ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) av lipoproteinene i en vertikal plategelapparatur (14x12x0,15 cm). Gelene ble preparert under anvendelse av 25 mM Tris-glycinbuffer ved en pH-verdi på 8,6. Den øverste stablende gel inneholdt 1% SDS, 3% acrylamid, og den nedre "running" gel var enten en 3 til 20% eller 3 til 6% acrylamidgradient inneholdende 1% SDS. Lipoproteinene ble delipidert ved kokning i 3 minutter i elektroforese-prøvebuffer som inneholdt 1% natriumdodecylsulfat, 10 mM Tris. og 0,2 4 mM EDTA. Molekylvektmarkører og deres respekt-
ive tilsynelatende relative molekylmasser var: fibrinogen, 340.000; IgG, 140.000; albumin, 69.000; ovalbumin, 43.000; soyabønnetrypsin-inhibitor, 20.500; og lysozym, 14.300. Gelene ble elektroforert i ca. 18 timer ved 13,5, milliampére (mA) konstant strømstyrke.
Gelene ble vasket i destillert vann i 10 minutter og deretter i 10 minutter i 25 mM Tris, 192 mM glycin, pH 8,3, inneholdende 20% (v/v) methanol. Overføring til nitrocellulose (0,45 mikrometer) ble utført ved elektroforese i 1 time ved 400 mA. Gjenværende aktive bindingssteder på nitrocellulosen ble mettet ved neddypning over natten i PBS inneholdende 3% BSA, 3% normalt geiteserum, 0,01% natriumazid (blokkerende løsning).
De fikserte geler eller nitrocelluloseoverføringene ble inkubert i 18 timer ved 4°C med enten immunt museserum eller ascitesvæske hensiktsmessig fortynnet i PBS inneholdende 3% BSA, 3% normalt geiteserum, 0,05% Tween<®->20 (poly-oxyethylen 20 monolaurat). Etter gjentatt vasking ble antistoffbinding påvist ved en andre 4 timers inkubering ved 4°C med <125>I-geite-anti-immun lg (0,5 mikroCi/ml) i den samme buffer, igjen etterfulgt av grundig vaskning.
Ikke-spesifikk binding til nitrocellulosen ble signifikant redusert ved vasking etter inkubering med både første og andre antistoffer i PBS inneholdende 3% BSA, 0,05% Tween®-20 og deretter i 0,5 M LiCl inneholdende 0,1% SDS.
Gelene eller nitrocelluloseoverføringene ble tørket og analysert ved autoradiografi ved -20°C. Om hensiktsmessig, ble gelene beiset med enten 0,1% Coomassie brilliant blue R-250 i 50% trikloreddiksyre eller sølvbeis som beskrevet av Merril et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 4335-4339 (1979).
F. Fremstilling av Fab- fragmenter
Fab-fragmenter av isolert reseptormolekyl-antistoff ble dannet ved oppslutning med papain. Antistoff Fc-delene og uoppløste antistoffer ble fjernet ved passasje over en protein A-Sepharose<®> 4B-kolonne. SDS-PAGE av Fab-fragmentene viste to adskilte bånd på 25.000 og 40.000 dalton. Immuno-reaktivitet av Fab-fragmentene ble bekreftet ved spesifikk binding til LDL i en fast fase-RIA (Milne et al., Arterio-scler<p>sis 3, 23,30 (1983)).
G. Radioimmunobestemmelser ( RIA)
125
1. Væskefase- I- merket antigen RIA
For å bestemme fraksjonen av <125>I-LDL-partikler bundet av MB47 og MB24, ble en væskefase-RIA anvendt [Curtiss og Edgington, J. Biol. Chem., 25.' 15213-15221
(1982)]. To forskjellige LDL- (d=l,019-1,063 g/ml) preparater ble studert, ett isolert fra oppsamlet plasma fra 10 normale personer og ett isolert fra plasma fra én normal person. <125> I-LDL (2000 cpm/ng) fremstilt under anvendelse av jodogen-teknikken, var 90% utfellbar med trikloreddiksyre (TCA). Det ble fortynnet i 9% kvegserumalbumin (BSA) og sentrifugert ved 30.000xg i 15 minutter før hver bestemmelse for å fjerne komplekst materiale. Bestemmelser ble utført i 12x75 mm glassrør in triplo i 55 mM natrium-barbitalbuffer ved en pH-verdi på 8, inneholdende 150 mM NaCl, 0,02% natriumazid, 3% BSA og 1,5 mM natrium-EDTA. Til
125
0,1 ml I-LDL (inneholdende 20 ng LDL-protein) ble tilsatt 0,1 ml buffer eller konkurrerende antigen og 0,1 ml av økende konsentrasjoner av isolerte MB47-reseptorer fortynnet 1 BSA-barbitalbufferen. Etter 18 timer ved 4° ble 0,1 ml IgSorb tilblandet. Etter 2 timers opprettholdelsestid ble
2 ml BSA-fritt barbitalbuffer tilsatt, og rørene ble umiddelbart sentrifugert ved 1.500xg i 60 minutter. Utfell-ingene ble vasket to ganger med barbitalbuffer. Maksimal utfellbar radioaktivitet ble bestemt ved å erstatte IgSORB med 100% TCA. Den minimale utfellbare radioaktivitet ble
125 bestemt i fravær av MB47-reseptorer. Prosent bundet I-LDL ble deretter beregnet.
125
2. Væskefase I-merket re septor RIA
—■■- m 1 1 ■■ — —— ■ ■ —- . i fci i. ■ / Intakte antistoff-MB47-reseptorer isolert ved immunorensing, ble jodert med <125>I under anvendelse av
jodogenteknikken (spesifikk aktivitet 3000 cpm/ng). Etter grundig dialyse mot PBS ble over 95% av radioaktiviteten utfelt med 10% TCA. Mer enn 98% av <125>I-MB47 ble bundet til en human LDL-affinitetskolonne. Bestemmelser ble utført in triplo i 10x75 mm siliconbelagte glassrør. Økende kon-125
sentrasjoner av I-MB47 i 0,1 ml BSA-barbitalbuffer ble tilsatt til 100 ng av oppsamlet, normalt, humant LDL fortynnet i 0,2 ml BSA-barbitalbuffer. Hvert rør inneholdt 182 fmol LDL apo B (idet man antok en apo B molekylvekt på 550.000 dalton). Etter opprettholdelse i 16 timer ved 4°C ble LDL kvantitativt utfelt med et lipoproteinfattig kanin-antiserum spesifikt for humant LDL. (Bare den fraksjon av kanin-antiserumet med densitet større enn 1,21 g/ml ble anvendt fordi antistoff MB47 binder kanin apo B).
Preliminære studier fastslo en konsentrasjon av delipidert kanin-antiserum som utfelte 97% av 100 ng 125 I-humant LDL. Etter tilblanding av kanin-antistoff ble rørene opprettholdt i 16 timer ved 4°C og ble deretter sentrifugert ved 1500xg i 50 minutter ved 4°C. Supernatantene ble fjernet, og pelletene ble vasket to ganger med 2 ml iskald barbitalbuffer. Ikke-spesifikk binding og utfelling ble bestemt i to sett av parallelle rør.
I det første sett ble ikke noe humant LDL tilsatt til begynnelsesinkuberingen, men samme mengde kanin andre antistoff ble tilsatt. I det andre sett av rør ble ikke-immunt kaninserum (densitet større eller lik 1,21 g/ml-fraksjonen) anvendt istedenfor det immune kaninserum-antistoff.
Begge metoder ga identiske verdier for ikke-spesifikk binding som var lineær med økende konsentrasjoner av 125
I-MB47-antistoff og var i alle tilfeller mindre enn 1%
125
av de totalt tilsatte slag. Spesifikk I-MB47-binding til LDL ble erholdt ved å subtrahere ikke-spesifikk binding fra total binding. Bindingsdataene ble analysert under anvendelse av et lineært regresjonsprogram for Scatchard-analyse av ligand-bindingssystemer som ga en verdi for antistoff-affinitetskonstanten (Ka) og reseptor- eller
epitopekonsentrasjonen (Munson et al., Anal. Biochem.,
107, 220-239 (1980)).
3. Fast fase- festet antigen RIA
En screeningsbestemmelse for å bestemme hvorvidt en hybridomkultur produserte antistoffer ifølge oppfinnelsen, ble utført i fleksible rundbundede polyvinylklorid-mikro-titerplater som fast matriks. Lipoproteinantigener
(apo B-100-reagens) ble festet (bundet) til de indre vegger av mikrotiterplatebrønnene ved tilblanding av 0,05 ml lipoprotein i lipoproteinbuffer og inkubering av platene ved romtemperatur i 3 timer under dannelse av en konstant sluttelig bundet antigenkonsentrasjon og den faste bærer. Preliminære direkte bindingsstudier under anvendelse av radiojoderte lipoproteiner indikerte at det var signifikant forskjell i effektiviteten med hvilken hvert av lipoproteinene var bundet til mikrotiter plastbrønnene. For å oppnå en sluttelig bundet antigenkonsentrasjon på 50 ng protein/brønn ble derfor VLDL anvendt til 50 ug/ml, IDL til 6,2 ug/ml, LDL til 4,4 ug/ml og HDL til 24 ug/ml. Ikke-spesifikke bindingssteder ble deretter blokkert ved tilblanding av 0,25 ml blokkeringsløsning i hver brønn, blandingen ble opprettholdt i 1 time, og den blokkerende løsning ble deretter separert fra brønnene under dannelse av en fast bærer med lav, ikke-spesifikk bindingskapasitet.
For bestemmelsen ble 0,050 ml antiserum, kultursupernatant eller ascitesvæske fortynnet i PBS inneholdende 3% BSA, 3% normalt geiteserum og 0,05% Tween<®->20 [polyoxy-ethylen- (20) sorbitan-monolaurat] tilblandet i brønnene under dannelse av fast/væskefase-immunoreaksjonsblandinger. Blandingene ble deretter opprettholdt (immunoreagert) i
18 timer ved 4°C.
Etter vasking av brønnene med PBS inneholdende 3% BSA og 0,05% Tween<®->20 for å fjerne ikke-bundet materiale, ble fast fase-bundne reseptorer fremstilt for direkte påvisning ved tilblanding av 10 ng immunokjemisk renset og radio-jodert geite-anti-murint lg i hver brønn under dannelse av en andre fast/væskefaseblanding. Denne blanding ble opprettholdt i 4 timer ved 4°C for å tillate at de merkede, andre reseptorer fikk binde de fast fase-bundne første reseptorer og danne en sammensatt immunoreaktant.
Etter en sluttelig vask.for å fjerne ikke-bundne, merkede reseptorer ble de individuelle brønner fjernet og tellet med hensyn til 125 I hvor mengden av påvist 12 5I står i direkte proporsjon med mengden av første reseptorer bundet som fast fase-immunoreaktant.
Det immunokjemisk rensede andre antistoff ble radio-jodert enzymatisk under anvendelse av immobilisert lacto-peroxydase og glucoseoxydase til spesifikke aktiviteter på 3-4 mikroCi/mikrogram. 4. Konkurrerende fast fase- festet reseptor RIA Konkurrerende fast fase-radioimmunobestemmelser (RIA) med hensyn til humant apo B ble utført under anvendelse av antistoff MB47. Polyvinylkloridbrønner ble belagt med 0,5 ml humant LDL (apo B-100-reagens), ble fortynnet til 10 ug/ml i PBS, pH 7,35, og ble opprettholdt i 2 timer ved 37°C. Ikke-spesifikke bindingssteder ble blokkert ved belegning med 5% BSA i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket med PBS vaskebuffer ytterligere inneholdende 0,1% BSA, 0,01% natriumazid og 0,05% Tween<®->20.
Friskt, humant LDL, fremstilt fra oppsamlet, normalt plasma, ble anvendt som apo B-100-reagens for standardkurven i fortynninger varierende fra 0,4 ug/ml til 97,2 ug/ml.
Alle fortynninger ble foretatt i PBS-buffer inneholdende
3% BSA, 0,01% natriumazid og 0,05% Tween<®->20. LDL-stand-arden eller konkurrenter (0,025 ml) ble blandet til de LDL-belagte brønner etterfulgt av 0,025 ml buffer inneholdende en bestemt og begrensende mengde av monoklonalt antistoff (ascites-væske). Den optimale, sluttelige konsentrasjon av antistoff ble bestemt fra preliminære antistoff-fortynnings-studier og ble valgt som den mengde av antistoff som resul-terte i 50% maksimal binding.
Platene ble opprettholdt i et tidsrom på ca. 18 timer ved 4°C og ble deretter vasket med PBS vaskebuffer. Muse-antistoffbinding ble deretter kvantifisert ved tilblanding av 0,05 ml <125>I-immunorenset geite-anti-muse-Ig (450 ng/brønn, 8.000 cpm/ng). Etter en 4 timers opprettholdelsestid ved
Q
4 ble platene vasket, og de individuelle brønner tellet.
H. Enzymkjedet immunosorbantbestemmelse ( ELISA)
1. Ikke- konkurrerende ELISA
Isolerte MB47-reseptorer ble festet til veggene av polystyren-mikrotiterplatebrønner ved blanding av 0,15 ml av en natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0, inneholdende 1 ug/ml reseptorprotein i hver brønn. Brønnene ble opprettholdt i 16 timer ved 4°C og ble deretter vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% Tween<®>. Gjenværende, ikke-spesifikke bindingssteder ble deretter blokkert ved tilblanding av 0,2 ml 3% BSA i PBS i hver brønn, blandingen ble opprettholdt i 1 time ved 23°C, og vasking ble deretter utført som ovenfor beskrevet. De således fremstilte brønner (faste bærere) kan anvendes opptil 1 måned etter fremstilling når de lagres i et fuktig kammer.
Apo B-100-reagens (humant LDL) ble fortynnet i PBS til konsentrasjoner varierende fra 2,0 til 0,062 ug/ml for anvendelse som standardkontrolløsninger. Plasmaprøver ble fortynnet 1:2000 i PBS.
50 mikroliter av standard eller prøve ble tilblandet
i brønnene in triplo. I løpet av ca. 5 minutter ble deretter 50 ul PBS inneholdende mg/ml HRPO-merket MB24-reseptorer, tilblandet i hver brønn. Immunoreaksjonsbland-ingene ble opprettholdt i 30 minutter ved 25°C. Ikke-
bundet materiale ble deretter fraskilt fra veggene ved vasking som ovenfor beskrevet.
Mengden av fast fase-festet, sammensatt immunoreaktant inneholdende HRPO-markør, ble deretter bestemt ved tilblanding av 0,1 ml friskt fremstilt substratløsning (destillert vann inneholdende 3% H202 og 0,67 mg/ml o-fenylendiamin (OPD)) til hver brønn. Farge fikk tillates å utvikles i 30 minutter ved 25°C. Substrat-omdannelses-reaksjonen ble deretter stoppet ved tilblanding i hver brønn av 0,05 ml 4N ^ 2°2' Den °Pt:*-ske densitet (O.D.) av løsningene ble bestemt ved 4 90 nanometer (nm) bølgelengde under anvendelse av en Dynatech<®> MR600 mikrotiterplate-leser.
2. Konkurrerende ELISA
Apo B-100-reagens ble festet til brønnene av fleksible polyvinylklorid-mikrotiterplatebrønner som fast matriks ved tilblanding av 0,2 ml PBS inneholdende 5 ug/ml isolert, humant LDL i hver brønn. Brønnene ble opprettholdt i 16 timer ved 4°C og ble deretter vasket tre ganger med 0,2 ml PBS inneholdende 1% BSA, 0,5% Tween<®> og 0,02% aprotinin. Gjenværende, ikke-spesifikke bindingssteder ble blokkert som beskrevet for ikke-konkurrerende ELISA.
For standardkurven som var inkludert på hver-plate, ble apo B-100-reagenset fortynnet i PBS inneholdende 0,5% lipoprotein-fattig plasma (LPDP) for å tilveiebringe konsentrasjoner varierende fra 32 mg/ml til 0,25 mg/ml.
Plasmaprøver ble fortynnet 1:200 i PBS inneholdende 0,5% LPDP. 50 mikroliter av standardene eller prøvene ble blandet in triplo i brønnene. I løpet av ca. 5 minutter deretter ble 50 ul PBS inneholdende 3% BSA og 4 ug/ml MB24-reseptorer tilblandet til hver brønn. De således dannede blandinger ble opprettholdt i 18 timer ved 4°C. Det ikke-bundne materiale ble deretter separert fra fast fase-bundne MB24-apo B-100-reagens-immunoreaksjonsprodukter ved vasking som ovenfor beskrevet.
Fast fase-immunoreaktantene ble preparert for bestemmelse ved tilblanding av 0,1 ml PBS inneholdende 1% BSA og en effektiv mengde av HRPO-merket geite-anti-muse-IgG til hver brønn. Denne andre immunoreaksjonsblanding ble opprettholdt i 1 time ved 24°C og ble deretter vasket som beskrevet ovenfor, under dannelse av en sammensatt immunoreaktant.
Mengden av fast fase-festet, sammensatt immuno-. reaktant inneholdende HRPO-markør, ble bestemt som beskrevet i den konkurrerende ELISA.
I. Plasmaprøver og lipoproteinkvantifisering
Plasmaprøver ble erholdt fra 20 pasienter med koronar arteriesykdom fra hjertekateteriseringslaboratiet ved San Diego VA hospital og fra 20 pasienter med familiær hypercholesterolemia fra University of California,
San Diego-klinikken. I tillegg ble plasma erholdt fra
20 normale personer.
Blod ble oppsamlet i rør inneholdende 1,5 mg/ml ethylendiamintetraacetat (EDTA), og plasma ble umiddelbart separert ved sentrifugering ved 4°C.
Totalt plasmacholesterol og triglycerider ble målt på friske plasmaprøver i et standardisert, klinisk labora-torium under anvendelse av en Abbotl® ABA-200 bikromatisk analyseringsanordning, og Boehringer-Mannheim cholesterol-réagens 236691 med høy ytelse og Abbott Laboratories triglycerid-A-gent. LDL- og HDL-cholesterol ble målt under anvendelse av teknikker beskrevet i Lipid Research Clinic Procedures, HEW publ. nr. 75-628 (NIH), 2. utg., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974). Aproprotein B-nivåer ble bestemt under anvendelse av to kommersielt tilgjengelige radial-immunodiffusjonssett: "Diffu"-gen RID, som her angis som RID #1, og M— Partigen® RID, som her angis som RID #2.
J. LDL- binding til en MB47- Sepharose® 4B- kolonne
50 milligram av hovedsakelig rene MB47- antistoffer, erholdt ved protein A kolonnekromatografi, ble kjedet til 12 ml cyanogenbromid-aktivert Sepharose<®> 4B i henhold til fabrikantens instruksjoner. 10 mg LDL ble deretter tilsatt til kolonnen og ble opprettholdt over natten (ca. 16 timer) ved 4°C. Ikke-bundet LDL ble deretter eluert og undersøkt med hensyn til LDL-protein som tidligere beskrevet.
Claims (7)
1. Monoklonalt antistoff,
karakterisert ved at det er et intakt antistoff som (a) immunoreagerer med apoprotein B-100, og (b) utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnr. HB 8746, eller utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnr. HB 8742.
2. Hybridomer,
karakterisert ved at de har ATCC deponeringsnr. HB 8746 og HB 8742, og som fremstiller antistoffet ifølge krav 1.
3. Anvendelse av antistoffet ifølge krav 1 for bestemmelse av en kroppsvæskeprøve med hensyn til mengden åv apoprotein B-100, eller som steril affinitetssorbant.
4. Diagnostisk system for bestemmelse av mengden av apo B-100 i en kroppsprøve,
karakterisert ved at det omfatter: (a) et biologisk aktivt, første spesifikt bindingsmiddel som omfatter antistoffer som (i) immunoreagerer med apoprotein B-100, og (ii) er enten antistoffene utskilt av hybridomet ATCC HB 8746 eller antistoffer utskilt av hybridomet ATCC HB 8742; og (b) et biologisk aktivt, merket, andre spesifikt bindingsmiddel for signalisering av immunoreaksjonen mellom første bindingsmiddel og apo B-100.
5. Diagnostisk system ifølge krav 4, karakterisert ved at det merkede, andre spesifikke bindingsmiddel er de andre antistoffer av enten antistoffene utskilt av hybridomet ATCC HB 8746 eller antistoffene utskilt av hybridomet ATCC HB 8742.
6. Diagnostisk system ifølge krav 5, karakterisert ved at markøren er et enzym.
7. Diagnostisk system ifølge krav 4,
karakterisert ved at angitte, første
spesifikke bindingsmiddel er festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89365986A | 1986-08-06 | 1986-08-06 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO873271D0 NO873271D0 (no) | 1987-08-05 |
| NO873271L NO873271L (no) | 1988-02-08 |
| NO172596B true NO172596B (no) | 1993-05-03 |
| NO172596C NO172596C (no) | 1993-08-11 |
Family
ID=25401879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO873271A NO172596C (no) | 1986-08-06 | 1987-08-05 | Apolipoprotein b-spesifikke monoklonale antistoffer produsert av to nye hybridomer, anvendelse av disse og diagnostiske systemer inneholdende disse |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5330910A (no) |
| EP (1) | EP0257778B1 (no) |
| JP (1) | JP2831352B2 (no) |
| AT (1) | ATE120233T1 (no) |
| AU (1) | AU7657387A (no) |
| CA (1) | CA1338032C (no) |
| DE (1) | DE3751182T2 (no) |
| DK (1) | DK174932B1 (no) |
| ES (1) | ES2070820T3 (no) |
| FI (1) | FI92714C (no) |
| IE (1) | IE66195B1 (no) |
| NO (1) | NO172596C (no) |
| PT (1) | PT85490B (no) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3734015A1 (de) * | 1987-10-08 | 1989-04-20 | Behringwerke Ag | Diagnostisches mittel und verfahren zur bestimmung von apolipoprotein b |
| JPH07104351B2 (ja) * | 1988-09-29 | 1995-11-13 | 株式会社日本抗体研究所 | 脂質代謝異常検出用キット |
| US5183738A (en) * | 1988-09-29 | 1993-02-02 | Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd. | Kit for the detection of denatured lipoproteins |
| KR950008684A (ko) * | 1993-09-21 | 1995-04-19 | 쇼다 오사무 | 아포리포프로틴 b로 이루어진 엔도텔린 전환효소 |
| US6107045A (en) * | 1994-06-30 | 2000-08-22 | Oklahoma Medical Research Foundation | Antibodies to lipoproteins and apolipoproteins and methods of use thereof |
| JPH1026621A (ja) * | 1996-07-12 | 1998-01-27 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | イムノアッセイ法 |
| US6506569B1 (en) * | 1997-05-30 | 2003-01-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR10 |
| US6716410B1 (en) * | 1999-10-26 | 2004-04-06 | The Regents Of The University Of California | Reagents and methods for diagnosing, imaging and treating atherosclerotic disease |
| CA2453538A1 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for determination of denatured lipoprotein, reagent for determination of denatured lipoprotein, method for detection of cardiovascular disease, and reagent for detection ofcardiovascular disease |
| CA2562550C (en) | 2004-04-15 | 2013-09-24 | Athera Biotechnologies Ab | Phosphorylcholine conjugates and corresponding antibodies |
| US7875182B2 (en) * | 2006-11-20 | 2011-01-25 | Cytosorbents, Inc. | Size-selective hemoperfusion polymeric adsorbents |
| US9182389B2 (en) * | 2011-02-22 | 2015-11-10 | Chrome Red Technologies, Llc | Detection of specific antigens in a population of antigens |
| TWI707873B (zh) | 2011-08-09 | 2020-10-21 | 阿雷拉生物技術Ａｂ公司 | 新抗體 |
| AU2012294431B2 (en) | 2011-08-09 | 2017-03-30 | Athera Biotechnologies Ab | Antibodies binding to phosphorylcholine (PC) and/or PC conjugates |
| US10858422B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-12-08 | Abcentra, Llc | Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody |
| EP3463416A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-04-10 | CardioVax, LLC | Methods for diagnosing and treating systemic lupus erythematosus |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| JPS6015559A (ja) * | 1983-07-06 | 1985-01-26 | Shiraimatsu Shinyaku Kk | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
| DE3338836A1 (de) * | 1983-10-26 | 1985-05-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung |
| JPS60193926A (ja) * | 1984-03-15 | 1985-10-02 | Tokyo Daigaku | 単クローン性抗ヒトアポリポ蛋白質ｂ１００抗体 |
| JPS60239425A (ja) * | 1984-05-14 | 1985-11-28 | Teijin Ltd | 脂質代謝調節用固相担体 |
| JPS62501770A (ja) * | 1984-12-31 | 1987-07-16 | ゾマ、コーポレーション | ヒトアポリポタンパク質のペプチドフラグメント、種特異性抗体及び使用方法 |
| US4677057A (en) * | 1985-03-11 | 1987-06-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Diagnostic assay for the presence of apolipoproteins associated with plasma high density lipoproteins |
| US4828986A (en) * | 1986-09-29 | 1989-05-09 | Scripps Clinic And Research Foundation | Assay method and diagnostic system for determining the ratio of APO B-100 to APO A-I in a blood sample |
-
1987
- 1987-07-20 ES ES87306413T patent/ES2070820T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-20 AT AT87306413T patent/ATE120233T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-20 EP EP87306413A patent/EP0257778B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-20 DE DE3751182T patent/DE3751182T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-04 AU AU76573/87A patent/AU7657387A/en not_active Abandoned
- 1987-08-05 NO NO873271A patent/NO172596C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-08-05 CA CA000543750A patent/CA1338032C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-08-05 PT PT85490A patent/PT85490B/pt unknown
- 1987-08-05 DK DK198704079A patent/DK174932B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-08-05 IE IE210487A patent/IE66195B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-05 FI FI873410A patent/FI92714C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-08-06 JP JP62197250A patent/JP2831352B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-09-27 US US07/415,432 patent/US5330910A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-03-30 US US08/219,963 patent/US5460947A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO873271L (no) | 1988-02-08 |
| DK174932B1 (da) | 2004-03-01 |
| FI873410A0 (fi) | 1987-08-05 |
| IE872104L (en) | 1988-02-06 |
| AU7657387A (en) | 1988-02-11 |
| JP2831352B2 (ja) | 1998-12-02 |
| IE66195B1 (en) | 1995-12-13 |
| FI873410A (fi) | 1988-02-07 |
| DE3751182D1 (de) | 1995-04-27 |
| DK407987D0 (da) | 1987-08-05 |
| EP0257778A2 (en) | 1988-03-02 |
| DE3751182T2 (de) | 1995-10-26 |
| DK407987A (da) | 1988-02-07 |
| JPS63279783A (ja) | 1988-11-16 |
| US5330910A (en) | 1994-07-19 |
| ATE120233T1 (de) | 1995-04-15 |
| FI92714B (fi) | 1994-09-15 |
| CA1338032C (en) | 1996-02-06 |
| ES2070820T3 (es) | 1995-06-16 |
| FI92714C (fi) | 1994-12-27 |
| US5460947A (en) | 1995-10-24 |
| NO172596C (no) | 1993-08-11 |
| PT85490B (pt) | 1990-06-29 |
| EP0257778B1 (en) | 1995-03-22 |
| EP0257778A3 (en) | 1990-03-21 |
| NO873271D0 (no) | 1987-08-05 |
| PT85490A (en) | 1987-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0266880B1 (en) | Hybridomas and monoclonal paratopic molecules to apolipoprotein a-i | |
| US4677057A (en) | Diagnostic assay for the presence of apolipoproteins associated with plasma high density lipoproteins | |
| US4828986A (en) | Assay method and diagnostic system for determining the ratio of APO B-100 to APO A-I in a blood sample | |
| US5330910A (en) | Apolipoprotein B-specific monoclonal antibodies produced by two novel hybridomas | |
| US5814467A (en) | APO AI polypeptides, diagnostic methods and systems for quantifying APO AI, and therapeutic methods | |
| CA1307479C (en) | Diagnostic methods and systems for quantifying apo ai | |
| Vemuri et al. | Identification of the cardiac sarcolemmal Na+− Ca 2+ exchanger using monoclonal antibodies | |
| EP0465652B1 (en) | Antibody against heavy chain of smooth muscle myosin | |
| US5747652A (en) | Antibody to smooth muscle myosin heavy chains | |
| IE911922A1 (en) | Apo ai polypeptides, diagnostic methods and systems for¹quantifying apo ai, and therapeutic methods | |
| AU2721888A (en) | Diagnostic methods and systems for quantifying apo ai | |
| NO894709L (no) | Diagnosefremgangsmaater og -systemer for kvantifisering avapo ai. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |