DE3783015T2

DE3783015T2 - Hybridomen und monoklonale paratopische molekuele gegen apolipoprotein ai.

Info

Publication number: DE3783015T2
Application number: DE8787308394T
Authority: DE
Inventors: Linda K Curtiss
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1986-09-29
Filing date: 1987-09-22
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2007-09-23
Also published as: JP2505218B2; PT85826A; ZA876973B; NZ221938A; EP0266880B1; EP0266880A2; FI92715C; NO874055L; IL83937A0; JPS63159398A; GR3006843T3; CA1309041C; AU7902987A; IE872502L; AU600975B2; NO174004C; IL83937A; FI92715B; FI874252A0; EP0266880A3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Apolipoprotein A-I, und insbesondere Hybridomen und monoklonale paratope Moleküle, welche zum Testen auf Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe brauchbar sind, sowie ein diagnostisches Verfahren und System zur Durchführung eines solchen Tests.

Grundlage der Erfindung

A. Atherosklerose und Lipoproteine

Die Atherosklerose (= Arteriosklerose) ist jene Krankheit, bei welcher Cholesterin und andere Lipide, welche sich auf den wänden von Arterien ansammeln, voluminöse Beläge bilden, welche den Blutstrom hemmen und zur Bildung eines Gerinnsels führen können, welches eine Arterie verstopfen kann und eine Erkrankung im Sinne eines verschließenden Thrombus oder einer verschließenden Embolie, wie z.B. einen Herzanfall bzw. Herzinfarkt oder einen Schlaganfall verursachen kann. Bis zu 50% aller Todesfälle in den Vereinigten Staaten werden durch Atherosklerose und deren Sekundärkomplikationen verursacht.
Die Human-Atherosklerose wird als die Ansammlung ausgewählter Lipide, darunter Cholesterin, und von Zellen in den Wänden von Arterien definiert und sie erzeugt mit der Zeit verschließende Läsionen. Obgleich die Etiologie der Atherosklerose eine multifaktorielle ist, wird es durch ein umfangreiches klinisches, pathologisches, genetisches und experimentelles Beweismaterial nehegelegt, daß Abnormitäten des Lipoprotein-Stoffwechsels zu der Entwicklung der Atherosklerose beitragen können. Diese Lipide werden in dem Blutstrom als Lipoproteine genannte Lipid-Protein-Komplexe befördert.
Die Atherosklerose, und insbesondere jene Form derselben, welche als koronare Herzkrankheit ("coronary artery disease", CAD) bekannt ist, ist ein großes Gesundheitsproblem. Die Atherosklerose und die damit in Beziehung stehenden Gefäßkrankheiten waren 1983 für 983.000 Todesfälle verantwortlich; und die CAD allein ist alljährlich für mehr Todesfälle verantwortlich als alle Formen von Krebs zusammengenommen. In den Vereinigten Staaten kommen jedes Jahr nehr als 1 Million Herzanfälle bzw. Herzinfarkte vor, und mehr als 500.000 Menschen sterben an den Folgen dieser Krankheit. Die CAD verursacht in den Vereinigten Staaten mehr als 60 Milliarden $ pro Jahr an direkten Kosten für die medizinische Versorgung. Dieser enorme Tribut hat die Aufmerksamkeit auf Mittel und Wege fokussiert, um jene besonderen Bevölkerungsanteile zu identifizieren, bei welchen ein Risiko im Sinne einer CAD besteht, so daß die Krankheit mit Diät, einer Modifikation des Verhaltens (Übungen, Bewegung), und mit spezifischen therapeutischen Mitteln unter Kontrolle gebracht werden kann.
Wegen der großen Beteiligung von Cholesterin an der CAD sind dieses Molekül und die ihm zugeordneten Plasmaproteine eingehend untersucht worden. Vier Hauptklassen von dem Cholesterin zugeordneten Plasma-Lipoproteinteilchen sind definiert worden, und sie haben ihren Ursprung im Darm oder in der Leber. Diese Teilchen sind an dem Transport der neutralen Lipide, einschließlich des Cholesterins und der Triglyceride, beteiligt. Alle Klassen von Plasma-Lipoproteinen weisen mit dem Lipid-Protein-Komplex assoziierte Apolipoproteine auf; und die Apolipoproteine spielen die erforderlichen Rollen in der Funktion dieser Lipoproteine.
Die erste Klasse sind die Chylomikronen. Sie sind die größten der Lipoproteine und sind reich an Triglyceriden. Die Ursprungsstelle der Chylomikronen ist der Darm.
Während die Apolipoproteine einen quantitativ kleinen Anteil der Masse der Chylomikronen ausmachen, wird von den Apolipoproteinen A-I, A-II und A-IV berichtet, daß sie in signifikanter Weise mit den Chylomikronen assoziiert sind, und eine Intestinalsynthese dieser Apolipoproteine-A ist gefunden worden. Die Chylomikronen enthalten auch Apolipoprotein B-48. Ein Großteil der Chylomikronen-Ergänzung von Apolipoproteinen-A geht verloren, und die C- und E-Apolipoproteine werden erworben, wenn die Chylomikronen in vitro der Einwirkung von Plasma oder Lipoprotein hoher Dichte (HDL) ausgesetzt Erden. Die Erzeugung der Apolipoproteine-A (Apo A) im Darm kann durch andere Faktoren als die Fettabsorption und die Bildung von Chylomikronen geregelt werden.
Die nächste Klasse von Lipoproteinen sind die Lipoproteine von sehr niedriger Dichte, VLDL. Das VLDL-Teilchen ist am Triglycerid-Stoffwechsel und am Tranpport dieser Lipide aus der leber beteiligt. Die Apolipoproteine Apo B-100 und Apo E sind die Hauptbestandteile des VLDL-Teilchens.
Das dritte Lipoprotein wird Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) genannt, und es ist ein spezifisches Produkt des Katabolismus (Abbaustoffwechsels) von VLDL. Das überwiegende Apolipoprotein in dem LDL-Teilchen ist Apolipoprotein B-100 oder Apo B-100.
Die Ergebnisse der nunmehr klassischen Framingham-Untersuchung (1971) zeigen eine klare Korrelation zwischen einem Risiko hinsichtlich der CAD und den Serum-Cholesteringehalten. Diese Untersuchung hat auch gezeigt, daß hohe Gehalte an LDL- (Lipoprotein niedriger Dichte) -Cholesterin mit einem erhöhten CAD-Risiko verbunden sind. Kürtzlich hat eine von dem Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial (1984) durchgeführte Untersuchung gezeigt, daß die Plasmaspiegel an Cholesterin und LDL-Cholesterin durch ein kombiniertes Behandlungsprotokoll aus Diät und Arzneimitteln reduziert werden können, und daß diese Reduktion des Plasma-Cholesterins zu einer Verringerung des Auftretens von CAD-Mortalität führt.
LDL ist das hauptsächliche, Cholesterin-transportierende Lipoprotein im Plasma. Das LDL ist ein großes, kugelförmiges Teilchen, dessen öliger Kern aus etwa 1500 Cholesterinmolekülaren besteht, von denen ein jedes über eine Esterbindung an eine langkettige Fettsäure gebunden ist. Dieser Kern aus Cholesterylestern ist von einer Schicht aus Phospholipid, nicht-veresterten Cholesterinmolekülen und einem einzelnen Molekül von Apolipoprotein B-100 umschlossen. Die Phospholipide sind regelmäßig so angeordnet, daß die hydrophilen Köpfe außen sind, wodurch es ermöglicht wird, daß sich das LDL in dem Blut oder in den extrazellulären Flüssigkeiten in einer hydratisierten Suspension befindet.
Das Cholesterin wird an die Zellen auf LDL über einen spezifischen LDL-Rezeptor abgegeben, und es wird aus den LDL-Teilchen in den Lysosomen freigesetzt, wo es den Cholesterinstoffwechsel der Zelle regeln kann. Eine Ahhäufung von interzellulärem Cholesterin moduliert drei Verfahren.
Erstens reduziert sie die Fähigkeit der Zelle, deren eigenes Cholesterin herzustellen, indem sie die Synthese eines Enzyms, HMG-CoA-Reduktase, abdreht, welches eine Stufe in dem Weg der biologischen Cholesterinsynthese katalysiert. Durch die Unterdrückung dieses Enzyms wird die Zelle von äußerem Cholesterin abhängig, welches aus der durch den Rezeptor vermittelten Aufnähme von LDL stammt.
Zweitens fördert das hereinkommende, aus LDL stammende Cholesterin die Lagerung von Cholesterin in der Zelle, indem es ein mit Lipoprotein- Acyltransferase bezeichnetes Enzym aktiviert. Dieses Enzym verestert Fettsäuren zu überschüssigen Cholesterinmolekülen, wobei Cholesterylester hergestellt werden, welche in Vorratströpfchen abgelagert werden.
Drittens, und am wichtigsten, wird durch die Anhäufung von Cholesterin innerhalb der Zelle ein Feedback-Mechanismus angetrieben, welcher bewirkt, daß die Zelle auhhört, neue LDL-Rezeptoren zu synthetisieren. Dadurch stellen die Zellen ihre Zahl von äußeren Rezeptoren so ein, daß genügend Cholesterin in die Zellen hereingebracht wird, um den verschiedenen Erfordernissen der Zellen zu entsprechen, aber wiederum nicht genug Cholesterin hereingebracht wird, um die Zellen zu überladen. Beispielsweise halten Fibroblasten, die sich aktiv teilen, so daß neues Membranmaterial benötigt wird, eine maximale Zahl von LDL-Rezeptoren von etwa 40.000 je Zelle aufrecht. In Zellen, welche nicht wachsen, beginnt sich das hereinkammende Cholesterin anzuhäufen, das Feedback-System reduziert die Herstellung der Rezeptoren, und die Anzahl der Rezeptoren wird um so viel wie das Zehnfache reduziert.
Anderseits ist gezeigt worden, daß ein anderes, zirkulierendes Lipoprotein, nämlich das Lipoproteinteilchen von hoher Dichte (HDL), an einem Zustand erhöhten Cholesterins beteiligt ist, der seinerseits mit einem abgesenkten Atherosklerose-Risiko verbunden ist. Das Apolipoprotein A-I ist ein strukturelles Protein und ein Ligand des HDL-Teilchens. Die Menge des HDL steht in umgekehrter Korrelation mit dem vorausgesagten Auftreten von Atherosklerose.
Das Lipoprotein hoher Dichte (HDL) enthält zwei Haupt-Apolipoproteine, nämlich Apolipoprotein A-I (Apo A-I) und Apolipoproteen A-II (Apo A-II). Apo A-I ist die Hauptproteinkomponente aller Primaten-HDL. Alle HDL-Teilchen enthalten Apo A-I, und daher hat die Immunquantifizierung von HDL gewöhnlich die Quantifizierung von ApoA-I umfaßt. Etwa 80% der HDL-Teilchen enthalten auch Apo A-II, doch sind noch keine HDL-Teilchen beschrieben worden, welche nur Apo A-II enthalten.
Eine Funktion des Apo A-I ist die Aktivierung des Plasmaenzyms, Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT). Dieses Enzym ist für die Veresterung des freien Cholesterins auf HDL für den Transport zur Leber erforderlich. Bei Fehlen von Apo A-I wird das Cholesterin im Blut nicht verestert, und somit wird das Cholesterin aus dem Blut auch nicht weggeräumt. Die spezifische Rolle in dem HDL-Stoffwechsel, welche von dem Apo A-II gespielt wird, ist noch nicht definiert worden.
Viele Untersuchungen haben gezeigt, daß erhöhte Spiegel an HDL mit einem verringeren Auftreten von korrelieren. Einige Autoren haben die Veresterung ausgesprochen, daß das HDL das Cholesterin von peripheren Stellen, wie z.B. der Arterienwand, entfernt, und daher zu den anti-atherogenen Eigenschaften des HDL beiträgt. Höhere Konzentrationen von HDL-Cholesterin korrelieren mit einem relativ normalen Lipidstoffwechsel und einem niedrigeren Auftreten von kadiovaskulären Erkrankungen bzw. mit einer geringeren Schwere dieser Erkrankungen, während hohe Spiegel an LDL-Cholesterin einem abnormen Lipidstoffwechsel und einem erhöhten Risiko von CAD zugeordnet sind. Für die richtige Führung von Patienten mit Hyperlipidämie (einem übermäßigen Lipidgehalt im Blut) und jener Patienten, bei denen ein besonderes Risiko für CAD besteht, ist es wünschenswert, häufig die engen von LDL- und HDL-Cholesterin zu bestimmen. Bisher sind die Tests auf HDL-Cholesterin umständlich und ungenau zur Bestimmung der Blutspiegel an HDL gewesen.

B. Lipoprotein-Struktur und -funktion

Es ist wichtig, zu verstehen, daß das Cholesterin im Plasma nicht frei vorkommt, sondern durch Lipoproteine zu Gewebestellen im Körper transportiert wird. Das Cholesterin kann durch darauf gerichtete, zelluläre Synthese oder durch die Nahrung erhalten werden. Das Cholesterin kann jedoch aus dem Wirtsorganismus nur durch die Leber entfernt werden, so es zu Gallensäuren umgewandelt und ausgeschieden wird.
Die Chylomikronen transportieren Cholesterin und Triglyceride zu der Leber für die spätere Verarbeitung, während das LDL das Cholesterin zu außerhalb der Leber befindlichen Geweben, einschließlich der Koronararterien, heranbringt. Daher ist das Lipoprotein LDL/Apo B an der Ablagerung von "schlechtem" Cholesterin in peripherem Gewebe beteiligt. Umgekehrt entfernt das Lipoprotein HDL/Apo A "gutes" Cholesterin aus den Geweben und bringt das Cholesterin für die Ausscheidung zur Leber zurück.
Historisch gesehen sind schon viele Systeme zum Isolieren und Kennzeichnen von Lipoproteinen entwickelt worden. Diese Techniken basieren gewöhnlich auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipoproteinteilchen. Die zwei am häufigsten angewendeten Techniken sind die Ultrazentrifugation und die Elektrophorese.
Die auf einem Differential-Dichtegradienten basierende Ultrazentrifugation nützt die Tatsache aus, daß Lipoproteine leichter oder weniger dicht als andere Plasmaproteine sind, und es ist relativ leicht, wenn auch zeitraubend und umständlich, die Chylomikronen (die leichtesten Lipoproteine), VLDL, LDL und HDL voneinander zu trennen. Elektrophoresetechniken sind zum Klassifizieren von Patienten mit Hyperlipidämien nützlich gewesen. Diese Techniken kennen jedoch in einem gewöhnlichen, klinischen Laboratorium nicht ohne weiteres durchgeführt werden.
Es ist auch einzusehen, daß die einfache Quantifizierung von Blutcholesterin oder -triglyceriden dem Arzt keine Information darüber erteilt, welche Lipoproteine diese Lipide transportieren, und was deren Quantifizierung ist.

C. Die Plasma-Lipoproteine

Vier Hauptklassen von Plasma-Lipoproteinen, nämlich die Chylomikronen, VLDL, LDL und HDL, sind definiert worden, und zweifellos gibt es auch Unterklassen innerhalb dieser Klassen. Alle Lipoproteine haben ihren Ursprung im Darm oder in der Leber, oder in beiden, und sie scheinen eine pseudomizellare Struktur zu haben. Neutrale Lipide, und insbesondere Cholesterinester und Triglyceride, werden im Kern der Lipoproteine in einer löslichen und stabilen Form durch Wechselwirkungen mit den polaren Oberflächenbestandteilen, nämlich den Apolipoproteinen und Phospholipiden, gehalten.
In diesen Komplexen ist auch nicht-verestertes Cholesterin vorhanden. Seine Polarität liegt zwischen jener der neutralen Lipide (Cholesterylester und Triglyceride) und jener der in höherem Maße polaren Apolipoproteine und Phospholipide, und es findet sich sowohl im Kern als auch auf der Oberfläche.
Eine äußere Oberfläche, welche aus Apolipoproteinen, nicht-verestertem Cholesterin und Phospholipiden besteht, umgibt einen wasserunlöslichen Kern aus Cholesterylestern und Triglyceriden und schützt die apolaren Lipide vor der wäßrigen Umgebung. Diese generelle Auffassung von der Struktur wird durch Untersuchungen anhand der Streuung von Röntgenstrahlen unter einem niedrigen Einfallswinkel und durch andere physikalische Untersuchungen gestützt, bei welchen eine Vielfalt von Sonden zum Erforschen der Struktur der Lipoproteine verwendet worden ist. Eine wichtige Funktion der Plassa-Lipoproteine liegt somit in der Solubilisierung und im Transport der neutralen Plasmalipide.

D. Die Apolipoproteine

Die Apolipoproteine sind die lipidfreien Proteinkomponenten der Plasma-Lipoproteine, welche durch Behandeln isolierter, intakter Lipoproteine mit organischen Lösungsmitteln, Detergentien und chaotropen Mitteln erhalten worden sind. Nicht alle mit Lipoproteinen eingefangenen Proteine spielen notwendigerweise eine Rolle im Lipidtransport. Ein einschlägiges Beispiel ist die vor kurzem gewonnene Erkenntnis, daß die Serum-Amyloid-A-Proteine, nämlich Reaktionskomponenten der akuten Phase, in an HDL gebundenem Plan transportiert werden. Diese ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden Proteine köhnen bis zu 30% der Apo-HDL in Entnündungszuständen ausmachen, doch ist es zweifelhaft, ob sie spezifische Rollen beim Lipidtransport spielen.
Das Apolipoprotein A-I (Apo A-I), welches in HDL-Teilchen vorhanden ist, ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung interessierende Protein. Das Apo A-I wird nachstehend erörtert.
Das Apo A-I ist die Hauptproteinkomponente von allen Primaten-HDL, es liegt in allen HDL-Teilchen vor, und es gibt mehrere, z.B. etwa 7-8, Apo-A-I-Moleküle je HDL-Teilchen. Es ist über das Apo A-I berichtet worden, daß es in relativ geringen Mengen in Chylomikronen, VLDL und LDL vorliegt, sowie daß es etwa 60 bis 80% des HDL-Proteins ausmacht.
Das Apo A-I besteht aus einer einzelnen Kette von 243 bis 245 Resten; es enthält kein Cystin, Cystein, Leucin oder Kohlenhydrat; und es kommt in verschiedenen Isoformen vor. Das Apo A-I hat einen Alpha-Helix-Gehalt von etwa 55% im lipidfreien Zustand, der nach einem Binden an ein Phospholipid auf etwa 75% ansteigt. Sich wiederholende Zyklen von 11 Helix-Resten sind in diese Apolipoprotein identifiziert worden. Es ist die Vermutung ausgesprochen worden, daß diese Einheiten eine einzelne Stammkette darstellen, aus welcher durch Gen-Duplikation eine aus 22 Resten bestehende, sich wiederholende Einheit entstanden ist. Diese Einheiten weisen eine nahe Homologie in ihren Sequenzen auf, und es wird angenommen, daß sie die lipidbindenden Regionen des Proteins darstellen.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, ist das Apo A-I ein wirksamer Aktivator der LCAT, eines Plasmaenzyms, welches die Umwandlung von (Cholesterin und Phosphatidylcholin in Cholesterylester bzw. Lysophosphatidylcholin katalysiert. Es ist gefunden worden, daß spezifische Lipidbindungsregionen des Apo A-I die LCAT aktivieren, und diese Aktivität ist der Lipidbindungseigenschaft zugeordnet worden. Wie bereits erwähnt worden ist, wird das Apo A-I in der Leber und im Darm synthetisiert, doch sind deren relative Beitragsmengen zum Gesamtplasmagehalt sowie die Faktoren, welche die Apo A-I-Produktion modulieren, noch nicht wohldefiniert.
Typischerweise sind mehr als etwa 90% des Plassa-Apo-A-I mit HDL assoziiert, weniger als etwa 1% sind mit VLDL und LDL assoziiert, und etwa 10% oder weniger sind mit der lipoproteinfreien Fraktion des Plasmas assoziiert. Die Mengen des Apo A-I in jedem Teilchentypus unterscheiden sich voneinander, in Abhängigkeit von den Personen, welche über diese Daten berichten, und es scheinen diese Mengenangaben eine Funktion der zum Auftrennen der Teilchen angewendeten Techniken zu sein.
Die Messung des Hauptproteinbestandteiles von HDL, nämlich des Apo A-I, ist klinisch von Bedeutung. Die Ergebnisse einer Anzahl von Untersuchungen haben aufgezeigt, daß die Apo-A-I-Gehalte in Subjekten mit CAD verringert sind. Diese Beobachtung betont die schützende Rolle des Plasma-Apo-A-I in dieser Patientengpppe.
Durch die Ergebnisse von mehreren Untersuchungen wird es nahegelegt, daß es durch genaue Messung des Apo-A-I-Gehaltes möglich sein kann, die Prognose eines Individuums hinsichtlich eines abnormen Lipidstoffwechsels, von Atherosklerose und insbesondere von CAD, vorherzusagen. Die Menge des Apo A-I allein konnte jedoch nicht als Marker für einen abnormen Lipidstoffwechsel benützt werden, wenn auch nur aus dem Grunde, daß es schwierig ist, die Menge des Apo A-I genau und exakt zumessen. Obwohl somit relativ hohe Apo-A-I-Spiegel die Tendenz zeigen, mit einem normalen Lipidstoffwechsel zu korrelieren, und relativ niedrige Mengen von Apo A-I die Tendenz zeigen, mit einem abnormen Lipidstoffwechsel und CAD zu korrelieren, ist nichts über eine klare Trennlinie zwischen normalen Personen und solchen mit bekannter CAD berichtet worden.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, hat es sich erwiesen, daß das Apo A-I äußerst schwierig genau und exakt in einem klinisch brauchbaren Immunoassaysystem zu quantifizieren ist, wie z.B. in einem Radioimmunoassay (RIA), einem Enzyme-Linked Immunoassay (ELISA), einem Elektroimmunoassay (EIA), einer Radialimmundiffusion (RID) oder durch Immunnephelometrie (INA). Siehe z.B. die Tabelle 1 von Steinberg et al. (1983), Clin.Chem. 29/3: 415-426, hinsichtlich der Veränderlichkeit in den Werten, die für die verschiedenen Techniken angegeben werden.
Einer der Gründe, die für diese Schwierigkeiten bei der Analyse angerührt werden, besteht darin, daß das Apolipoprotein-A-Molekül im Plasma und Serum als Teil eines großen, biochemisch heterogenen Teilchens vorliegt, in welchem einige der antigenen Stellen (Epitopen) der Moleküle versteckt und abgedeckt sind. Demzufolge haben mehrere Forscher bei ihren Proben Demaskierungsbehandlungen angewendet, so daß die normalerweise versteckten Epitope demaskiert werden und für die Immunreaktion zur Verfügung stehen.
Steinberg et al. (1983), Clin.Chem.29:415-426, erörtern ebenfalls eine Demaskierung durch Behandlung einer Blutprobe, wie z.B. Plasma oder Serum, mit Denaturierungsmitteln, wie z.B. Harnstoff, Tetramethylharnstoff und Guanidin, grenzflächenaktiven Mitteln, wie z.B. Natriumdodecylsulfat und Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat (Tween 20), durch Erhitzen, wie z.B. auf 52ºC während 3 h, und auf 37ºC während 2 h, sie mit entlipidierenden, orgnischen Lösungsmitteln, wie z.B. mit Gemischen aus Ethanol und Diethylether, Methahol und Diethylether, Chloroform und Methanol und dgl. mehr. Zusätzliche, spezifische Demaskierungsbehandlungen finden sich in den Arbeiten, über welche von Maciejko et al. (1982), Clin.Chem., 28:199-204 (grenzflächenaktives Mittel); Koren et al. (1985), Clin.Chem.Chim.Acta, 147:85-98 (organisches Lösungsmittel); und Bury et al. (1985), Clin.Chem., 31:247-251 (37ºC, 2 h) berichtet worden ist.
Einige der eigen Forscher und andere haben auch Präparationen polyklonaler Antikörper verwendet, in dem Bestreben, die scheinbare Heterogenität des Apo-A-I, wie dasselbe in Plasma und Serum vorliegt, zu vermeiden. Maciejko et al. (1982), Clin.Chem., 28:199-204; Koren et al. (1985), Clin.Chim.Acta, 147:85-95; Bury et al. (1985), Clin.Chem., 31:247-251; und Fesmire et al. (1984), Clin.Chem., 30:712-716. Selbstverständlich ist die Verwendung polyklonaler Antikörper in einem klinisch brauchbaren, quantitativen Immunoassay mit dem Nachteil behaftet, daß Unterschiede in der Antikörperektivität auftreten, welche auf den Gebrauch von Seren aus verschiedenen Tieren zurückzuführen sind, und daß auch Unterschiede in der Immunspezifität bei verschiedenen Serumchargen auftreten.
Darüberhinaus haben Kottke et al. (1986), Mayo Clin.Proc., 61:313-320, die Gehalte an Apolipoproteinen A-I, A-II und B, HDL-Cholesterin, Triglyceriden und das Alter als Variable in männlichen Individuen gemessen, und sie haben gefunden, daß die Verwendung aller sechs dieser Variablen erforderlich war, um CAD-Patientengenau von asympomatischen Kontrollen zu unterscheiden. Diese Forscher benützten Radioimmunoassays für ihre Bestimmungen.
Nach den Berichten von Kottke et al. wurden für die RIA-Messung von Apo-A-I Werten polyklonale Antikörper, eine Aufrechterhaltungszeit von Antikörper und Probe von 16 h, und eine demaskierende Behandlung mit einem Detergens angewendet. Für die RIA-Messung des Apo-B wurde den Berichten nach ein monoklonaler Antikörper verwendet. Kottke et al. gaben mittlere Apo-A-I-Werte für normale und CAD-Patienten an, welche innerhalb einer Standardabweichung keine Überlappungen zeigten.
Anderseits haben keine anderen Forscher, abgesehen von den monoklonalen, paratopen Molekülen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, monoklonale Antikörper beschrieben, welche im wesentlichen gleichermaßen mit HDL-Teilchen und Apo-A-I eine Immunreaktion eingehen, und welche auch mit im wesentlichen dem gesamten, in einer Probe vorhahenen Apo-A-I eine Immunreaktion eingehen. So haben Curtiss et al. (1985), J.Biol.Chem., 200:2982-2998, über einen mit A-I-7 bezeichneten, monoklonalen Antikörper berichtet, der zwar etwa gleichermaßen mit Apo-A-I und HDL immunologisch reagierte, der aber nur in der Lage war, etwa 60% des bekanntermaßen in den untersuchten Proben vorhandenen, radioaktiv markierten Apo-A-I oder HDL immunologisch auszufällen.

E. Monoklonale, paratope Moleküle als Reagentien für Apo A-I

Die Verwendung monoklonaler Antikörper oder von deren Teilen, welche eine Antikörperbindungsstelle enthalten, nämlich paratoper Moleküle, als Reagentien zum Testen auf das Vorliegen von Apo A-I in Humanblutproben ist attraktiv, weil solche Reagentien, sobald sie einmal erhalten worden sind, in relativ großen Mengen mit gleichmäßiger Qualität erzeugt werden können, wodurch somit das mit polyklonalen Antikörpern verbundene Ungleichmäßigkeitsproblem vermieden wird. Es gibt jedoch einige Faktoren, welche gegen die Verwendung eines besonderen, monoklonalen, paratopen Moleküls als Komponente in solchen Testsystemen sprechen.
Für die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als Beispiel eines monoklonalen, paratopen Moleküls gilt nach dem Stand der Technik die Lehre, daß ein monoklonaler Antikörper in zu hohem Maße immunspezifisch sein kann, um von Nutzen zu sein, und zwar wegen der antigenen Heterogenität seines Zielantigens. Beispielsweise hängt die Spezifität herkömmlicher Antiseren mit einem Gehalt an polyklonalen Antikörpern von einer Übereinstimmung von Hunderttausenden von unterschiedlichen Antikörpern ab, welche sich an antigene Determinanten binden, welche ein antigenes Protein zum größten Teil oder insgesamt bedecken, was sich in Apo-A-I-Tests als nützlich erwiesen hat. Demzufolge werden kleine Veränderungen in der Struktur des Antigens, welche auf genetischen Polymorphismus, eine Heterogenität bei der Glykosylierung, auf eine geringfügige Denaturierung oder auf eine sonstige Reaktion zurückzuführen sind, gewöhnlich kaum eine Wirkung auf das Binden durch polyklonale Antikörper haben. In ahnlicher Weise wird eine größere oder kleinere Unterklasse von Antikörpern aus polyklonalen Antiseren sich gewöhnlich an Antigene binden, welche modifiziert oder denaturiert worden sind.
Im Gegensatz hierzu binden sich monoklonale Antikörper gewöhnlich an eine einzige antigene Determinante (ein Epitop) auf dem Antigenmolekül. Wird diese Determinante aus irgendeinem Grunde verändert, so mag sich der Antikörper weiterhin an dieselbe binden, oder auch nicht. Ob dies nun ein Problem oder ein Vorteil ist, hängt von den jeweiligen besonderen Umständen ab. Soll der monoklonale Antikörper, wie im vorliegenden Falle, in einem diagnostischen Test auf ein Apolipoprotein verwendet weden, dann kann eine kleine antigene Veränderung in diesem Protein zu groben Fehlern führen.
Zweitens hängt die erfolgreiche Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (Mab) - wegen der einzigartigen Spezifität solcher Antikörper - oft von der Affinität des Antikörpers für das Zielantigen ab. Beispielsweise kann ein Mab zwar eine ausreichende Affinität aufweisen, um zum Binden eines in flüssiger und fester Phase vorliegenden Antigens nützlich zu sein, wobei der Mab selbst in der flüssigen Phase vorliegt; es mag derselbe Antikörper aber dann nicht brauchbar sein, wenn er als ein an eine feste Phase gebundener Antikörper vorliegt, der brauchbar ist, um das Antigen aus der Lösung zu binden und festzuhalten.
Die obigen Probleme gelten generell für die Verwendung monoklonaler Antikörper. Die Fachleute haben daher erkannt, daß es wesentlich ist, monoklonale Antikörper in jedem Testsystem, in welchem sie verwendet werden sollen, zu prüfen und zu kennzeichnen. Siehe Goding, James W., "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, New York (1983), Seiten 40-46.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Hybridome und die von diesen Hybridomen sezernierten, monoklonalen, paratopen Moleküle vorgesehen, welche immunologisch mit Apolipoprotein A-I reagieren, sowie sind Verfahren zum Testen auf das Vorliegen von Apolipoprotein A-I oder HDL in einer flüssigen Probe und ein diagnostisches System, typischerweise in Kitform, vorgesehen, welches zur Durchführung von Testverfahren, insbesondere anhand einer flüssigen Blutprobe, nützlich sind.
Somit ist gemäß einem Aspekt der Erfindung ein Hybridom vorgesehen, welches aus einer Gruppe von Hybridomen ausgewählt ist, welche die ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 aufweisen. Erfindungsgemäß sind weiterhin die monoklonale, paratopen Moleküle vorgesehen, welche von jedem dieser Hybridomen sezerniert werden, und welche mit Apolipoprotein A-I reagieren. Diese monoklonalen, paratopen Moleküle sind vorzugsweise ganze monoklonale Antikörper.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Testen auf das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe. Dieses Verfahren umfaßt die Stufen des Vermischens einer zu untersuchenden, flüssigen Probe mit einer wirksamen Menge von einem der obgenannten fünf monoklonale, paratopen Moleküle unter Bildung eines Gemisches. Dieses Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die paratopen Moleküle mit dem in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und eine Immunreaktionskomponente bilden, aufrechterhalten. Dann wird das Vorliegen der Immunreaktionskomponente festgestellt, womit auch das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der ursprünglichen Probe festgestellt wird. Bei dieser Ausführungsform enthalten die paratopen Moleküle vorzugsweise ein mit ihnen in wirksamer Weise verknüpftes, radioaktives Element als Anzeigemittel, und das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der ursprünglichen Probe wird durch Abtrennen der Immunreaktionskomponente von dem Rest des Gemisches und Testen der abgetrennten Immunreaktionskomponente auf emittierte Strahlung festgestellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des Testverfahrens werden die erstgenannten, monoklonalen, paratopen Moleküle vor der Bildung des Gemisches unter Bildung eines festen Trägers an eine feste Matrix gebunden. Die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen dieses festen Trägers werden blockiert. Die Immunreaktionskomponente, welche nach dem Vermischen der flüssigen Probe gebildet worden ist, wild an den festen Träger als an eine feste Phase gebundene Immunreaktionskomponente gebunden. Bei dieser Ausfürungsform wird es bevorzugt, daß das Vorliegen der an eine feste Phase gebundenen Immunreaktionskomponente unter Verwendung zweiter, monoklonaler, paratoper Molekule festgestellt wird.
Hier werden die in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Moleküle mit dem obigen, erstgenannten Gemisch unter Bildung eines zweiten Gemisches vermischt. Diese zweiten paratopen Moleküle geben mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion ein und werden aus den 0bgenannten, monoklonalen, paratopen Molekülen ausgewählt, sie sind aber nicht jene Moleküle, die in dem erstgenannten Gemisch verwendet worden sind, noch wird die Immunreaktion dieser zweiten, monoklonalen, paratopen Moleküle durch die Immunreaktion der erstgenannten, paratopen Moleküle wesentlich blockiert oder gehemmt. Diese zweiten, paratopen Moleküle sind in wirksamer Weise mit einem Anzeigemittel verknüpft, welches vorzugsweise ein Enzym ist.
Das zweite, so gebildete Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die zweiten, mit dem Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle mit dem in dem Gemisch voihandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, aufrechterhalten. Die nach dem Vermischen beider paratoper Moleküle, und der Bildung der Immunreaktionskomponente, gebildeten, festen und flüssigen Phasen werden voneinander getrennt, und das Vorliegen des mit dem Anzeigemittel verknüpften Apolipoproteins A-I in der abgetrennten, festen Phase wird festgestellt, wodurch auch das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der Probe festgestellt wird.
Die monoklonalen, paratopen Moleküle der vorliegenden Erfindung sind auch in quantitativen Tests auf die Menge von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe, insbesondere in einer flüssigen Blutprobe, wie z.B. Serum oder Plasma, nützlich. Sind quantitative Ergebnisse erwünscht, dann werden generell ähnliche Stufen wie die vorstehend in Umrissen beschriebenen, wie folgt angewendet.
So wird eine bekannte Menge einer zu untersuchenden, flüssigen Probe mit einem festen Träger, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an die feste Phase gebundene, erste, monoklonale, paratope Moleküle aufweist, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, unter Bildung eines aus festen und flüssigen Phasen bestehenden Gemisches, vermischt. Die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche des festen Trägers werden blockiert. Das aus festen und flüssigen Phasen bestehende Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne aufrechterhalten, welche dafür ausreicht, daß die ersten paratopen Moleküle mit im wesentlichen dem gesamten, in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, aufrechterhalten.
Das Apolipoprotein A-I der obigen flüssigen Probe wird weiterhin mit den in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Molekülen, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, aber in dem erstgenannten Gemisch nicht verwendet werden, und welche in wirksamer Weise an ein Enzym-Anzeigemittel gebunden sind, unter Bildung eines zweiten Gemisches, vermischt. Somit sind die in dieser Stufe verwendeten, paratopen Moleküle jeweils die anderen von den zwei in der ersten Vermischungsstufe genannten Molekülen.
Das so gebildete, zweite Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese zweiten, an das Anzeigemittel gebundenen, paratopen Moleküle mit im wesentlichen dem gesamten, in dieser Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktionkomponente bilden, aufrechterhalten. Die festen und flüssigen Phasen, welche sich aus den obigen Vermischungs- und Aufrechterhaltungsstufen ergeben, werden voneinander getrennt, und die Menge der an das Anzeigemittel gebundenen, das Apolipoprotein A-I enthaltenden Immunreaktionkomponente, welche in der abgetrennten festen Pbase vorliegt, und dadurch die Menge des in der Probe vorhandenen Apolipoproteins A-I, wird festgestellt.
Es wird besonders bevorzugt, daß die zwei Vermischungsstufen des obigen Testverfahens im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden, und daß die zwei Stufen des Aufrechterhaltens zusammen durchgeführt werden.
Dort, wo diese Stufen nicht im wesentlichen gleichzeitig bzw. zusammen durchgeführt werden, wird es bevorzugt, daß die festen und flüssigen Phasen, welche am Ende der ersten Aufrechterhaltungsstufe vorhanden sind, vor dem zweiten Vermischen voneinander getrennt werden, in welchem Fall das in dem zweiten Gemisch verwendete Apolipoprotein A-I jenes ist, welches in der an eine feste Phase gebundenen Immunreaktionskomponente vorliegt, die in dieser ersten Aufrechterhaltungsstufe gebildet worden ist.
Ein diagnostisches System, typischerweise in Kitform, und welches für den Gebrauch zum Feststellen des Vorliegens von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe geeignet ist, stellt einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Bei einer Ausführungsform umfaßt das System eine Packung, welche paratope Moleküle enthält, die von einer der oben erörterten Hybridomen sezerniert worden sind, und die in einer Menge vorliegen, die für die Durchführung von wenigstens einem Test ausreicht. In höherem Maße bevorzugt enthält das diagnostische System weiterhin ein Anzeigemittel, welches in wirksamer Weise direkt mit dem obigen, paratopen Molekül verknüpft ist, oder welches mit einem anderen Molekül verknüpft ist, welches befähigt ist, die Immunreaktion der obigen paratopen Moleküle mit Apolipoprotein A-I zu signalisieren.
In höchstem Maße bevorzugt ist das diagnostische System für den Gebrauch zum Feststellen der Menge des in einer flüssigen Blutprobe vorhandenen Apolipoproteins A-I geeignet. Dieses diagnostische System umfaßt eine erste Packung, welche einen festen Träger enthält, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an diese feste Matrix gebundene, monoklonale, paratope Moleküle aufweist, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 2101 sezerniert worden sind. Die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen dieses festen Trägers sind blockiert. Dieses System umfaßt weiterhin eine zweite Packung, welche paratope Moleküle enthält, die mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder BB 9201 sezerniert worden sind, aber nicht von den Hybridomen der ersten Packung sezerniert worden sind, und welche in wirksamer Weise mit einem Enzym-Anzeigemittel verknüpft sind.
Die vorliegende Erfindung weist verschiedene Vorteile auf und ist in mehrfacher Hinsicht von Nutzen.
Einer dieser nützlichen Aspekte und Vorteile besteht darin, daß durch die vorliegende Erfindung Reagentien zur Verfügung gestellt werden, welche befähigt sind, mit im wesentlichen dem gesamten Apolipoprotein A-I oder mit allen HDL-Teilchen in einer flüssigen Blutprobe, wie z.B. Serum oder Plasma, immunologisch zu reagieren.
Ein anderer Nutzen und Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin gelegen, daß durch die Verwendung jener paratopen Moleküle ein qualitativer Test auf das Vorliegen von Apolipoprotein A-I oder HDL zur Verfügung gestellt werden kann.
Noch ein weiterer Nutzen und Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin gelegen, daß durch die Verwendung der besonders bevorzugten paratopen Moleküle, welche von zweien der erfindungsgemaßen Hybridomen sezerniert worden sind, ein in hohem Maße genauer und präziser Test durchgeführt werden kann, um die Menge des in einer Blutprobe vorhandenen Apolipoproteins A-I zu quantifizieren.
Ach weitere nützliche Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der nachstehenden, eingehenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Zeichnungsfiguren, welche einen Teil der vorliegenden Offenbarung bilden, zeigen:
Die Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die Fähigkeit einer bekannten, konstanten Menge (0,375 ug/ml) von mit Meerrettich-Peroxidase (HRPO) markierten AI-10-Molekülen, mit dem an einer festen Phase befestigten Reagens Apolipoprotein A-I in Genwart zunehmender Mengen von nicht-markierten AI-10- ( ) - und AI-11- ( ) -Molekülen immunologisch zu reagieren, veranschaulicht. Die Ordinate zeigt die Einheiten der tischen Dichte, während die Abszisse die Einheiten von ug der zugesetzten, nicht-markierten, konkurrierenden, monoklonalen Antikörper zeigt. Einzelheiten betreffend diese Untersuchung finden sich in dem Abschnitt mit der Überschrift "Materialien und Methoden".
Die graphische Darstellung zeigt, daß zunehmde Mengen der unmarkierten AI-10-Moleküle in dem Immunreaktionsgemisch zu einer entsprechenden Abnahme in der Menge des markierten AI-10 führen, welches als an die feste Phase gebundene Immunreaktionskomponente vorliegt. Somit konkurriert das unmarkierte AI-10 mit dem markierten AI-10 um das Apo A-I.
Die graphische Darstellung zeigt auch, daß zunehmende Mengen von unmarkierten AI-11-Molekülen zu keiner signifikanten Abnahme in der Menge der markierten AI-10-Moleküle führen, welche als in fester Phase vorliegende Immunreaktionskomponente gebunden sind. Somit stehen die unmarkierten AI-11-Moleküle nicht in Konkurrenz mit den markierten AI-10-Molekülen um das Binden mit dem Apolipoprotein A-I.
Die Fig. 2 enthält eine graphische Darstellung, welche veranschaulicht, daß bei Verwendung von HDL als an die feste Phase gebundenem Antigen mit einer konstanten Menge (0,375 ug/ml) von mit HRP-markieren AI-10-Molekülen, sowie mit unmarkierten AI-11-Molekülen ( ) und AI-10-Molekülen ( ) äbnliche Ergebnisse wie jene der Fig. 1 erhalten werden. Die AI-10- und AI-11-Moleküle binden sich daher an verschiedene Epitope, welche auf der Oberfläche des Apolipoproteins A-I oder HDL in ausreichendem Maße voneinander getrennt sind, um ein Binden beider Moleküle von monoklonalen Antikörpern an ein einzelnes Apo-A-I-Molekül ohne sterische Behinderung oder Hemmung des Bindens des jeweils anderen Moleküls zu ermöglichen.

Eingehende Bescbreibung der Erfindung

1. Erörterung

A. Definitionen

Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf ein Molekül, das ein Glied einer Familie von glykosylierten Proteinen ist, welche Immunglobuline genannt werden und welche sich spezifisch mit einem Antigen verbinden können. Ein solcher Antikörper verbindet sich mit seinem Antigen durch eine spezifische immunologische Bindungswechselwirkung zwischen der antigenen Determinante des Antigens und der Antikörper-Bindungsstelle des Antikörpers.
Eine "Antikörper-Bindungsstelle" ist jener strukturelle Teil eines Antikörpermoleküls, welches aus einer Schweren und einer Leichten Kette sowie aus variablen und hypervariablen Regionen besteht, der sich spezifisch an das Antigen bindet. Unter Verwendung der Nomenklatur von Jerne, (1974), Ann.Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-389, wird eine Antikörper-Bindungsstelle hierin gewöhnlich als "Paratop" bezeichnet.
Die die Antikörper-Bindungsstelle enthaltenden (das Paratop enthaltenden) Polypeptidteile von Antikörpern sind jene Teile der Antikörpermoleküle, welche das Paratop enthalten und sich an ein Antigen binden, und welche z.B. die Fab-, Fab'-, F(ab')&sub2;- und F(v)-Teile der Antikörper enthalten. Die Fab- und F(ab')&sub2;-Teile von Antikörpern werden durch die proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin mit im wesentlichen intakten Antikörpern nach wohlbekannten Verfahren hergestellt. Siehe z.B. die US-PS Nr. 4 342 566 von Theofilopolous und Dixon. Die Fab'-Antikörperteile sind ebenfalls wohlbekannt und werden aus F(ab')&sub2;-Teilen, mit anschließender Ruduktion der die zwei Teile der Schweren Kette miteinander verbindenden Disulfidbindungen, z.B. mit Merkaptoethanol, und anschließender Alkylierung des entstandenen Proteinmerkaptans mit einem Reagens wie z.B. Jodacetamid hergestellt. Intakte Antikörper werden bevorzugt, und sie werden als die monoklonalen Ligandenmoleküle dieser Erfindung veranschaulichend herangezogen.
Das Art "Antigen" ist historisch zur Bezeichnung eines Moleküls verwendet worden, das durch einen Antikörper gebunden wird, und es ist auch zur Bezeichnung des Moleküls verwendet worden, welches die Produktion des Antikörpers induziert. Nach dem geläufigeren Wortgebrauch wird die Bedeutung von "Antigen" auf jenes Molekül beschränkt, welches von einem Antikörper gebunden wird, während das Wort "Immunogen" für jenes Molekül verwendet wird, welches die Produktion von Antikörpern induziert. Ist ein im Rahmen der vorliegenden Unterlagen erörtertes Molekül sowohl immunogen als auch antigen, so wird es generell als Antigen bezeichnet.
Der Ausdruck "antigene Deteminante" bezieht sich auf den tatsächlichen, strukturellen Teil des Antigens, der von einer Antikörper-Bindungsstelle immunologisch gebunden wird. Nach der Jerne-Nomenklatur wird eine antigene Determinante auch als "Epitop" neu definiert.
Der Ausdruck "biologisch aktiv" bezeichnet zumindest die Fähigkeit eines proteinartigen Moleküls, sich spezifisch an ein Antigen oder an eine spezifische Antikörper-Bindungsstelle zu binden, obgleich in diesem Molekül auch eine andere, generelle oder Effektor-Fähigkeit vorliegen kann. Die biologische Aktivität eines paratopen Moleküls, welches eine Antikörper-Bindungsstelle enthält, erweist sich durch die immunologische Reaktion des Paratops (der Antikörper-Bindungsstelle) mit dessen (deren) Epitop (der antigenen Determinante) - wenigstens bei physiologischen pH-Werten und Ionenkonzentrationen - bei deren Vermischen in einem wäßrigen Medium unter Bildung einer Immunreaktionskomponente. Vorzugsweise kamitt die biologische Aktivität unter den Bedingungen eines biologischen Tests vor; nämlich jenen Bedingungen, unter welchen sich ein im Rahmen dieser Erfindung brauchbares, monoklonales, paratopes Molekül an das Epitop (die antigene Determinante) innerhalb eines pH-Wertebereiches von etwa 5 bis etwa 9, und bei Ionenkonzentrationen, wie z.B. von jenen des destillieren Wassers bis zu etwa jener einer 1M Natriumchloridlösung, und bei Temperaturen von etwa 4ºC bis etwa 45ºC, bindet. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbaren, monoklonalen, paratopen Moleküle sind alle biologisch aktiv.
Der Ausdruck "ELISA" betrifft einen "Enzyme-Linked-Immunoasorbent-Assay", bei welchem ein an eine feste Phase gebundenes Antigen oder ein an eine feste Phase gebundener Antikörper und ein Enzym-Antikörper- oder Enzym-Antigen-Konjugat verwendet werden, um die Menge des in einer Probe vorliegenden Antigens oder Antikörpers festzustellen und zu quantifizieren. Eine Beschreibung der ELISA-Technik findet sich in Kapitel 22 der 4. Auflage von "Basic and Clinical Immunology" von D.P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publicaticns, Los Altos, CA, im Jahre 1982, und in den US-PS'en Nrn. 3 654 090; 3 850 752; und 4 016 043, welche allesamt durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen werden.
Der Ausdruck "Enzym" bezieht sich auf ein Protein, welches aufgrund einer katalytischen Wirkung befähigt ist, eine bestimmte Veränderung in einem Substrat zu beschleunigen oder hervorzurufen, für welches Substrat das Enzym häufig spezifisch ist.
Der Ausdruck "Immunreaktionskomponente", wie er in den vorliegenden Unterlagen gebraucht wird, bezieht sich auf das Produkt einer immunologischen Reaktion; nämlich auf jenes Molekül, das entsteht, wenn ein Antigen immunologisch von einen Antikörper oder einem ein Paratop enthaltenden Molekül gebunden wird. Eine Immunreaktionskomponente ist daher eine spezifische Art von Komplex, der zwischen Molekülen ausgebildet worden ist.
Die Ausdrücke "Anzeigemittel", "Enzym-Anzeigemittel" oder "Label" - in verschiedenen grammatikalischen Formen - werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen austauschbar verendet, und sie umfassen einzelne Atome, Moleküle und Enzyme, welche an der Erzeugung eines feststellbaren Signals entweder direkt oder indirekt beteiligt sind, wobei dieses Signal das Vorliegen einer Immunreaktionskomponente anzeigt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist im wesentlichen irgendein Anzeigemittel brauchbar, das mit einem Antikorper verknüpft oder demselben einverleibt werden kann, und diese Anzeigemittel können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagentien verwendet werden. Solche Indikatoruruppen oder Labels sind in der Immunchemie als solche wohlbekannt, und sie stellen einen Teil dieser Erfindung nur insofern dar, als sie bei ansonsten neuen, paratopen Molekülen, Verfahren und/oder Systemen benützt werden. An ein Enzym-Anzeigemittel gebundene, paratope Moleküle werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen manchmal als an ein Enzym gebundene, paratope Moleküle bezeichnet.
Der Ausdruck "ganzer Antikörper" wird im Rahmen der vorliegenden Unterlagen verwendet, um ein vollständiges, intaktes Molekül, welches von einer Zelle sezerniert worden ist, von anderen, kleineren Molekülen zu unterscheiden, welche ebenfalls das für die biologische Aktivität an einer Immunreaktion mit einem Epitop notwendige Paratop enthalten.
Die paratopen Moleküle der vorliegenden Erfindung sind monoklonale, paratope Moleküle. Ein "monoklonaler Antikörper" (Mab) ist ein Antikörper, der von Klonen eines Hybridoms erzeugt worden ist, welches nur eine Art von Antikörpermolekül sezerniert, und ein monoklonales, paratopes Molekül ist ein monioklonaler Antikörper oder ein das Paratop enthaltener Polypeptidteil desselben, wie nachstehend noch erörtert wird. Die Hybridomzelle ist durch Fusion aus einer Antikörper-produzierenden Zelle und einer Myelomzellinie oder einer anderen, sich immerwährend selbsterhaltenden Zellinie, entstanden. Solche Antikörper wurden erstmals von Kohler und Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975), beschrieben, welche Beschreibung durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird.
Die Ausdrücke "monoklonales, paratopes Molekül" und "paratopes Molekül" allein werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen austauschbar und kollektiv verwendet, und sie beziehen sich auf jene Gattung von Molekülen, welche eine Bindungsstelle eines monoklonalen Antikörpers enthalten, und sie umfassen einen ganzen monoklonalen Antikörper, einen im wesentlichen ganzen, monoklonalen Antikörper und einen eine Antikörper-Bindungsstelle enthaltenden Teil eines monoklonalen Antikörpers. Die mit AI-10 und AI-11, AI-12, AI-13 und AI-14 bezeichneten, ganzen, monoklonalen Antikörper sind paratope Moleküle dieser Erfindung, und das gleiche gilt auch für Teile dieser ganzen Antikörper, welche das Paratop enthalten. Die Ausdrücke "monoklonales, paratopes Molekül" oder "paratopes Molekül" werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen dann allein verwendet, wenn generell ein biologisch aktiveds Molekül gemeint ist, welches die Antikörper-Bindungsstelle der obigen monoklonalen Antikörper enthält, während die Ausdrücke AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 und AI-14, mit und ohne die Wörter "paratopes Molekül", dann verwendet werden, wenn die spezifischen, ganzen Antikörper gemeint sind, welche von den Hybridomen HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 oder HB 9204 erzeugt worden sind.
Die Wörter "sezernieren" und "produzieren" weden auf dem betreffenden Fachgebiet häufig austauschbar verwendet, und sie beziehen sich auf Zellen, aus welchen Antikörpermoleküle erhalten werden. Es mag jedoch vorkommen, daß die Antikörper produzierenden Zellen diese Moleküle nicht in ihre Umgebung sezernieren. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung interessierenden Hybridomenzellen sezernieren monoklonale Antikörper in ihre Umgebung. Nichtsdestoweniger werden solche Zellen manchmal im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als "Antikörper-produzierende Zellen" bezeichnet, und von ihren Antikörpern wird manchmal als "produziert" gesprochen, wie dies auf diesem Fachgebiet üblicher Sprachgebrauch ist. In ähnlicher Weise werden hierin die das Paratop enthaltenden Polypeptidteile der obigen Antikorper als "produziert" bzw. "sezerniert" bezeichnet, obgleich es sich von selbst versteht, daß solche Moleküle aus Antikörpern hergestellt werden, die selbst "produziert" oder "sezerniert" worden sind.
Die Ausdrücke "Überstand" bzw. "Uberstände"werden hierin austauschbar zum Bezeichnen des flüssigen In-vitro-Mediums verwendet, in welchem die Zellen kultiviert werden. Die von den im Rahmen der vorliegenden Unterlagen interessierenden Hybridomenkulturen produzierten, monoklonalen Antikörper werden in das diese Hybridomen umgebende Kulturmedium sezerniert. Daher stellt der Überstand des Kulturmediums für solche Zellen eine bevorzugte Quelle für die monoklonalen, paratopen Moleküle dar, und es kann dieser Überstand leicht frei von Hybridomenzellen nach wohlbekannten Techniken erhalten werden. Beispiele solcher Techniken sind Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, um die Zellen aus dem flüssigen Medium durch Absetzen zu entfernen. Die monoklonalen, paratopen Moleküle konnten alternativ aus der Aszitestumorflüssigkeit (der Aszitesflüssigkeit) von Laboratoriumstieren erhalten werden, in welche das Hybridomengewebe eingeführt worden ist. Beide Methoden sind nachstehend beschrieben.
Der Ausdruck "im wesentlichen gleichzeitig", wie er im Rahmen der vorliegenden Unterlagen unter Bezugnahme auf das Gemisch aus dreien oder noch mehr Komponenten aus Antigenen und paratopen Molekülen verwendet wird, welches Gemisch ein Immunreaktionsgemisch bildet, bedeutet, daß alle Komponenten im zeitlichen Abstand von etwa 15 min voneinander in einem einzigen Gemisch vorhanden und miteinander vermischt sind, und daß vorzugsweise irgendwelche zwei der Komponenten in einem zeitlichen Abstand voneinander von etwa 5 min in dem Gemisch vorhanden sind.
Der Ausdruck "im wesentlichen alle" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Unterlagen und unter Bezugnahme auf die Immunreaktion zwischen einem paratopen Molekül und dessen Antigen Apolipoprotein A-I, unter Bildung einer Immunreaktionskomponente, daß das paratope Molekül mit etwa 90% des in der lösung vorhandenen Antigens unter Bildung der Immunreaktionskomponente immunologisch reagiert, wenn das paratope Molekül im Überschuß vorhanden ist.

B. Hybridomen und monoklonale, paratope Moleküle

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind paratope Moleküle vorgesehen, welche von fünf Hybridomen sezerniert werden. Diese paratopen Moleküle gehen mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion ein. Das Apolipoprotein-A-I-Molekül wird im Rahmen der vorliegenden Unterlagen auch häufig als Apo A-I bezeichnet.
Von den fünf Hybridomen sind jene besonders bevorzugt, welche die Laboratoriumsbezeichnungen H91H4.2H8 und H103D8.1D11 tragen und welche die mit AI-10 bzw. AI-11 bezeichneten, paratopen Moleküle sezernieren. Jedes der paratopen Moleküle AI-10 und AI-11 reagiert immunologisch mit einer erhalten gebliebenen, antigenen Determinante auf dem Apolipoprotein A-I, und es reagiert immunologisch mit wenigstens etwa 90% der ¹²&sup5;I-HDL-Teilchen in einem Flüssigphasen-RIA. Wie aus einer Prüfung der Fig. 1 und 2 zu ersehen ist, binden sich beide paratope Moleküle AI-10 und AI-11 an das Apo A-I, sie verursachen aber keine wesentliche gegenseitige Störung beim Binden.
Jede der fünf Hybridomen wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, ND, am 16. September 1986 gemäß dem Budapest-Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens hinterlegt. Die Laboratoriumsbezeichnungen, Bezeichnungen der paratopen Moleküle und von deren Klassen sowie die ATCC-Hinterlegungsnummern sind nachstehend angeführt. Laboratoriumsbezeichnung des Hybridoms Bezeichnung des paratopen Moleküls IgG-Klasse ATCC-Hinterlegungsnummer
Die obigen Hinterlegungen wudeen gemäß den Erfordernissen des Budapest- Vertrages getätigt, wonach die Gültigkeitsdauer der Hinterlegung 30 Jahre, vom Datum der Hinterlegung, oder 5 Jahre nach dem letzten Hinterlegungsantrag bei der Hinterlegungsstelle betragen soll, oder der Gültigkeitsdauer eines US-Patentes entsprechen soll, welches auf diese Anmeldung erteilt wird, was immer die längere Frist ist. Die Hybridomen werden ergänzt bzw. wieder aufgefüllt werden, sollten sie in der Hinterlegungsstelle nicht-lebensfähig werden, und sie werden der Allgemeinheit nach Ausgabe eines Patentes auf diese Patentanmeldung zur Verfügung gestellt werden.
Curtiss und Edgington (1985), J.Biol.Chem., 260:2982-2993, haben über die immunchemische Heterogenität von Human-HDL berichtet, und sie haben auch über die Herstellung von drei Hybridomen berichtet, deren monoklonale, paratope Moleküle mit dem Apo A-I immunologisch reagierten. Diese mit AI-4, AI-7 und AI-9 bezeichneten, monoklonalen, paratopen Moleküle reagierten jedes immunologisch mit Human-ApöA-I und Human-HDL- Teilchen in Flüssigphasen-RIAs, sie zeigten jedoch unterschiedliche Grade der Immunreaktivität.
In diesen Untersuchungen, über welche in jenem Aufsatz berichtet wird, sind für einen Flüssigphasen-RIA, die indirekten Immunpräzipitationsimmunreaktivitäten mit ¹²&sup5;I-HDL, in überschüssigem Antikörper, als Prozentsätze jener Menge des radioaktiv markierten HDL angeführt, die insgesamt mit Trichloressigsäure ausfällbar ist: AI-4, etwa 44%; AI-7, etwa 61%; und AI-9, etwa 32%. Es wurde auch berichtet, daß die maximalen Immunreaktionsprozentsätze von AI-4, AI-7 und AI-9 mit isoliertem¹²&sup5; 1-Apo A-I in Flüssigphasen-RIAs etwa 60% für AI-4 und AI-7, und etwa 30% für AI-9 betrugen.
Kombinationen von zweien oder dreien dieser monoklonalen, paratopen Moleküle gelang es nicht, 100% des markierten HDL immunologisch auszufällen. Kombinationen von irgendwelchen zweien dieser monoklonalen, paratopen Moleküle mit monoklonalen, paratopen Molekülen gegen Apolipoprotein A-II waren jedoch insofern erfolgreich, als sie mit 100% des ausfällbaren ¹²&sup5;I-HDL immunologisch reagierten.
Wie in dem nachstehenden, mit "Ergebnisse" überschriebenen Abschnitt dargelegt wird, sind die Immunreaktivitäten der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Hybridomen mit sowohl Human-HDL als auch Human-Apo-A-I beträchtlich verbessert gegenüber jenen, über welche in dem Aufsatz von Curtiss und Edgington (1985), J.Biol.Chem., 260:2982-2993, berichtet wird. Diese maximalen Immunreaktivitäten mit dem HDL in einem Flüssigphasen-RIA sind um etwa 30% oder mehr % höher als die für AI-7 in dem obigen Aufsatz angeführten, welche gemäß diesem Bericht mit etwa 60% des ¹²&sup5; I-HDL immunologisch reagiereen.
Die Hybridomen dieser Erfindung wurden aus drei getrennten Fusionen von Mäuse-Milzzellen mit Zellen der nicht-sezernierenden Mäuse-Myelom- Zellinie P3x63Ag8.653 hergestellt. Als Immunogene wurden frisches, natürlich vorkommendes Human-HDL oder frisches, mit Glutaraldehyd vernetztes Human-HDL verwendet.

C. Verfahren

Gemäß dem Verfahrensaspekt der vorliegenden Erfindung wird das Vorliegen und gewünschtenfalls die Menge des Apolipoproteins A-I in einer flüssigen Probe bestimmt. Die flüssige Probe ist eine wäßrige, und es kann sich um Wasser allein, eine Zusammensetzung von Salzen, eine Pufferlösung, oder eine Körperflüssigkeit, wie z.B. eine Blutprobe, handeln.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird häufig eine flüssige Blutprobe dann verwendet, wenn eine quantitative Bestimmung auf Apo A-I oder HDL erwünscht ist. Die Probe kann entweder Serum oder Plasma sein, weil gefunden worden ist, daß Ergebnisse, die unter Verwendung entweder des einen oder des anderen dieser beiden Substanzen erhalten worden sind, statistisch voneinander nicht unterscheidbar sind. In der Tat wurden einige der nachstehend angeführen Ergebnisse unter Anwendung des Verfahrens dadurch erhalten, daß man die Mittelwerte aus Tests herangezogen hat, die sowohl mit Serum als auch mit Plasma durchgeführt worden sind. Unabhängig davon, ob Serum oder Plasma verwendet wird, wird die flüssige Blutprobe vorzugsweise aus Personen erhalten, die wähend wenigstens etwa 12 h gefastet haben, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist. Eine solche Blutprobe wird als "Fasten"-Probe bezeichnet. Bemerkt sei auch, daß dann, wenn Serum oder Plasma als flüssige Probe in einem quantitativen Test vewendet werden, diese Probe keiner demaskierenden Behandlung unterworfen zu werden braucht, wie eine solche gewöhnlich bei der Bestimmung des Apo A-I aus solchen Proben durchgeführt wird.
Es war überraschend, daß genaue und präzise Ergebnisse unter Anwendung der im Den der vorliegenden Unterlagen beschriebenen, besonders bevorzugten ELISA-Methoden und unter Verwendung einer flüssigen Blutprobe, wie z.B. Plasma oder Serum, erhalten werden konnten, weil diese Probenmaterialien Proteine, Lipide und andere Verbindungen enthalten, von denen erwartet werden konnte, daß sie den Test stören. Siehe z.B. Maggio, "Enzym-Immunoassay", CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, 1980, S. 65.
Für quantitative Messungen wird die Menge des Apolipoproteins A-I unter Verwendung einer vorbestimmmten Menge der flüssigen Probe bestimmt. Ist die flüssige Probe eine flüssige Blutprobe, wie z.B. Plasma oder Serum, dann ist eine demaskierende Behandlung, wie sie für das Messen von Apo A-I üblich ist, nicht erforderlich, und die betreffende Probe kann frei von solchen demaskierenden Behandlungen verwendet werden.
Ist ein qualitativer Test erwüscht, dann ist es nicht kritisch, daß dem Benützer das Vollen der verwendeten flüssigen Probe bekannt ist. Selbstverständlich sollten jedoch das verwendete Probenvolumen und die benützte Apo-A-I-Konzentration nicht so groß sein, daß dadurch die verendeten Reagentien überwältigt werden, noch sollten sie so klein sein, daß das Vorliegen einer unrealistisch kleinen Menge von Apo A-I gesucht wird. Beispielsweise werden nach einem ELISA-Verfahren genaue und präzise, quantitative Bestimmungen routinemäßig unter Verwendung von Proben durchgeführt, welche etwa 10 bis etwa 200 ng Apo A-I enthalten. Somit können qualitative Bestimmungen bei noch niedrigeren Mengen des Apo A-I durchgeführt werden.
Algemein gesprochen umfaßt das Verfahren die Stufen des Vezmischens einer zu untersuchenden, flüssigen Probe mit einer wirksamen Menge von paratopen Molekülen, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus den obgenannten fünf monoklonalen, paratopen Molekülen besteht, unter Bildung eines Gemisches. Dieses Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese paratopen Moleküle mit dem in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingeben und eine Immunreaktionskomponente bilden, aufrechterhalten. Das Vorliegen der Immunreaktionskomponente wird anschließend bestimmt, und dadurch wird auch das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der ursprünglichen Probe festgestellt.
Es versteht sich von selbst, daß der obige Test ein Festphasentest oder ein Flüssigphasentest, oder irgendein anderer Immunoassay sein kann, wie dieselben wohlbeknnt sind. Als Beispiele herangezogene Flüssig- und Festphasentests werden nachstehend veranschaulicht. Außerdem können, für Festphasentests, entweder die konkurrierenden Apo-A-I-(HDL)-Moleküle oder die paratopen Molekule an die feste Phase gebunden weden.
Das Vorliegen der Immunreaktionskomponente kann auf verschiedenen von einer Anzahl von Wegen festgestellt werden, von denen bei einem jeden typischerweise ein im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenes Anzeigemittel verwendet wird.
Bei diesem Aspekt der Erfindung enthalten die paratopen Moleküle jedoch vorzugsweise ein in wirksamer Weise mit denselben verknüpftes, radioaktives Element als Anzeigemittel, und das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der ursprünglichen Probe wird durch Abtrennen der Immunreaktionskomponente von dem Rest des Gemisches und Testen auf die aus der abgetrennten Immunreaktionskomponente emittierende Strahlung bestimmt.
Bei einer anderen Ausfürungsform des Festverfabrens werden die erstgenannten, monoklonalen, paratopen Moleküle vor der Bildung des Gemisches unter Bildung eines festen Trägers an eine feste Matrix gebunden. Die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen dieses festen Trägers werden blockiert. Die nach dem Vermischen gebildete Immunreaktionskomponente ist an den festen Träger als an eine feste Phase gebundene Immunreaktionskomponente gebunden. Bei dieser Ausführungsform wird es bevorzugt, daß das Vorliegen einer an eine feste Phase gebundenen Immunreaktionskomponente durch Verwendung von ein Anzeigemittel enthaltenden Molekülen bestimmt wird, welche zweite, monoklonale, paratope Moleküle sind, wie dies nachstehend erörtert ist. Hier werden die in flüssiger Phase vorliegenden, ein Anzeigemittel enthaltenden Moleküle mit dem obigen, erstgenannten Gemisch unter Bildung eines zweiten Gemisches vezmischt.
Diese ein Anzeigemittel enthaltenden Moleküle reagieren immunologisch mit einem zweiten Epitop des Apolipoproteins A-I, welches durch die Immunreaktion der erstgenannten, monoklonalen, paratopen Moleküle nicht wesentlich blockiert ist, und sie sind aus den obgenannten, monoklonalen, paratopen Molekülen ausgewählt, sind aber nicht diejenigen Moleküle, die für das erstgenannte Gemisch ausgewählt worden sind. Ein besonders nützliches Paar von monoklonalen, paratopen Molekülen sind jene, die von Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 und HB 9201 sezerniert worden sind. Diese zweiten, paratopen Moleküle sind in wirksamer Weise mit einem Anzeigemittel verknüpft, welches vorzugsweise ein Enzym ist. Das mit diesen Molekülen verknüpfte Anzeigemittel kann irgendeines der im Rahmen der vorliegenden Unterlagen erörterten Anzeigemittel sein.
Das so gebildete, zweite Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese zweiten, an das Anzeigemittel gebundenen, paratopen Moleküle mit dem im Gemisch vorhandenen Apolipoprotein A-I immunologisch reagieren, aufrechterhalten. Die nach dem Vermischen mit den beiden paratopen Molekülen und der Bildung von deren Immunreaktionskomponenten gebildeten, festen und flüssigen Phasen werden voneinander getrennt. Das Vorliegen des mit dem Anzeigemittel verknüpften Apolipoproteins A-I in in der abgetrennten, festen Phase wird bestimmt, wodurch auch das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in der Probe festgestellt wird. Die Immunreaktionskomponente, welche zwischen einem an eine feste Phase gebundenen, paratopen Molekül, dem Apo-A-I-Antigen und dem mit einem Label verknüpften, zweiten paratopen Molekül gebildet worden ist, wird hierin manchmal als Sandwich-Immunreaktionskomponente bezeichnet.
Die monoklonalen, paratopen Moleküle der vorliegenden Erfindung sind auch in quantitativen Tests auf die Menge von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe, insbesondere in einer flüssigen Blutprobe, wie z.B. Serum oder Plasma, nützlich, wie vorstehend bereits erwähnt worden ist. Sind quantitative Ergebnisse erwünscht, dann werden generell ähnliche Schritte wie die vorstehend für den Festphasentest in Umrissen beschriebenen befolgt.
So wird in der quantitativen Analyse auf die Menge des Apolipoprotein A-I ein erstes, aus festen und flüssigen Phasen bestehendes Gemisch dadurch ausgebildet, daß man eine vorbestimmte, bekannte Menge einer flüssigen Probe, wie z.B. Plasma oder Serum, welche frei von einer demaskierenden Behandlung ist, mit einem festen Träger vermischt, welcher im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an die feste Phase gebundene, erste, monoklonale, paratope Moleküle aufweist, welche mit Apo-A-I immunologisch reagieren. Diese an die feste Phase gebundenen, ersten, monoklonalen, paratopen Moleküle sind im Überschuß über die in der Probe vermutete Menge des Apo A-I vorhanden, und sie sind von einer der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert worden. Vor diesem Vermischen sind nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche dieses festen Trägers blockiert worden.
Dieses erste, aus festen und flüssigen Phasen bestehende Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne aufrechterhalten, welche dafür ausreicht, daß die ersten paratopen Moleküle mit dem in der aliquoten Menge der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I immunologisch reagieren und eine an die feste Phase gebundene Immunreaktionskomponente bilden, welche im wesentlichen das gesamte, in der Probe vorhandene Apolipoprotein A-I enthält.
Das Apo A-I der Probe wird auch mit den in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Molekülen vermischt, welche mit Apolipoprotein A-I immunologisch reagieren, um ein zweites Gemisch zu bilden. Diese zweiten, monoklonalen, paratopen Moleküle sind von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert worden, sind aber in dem erstgenannten Gemisch nicht verwendet worden. Diese zweiten, paratopen Moleküle sind auch in wirksamer Weise an ein Enzym-Anzeigemittel gebunden. Somit sind die in dieser zweiten Stufe velwendeten, paratopen Moleküle jeweils die anderen der zwei Arten von paratopen Molekülen, die in der obigen, ersten Vermischungsstufe angeführt worden sind.
Das zweite, so gebildete Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne aufrechterhalten, welche dafür ausreicht, daß die zweiten, an ein Enzym gebundenen, paratopen Moleküle eine Sandwich-Immunreaktionskomponente bilden, welche im wesentlichen das gesamte, in dem aliquoten Anteil der Probe vorhandene Apolipoprotein A-I enthält.
Die festen und flüssigen Phasen, welche durch das Vermischen der beiden paratopen Moleküle und die Bildung von Immunreaktionskomponente zwischen den beiden paratopen Molekülen und dem Apo A-I entstanden sind, werden voneinander getrennt, wie z.B. durch Spülen, und die Menge der Sandwich-Immunreaktionskomponente, welche das mit dem Anzeigemittel verknüpfte Apolipoprotein A-I enthält und welche in der abgetrennten festen Phase vorliegt, wird bestimmt. Da jedes der zwei monoklonalen, paratopen Moleküle mit im wesentlichen dem gesamten, in dem aliquoten Anteil der Probe vorhandenen Apo A-I immunologisch reagiert, und weil wenigstens eines der paratopen Moleküle mit einem nicht-kreuzreaktiven, erhalten gebliebenen Epitop auf dem Apo A-I immunologisch reagiert, ergibt die Bestimmung der Menge des mit dem Enzym verknüpften Apo A-I in der Immunreaktionskomponente eine Bestimmung der Menge des in dem aliquoten Anteil der Probe vorhandenen Apolipoproteins A-I. Die Menge des Apolipoproteins A-I in der Probe kann leicht berechnet werden, wenn man das Volumen der ursprünglich benützten, vorbestimmten Menge des aliquoten Anteiles der flüssigen Probe kennt.
Die vorstehend erörterten Festphasentests auf Apolipoprotein A-I können jeweils dadurch ausgeführt werden, daß man entweder jede der Vermischungs- und Aufrechterhaltungsstufen in jedem Test aufeinanderfolgend ausführt, oder es können die zwei Vermischungsstufen in jedem Test im wesentlichen gleichzeitig ausgeführt werden, wobei die zwei Aufrechterhaltungsstufen in jedem Test zusammen durchgeführt werden, wie dies bereits erwähnt worden ist.
Erden die Stufen aufeinanderfolgend ausgeführt, dann wird es bevorzugt, daß die an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Moleküle beigemengt werden, und das so gebildete Gemisch aufrechterhalten wird, bevor die mit dem Enzym-Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle beigemengt und dieses so entstandene Gemisch aufrechterhalten wird. Werden die bevorzugten, aufeinanderfolgenden Stufen ausgeführt, dann wird es weiterhin bevorzugt, daß die dabei entstandenen, festen und flüssigen Phasen voneinander getrennt werden, und daß die feste Phase abgespült wird, um diese Auftrennung unterstützend zu gewährleisten, bevor das Beimengen der flüssigen, mit dem Enzym-Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle zu der abgetrennten, festen Phase vorgenommen wird, und dieses letztgenannte Gemisch aufrechterhalten wird.
Bemerkt sei auch, daß die mit dem Enzym-Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle die ersten sein können, die mit der entsprechenden Probe vemischt werden. Wird dieser Modus der Ausführung des Verfahrens angewendet, dann findet kein Auftrennen der Phasen vor dem Beimengen der an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Moleküle statt.
In höchstem Maße bevorzugt werden die an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Moleküle, die flüssige Probe und die mit dem Enzym-Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle getrennt im wesentlichen gleichzeitig veimischt, und die so entstandenen Gemische aus festen und flüssigen Phasen werden zusammen aufrechterhalten. Somit wird das Gemisch während einer Zeitspanne aufrechterhalten, welche dafür ausreicht, daß die an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Moleküle an die feste Phase gebundene Immunreaktionskomponenten mit im wesentlichen dem gesammen Apo A-I bilden, und daß die in flüssiger Phase vorliegenden, mit dem Enzym-Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle ebenfalls mit im wesentlichen dem gesamten, in der Probe vorhandenen Apo A-I immunologisch reagieren. Die so gebildete Immunreaktionskomponente wird als eine an die feste Phase gebundene Sandwich-Immunreaktionskomponente bezeichnet. Eine flüssige Phase ist ebenfalls vorhanden.
Ähnliche Ergebiisse werden unter Verwendung von jedem der beiden monoklonalen, paratopen Moleküle als an eine feste Phase gebundenen, paratopen Molekülen in den betreffenden Tests erhalten. Für den Test auf das Apolipoprotein A-I wurden jedoch die meisten der in den vorliegenden Unterlagen erörterten Arbeiten unter Verwendung jener Moleküle durchgeführt, die von dem Hybridom mit der ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 sezerniert worden sind (AI-10), und die an die Festphasenmatrix gebunden sind.
Beispiele fester Matrices, welche im Rahmen der obigen Verfahren brauchbar sind, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen eine feste Matrix, wie z.B. eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, welche unter der Bezeichnung "Falcon Microtest III Flexible Assay Plates" (Falcon Plastics, Oxnard, CA) vertrieben wird, oder einen Mikrotiterstreifen, welcher zwölf Vertiefungen in einer Reihe auwweist, wie z.B. jene Streifen, welche unter der Bezeichnung "Immulon I und II" (Dynatech, Alexandria, VA) vertrieben werden. Der Mikrotiterstreifen oder die Mikrotiterplatte ist aus einem klaren Kunststoffmaterial, vorzugsweise Polyvinylchlorid oder Polystyrol, angefertigt. Alternative feste Matrices für den Gebrauch in einem oben beschriebenen Verfahren dieser Erfindung umfassen Polystyrolperlen, mit einem Durchmesser von etwa 1 um bis etwa 5 mm, welche von der Firma Abbott Laboratories, North Chicago, IL, erhältlich sind; Polystyrolröhrchen, -stäbchen oder -schaufeln von beliebiger, zweckmäßiger Größe; und Polystyrollatex, dessen Polystyrolteilchen eine Größe von etwa 1 um aufweisen und durch Zentrifugieren von dem Rest des Latex abgetrennt werden können.
Die feste Matrix kann auch aus einer Vielfalt von Materialien angefertigt sein, wie z.B. aus vernetztem Dextran, z.B. Sephadex G-25, -50, -100, -200 und dgl. mehr, welche von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, erhältlich sind, Agarose und vernetzter Agarose, z.B. Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46 und dgl., welche ebenfalls von der Firma Pharmacia Fine Chemicals erhältlich sind.
Das Indikatormittel kann derekt an ein paratopes Molekül dieser Erfindung gebunden sein, es kann an ein brauchbares Antigen gebunden sein, oder es kann aus einem separaten Molekül bestehen. Das Indikatormittel kann ein getrenntes Molekül, wie z.B. Antikörper sein, welche sich an paratope Moleküle dieser Erfindung binden, wie z.B. Ziegen- oder Kaninchen-Anti-Mäuse-Antikörper. Staphylococcus aureus Protein A, welches hierin manchmal als Protein A bezeichnet wird, kann ebenfalls als ein aus einem getrennten Molekül bestehendes Indikator- oder Markierungsmittel eingesetzt werden, wenn ganze oder im wesentlichen ganze, paratope Moleküle dieser Erfindung verwendet werden; das heißt dort, wo Moleküle verwendet werden, welche den Teil der Fc-Regionen von paratopen Molekülen enthalten, welche durch Protein A gebunden werden. Für solche Verwendungszwecke enthält das Protein A selbst ein Label, wie z.B. ein radioaktives Element oder einen Fluorochrom-Farbstoff.
Radioaktive Elemente stellen eine Klasse von Markierungsmitteln dar, welche besonders nützlich ist. Ein Beispiel für ein radioaktives Markierungsmittel, welches im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, ist ein radioaktives Element, welches Gammastrahlenemissionen produziert. Elemente, welche selbst Gammastrahlen emittieren, wie z.B. ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup8;I, ¹³¹I und ¹³²I und &sup5;¹Cr, stellen eine Klasse von aus radioaktiven Elementen, welche Gammastrahlenemissionen produzieren, bestehenden Indikatorgruppen dar. Eine andere Gruppe von nützlichen Indikatorgruppen sind jene Elemente, wie z.B. ¹¹C, ¹&sup8;F, ¹&sup5;O und ¹³N, welche selbst Positronen emittieren. Die so emittierten Positronen erzeugen Gammastrahlen, wenn sie auf in dem Gemisch vorhandene Elektronen treffen.
Ein radioaktives, monoklonales, paratopes Molekül kann typischerweise dadurch hergestellt werden, daß man das monoklonale, paratrope Molekül isoliert und dann das paratrope Molekül mit einem der obigen oder einem anderen geeigneten radioaktiven Element markiert, wie dies in der US-PS Nr. 4 381 292 beschrieben ist. Ein Beispiel für ein Indikatormarkierungsmittel ist ein fluoreszierendes, markierendes Mitttel, das sich an die Antikörper oder Antigene unter Bildung eines Fluorochroms (Farbstoffes), der ein nützlicher Immunfluoreszenz-Tracer ist, chemisch bindet, ohne diese Antikörper oder Antigene zu denaturieren. Geeignete fluoreszierende Markierungsmmittel sind Fluorochrome, wie z.B. Fluoresceinisocyanat (FIC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Dimethylaminnaphthalin-S-sulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin-B200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) und dgl. mehr. Eine Beschreibung der Immunfluoreszenzanalysentechniken findet sich in DeLula, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As A Tool, Marchalonis et al., Hsg., John Wiley & Sons, Ltd., S. 189-231 (1982), welche Veröffentlichung durch Bezugnahme darauf in die vorliegenden Unterlagen aufgenommen wird.
Ein Enzym ist ein besonders bevorzugtes Anzeigemittel. Wird ein Enzym verwendet, so wird dasselbe vorzugsweise unter Bildung eines Konjugates direkt mit einem paratopen Molekül dieser Erfindung verknüpft.
Es versteht sich von selbst, daß nützliche Enzymmoleküle oder andere Anzeigemittel, welche mit einem paratopen Molekül verknüpft sind, in wirksamer Weise verknüpft sind. So ist die Funktion des Enzyms oder des sonstigen Markierungsmittels durch das Verknüpfen oder durch das paratope Molekül nicht wesentlich beeinträchtigt, noch ist die Funktion des monoklonalen, paratopen Moleküls, mit welchem das Enzym oder das sonstige Markierungsmittel verknüpft ist, durch diese Verknüpfung oder durch das Vorliegen des Enzyms oder des sonstigen Markierungsmittels wesentlich beeinträchtigt.
Das Enzym-Anzeigemittel ist ein biologisch aktives Enzym, wie z.B. Meerrettichperoxidase (HRPO) oder Glucosexidase oder dgl. mehr. Wie wohlbekannt ist, sind dort, wo das Anzeigemittel ein Enzym, wie z.B. HRPO oder Glucoseoxidase ist, zusätzliche Reagentien erforderlich, um die Tatsache sichtbar zu machen, daß ein Antikörper-Antigen-Komplex gebildet worden ist. Solche zusätzliche Reagentien auf HRPO umfassen Wasserstoffperoxid und einen Oxidationsfarbstoffvorläufer, wie z.B. Diaminobenzidin. Weitere, für Glucosexidase brauchbare Reagentien umfassen Glucose und 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS).
Techniken zum wirksamen Verknüpfen eines Enzyms mit einem paratopen Molekül unter Bildung eines Konjugates sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Als Beispiele anzuführende Techniken sind in Maggio, "Enzym-Immunoassay", Kapitel 4 von Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, FL (1980), Seiten 71-104, erörtert.
Die monoklonalen, paratopen Moleküle können so, wie sie aus Hybridomen- Überständen oder als Aszites erhalten worden sind, verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, daß gereinigte, paratope Moleküle verwendet werden.
Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Mittel zum Reinigen paratoper Moleküle wohlbekannt, und typischerweise werden hierzu chromatographische Techniken angewendet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Schnell-Protein-Flüssigkeitschromatogsphie (FPLC) die Reinigungstechnik der Wahl.
Die mit einem Enzym verknüpften, paratopen Molekül-Konjugate werden zu den Gemischen in der flüssigen Phase zugegeben. Diese Moleküle werden typischerweise in einer wäßrigen Zusammensetzung aufgelöst. Typische Zusammensetzungen enthalten Puffersalze, wie dies bei den als Beispiele angeführten, den gereinigten, monoklonalen Antikörper enthaltenden Zusammensetzungen der Fall ist, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und welche phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Verdünnungsmittel enthalten. Verdünnte Aszitesflüssigkeit ist ebenfalls brauchbar.
Wie vorstehend bereits erwähnt worden ist, werden die nicht-spezifischen Proteinbindungsstellen auf der Oberfläche des Festphasenträgers blockiert. So werden die an die feste Phase gebundenen, paratopen Moleküle z.B. durch Adsorption oder mit anderen wohlbekannten Befestigungsmitteln an die feste Matrix gebunden. Anschließend wird eine wäßrige Lösung eines Proteins, welches den Test in keiner Weise stört, wie z.B. Rinderserumalbumin, Pferdeserumalbumin, oder ein anderes Serumalbumin, welches ebenfalls von einer Verunreinigung durch Human-Apo-A-I frei ist, mit der festen Phase gemischt, um das beigemengte Protein an die Oberfläche des die paratopen Moleküle enthaltenden, festen Trägers an den Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche, welche nicht von dem monoklonalen, paratopen Molekül besetzt sind, zu adsorbieren.
Eine typische wäßrige Proteinlösung enthält etwa 3 bis etwa 10 Gew.-% Rinderserumalbumin in PBS bei einem pH-Wert von 7,1 bis 7,5. Das Gemisch aus der wäßrigen Proteinlösung und dem festen Träger wird typischerweise während einer Zeitspanne aufrechterhalten, welche wenigstens 1h bei 37ºC beträgt, und die so entstandene feste Phase wird anschließend von ungebundenem Protein freigespült.
Die flüssige Blutprobe kann Plasma oder Serum sein, wie bereits erwähnt worden ist. Diese Probe wird vorzugsweise in einem Ausmaß von etwa 1:2500 bis etwa 1:20.000, in höherem Maße bevorzugt von etwa 1:5000, vor dem Gebrauch verdünnt, um in den nachstehend spezifisch beschriebenen Tests lineare Ergebnisse zu erhalten. Die Verwendung einer kleineren Verdünnung kann zuviel des Apolipoprotein-Antigens in das Gemisch einbringen und die Linearität der Testergebnisse beeinträchtigen sowie den Überschuß des an die feste Phase gebundenen, paratopen Moleküls über das beigemente Antigen verringern oder aufheben. Bei Anwendung einer größeren Verdünnung als etwa 1:20.000 besteht die Tendenz in Richtung auf eine Abnahme der Genauigkeit.
Die angewendeten Aufrechterhaltungszeiten können innerhalb weiter Bereiche mit nur geringen Abweichungen in den Ergebnissen variiert werden, solange nur eine Mindestzeit von etwa 30 min bei Umgebungszimmertemperatur (etwa 20 bis 25ºC) angewendet wird. Wünscht man, eine Mindestaufrechterhaltungszeit von 30 min anzuwenden, so wird es bevorzugt, daß das aufrechterhalteee Gemisch während dieser Zeitspanne hin- und herbewegt wird, um eine im wesentlichen vollständige Immunreaktion zwischen dem Apolipoprotein-A-I-Antigen und den monoklonalen, paratopen Molekülen zu gewährleisten. Werden längere Aufrechterhaltungszeiten angewendet, dann ist kein Hin- und Herbewegen erforderlich. Das gewünschte Hin- und Herbewegen kann leicht mit Hilfe einer bei etwa 100 U/min betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung bewirkt werden. Jeder der im quantitativen Verfahren ausgeführten Tests kann unter Anwendung von Aufrechterhaltungszeiten für das Gemisch aus den paratopen Molekülen und der Probe von etwa 30 min bis zu etwa 60 min bei Umgebungszimmertemperatur durchgeführt werden.
Die Menge des in der untersuchten Immunreaktionskomponente vorhandenen Apolipoprotein-A-I-Antigens wird durch Vermischen der abgetrennten, das mit dem Enzym verknüpfte Apolipoprotein enthaltenden, festen Phase mit einer vorbestimmten Menge des sichtbarmachenden Reagens oder der sichtbarmachenden Reagentien festgestellt. Wird HRPO als das Enzym-Anzeigemittel verwendet, dann werden sichtbarmachende Reagentien, wie z.B. Wasserstoffperoxid und ein oxidierender Farbstoffvorläufer, wie z.B. o-Phenylendiemin (OPD), die in einem wäßrigen Medium vorliegen, mit der abgetrennten, an die feste Phase gebundenen Immunreaktionskomponente vermischt. Das so gebildete Gemisch wird unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimten Zeitspanne, wie z.B. während wenigstens etwa 30 min bei Umgebungstemperatur, aufrechterhalten, damit sich die Farbe entwickelt. Die Farbentwicklung wird anschließend durch Beimengen eines Stoppmittels, wie z.B. 4N Schwefelsäure, gestoppt. Dann wird die optische Dichte der Zusammensetzung abgelesen, mit den Werten auf einer Standardkurve verglichen, und die Menge des Apolipoproteins wird in wohlbekannter Weise bestimmt.
Somit kann ein quantitativer Test bei Umgebungszimmertemperatur in einer Zeitspanne von etwa 1 h durchgeführt werden, sobald der feste Träger und die flüssige Blutprobe hergestellt worden sind; nämlich mit einer Aufrechterhaltungszeit von 30 min, unter Hin- und Herbewegen, für das aus den paratopen Molekulen und der Probe gebildete Gemisch, und mit einer weiteren Aufrechterhaltungszeit von 30 min für die Farbentwicklung. Tatsächlich braucht man den festen Träger nicht unmittelbar vor jedem Gebrauch herzustellen, sondern es können vielmehr solche Träger der im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenen Art während einer Zeitspanne von wenigstens einem Monat vor dem Gebrauch hergestellt und unter den üblichen Kühlbedingungen feucht gelagert und abgedeckt werden.
Für den quantitativen Test auf Apo A-I verwendet man einen Standard, mit welchem die in den ELISAs erhaltenen Werte für die optische Dichte verglichen werden, um die Konzentrationen des Apolipoproteins zu berechnen. Bei dem Test wird ein Sekundärstandard verwendet. Dies bedeutet, daß man, statt ein spezifisches HDL oder Apo A-I als Standards zu verwenden, bei diesem Test vereinigtes Human-HDL als Standards verwendet. Die Sekundarstandards werden wegen der relativen Unbeständigkeit des primären Apolipoproteins A-I oder des HDL bei der Lagerung verwendet. Kottke und Mitarbeiter stellten ebenfalls einen Abbau des gereinigten, als Primärstandard verwendeten Apo A-I fest, und sie benützten einen Sekundärstandard in ihrem RIA auf Apo A-I mit polyklonalem Serum. Au et al. (1986), Clin.Chem., 32:1394-1397.
Die Sekundärstandards werden als lyophilisiertes, vereinigtes Human- Fastenplasma mit einem Gehalt an HDL (Apo A-I) zur Verfügung gestellt, und sie werden vor dem Gebrauch rekonstituiert. Jeder der Standards ist selbst gegen HDL oder Apo-A-I-Primärstandards standardisiert worden. Eine als Beispiel dienende Verfahrensweise für Apolipoprotein A-I ist in dem mit "Materialien und Verfahren" überschriebenen Abschnitt veranschaulicht.

D. Diagnostische Systeme

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch ein diagnostisches System, typischerweise in Kitform, vorgesehen, welches zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren verwendet werden kann. Das System umfaßt eine Packung, welche eine Art der oben beschriebenen, monoklonalen, paratopen Moleküle enthält, welche mit Apo A-I immunologisch reagieren. Die Packung enthält eine Menge dieser paratopen Moleküle, welche ausreicht, um wenigstens einen Test auf Apo A-I durchzuführen.
Das Testsystem enthält, in höberem Maße bevorzugt, weiterhin ein Anzeigemittel, welches in wirksamer Weise entweder direkt mit den obigen, paratopen Molekülen verknüpft ist, oder mit einem anderen Molekül verknüpft ist, welches befähigt ist, die Immunreaktion der obigen, paratopen Moleküle mit dem Apo A-I zu signalisieren.
In höchstem Maße bevorzugt ist das System für den Gebrauch zur quantitativen Bestimmung der Menge des in einer flüssigen Blutprobe vorhandenen Apo A-I geeignet. Ein solches System umfaßt eine erste Packung, welche einen festen Träger enthält, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, an welche monoklonale, paratope Moleküle gebunden sind, die mit Apo A-I immunologisch reagieren, und deren nicht-spezifische Proteinbindungsstellen auf der Oberfläche blockiert sind. Das System umfaßt weiterhin eine zweite Packung, welche ein Konjugat aus einem mit einem Enzym verknüpften, monoklonalen, paratopen Molekül enthält, welches immunologisch mit Apo A-I reagiert. Bei diesem System werden die gleichen zwei paratopen Moleküle verwendet, wie dieselben auch vorstehend unter Bezugnme auf die quantitative Apo-A-I-Bestimmung erörtert worden sind.
Die Festphasenmatrices des obigen diagnostischen Systems können aus irgendeiner der vorstehend erörterten Festphasenmatrices bestehen. Besonders bevorzugt sind Mikrotiter-Vertiefungen, wie z.B. die oben beschriebenen Streifen mit 12 Vertiefungen und die Platten mit 96 Vertiefungen. Wie vorstehend schon erörtert worden ist, sind die nicht-spezifischen Bindungsstellen auf den festen Trägern blockiert.
Die feste Matrix kann einen Behälter für die an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Moleküle dieser Ausführungsform darstellen. Typische Behalter für die mit dem Enzym verknüpften, monoklonalen, paratopen Moleküle sind Fläschchen oder Flaschen aus Glas oder einem Kunststoff wie z.B. Polyethylen oder Polypropylen.
Unter Verwendung einer Mikrotiterplatte als beispielsweiser fester Matrix, und von ganzen, monoklonalen Antikörpern AI-10 als den an die feste Phase gebundenen, monoklonalen, paratopen Molekülen, von Serum als flüssiger Blutprobe, und von ganzen, monoklonalen, mit HRPO verknüpften Antikörpern AI-11, umfaßt ein als Beispiel dienendes, in höherem Maße bevorzugtes diagnostisches System in Kitform die folgenden Bestandteile:
a) einen festen Träger, der im wesentlichen aus einer Mikrotiterplatte besteht, an welche monoklonaler Antikörper AI-10 in einer Menge gebunden ist, welche ausreicht, um einen Test anhand einer Serumprobe auf die Menge des darin vorhandenen Apolipoproteins A-I durchzuführen; und deren nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche blockiert sind; und
b) eine getrennte Packung, welche eine wäßrige Lösung enthält, welche monoklonalen Antikörper AI-11 enthält, der in wirksamer Weise mit HRPO verknüpft ist, und der in einer Menge vorliegt, welche ausreicht, um anhand einer Serumprobe einen Test auf die Menge des darin vorhandenen Apo A-I durchzuführen.
In höchstem Maße bevorzugt umfaßt ein diagnostisches System die obigen enten und einen oder mehrere der folgenden Bestandteile: (i) einen Vorrat von Wasserstoffperoxidd von bekannter Konzentration; (ii) einen sichtbarmachenden, oxidierenden Farbstoffvorläufer, wie z.B. OPD; (iii) eine Lösung eines Stoppmittels, wie z.B. 4N Schwefelsäure, um diefarbbildende Reaktion auszulöschen; (iv) einen oder mehrere Puffer in trockener oder flüssiger Form für die Verwendung in dem Test; (v) Materialien zur Herstellung von Standard-Bezugskurven; und (vi) Anleitungen zur Durchführung der Tests. Jede der unmittelbar vorstehend aufgezählten Kompenten ist in dem diagnostischen System in einer Menge vorhanden, welche ausreicht, um wenigstens einen Test durchzuführen, und diese Komponenten sind auch in angemessener Weise getrennt verpackt.

II. Ergebnisse

Wie vorstehend bereits erwähnt worden ist, reagieren die paratopen Moleküle, die von jedem der hinterlegten Hybridomen sezerniert worden sind, immunologisch sowohl mit HDL als auch mit Apo A-I. Typische Ergebnisse, welche in einem Flüssigphasen-RIA auf die Immunreaktion von jedem dieser monoklonalen, paratopen Moleküle mit HDL und Apo A-I erhalten worden sind, sind in den nachstehenden Tabellen 1A und 1B veranschaulicht, und zwar sind sie als Prozentsätze des gesammen, mit Trichloressigsäure ausfällbaren ¹²&sup5;I-HDL angeführt. Tabelle 1A Maximale Immunpräzipitation mit ¹²&sup5;I-HDL in einem Flüssigphasen-RIA (%) Monoklonale, paratope Moleküle1) Aszites2) FPLC-Aszites2,3) Überstand4)
1) Die in flüssiger Phase vorliegenden, paratopen Moleküle wurden mit in flüssiger Phase vorliegendem ¹²&sup5;I-HDL oder ¹²&sup5;I-Apo A-I vermischt.
2) Als Quelle für die angeführten, paratopen Moleküle wurde Mäuse- Aszitesflüssigkeit verwendet.
3) Als Quelle für die angeführten, paratopen Moleküle wurde Mäuse- Aszitesflüssigkeit verwendet, die durch Schnellprotein-Flüssigchomatographie (FPLC) gereinigt worden war.
4) Als Quelle für die angeführten, paratopen Moleküle wurde der Überstand aus einer Hybridomenzellkultur verwendet. Tabelle 1B Maximale Immunopräzipitation mit ¹²&sup5;I-Apo-I in einem Flüssigphasen-RIA (%) Monoklonale, paratope Moleküle1) Aszites2) FPLC-Aszites2,3) Überstand4)
1,2,3,4) Siehe die Fußnoten der Tabelle 1A.
Aus den Daten in der vorstehenden Tabelle 1A ist zu ersehen, daß die paratopen Moleküle der vorliegenden Erfindung immunologisch in einem viel größeren Ausmaß mit ¹²&sup5;I-HDL reagieren als dies bei den Antikörpern der Fall ist, über welche schon früher von Curtiss und Edgington (1985), J.Biol.Chem., 260:2982-2993, berichtet worden ist. Die obigen Daten veranschaulichen auch eine generell verstärkte Immunreaktivität mit ¹²&sup5;I-ApoA-I im Vergleich zu den Immunreaktivitäten gegen das gleiche Antigen, über welche von Curtiss und Edgington berichtet worden ist. Außerdem haben weitere Arbeiten gezeigt, daß das Alter des Standards eine große Wirkung auf die erhaltenen Ergebnisse haben kann.
Es wurde auch eine Untersuchung durchgeführt, wobei verschiedene Kombinationen der drei monoklonalen Anti-Apo A-I- und Anti-Apo A-II-Antikörper von Curtiss und Edgington im Vergleich zu den AI-10 und AI-11 der vorliegenden Erfindung in der ELISA-Messung von Apo A-I in Blutproben verwendet wurden. Die meisten dieser Vergleiche lieferten vergleichbare Ergebnisse. Mehrere Proben, und insbesondere Blutproben aus CAD-Patienten, lieferten jedoch abweichende Ergebnisse im Vergleich zu dem im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenen Test, und zu Tests, die nach anderen Techniken durchgeführt wurden. Einige dieser vergleichbaren und abweichenden Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 für zwei Kombinationen der monoklonalen Antikörper von Curtiss und Edgington angeführt. Tabelle 2 Vergleichbare Apo-A-I-Mengen, gemessen nach ELISA1) Apo A-I Probe2) C&E Mab Vergleich 13) C&E Mab Vergleich 24) AI-10 AI-115)
1) Mengen des Apo A-I in mg/dl, gemessen nach ELISA unter Anwendung der generellen, im Rahmen der vorliegenden Unterlagen erörterten Sandwich-ELISA-Techniken.
2) Im Handel bezogene Proben mit einem Gehalt von Apo A-I [Nr.1 (Calbiochem-Behring), Nr.2 (International Union of Immunological Standards; IUIS), Nr.6 (Isolab-Elektrophoreseprobe) und Nr.9 (Omega)]; aus normalen, asymptomatischen Personen (Nrn. 3, 4 und 5); oder CAD-Patienten (Nrn. 7 und 8). Die zwischen Klammern angeführten Nummern stellen jene Menge von Apo A-I dar, die laut Angaben der Lieferfirma vorhanden ist.
3) ELISA, der unter Verwendung eines Gemisches der monoklonalen Antikörper gemäß Curtiss und Edgington (C&E Mab) AI-4, AI-7 und AII-1, die an eine feste Matrix gebunden waren, und des monoklonalen Antikörpers AI-4, der mit HRPO verknüpft war, als zweiten, ein Anzeigemittel enthaltenden, nonoklonalen Antikörpern durchgeführt worden war.
4) ELISA, wie bei Fußnote 3, unter Verwendung der monoklonalen Antikörper AI-7, AI-9 und AII-1, welche an die feste Matrix gebunden waren, und von mit HRPO verknüpftem AI-4 als zweitem, monoklonalem Antikörper.
5) ELISA, wie bei Fußnote 3, unter Verwendung monoklonaler, paratoper Moleküle dieser Erfindung. Der AI-10 war an die feste Matrix gebunden, wärend der mit HRPO verknüpfte AI-11 als zweites, monoklonales, paratopes Molekül verwendet wurde.
6) N.D. = Nicht durchgeführt.
7) Der erhaltene Wert lag über dem Testbereich.
Zwar zeigen die obigen Daten, daß man bei Verwendung der vorliegenden, paratopen Moleküle Ergebnisse erhalt, welche sich von jenen unterscheiden, die man unter Verwendung der Antikörper gemäß Curtiss und Edgington in den abweichenden Proben erhält, doch zeigen diese Daten nicht an, welche der Ergebnisse die richtigen sind. Die in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefaßten Daten zeigen, daß die unter Verwendung der paratopen Moleküle der vorliegenden Erfindung erhaltenen Daten für diese abweichenden Proben richtig sind, verglichen mit jenen Daten, die unter Verwendung der Antikörper gemäß Curtiss und Edgington erhalten worden sind.
Die in der Tabelle 3 zusammengefaßten Daten wurden unter Verwendung von Serum und/oder Plasma aus 30 normalen, asymptomatischen Personen (15 Männern und 15 Frauen) und unter Anwendung des im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenen, quantitativen Sandwich-Tests erhalten. Es wurden auch Tests unter Verwendung von zwei im Handel erhältlichen RIAs (RIA-I und RIA-II) und von zwei im Handel erhältlichen RIDs (RID-I und RID-II) durchgeführt. Eine Probe aus jedem Spender wurde in jedem Test gemessen. Tabelle 3 Zusammenfassung von vergleichenden Apo-A-I-Werten, welche unter Anwendung verschiedener Techniken erhalten worden sind 1) ELISA2) RIA-I3) RIA-II4) RID-I5) RID-II6) Mittelwert7) S.D.8)
1) Apo-A-I-Mengen in mg/dl.
2) ELISA-Test, der unter Verwendung von Serum und Plasma wie in der Fußnote 5 der Tabelle 2 beschrieben durchgeführt worden ist.
3) Bei dem RIA-I wurde Plasma verwendet, und dieser Test wurde mit Materialien, welche von der Firma Isotex Diagnostics, Friendswood, TX, bezogen worden war, und gemäß den Anleitungen der Lieferfirma durchgeführt.
4) Bei dem RIA-II wurde Serum verwendet, und dieser Test wurde mit Materialien, welche von der Firma Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME, bezogen worden waren, und gemäß den Anleitungen der Lieferfirma durchgeführt.
5) Bei dem RID-1 wurde Plasma verwendet, und dieser Test wurde mit Materialien, welche von der Firma Tago Inc., Burlingame, CA, bezogen worden waren, und gemäß den Anleitungen der Lieferfirma durchgeführt.
6) Bei diesem RIA-I wurde Serum verwendet, und der Test wurde mit Materialien, welche von der Firma Calbiochem-Behring, La Jolla, CA, bezogen worden waren, und gemäß den Anleitungen der Lieferfirma durchgeführt.
7) Mittelwert der Apo-A-I-Werte aus allen untersuchten 30 Proben.
8) S.D. = Art einer Standardabweichung von dem Mittelwert.
Aus den obigen Zusammenfassungen ist zu ersehen, daß der bei Anwendung des vorliegenden ELISA-Tests erhaltene Mittelwert etwa in der Mitte zwischen den Mittelwern lag, die unter Anwendung der zwei RIA-Tests (auf der niedrigen Seite) und unter Anwendung der zwei RID-Tests (auf der hohen Seite) erhalten worden sind. Aus der allgemeinen Gültigkeit des Ergebnisses, welches unter Anwendung des vorliegenden ELISA-Tests erhalten worden ist, geht somit hervor, daß die Daten in Tabelle 2, welche unter Verwendung von AI-10 und AI-11 erhalten worden sind, in der Tat richtig waren.
Bei den Tests der vorliegenden Erfindung wird - wie bei irgendwelchen anderen Tests - ein Standard verwendet. Bei den ELISA-Tests kann ein Apo-A-I- oder HDL-Primärstandard verwendet werden, doch wird der Bequemlichkeit und Genauigkeit halber für die bevorzugte Praxis ein HDL-Sekundärstandard verwendet.
Der verwendete Sekundärstandard wird aus dem vereinigten Fastenplasma aus mehreren Spendern erhalten. Hier wird typischerweise das vereinigte Plasma aus 20 Spendern verwendet. Der Sekundärstandard wird selbst gegen einen Primärstandard standardisiert.
Ein Apo-A-I-Primärstandard wird gewöhnlich nicht verwendet, weil solche Standards bei der Lagerung nicht stabil gewesen sind. Es wird angenommen, daß das gereinigte Protein oder die Glutamin- oder Asparaginreste des Proteins entaminiert werden können. Es wird auch angenommen, daß das gleiche mit gereinigtem HDL geschieht, wenn dasselbe als ein Primärstandard verwendet wird.
Um weiterhin die Daten zu bestätigen, die unter Verwendung des Sekundärstandards bei quantitativen ELISA-Tests dieser Erfindung erhalten worden sind, wurde unter Verwendung von an die feste Phase gebundenem AI-10 und von mit HRPO verknüpftem AI-11 und mit verschiedenen, im Handel ernältlichen Apo-A-I-Standards eine Reihe von ELISA-Tests durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Quantitative ELISA-Tests unter Verwendung verschiedener Apo-A-I-Standards1) Probe 2) Sekundär-Standard Apo-A-I 3) Primär-Std.-I 4) Primär-Std.-II 5) Primar-Std.-III 6)
1) Apo-A-I-Mengen in mg je dl.
2) Proben aus Laboratoriumspräparationen, als Geschenke erhaltene Proben, oder Proben aus Handelsquellen (Nrn. 1 bis 11) oder Proben aus normalen, asymptomatischen Spendern (Nrn. 12 bis 17). Bemerkt sei, daß die Probe 12 aus derselben Person wie die Probe 3 der Tabelle 2 stammte, und daß die Probe 15 aus derselben Person wie die Probe 5 jener Tabelle stammte.
3) HDL-Sekundärstandard, wie derselbe im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschrieben ist.
4) Primär-Std-I (Primärstandard I) wurde von der Firma Meloy Laboratories, Springfield, VA, erhalten.
5) Primär-Std-II (Primärstandard II) wurde von den Scripps Laboratories, La Jolla, CA, erhalten.
6) Primär-Std-III (Primärstandard III) wurde von der Firma Chemicon International, Inc., El Segundo, CA, erhalten.
Wie aus einem horizontalen Vergleich der Daten in der Tabelle 4 ersehen werden kann, waren die mit allen Standards erhaltenen Ergebnisse ähnlich. Ebenfalls ist zu ersehen, daß die unter Verwendung des Meloy-Standards erhaltenen Ergebnisse generell etwas niedriger als die unter Verwendung der anderen Standards erhaltenen Werte waren. Bemerkt sei auch, daß der von der Lieferfirma des Meloy-Standards demselben zugeordnete Art etwa halb so groß wie jener Wert war, der durch eine unabhängige Analyse gefunden wurde.
Über einen Zeitraum von etwa drei Monaten wurde unter Verwendung der obigen, handelsüblichen Standards eine Reine von Bestimmungen durchgeführt, um die Wiederholbarkeit (den Variationskoeffizienten) des quantitativen Tests der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Der Variationskoeffizient wurde mit etwa 11 bis 13 % befunden.
Bei der Durchführung der Tests der vorliegenden Erfindung werden mit Anzeigemitteln verknüpfte, paratope Moleküle verwendet, welche mit Apo A-I immunologisch reagieren, um die Immunreaktion des Apo A-I mit anderen, monoklonalen, paratopen Molekulen zu signalisieren. Da pro HDL-Teilchen mehr als ein Apo-A-I-Molekül vorhanden ist, ist es unklar, ob es notwendig ist, daß die an die feste Phase gebundenen, paratopen Moleküle und die mit dem Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle mit verschiedenen Epitopen auf dem Apo-A-I immunologisch reagieren, um ein genaues und präzises, quantitatives Testergebnis zu erhalten. Solange beide paratopen Moleküle befähigt sind, mit im wesentlichen dem gesamten Apo A-I oder HDL einer Probe immunologisch zu reagieren, wird es jedoch bevorzugt, daß jeder der beiden Typen von monoklonalen, paratopen Molekülen von einer Hemmwirkung auf die Immunreaktion der anderen, monoklonalen, paratopen Moleküle frei ist.
Wie aus den Daten der Fig. 1 und 2, betreffend einen enzymometrischen Konkurrenz-Immuntest, erseben weden kann, reagieren die mit HRPO markierten AI-10 immunologisch mit Apo A-I und HDL. Die Daten der Fig. 1 zeigen, daß die Immunreaktion des markierten AI-10 mit Apo A-I durch das Vorliegen des unmarkierten AI-10 gehemmt wird, durch das Vorliegen von unmarkiertem AI-11 aber nicht gehemmt wird. Die Fig. 2 veranschaulicht ein ähnliches Ergebnis unter Veiwendung von HDL als an die feste Phase gebundenem Antigen. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch unter Verwendung von mit HRPO markiertem AI-11, mit unmarkiertem AI-10 und AI-11 sowie mit Apo A-I und HDL als Antigen erhalten.
Es wurden zusätzliche Flüssigphasenbindungsuntersuchungen unter Verwendung von ¹²&sup5;I-HDL und ¹²&sup5;I-Apo A-I und unter Anwendung von RIA-Techniken durchgeführt, welche generell in Tsao et al. (1982), J.Biol.Chem., 257:15222-15228, beschrieben sind. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachstehenden Tabelle 5 angeführt, und zwar als Prozentsätze der gesamten, mit Trichloressigsäure (TCA) präzipitierbaren Radioaktivität. Tabelle 5 Flüssigphasen-Immunreaktivitäten von AI-10 und AI-11 Maximales Binden des Antigens (%) Paratope Moleküle1) ¹²&sup5;I-HDL2) ¹²&sup5;I-Apo A-I2) Überstand Aszites FPLC-Aszites
1) Es wurden in flüssiger Phase vorliegende, paratope Moleküle aus dem Überstand von Hybridomenzellkulturen (Überstand), aus Mäuse-Aszitesflüssigkeit (Aszites), und aus durch Schnell-Protein-Flüssigchromatographie gereinigter Aszitesflüssigkeit (FPLC-Aszites) verwendet.
2) Prozentsatz der mit TCA ausfällbaren Radioaktivität.
Die Daten der Tabelle 5 veranschaulichen das relativ hohe Ausmaß des Bindens von ganzem AI-10 und AI-11 an radioaktiv markiertes HDL in dem angewendeten Flüssigphasentest. Diese Daten reflektieren auch die relative Unbeständigkeit des Apo A-I als solchem und das daraus resultierende, niedrige Ausmaß des Bindens an das Apo A-I. Diese relative Unbeständigkeit von Apolipoprotein A-I hat die Verwedung einer Ansammlung von lyophilisiertem Plasma als Sekundärstandard in dem Apo-A-I-Test erforderlich gemacht, wie oben bereits erörtert worden ist. Die obigen Daten veranschaulichen auch ein relativ niedrigeres Ausmaß des Bindens von AI-11 an Apo A-I als an HDL-Teilchen. Nichtsdestoweniger zeigt ein Vergleich der Daten, die unter Anwendung des ELISA-Verfabres auf Apo A-I erhalten worden sind, mit jenen Daten, die bei den mühsameren Techniken, wie etwa im Zusammenhang mit der Tabelle 4, erhalten worden sind, daß nach dem ELISA-Verfahren quantitativ im wesentlichen das gesamte, vorhandene Apo A-I (HDL) in den untersuchten Proben nachgewiesen wird.
Weitere Ergebnisse, die unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten worden sind, welches Testverfahren in dem nachstehenden, mit "Materialien und Verfahren" überschriebenen Abschnitt noch eingehender beschrieben wird, werden nachstehend erörtert. Als feste Matrices wurden Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen benützt. Es wurden ganze, monoklonale Antikörper AI-10 als die an die feste Phase gebundenen ersten, monoklonalen, paratopen Moleküle verwendet. Die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen auf den Oberflächen der festen Träger wurden mit BSA blockiert. Als die zweiten und vieren monoklonalen, paratopen Moleküle wurden mit HRPO verknüpfte, ganze, monoklonale Antikörper AI-11 verwendet, wobei OPD als sichtbarmachender, oxidierender Farbstoffvorläufer verwendet wurde.
Für 37 asymptomatische Personen ohne Geschichte einer CAD wurden Tests auf Apo A-I durchgeführt. Diese Personen werden als "Normale" bezeichnet.
Die Apo-A-I-Werte wurden unter Verwendung von verdünntem Plasma und Serum als flüssigen Blutproben erhalten. Es wurde gefunden, daß diese Werte keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den zwei Probenquellen zeigen, und sie wurden für den Gebrauch gemittelt.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die "Normalen" ist in der nachstehenden Tabelle 6 angeführt, und zwar getrennt für die 23 Männer und 14 Frauen, und auch als "kombinierte" Werte. Eine ähnliche Zusammenfassung der Apo-A-I-Werte, welche aus dem Serum und Plasma von 42 Männern erhalten wurden, welche klinisch als an CAD leidend identifiziert worden waren, ist ebenfalls in der Tabelle 6 angeführt. Tabelle 6 Normale Apolipoprotein A-I-Gehalte Normale Personen Männer1) Frauen1) Kombiniert1) Mittelwert S.D.-Bereich CAD-Patienten
1) "n" ist die Anzahl von Personen in jeder Untersuchung. "Mittelwert" bedeutet den erhaltenen, mittleren Apo-A-I-Wert, ausgedrückt in mg/dl. "S.D." ist der Wert einer Standardabweichung von dem Mittelwert. "S.D.-Bereich" ist die Breite einer Standardabweichung auf jeder der beiden Seiten von dem Mittelwert. Die Tests wurden wie in dem mit "Materialien und Verfahren" überschriebenen Abschnitt beschrieben durchgeführt.
Bei der Durchsicht der obigen Daten und beim Vergleichen dieser Daten mit den von Kottke et al. (1986), Mayo Clin.Proc., 61:313-320, zur Verfügung gestellten Daten ist zu ersehen, daß die Mittelwerte für normale Personen und CAD-Patienten für das Apo A-I in dem obigen TAest den von Kottke et al. angegebenen ähnlich sind. Bei beiden Arten von Tests wurden auch ähnliche Standardabweichungen erhalten.
Diese Ähnlichkeit der Ergebnisse war aus mehreren Gründen überraschend.
Erstens benützten die Kottke et al.-Forscher ein Detegens (Tween 20) als demaskierende Behandlung für ihre Tests, während die vorliegenden, flüssigen Blutproben frei von solchen Behandlungen waren. Zweitens benützte die Gruppe von Kottke et al. einen Radioimmunoassay, welcher generell als genauer und präziser als ein im Rahmen der vorliegenden Unterlagen verwendeter ELISA-Test angesehen wird. Voller et al. (1976), Bull.World Health Organ., 53:55-65. Drittens wurden von Kottke et al. polyklonale Antikörper verwendet, welche normalerweise als zu einer verbesserten Immunreaktion mit dem relativ heterogenen Apo A-I befähigt angesehen werden, während im Rahmen der vorliegenden Erfindung monoklonale Antikörper verwendet wurden. Viertens benützte die Gruppe von Kottke et al. eine Aufrechterhaltungszeit von 16h bei Zimmertemperatur für die Immunreaktion ihrer polyklonalen Antikörper mit dem Apo A-I, während im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Zeitspanne von 30 min bei Zimmertemperatur angewendet wurde.

III. Materialien und Verfahren

A. Lipoproteine

Bei diesen Untersuchungen wurden Lipoproteine aus Plasma isoliert, welches in der lokalen Blutbank (San Diego Plasma Center, San Diego, CA) durch Plasmaphorese aus dem Blut von normalen, fastenden spendern erhalten worden war. Für diesen Zweck wurde das so erhaltene Plasma so eingestellt, daß es eine Endkonzentration von 5 mM Benzamidin, 1 mM Diisopropylfluorphosphat, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 10.000 Einheiten je ml Aprotinin enthielt. Die Lipoproteine wurden dann aus diesem eingestellten Plasma durch sequentielle Ultrazentrifugation unter Verwendung von festem Kaliumbromid (KBr) zur Dichteeinstellung isoliert.
Zuerst wurde das eingestellte Plasma bei etwa 200.000xg während 18 bis 24h zentrifugiert. Festes KBr wurde so lange zu der Bodenschicht hinzugefügt, bis die Dichte größer als 1,063 g/ml war. Die so entstandene Zusammensetzung wurde dann unter einer 0,1%igen EDTA-Lösung mit einem Gehalt an KBr und einer Dichte von 1,063 g/ml geschichtet und während mehr als 48h bei 200.000xg weiterhin zentrifugiert.
Die Bodenschicht wurde wiederum rückgenen, und zu derselben wurde so lange feste KBr zugegeben, bis die Dichte größer als 1,21 g/ml war.
Diese eingestellte Schicht wurde unter einer 0,1%igen EDTA-Lösung mit einem Gehalt an KBr und mit einer Dichte von 1,21 g/ml geschichtet, und sie wurde während mehr als 48h bei 200.000xg weiterhin zentrifugiert.
Dann wurde die oberste Schicht rückgewonnen, und festes KBr wurde zu derselben so lange zugegeben, bis die Dichte größer als 1,063 g/ml war. Diese eingestellte, oberste Schicht wurde unter einer 0,1%igen EDTA-Lösung mit einem Gehalt an KBr und mit einer Dichte von 1,063 g/ml geschichtet, und während mehr als 48h bei 200.000xg noch weiteerin zentrifugiert.
Die mittlere Schicht wurde rückgewonnen, und zu derselben wurde so lange festes KBr zugegeben, bis die Dichte größer als 1,21 g/ml war. Diese eingestellte Mittelschicht wurde unter einer 0, 1%igen EDTA-Lösung mit einem Gehalt an KBr und mit einer Dichte von 1,21 g/ml geschichtet, und sie wurde während mehr als 48 h bei 300.000xg zentrifugiert.
Die oberste Schicht wurde rückgewonnen, und sie wurde mit "Lipoproteine hoher Dichte (HDL), mit einer Dichte von gleich 1,063 bis 1,21 g/ml" bezeichnet. Das rückgewonnene HDL wurde gegen einen Lipoproteinpuffer (LLB) dialysiert, welcher 150 mm NaCl, 1 mM EDTA, 0,005 % Alpha-Tocopherol und 5 mM Benzamidin enthielt, und es wurde unter sterilen Bedingungen nicht länger als 21 Tage gelagert.

B. Isolierung von Apolipoprotein A-I

Apolipoprotein A-I (Apo A-I) wurde nach den Verfahrensweisen von Kinoshita et al. (1983), J.Biochem., 94:615-617, aus dem (nachstehend erörterten) entlipidierten HDL durch Größenfraktionierung unter Anwendung von Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Etwa 300 mg von Ether:Ethanol-entlipidiertem HDL wurden in 200 ul von 0,1%igem Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1M Natriumphosphat (pH 7,0) aufgelöst und auf Spherogel - TSK-3000-SW-HPLC-Säulen (Bedman Instruments Inc., Fullerton, CA) nach der Größe fraktioniert, und die das gereinigte Apo A-I enthaltenden Fraktionen wurden bei -20ºC gelagert.

C. Erzeugung monoklonaler, paratoper Moleküle

Die fünf monoklonalen, paratopen Moleküle wurden aus drei getrennten Fusionen von Milzzellen ("Splenozyten") aus immunisierten Balb/c-ByJ-Mäusen (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, CA) unter Anwendung der im Rahmen der vorliegenden Unterlagen erörteren Standardfusionsprotokolle erhalten. Die Kulturüberstände wurden gesaamelt, und zuerst durch Festpbasen-Radioimmunoassay durchgeprüft, und wenn sie positiv waren, erneut gemäß dem nachstehend beschriebenen Flüssigphasen-Radioimmunoassay durchgeprüft. Alle Hybridomen wurden wenigstens zweimal durch beschränkende Verdünnung kloniert, und sie wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren gelagert.
Kurz gesagt wurden Balb/c-By-Mäuse durch intraperitoneale Injektion (i.p.) mit Human-HDL als Immunogen in unvollständigem Freunds-Adjuvans (CFA) immunisiert, und anschließend durch eine zweite und dritte Immunisierung, jeweils im Abstand von etwa drei Wochen, in unvollständigem Freunds-Adjuvans (IFA), immunisiert. Nur für das Hybridan AI-10 (ATCC HB 9200) wurde das HDL zuerst mit Glutaraldehyd vernetzt, und es wurde dann zuerst mit 500 Einheiten von Gamma-Interferon (IFN-γ) in CFA, und ohne IFN-γ bei einer darauffolgenden IFA-Immunisierung, injiziert. Das mit Glutaraldehyd vernetzte HDL wurde durch ansetzen von frischem HDL in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Glutaraldehyd bei einer Endkonzentration von 0,04 % bei 20ºC während einer Zeitspanne von 18 h hergestellt. Für die Hybridomen AI-11, AI-12, AI-13 und AI-14 (ATCC HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204) wurden die Immunisierungen mit natürlich vorkommendem HDL vorgenommen. In allen Fällen erhielten die Mäuse etwa drei Monate nach der letzten Adjuvans enthaltenden Immunisierung eine Präfusions-Booster-Injektion von natürlich vorkommendem HDL intravenös (i.v.) in normaler Kochsalzlösung, und eine zweite, ähnliche Präfusions-Booster-Injektion einen Tag später.
Etwa drei Tage nach der letzten Booster-Injektion wurden die so behandelten Tiere getötet, und die Milz aus jeder Maus wurde geerntet. Dann wurde eine Milzzellensuspension hergestellt. Die Milzzellen wurden dann aus der Milzzellensuspension durch Zentrifugation während etwa 10 min bei 1000 U/min und bei 23ºC extrahiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das Pellet aus Zellen erneut in 5 ml von kaltem, lysierendem NH&sub4;Cl-Puffer suspendiert und während etwa 10 min inkubiert.
Zu der lysierten Zellsuspension wurden 10 ml von "Dulbecco's Modified Eagle Medium" (DMEM) (Gibco) und HEPES-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperidinethansulfonsäure]-Puffer zugegeben, und dieses Gemisch wurde während etwa 10 min bei 1000 U/min und bei 23ºC zentrifugiert.
Der Überstand wurde dekantiert, das Pellet wurde erneut in 15 ml von DMEM und HEPES suspendiert, und die Suspension wurde während etwa 10 min bei 1000 U/min und bei 23ºC zentrifugiert. Die obige Verfahrensweise wurde wiederholt.
Dann wurde das Pellet erneut in 5 ml DMEM und HEPES suspendiert. Dann wurde ein aliquoter Anteil der Milzzellsuspension zum Zählen entfernt.
Die Fusionen wurden in der folgenden Weise unter Verwendung der nicht-sezernierenden Mäuse-Myelom-Zellinie P3x63Ag8.653.1, eines Subklons der Linie P3x63Ag8.653 (ATCC 1580), bewirkt. Unter Verwendung eines Verhältnisses von Myelomzellen zu Milzzellen von etwa 1 zu 10, oder etwa 1 zu 5, wurde eine ausreichende Menge der Myelomzellen zu einem Pellet zentrifugiert, zweimal in 15 ml DMEM und HEPES gewaschen und während 10 min bei 1000 U/min und bei 23ºC zentrifugiert.
Die Milzzellen und die Myelomzellen wurden in 15 ml-Rundbodenröhrchen (Falcon) vereinigt. Das Zellgemisch wurde während 10 min bei 1000 U/min und bei 23ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde durch Absaugen entfernt. Anschließend wurden 200 ul von 30%igem (Gew./Vol.) wäßrigem Polyethylenglykol mit einem MG von 4000 (PEG; ATCC Baltimore, MD) und von etwa 37ºC unter Verwendung einer 1 ml-Pipette und unter kräftigem Rüren zugesetzt, um das Pellet zu zerreißen, und die Zellen wurden während 15 bis 30 s sachte gemischt. Das Zellgemisch wurde während 4 min bei 700 U/min zentrifugiert.
Etwa 8 min nach dem Zeitpunkt der Zugabe des PEG wurden 5 ml von DMEM plus HEPES-Puffer langsam zu dem Pellet zugegeben, ohne die Zellen zu stören. Nach 1 min wurde das so entstandene Gemisch mit einer 1 ml-Pipette aufgebrochen, und es wurde während weiterer 4 min inkubiert. Dieses Gemisch wurde während 7 min bei 1000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, 5 ml von HT-(Hypoxanthin/Thymidin)-Medium wurden langsam zu dem Pellet zugegeben, und das Gemisch wurde während 5 min ungestört belassen. Dann wurde das Pellet zu großen Brocken zerbrochen, und die Endzellsuspension wurde in T75-Kolben (2,5 ml je Kolben) eingebracht, in welche zuvor 7,5 ml von HT-Medium eingebracht worden waren. Die so entstandene Zellsuspension wurde bei 37ºC inkubiert, um die fusionierten Zellen zu züchten. Nach 24 h wurden 10 ml von HT-Medium zu den Kolben zugegeben, und 6 h später wurden 0,3 ml von 0,04 mM Aminopterin beigemengt. 48 h nach der Fusion wurden 10 ml von HAT-(Hydroxanthin/Aminopterin/Thymidin)-Medium zu den Kolben zugegeben.
Drei Tage nach der Fusion wurden die lebensfähigen Zellen auf Gewebeeulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von etwa 2x10&sup4; lebensfähigen Zellen je Vertiefung (in insgesamt 768 Vertiefungen) in HAT-Puffermedium ausplattiert, wie dies in Kennett et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol., 81:77 (1978), beschrieben ist. Die Zellen wurden während sieben Tagen nach der Fusion mit HAT-Medium gefüttert, und nachher wurden sie, je nach Bedarf, in Abständen von etwa 4 bis 5 Tagen mit HT-Medium gefüttert. Das Wachstum wurde mikroskopisch verfolgt, und Antikörper enthaltende Kulturüberstände wurden am Tag 14 zwecks Untersuchung auf die Produktion HDL-spezifischer Antikörper durch Festphasen-Radioimmunoassay (RIA) gesammelt, wie dies in Curtiss und Edgington (1982), J.Biol.Chem., 257:15213-15221, beschrieben ist.
Die so hergestellten Hybridomen, welche Anti-HDL-Antikörper erzeugten, wurden durchgeprüft, getestet, und ihre Lebensfähigkeit wurde bestimmt. Die vorliegenden Hybridomen wurden aus etwa 30 Hybridomenkulturen ausgewählt, welche Anti-HDL-Antikörper in ihre Kulturmdien sezernierten.

D. Herstellung und Reinigung der paratopen Moleküle

Aus 10 Wochen alten Balb/c-Mäusen, welche mit 0,3 ml Mineralöl vorbehandelt worden waren, und in welche intraperitoneal 3-50x10&sup5; Hybridomenzellen injiziert worden waren, wurden die Aszitesflüssigkeiten gewonnen. Die Durchschnittszeit zum Entwickeln von Aszites waren 9 Tage. Nachdem die von jedem Hybridom produzierten Aszitesflüssigkeiten durch Zentrifugieren bei 15.000xg während 15 min und bei 23ºC geklärt worden waren, wurden sie vereinigt und eingefroren bei -20ºC gelagert.
Die gereinigten, monoklonalen, paratopen Moleküle aus jedem der fünf Hybridomen wurden durch Schnell-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) unter Verwendung einer Anionenaustauschersäule vom Typus "Pharmacia Mono Q HR5/5" (Pharmacia Fine chemicals, Piscataway, NJ) und unter Anwendung eines Gradienten von 0 bis 0,5M NaCl in 10 mM Tris vom PH 8,0 gemäß den Anleitungen, die mit der Säule geliefert worden waren, hergestellt. Die gereinigten Mabs wurden unter Verwendung einer mit einem Rührwerk ausgestatteten Amicon-Ultrafiltrationszelle (Danvers, MA; PM-30-Membran) auf eine Konzentration von 1 mg/ml konzentriert, gegen PBS (phosphatgepufferre Kochsalzlösung vom pH 7,2) dialysiert und bei -70ºC gelagert.
Die monoklonalen Antikörper AI-4, AI-7, AI-9 und AII-1 wurden wie in Curtiss und Edgingten (1985), J.Biol.Chem., 260:2982-2993, erörtert hergestellt.

E. Markieren mit radioaktivem Jod

Das Markieren von HDL, Apo-A-I und von immunchemisch gereinigtem Ziegen-Anti-Mäuse-Ig mit radioaktivem Jod wurde enzymatisch unter Anwendung der "Enzymobead"-Verfahrensweise des Markierens mit radioaktivem Jod und unter Verwendung von "Enzymobeads" ("Enzymperlen") durchgeführt, die von der Firma Biorad (Burlingame, CA) erhalten worden waren. Die "Enzymobead"-Verfahrensweise des Markierens mit radioaktivem Jod wurde angewendet, um die Antigene und Antikörper für den nachstehend erörteren Festphasen-Radioimmunoassay zu kennzeichnen.

G. Entlipidierung von Lipoproteinen mit Lösungsmitteln

Falls erforderlich, wurden die Lipoproteine durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln entlipidiert und als entlipidierte Lipoproteine bezeichnet. Zu diesem Zweck wurde das zu analysierende Lipoprotein gegen 0,01%ige EDTA znit einem pH-Wert von 7,5 über Nacht (während etwa 18 h) dialysiert.
Die so entstandene Probe wurde gegen 0,003%ige EDTA während etwa 12 h dialysiert, und sie wurde dann in einer Menge von 10 bis 20 mg Protein je Röhrchen lyophilisiert. Zu jedem Röhrchen wurden 35 ml von absolutem Ethanol:wasserfreiem Ether (1:1) von 4ºC zugegeben, und die so entstandene Lösung wurde vermischt.
Nach dem Vermischen wurde die Lösung währernd 20 min bei -20ºC inkubiert. Die Lösungen wurden dann während 30 min bei 1000xg und bei 0ºC geschleudert, und der Überstand wurde abgegossen.
Die oben beschriebene Ethahol/Ether-Extraktion wurde noch zweimal durchgeführt, so daß es insgesamt drei Extraktionsvorgänge gab. Dann wurden 35 ml wasserfreien Ethers von 4ºC zu der Probe zugegeben, und das Gemisch wurde während 30 min auf -20ºC gehalten. Die kalte Probe wurde bei 1000xg während 30 min bei -20ºC geschleudert, und der Überstand wurde weggegossen und verworfen. Die Pellets wurden unter Verwendung von gasförmigem Stickstoff getrocknet.

H. Quantitativer Apo-A-I-(HDL)-Sandwich-ELISA-Test

1. Apo-A-I-Primärstandards:

Quantifizierung von HDL und isoliertem Apolipoprotein A-I

Die HDL-Fraktion (1,063-1,21 g/ml) wurde aus vereinigtem Human-Plasma nach Standard-Ultrazentrifugationstechniken erhalten, und sie wurde gegen PBS dialysiert. Sie wurde dann steril durch eine 0,45 um-Filterscheibeneinheit vom Tupus "Acrodisc" filtriert und bei 4ºC gelagert. Der Proteingehalt der HDL-Fraktion wurde nach einem modifizierten Lowry-Test auf Protein mit BSA als Standard bestimmt. Es wurden drei Verdünnungen der HDL-Fraktion, jeweils als Duplikate, den Test durchlaufen gelassen, um abgelesene Werte innerhalb eines linearen Teiles der Standardkurve zu gewährleisten. Beispielsweise wurde die HDL-Fraktion bei Verdünnungen von 1:5, 1:10 und 1:20 durch den Testablauf geführt. Die Proteinkonzentration lag gewöhnlich zwischen 5 und 10 mg/ml. Für eine längere Lagerung wurde die HDL-Fraktion mit PBS auf eine Proteinkonzentration von 1 bis 2 mg/ml verdünnt. Nach dem Verdünnen wurde die Proteinkonzentration erneut durch den Lowry-Test bei Verdünnungen von 1:2, 1:5 und 1:10 bestätigt. Die verdünnte HDL-Fraktion wurde dann auf aliquote Anteile aufgeteilt und bei 4ºC gelagert.
Isoliertes Apolipoprotein A-I kann aus einer Anzahl von Handelsquellen bezogen werden. Obgleich der Hersteller typischerweise eine Angabe über den Proteingehalt und den Reinheitsgrad vorsieht, wurde die Proteinkonzentration stets nach dem Lowry-Test bestätigt, und erforderlichenfalls auf der Basis dieser Ergebnisse eingestellt. Die Verdünnungen der Apo-A-I-Präparation wurden wie in dem vorstehenden Abschnitt beschrieben behandelt. Die Präparation wurde auf aliquote Anteile aufgeteilt und wie vom Hersteller empfohlen gelagert.
Die HDL- und/oder Apo-A-I-Präparationen wurden dann in dem (nachstehend beschriebenen) Apo-A-I-ELISA-Test als unbekannte (und in einem Verhältnis von 1:5000 verdünnte) Proben geprüft. Über eine Zeitspanne von fünf Tagen wurden wenigstens zwei Testplatten pro Tag, welche jeweils einen vollständigen Satz von Standards, Qualitätskontrollen, sowie Verdünnungen der HDL- und/oder Apo-A-I-Präparationen enthielten, ausgeführt. Die für das HDL und/oder Apo A-I in dem ELISA-Test erhaltenen Werte stimmten mit den im Lowry-Test erhaltenen Proteinwerten innerhalb von 20% der letztgenannten überein. Falls die Werte nicht innerhalb der festgesetzten Grenzen übereinstimmten, wurde der Lowry-Test wiederholt, um die zugeordnete Proteinkonzentration zu bestätigen. Waren die Werte dann noch immer diskrepant, dann war dadurch gewöhnlich eine Alterung oder Verunreinigung der Präparation angezeigt, und dieselbe wurde für einen Gebrauch als Primärstandard nicht als geeignet erachtet.
Die Reinheit des Primärstandards wurde auch durch eine analytische Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; SDS-PAGE, bestimmt.

2. Herstellung von Apo-A-I-Sekundärstandards für ELISA-Tests und Zuordnung von Werten zu diesen Standards

a. Herstellung von vereinigtem, lyophilisiertem Standard-Plasma

Aus wenigstens 10 normolipidämischen Subjekten, welche über Nacht gefastet hatten, wurde frisches Plasma oder Serum gesammelt. Es wurde durch nicht-traumatische Venenpunktur unter Verwendung steriler Röhrchen mit einem Gehalt an Dinatrium-EDTA eine Blutabnahme (Phelbotomie) durchgeführt. Die Proben wurden bei 1500xg während 30 min bei 4ºC zentrifugiert, und das Plasma wurde in saubere, dicht verschlossene Röhrchen transferiert und währernd höchstens 24 h bei 4ºC gelagert. Gleiche Mengen der Proben wurden vereinigt, und aliquote Mengen von 0,5 ml wurden in mit Säure gereinigte 5 ml-Wheaton-Serumfläschchen eingebracht und über Nacht (während etwa 16 bis 18 h) lyophilisiert. Die Fläschchen wurden dicht verschlossen und bei 4ºC gelagert.

b. Rekonstitution der vereinigten, lyophilisierten Plasma-Standards

Vor dem Rekonstituieren wurden die Fläschchen auf Zimmertemperatur kommen gelassen. Der Aluminiumring und der Stöpsel wurden entfernt, wodurch das Vakuum in dem Fläschchen langsam aufgehoben wurde. Unter Verwendung einer Präzisionspipette wurden die vereinigten, getrockneten Standards mit 0,5 ml doppelt destillierten Wassers dadurch rekonstituiert, daß man das Wasser langsam auf die Seite der Fläschchen abgab. Die Stöpsel wurden wieder eingesetzt, und die Fläschchen wurden rasch drei- bis viermal herumgewirbelt und während mindestens 30 min bei Zimmertemperatur belassen. Der Standard wurde nicht stark herumgewirbelt oder hin- und herbewegt, sondern leicht herumgewirbelt, um eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten.

c. Zuordnung eines Wertes für den Apo-A-I-Sekundärstandard

Der Apo-A-I-Wert des lyophilisierten Sekundärstandards wird in dem Apo-A-I-ELISA-Test unter Verwendung des Primärstandards (entweder HDL oder Apo A-I) als Kalibrator bestimmt. Die Verfahrensweise des ELISA-Tests ist in den vorliegenden Unterlagen beschrieben.
Der lyophilisierte Sekundärstandard wurde als unbekannte Probe, dreifach, auf mindestens zwei Testplatten pro Tag und während wenigstens 10 Tagen geprüft, wodurch mindestens 20 Werte (jeweils die Mittelwerte aus den Dreifachproben) erzeugt wurden. Alle für den Sekundärstandard erhaltenen Werte wurden gemittelt, und der Apo-A-I-Wert, in mg/dl, wurde zugeordnet.
Nachdem die Zuordnung des Wertes vorgenommen worden war, wurde der Sekundärstandard benützt, um eine Standardkurve zu konstruieren, welche auf der gleichen ELISA-Platte mit einer Primärstandard-Kurve und mit einem vollständigen Satz von Kontrollen durch Testen ermittelt wurde. Die Primär- und Sekundärstandard-Kurven wurden auf mindestens 2 Testplatten mit je 96 Vertiefungen pro Tag über einen Zeitraum von 5 Tagen durch Testen ermittelt.
Nachdem die Wertzuordnung für den Sekundärstandard angenommen worden war, wurden die Standardkurven konstruiert und auf der gleichen ELISA-Platte mit der gleichzeitig angenommenen Charge von lyophilisierten Standards über einen Zeitraum von 5 Tagen (2 Testplatten je Tag) durch Testen ermittelt.

3. Der Test, generell

Die isolierten AI-10-Moleküle wurden an den Wänden der Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten ("Nunc-Immuno Plate 1"; Irving Scientific, Santa Ana, CA) befestigt, indem 0,15 ml eines Natriumbicarbonat-Puffers vom pH 9,0 mit einem Gehalt von 5 ug/ml von AI-10 in jede Vertiefung durch Beimengen eingebracht wurden. Die Platten wurden während 18 h auf 4ºC gehalten, und sie wurden dann dreimal mit einem PBS gewaschen, der 0,1% BSA und 0,05% Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat (Tween 20) enthielt. Dann wurden die restlichen, nicht-spezifischen Bindungsstellen durch Beimengen von 0,2 ml von PBS mit einem Gehalt von 10% BSA in jede Vertiefung blockiert, wobei das Gemisch während 1 h auf 37ºC gehalten wurde, wonach gespült wurde. Die so präparierten Vertiefungen können bis zu etwa 1 Monat nach der Präparation verwendet werden, wenn sie in einer feuchten Kammer gelagert werden.
Human-HDL wurde in PBS auf Konzentrationen verdünnt, welche in einen Bereich von 1,0 bis 0,031 ug/ml fielen, und welche für den Gebrauch als Standardkontrollösungen bestimt waren. Wie oben bereits angemerkt worden ist, wird als Standard in diesen Tests Human-HDL statt Human-Apo-A-I verwendet, weil gefunden wurde, daß das Apo A-I bei der Lagerung relativ instabil ist, während das HDL offensichtlich relativ lagerungsbeständiger ist. Die Plasma- (oder Serum-)-Proben wurden im Verhältnis von 1:5000 mit PBS verdünnt.
50 ul des Standards oder der Probe wurden, jeweils in dreifacher Ausführung, in die Vertiefungen durch Beimengen eingebracht. Etwa 5 min danach wurden 50 ul von PBS mit einem Gehalt an mit HRPO markierten, paratopen AI-11-Molekülen in jede Vertiefung durch Beimengen eingebracht. Die Immunreaktionsgemische wurden während einer Zeitspanne von 30 min bei 25ºC aufrechterhalten. Dann wurde ungebundenes Material aus den Vertiefungen wie oben beschrieben durch Waschen abgetrennt.
Dann wurde die Menge der an die feste Phase gebundenen, das HRPO-Label enthaltenden Sandwich-Immunreaktionskomponente dadurch getestet, daß man 0,1 ml von frisch hergestellter Substratlösung [destilliertem Wasser mit einem Gehalt von 3 % H&sub2;O&sub2; und 0,67 mg/ml o-Phenylendiamin] beimengte.

4. Stufenweiser Apo-A-I-/HDL-Sandwich-ELISA-Test

Für die Ausführung des Apolipoprotein-A-I-Sandwich-ELISA-Tests wurden die folgenden Stufen durchgeführt. Handelsübliche Kontrollen wurden mit entionisiertem Wasser gemäß den Anleitungen in der Packung rekonstituiert. Die Kontrollen wurden leicht herumgewirbelt und während 20 bis 30 min auf Zimmertemperatur gehalten, um ein vollständiges Auflösen zu gewährleisten.

a. Proben und Kontrollen

Die Proben und Kontrollen werden in einem Verhältnis von 1:5000 in PBS verdünnt. Eine Reihenverdünnung kann wie folgt hergestellt werden:
20 ul Probe + 1,98 ml PBS (1:100):
40 ul der obigen Verdnnnung + 1,96 ml PBS (1:5000).

b. Standard-Verdünnung

Isolierter Apo-A-I-(HDL)-Standard wird auf 4 ug/ml in PBS verdünnt. Dann werden Zweifach-Reihenverdünnungen auf 0,031 ug/ml hergestellt. Beispielsweise unter Verwendung einer mit 860527 bezeichneten HDL-Präparation, welche 868 ug/ml enthielt;
4 ug/ml = 46 ul + 9,954 ml PBS (1:217);
2 ug/ml = 1 ml der obigen Verdünnung + 1 ml PBS; und man setzt die Zweifach-Verdünnungen auf 0,031 ug/ml fort.

c. Verdünnung von mit HRPO-markierten AI-11-Molekülen

Es wird eine 1:5000-Verdünnung des AI-11-HRPO-Konjugat-Antikörpers in PBS veendet. Dabei können die folgenden Verdünnungen gemacht werden:
20 ul + 1,98 ml PBS (1:100); und
240 ul der obigen Verdünnung + 11,76 ml PBS (1:5000).
Man bedeckt mit einer Folie als Lichtschutz. Diese Menge reicht für 2 Platten aus.

d. 3%iges Wasserstoffperoxid

Man verdünnt 30%iges Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) 1:10 in destilliertem Wasser.

e. o-Phenylendiamin-Substrat

Man löst eine o-Phenylendiamin-(OPD)-Tablette (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 15 ml destillierten Wassers auf. Man fügt 62,5 ul von 3%igem H&sub2;O&sub2; hinzu. Man bedeckt mit einer Folie als Lichtschutz. Das Substrat ist jedesmal unmittelbar vor der Verwendung frisch herzustellen.

5. Test-Verfahrensweise

a. Man bringt eine ELISA-Platte mit daran gebundenem Antikörper bei Umbegungszimmertemperatur (20 bis 22ºC) während wenigstens 20 min ins Gleichgewicht. Man nimmt die Platte aus dem Beutel heraus und dreht sie um, um den restlichen Puffer aus den Vertiefungen zu entfernen. Man füllt die Vertiefungen mit 300 ul von Spülpuffer ("Rinsing Buffer") (PBS mit einem Gehalt von 0,1% BSA und 0,05% Tween 20, pH 7,2) und hält während einer Zeitspanne von 10 min aufrecht. Man dreht die Platte um, um den Puffer zu entfernen, man trocknet die Platte durch Ablöschen auf einem Papierhandtuch. Während des Tests soll man die Vertiefungen nicht länger als 10 min leer stehen lassen.
b. Man fügt zu den Vertiefungen 50 µl des Standards oder der Probe, jeweils in dreifacher Ausführung, hinzu.
Der 0 µg/ml-Standard sind 50 µl PBS.
Man fügt je 50 µl der verdünnten HDL-Standards zu den Standard-Vertiefungen (0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,50, 1,0 µg/ml) hinzu.
Man fügt je 50 µl der verdünnten Kontrollen bzw. Patientenproben zu den diesen entsprechenden Vertiefungen hinzu.
c. Zu allen Vertiefungen fügt man je 50 µl/Vertiefung von dem mit dem HRPO verknüpften Antikörper hinzu.
d. Man wickelt die Platte in Aluminiumfolie ein und legt dieselbe auf eine Rotationsschüttelvorrichtung (etwa 100 U/min) während 30 min bei Umgebungszimmertemperatur (etwa 20 bis 25ºC).
e. Man wäscht die Platte durch Anfüllen der Vertiefungen mit 300 µl/Vertiefung des Spülpuffers und dreht die Platte dann um, um den Puffer zu entfernen. Man wiederholt das Waschen zweimal, so daß insgesamt dreimal gewaschen wird. Nach dem dritten Waschvorgang wird die Platte auf einem Papierhandtuch durch Ablöschen getrocknet. Man lasse die Platte nicht austrocknen.
f. Man fügt 100 µl/Vertiefung von frisch präpariertem OPD-Substrat hinzu. Man läßt die Farbe bei Zimmertemperatur während 30 min entwickeln.
g. Man stoppt die Reaktion mit einer Zugabe von 50 µl von 4N Schwefelsäure zu allen Vertiefungen. Man liest die O.D. bei 492 nm ab.

I. Plasmaproben und Lipoprotein-Quantifizierung

Aus dem Herzkatheterisierungslaboratorium am San Diego VA Hospital wurden Plasmaproben aus 20 Patienten mit koronarer Herzkrankheit erhalten. Außerdem wurde Plasma aus 37 normalen Subjekten bezogen.
Das Blut wurde in Röhrchen gesamelt, welche 1,5 mg/ml Ethylendiamintetraacetat (EDTA) enthielten, und das Plasma wurde sofort durch Zentrifugation bei 4ºC abgetrennt.
Das Gesamtplasmacholesterin und die Gesamtplasmatriglyceride wurden anhand von frischen Plasmaproben in einem standardisierten klinischen Laboratorium unter Verwendung eines Abbott-Zweifarben-Analysators vom Typus "ABA 200" sowie eines Hochleistungs-Cholesterin-Reagens 236691 der Fa. Boehringer-Mannheim und eines Reagens, "A-gent", der Fa. Abbott Laboratories auf Triglyceride, gemessen. Das LDL- und das HDL-Cholesterin wurden unter Anwendung von Techniken gemessen, welche in Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. Nr. 75-628 (NIH), 2. Aufl., Washington, D.C., Gov.Print.Off. (1974), beschrieben sind.
Quantitative Apolipoprotein-A-I-Tests wurden auch unter Verwendung von im Handel erhältlichen Testkits durchgeführt, welche von den Firmen Isotex Disgnostics, Friendswood, TX; Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME; Tago, Inc., Burlingame, CA; und Calbiochem-Behring, La Jolla, CA, geliefert worden sind. Bei Durchführung dieser Tests wurden die mit jedem Kit mitgelieferten Gebrauchsanweisungen befolgt.
Quantitative ELISA-Untersuchungen auf Apo A-I wurden wie im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschrieben anhand von Serum- oder Plasmaproben durchgeführt, welche von Spendern - wie bereits beschrieben - erhalten worden waren, oder anhand von Proben durchgeführt, welche aus Laboratoriumspräparationen gewonnen worden waren, oder welche als Gaben oder von Lieferfirmen auf dem Markt erhalten worden waren. Diese handelsüblichen Proben wurden bezogen von: Meloy Laboratories, Springfield, VA; Scripps Laboratories, La Jolla, CA; Omega/Cooper Biomedical Inc., Malvern, PA; Isolab Lab, Akron, OH; Calbiochem-Behring, La Jolla, CA; International Union of Immunological Standards (IUIS), erhältlich von den Centers for Disease Control, Atlanta, GA; und Chemicon International, Inc., El Segundo, CA. Probengaben wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Firma Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ. Die Apo-A-I-Standards wurden von den Meloy Laboratories, Scripps Laboratories und Chemicon International erhalten.

J. Flüssigphasen-RIA mit mit ¹²&sup5;I markiertem Antigen

Zur Bestimmung der Fraktion von ¹²&sup5;I-HDL-Teilchen und Apo A-I, die bzw. das durch AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 und AI-14 gebunden werden, wurde ein Flüssigphasen-RIA benützt [Curtiss und Edgington (1985), J.Biol.Chem., 260:2982-2993]. So wurden zu 0,1 ml von mit radioaktivem Jod markiertem Antigen (HDL oder Apolipoprotein A-I) 0,1 ml von phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2, und 0,1 ml von verschiedenen Verdünnungen von Mäuse-Hybridomen-Kulturflüssigkeit oder Aszitesflüssigkeit, jeweils im Verhältnis von 1:50 in normalem Mäuse-Serum verdünnt, zugegeben. Alle Puffer enthielten auch 5% Dextran (MG 40.000). Nach 18 h bei 4ºC wurden 0,1 ml eines ausfällenden zweiten Antikörpers (Ziegen-Anti-Mäuse-IgG-Serum) zugegeben. Im Anschluß an eine 4-stündige Inkubation bei 4ºC wurden 2 ml von kaltem PBS zugesetzt, und die Röhrchen wurden bei 2000xg wähend 30 min bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert, und die ¹²&sup5;I-Aktivität der Pellets wurde in einem Gammazähler bestimmt.
Die maximal ausfällbare Radioaktivität wurde dadurch bestimmt, daß man den zweiten Antikörper zu 100% durch TCA ersetzte. Die minimale ausfällbare Radioaktivität oder das nicht-spezifische Binden (NSB) wurde durch Austauschen der spezifischen Hybridomen-Antikörper durch einen irrelevanten Hybridomen-Antikörper der gleichen Klassen von schweren Ketten bestimmt.
Die Daten wurden wie folgt berechnet:
Prozentsatz des gebundenen ¹²&sup5;I-Antigens = Mittelwert-NSB x 100/TCA-NSB,
wobei "Mittelwert" die in Gegenwart einer gegebenen Menge des spezifischen Antikörpers ausgefällte, mittlere Radioaktivität bedeutet, "NSB" die Menge der ausgefällten, nicht-spezifisch gebundenen Radioaktivität bedeutet, welche daduch bestimmt wurde, daß man die spezifischen, paratopen Moleküle der Erfindung durch einen irrelevanten Hybridomen-Antikörper der gleichen Klasse von schweren Ketten ersetzte, und "TCA" die maximale, durch TCA ausfällbare Radioaktivität bedeutet.

K. Enzymometrischer Konkurrenz-Immuntest auf AI-10 und AI-11

Biegsame Mikrotiterplatten aus Polyvinylchlorid wurden während einer Zeitspanne von etwa 18 h (über Nacht) bei 4ºC mit 0,2 ml einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) überzogen, welche 5 µg/ml von entweder HDL oder gereinigtem Apo A-I enthielt. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 0,3 ml von PBS gewaschen, welche 1,0 g BSA und 0,5 ml Tween 20 je Liter enthielt. Die restlichen Bindungsstellen auf den Vertiefungen wurden durch Inkubieren mit 0,2 ml von PBS mit einem Gehalt von 30 an BSA je Liter in den Vertiefungen während 1 h bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) blockiert. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit Spülpuffer gewaschen. Die Platten wurden sofort verwendet.
PBS (0,05 ml) mit einem Gehalt von 0,375 µg/ml an AI-10, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, wurde in den vorbeschichteten Vertiefungen mit 0,05 ml von PBS inkubiert, welche 0 bis 8,0 µg/ml von unkonjugiertem, monoklonalem AI-10-Antikörper oder von unkonjugiertem, monoklonalem AI-11-Antikörper enthielt. Die Inkubationszeit betrug 3 h bei Umgebungstemperatur. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit Spülpuffer gewaschen, und 0,1 ml von PBS mit einem Gehalt von o-Phenylendiamin-Substrat wurden zu allen Vertiefungen hinzugefügt und während 30 min bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºc) inkubiert. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von 0,05 ml von 4N H&sub2;SO&sub4; zu allen Vertiefungen gestoppt, und die optische Dichte (O.D.) jeder Vertiefung wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Ablesegerätes vom Typus "Dynatech" für Platten mit 96 Vertiefungen bestimmt.
Die Ergebnisse der mit Apo A-I beschichteten Platte sind in Fig. 1 dargestellt, und die Ergebnisse der mit HDL beschichteten Platte sind in Fig. 2 dargestellt. Eine 21-fache Zunahme der unmarkierten AI-11-Moleküle konkurrierte nicht signifikant mit mit Peroxidase markierten AI-10-Molekülen um das Binden an HDL oder Apo A-I. Die Untersuchung wurde unter Verwendung von mit Peroxidase markiertem AI-11 zusammen mit unmarkiertem AI-10 und unmarkiertem AI-11 bei den gleichen Konzentrationen und mit im wesentlichen den gleichen Ergebnissen wiederholt.
Die vorliegende Erfindung ist unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden. Dem Fachmann wird klar sein, daß Modifikationen und/oder Veränderungen an dem beschriebenen Gegenstand vorgenommen werden können, ohne den Schutzumfang der im Rahmen der vorliegenden Unterlagen beschriebenen Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Monoklonales, paratopes Molekül, welches mit Apolipoprotein A-I immunologisch reagiert und welches von einem Hybridom sezerniert wird, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 besteht.

2. Monoklonales, paratopes Molekül nach Anspruch 1, welches ein ganzer Antikörper ist.

3. Verfahren zum Testen auf das Vorliegen von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Vermischen einer zu untersuchenden, flüssigen Probe mit einer wirksamen Menge von monoklonalen, paratopen Molekülen, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, und welche von einem Hybridom sezerniert werden, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 besteht, unter Bildung eines Gemisches;

(b) Aufrechterhalten dieses Gemisches unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese paratopen Moleküle mit dem in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und eine Immunreaktionskomponente bilden;

(c) Feststellen des Vorliegens einer Immunreaktionskomponente.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die paratopen Moleküle ein damit in wirksamer Weise verknüpftes, radioaktives Element enthalten, und wobei das Vorliegen des Apolipoproteins A-I durch Abtrennen der Immunreaktionskomponente von dem Rest des Gemisches und Prüfen der von der abgetrennten Immunreaktionskomponente emittierten Strahlung festgestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die erstgenannten, monoklonalen, paratopen Moleküle vor der Bildung des Gemisches unter Bildung eines festen Trägers an eine feste Matrix gebunden werden, die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen des festen Trägers blockiert werden, und die gebildete Immunreaktionskomponenten an den festen Träger als in fester Phase gebundene Immunreaktionskomponente gebunden wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Vorliegen der in fester Phase gebundenen Immunreaktionskomponente festgestellt wird durch:

(i) Vermischen von in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Molekülen mit dem erstgenannten Gemisch unter Bildung eines zweiten Gemisches, wobei diese zweiten paratopen Moleküle mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und von einem Hybridom sezerniert werden, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 besteht, in dem erstgenannten Gemisch aber nicht verwendet werden, und wobei diese zweiten paratopen Moleküle in wirksamer Weise mit einem Enzym-Anzeigemittel verknüpft sind;

(ii) Aufrechterhalten des zweiten Gemisches unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die zweiten, mit dem Anzeigemittel verknüpften, paratopen Moleküle mit dem in diesem Gemisch vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und eine Sandwich-Immunreaktionskomponente und eine flüssige Phase bilden;

(iii) Trennen der festen und flüssigen Phasen voneinander; und

(iv) Feststellen des Vorliegens des mit dem Anzeigemittel verknüpften Apolipoproteins A-I in der in der abgetrennten, festen Phase vorliegenden Sandwich-Immunreaktionskomponente, und dadurch Feststellen von Apolipoprotein A-I in der Probe.

7. Verfahren zum Feststellen der Menge des in einer flüssigen Probe vorhandenen Apolipoproteins A-I, welches die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Vermischen einer vorbestimmten Menge einer flüssigen Probe mit einem festen Träger, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an die feste Phase gebundene, erste, monoklonale paratope Moleküle aufweist, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, unter Bildung eines aus festen und flüssigen Phasen bestehenden Gemisches, wobei die Oberfläche dieses Trägers blockierte, nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen aufweist;

(b) Aufrechterhalten dieses aus festen und flüssigen Phasen bestehenden Gemisches unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß die ersten paratopen Moleküle mit dem in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und eine an die feste Phase gebundene Immunreaktionskomponente bilden, welche im wesentlichen das gesamte, in der Probe vorhandene Apolipoprotein A-I enthält;

(c) Vermischen des Apolipoproteins A-I in der flüssigen Probe mit den in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Molekülen, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, aber in dem erstgenannten Gemisch nicht verwendet werden, und welche in wirksamer Weise an ein Enzym-Anzeigemittel gebunden sind, unter Bildung eines zweiten Gemisches;

(d) Aufrechterhalten dieses zweiten Gemisches unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese zweiten,an das Anzeigemittel gebundenen, paratopen Moleküle eine Immunreaktionskomponente bilden, welche im wesentlichen das gesamte, in der Probe vorhandene Apolipoprotein A-I enthält;

(e) Trennen der sich aus den obigen Stufen (a-d) ergebenden, festen und flüssigen Phasen voneinander; und

(f) Feststellen der enge der an das Anzeigemittel gebundenen, das Apolipoprotein A-I enthaltenden Immunreaktionskomponente, welche in der abgetrennten festen Phase vorliegt, und dadurch Feststellen der Menge des in dieser Probe vorhandenen Apolipoproteins A-I.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Vermischungsstufen (a) und (c) im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden, und wobei die Stufen des Aufrechterhaltens (b) und (d) zusammen durchgeführt werden.

9. Verfahren zum Bestimmen der in einer flüssigen Blutprobe vorhandenen Menge von Apolipoprotein A-I, welches Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Bilden eines aus festen und flüssigen Phasen bestehenden Gemisches durch im wesentlichen gleichzeitiges Vermischen einer flüssigen Blutprobe mit einem festen Träger, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an die feste Phase gebundene, erste, monoklonale paratope Moleküle aufweist, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, und mit in flüssiger Phase vorliegenden, zweiten, monoklonalen, paratopen Molekülen, welche in wirksamer Weise an ein Enzym-Anzeigemittel gebunden sind, und welche von irgendeinem der beiden Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden und nicht die ersten, an die feste Matrix gebundenen, paratopen Moleküle sind, wobei die Oberfläche dieses Trägers blockierte, nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen aufweist;

(b) Aufrechterhalten dieses aus festen und flüssigen Phase bestehenden Gemisches unter den Bedingungen eines biologischen Tests während einer vorbestimmten Zeitspanne, welche dafür ausreicht, daß diese ersten paratopen Moleküle und diese zweiten, an das Anzeigemittel gebundenen, paratopen Moleküle mit im wesentlichem dem gesamten, in der Probe vorhandenen Apolipoprotein A-I unter Bildung einer an die feste Phase gebundenen Sandwich-Immunreaktionskomponente und einer flüssigen Phase eine Immunreaktion eingehen;

(c) Trennen der festen und flüssigen Phasen voneinander; und

(d) Feststellen der Menge der mit dem Anzeigemittel verknüpften, das Apolipoprotein A-I enthaltenden, in der abgetrennten, festen Phase vorliegenden Sandwich-Immunreaktionskomponente, und dadurch der Menge des in dieser Probe vorhandenen Apolipoproteins A-I.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die ersten paratopen Moleküle von dem Hybridom mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9200 sezerniert werden.

11. Diagnostisches System, welches für den Gebrauch zum Feststellen des Vorliegens von Apolipoprotein A-I in einer flüssigen Probe geeignet ist, und welches umfaßt:

(a) eine Packung, welche paratope Moleküle aufweist, die mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen sezerniert werden, welche aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 besteht;

wobei diese paratopen Moleküle in einer Menge vorliegen, die für die Durchführung einer Bestimmung des Vorliegens von Apolipoprotein A-I ausreicht.

12. Diagnostisches System nach Anspruch 11, welches weiterhin ein Anzeigemittel umfaßt.

13. Diagnostisches System, welches für den Gebrauch zum Feststellen der in einer flüssigen Blutprobe vorhandenen Menge von Apolipoprotein A-I geeignet ist, und welches umfaßt:

(a) eine erste Packung, welche einen festen Träger enthält, der im wesentlichen aus einer festen Matrix besteht, welche an diese Matrix gebundene, monoklonale, paratope Moleküle aufweist, welche mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen und welche von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, wobei die nicht-spezifischen Protein-Bindungsstellen des Trägers blockiert sind; und

(b) eine zweite Packung, welche paratope Moleküle enthält, die mit Apolipoprotein A-I eine Immunreaktion eingehen, von einem der Hybridomen mit den ATCC-Hinterlegungsnummern HB 9200 oder HB 9201 sezerniert werden, aber nicht die paratopen Moleküle der ersten Packung sind, und welche in wirksamer Weise mit einem Anzeigemittel verknüpft sind; wobei diese paratopen Moleküle in einer Menge vorhanden sind, welche für die Durchführung einer Bestimmung des Vorliegens von Apolipoprotein A-I ausreicht.

14. Diagnostisches System nach Anspruch 13, wobei die monoklonalen, paratopen Moleküle, welche von dem Hybridom mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9200 sezerniert worden sind, an die feste Matrix der ersten Packung gebunden sind.

15. Hybridom mit einer ATCC-Hinterlegungsnummer, welche aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 und HB 9204 besteht.