CN112040932A - 一种保存和给药自人类血浆提取的前-β高密度脂蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于获取、保存和给药脱脂血浆的系统和方法。获得了提取的脱脂血浆，其包含前‑βHDL，并进行抽检以建立前‑βHDL的基线量或基线浓度。将批次进行保存、储存，然后再次制备以在将来使用。可以将批次的一部分再次测试以确定脱脂血浆中的前‑βHDL是否降解或不再有效。

Description

一种保存和给药自人类血浆提取的前-β高密度脂蛋白的方法

交叉引用

本申请要求2017年12月28日提交的第62/611,098号，标题是“一种治疗胆固醇相关疾病的方法”的美国临时专利申请的优先权，所述专利申请以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明总体涉及从HDL颗粒中除去脂质同时保留基本完整的LDL颗粒的系统、设备和方法，其通过使用一种或多种溶剂对血浆进行体外处理，其用于治疗慢性心血管疾病和急性肾脏疾病。具体来讲，本发明涉及用于保存和给药来自非自体、脱脂血浆的前-βHDL的系统和方法。

发明背景

家族性高胆固醇血症(FH)是遗传性的常染色体显性遗传疾病，其特征是包括LDL受体(LDLR)、载脂蛋白B-100(ApoB)或9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)的“FH基因”突变引起的低密度脂蛋白(LDL)、肌腱黄瘤和早发性冠心病明显升高。FH产生一种临床可识别的模式，该模式包括由于血浆中LDL的积聚导致的严重的高胆固醇血症，肌腱和皮肤中的胆固醇沉积，以及通常独特表现冠状动脉疾病(CAD)为主的动脉粥样硬化的高风险。在FH患者中，这种基因突变使肝脏无法有效代谢(或除去)多余的血浆LDL，导致LDL水平升高。

如果个体从父母一方那里遗传了一个有缺陷的FH基因，则FH的形式称为杂合子FH。杂合子FH是一种常见的遗传性疾病，以常染色体显性遗传模式遗传，在大多数国家中约有1：500的人发病。如果个体从父母双方那里遗传了有缺陷的FH基因，则FH的形式称为纯合子FH。纯合子FH非常罕见，全球约16万人至100万人中有1个人发病，其LDL水平>700mg/dl，比CVD患者理想的70mg/dl水平高10倍。由于所述高LDL水平，纯合子FH患者患有侵袭性动脉粥样硬化(狭窄和阻塞血管)和早期心脏病发作。这个过程始于出生之前，并迅速发展。它会影响冠状动脉、颈动脉、主动脉和主动脉瓣。

杂合子FH(HeFH)通常使用他汀类药物、胆汁酸螯合剂或其他降低胆固醇水平的降脂剂和/或通过提供遗传咨询进行治疗。纯合子FH(HoFH)通常对药物疗法反应不佳，同时可能需要其他治疗方法，包括进行LDL血液分离术(以类似于透析的方法除去LDL)，回肠旁路手术以显着降低其LDL水平，以及偶尔的肝移植手术。最近批准了一些被HoFH受试者使用的药物，然而这些药物仅降低LDL，并适度地有助于减缓而不是阻止动脉粥样硬化的进一步发展。此外，这些药物已知具有明显的副作用。

胆固醇是由肝脏合成或从饮食中获得的。LDL负责将胆固醇从肝脏转移到人体不同部位的组织中。但是，如果LDL聚集在动脉壁上，它会经受来自人体化学过程中释放的氧自由基引起的氧化作用，并与血管发生有害的相互作用。调整的LDL导致免疫系统中的白细胞聚集在动脉壁上，形成称作斑块的脂肪物质，并损害衬于血管的细胞层。调整的氧化LDL还降低了一氧化氮的含量，而一氧化氮会引起血管松弛，由此使血液自由流动。随着该过程的继续，动脉壁会缓慢收缩，导致动脉硬化，从而减少血液流动。斑块的逐渐堆积会导致冠状血管阻塞，并最终导致心脏病发作。斑块堆积也可能发生在诸如腿的外周血管中，这种情况被称为外周动脉疾病。

向大脑供血的血管中也会出现阻塞，这可能导致缺血性中风。这种阻塞的基本条件是在血管壁衬里内形成脂肪沉积。已知在美国，至少有2.7％的18岁以上的男性和女性有中风病史。随着年龄的增长，中风的患病率也更高。随着人口老龄化的加剧，中风幸存者的患病率预计会增加，尤其是在老年妇女中。所有中风中的相当一部分(至少87％)本质上是缺血性的。

进一步，已经表明高胆固醇血症和炎症是与动脉粥样硬化发展有关的两个主要机制。阿尔茨海默氏病和动脉粥样硬化二者的血管危险因素之间存在明显的重叠。炎症与阿尔茨海默氏病的发病机制有关，同时显示胆固醇稳态的异常也可能起着作用。此外，动脉粥样硬化的许多促成因素同时促成阿尔茨海默氏病。具体而言，在细胞培养物中，胆固醇水平的升高和降低分别促进和抑制自淀粉样前体蛋白(APP)形成的β淀粉样蛋白(Aβ)。因此，使用对动脉粥样硬化过程具有有效作用的治疗方法可能是治疗阿尔茨海默氏病病情发展的一种方法。

由于冠状动脉内的弹性衬里的动脉粥样硬化的发展(动脉硬化和狭窄)而发生的另一种常见的心血管疾病是冠状动脉疾病(CAD)，也称为缺血性心脏病(IHD)。根据2009年至2012年收集的统计数据，估计有1550万≥20岁的美国人患有CAD。在美国，≥20岁的成年人的CAD总患病率为6.2％。

冠状动脉中的血流急剧减少可能导致部分心肌无法正常工作，这种情况被称为急性冠状动脉综合征(ACS)。保守估计，2010年以ACS出院的人数是625,000。

与LDL相反，高血浆HDL水平是需要的，这是由于它们在“胆固醇逆向转运”中起着主要作用，将多余的胆固醇从组织部位转移到肝脏，然后消除。最佳总胆固醇水平为200mg/dl或以下，其中包括160mg/dl或以下水平的LDL胆固醇，以及男性45mg/dl的HDL胆固醇水平和女性50mg/dl的HDL胆固醇水平。有胆固醇升高、动脉粥样硬化或冠状动脉疾病史的人建议降低LDL水平。高水平的LDL增加冠状动脉中的脂质含量，导致形成易于破裂的充满脂质的斑块。另一方面，已经证明HDL降低了充满脂质的斑块中的脂质含量，降低了破裂的可能性。在过去的几年中，低密度脂蛋白(LDL)降低药物的临床试验已明确确定，LDL的降低与临床心血管疾病(CVD)事件减少30-45％有关。CVD事件包括在诸如HoFH，HeFH和外周动脉疾病等疾病中发生的事件。尽管LDL降低，但许多患者仍会发生心脏事件。低水平的HDL经常存在于具有CVD的高水平患者中，流行病学研究已经确定HDL是调节心血管疾病风险的独立危险因素。除流行病学研究外，其他证据表明提高HDL可以降低CVD的风险。人们日益关注通过饮食、药理或基因操作改变血浆HDL水平，将其作为治疗包括HoFH、HeFH、缺血性中风、CAD、ACS和周围动脉疾病等CVD以及治疗阿尔茨海默氏病病情发展的潜在策略。

LDL的蛋白质成分(被称为载脂蛋白B(ApoB))及其产物包含致动脉粥样硬化成分。血浆LDL水平升高和HDL水平降低被认为是造成冠状动脉疾病的主要原因。ApoB在LDL颗粒中的浓度最高，而不存在于HDL颗粒中。在HDL中发现了载脂蛋白A-I(ApoA-I)和载脂蛋白A-II(ApoA-II)。在HDL中也发现了其他载脂蛋白，例如ApoC及其亚型(C-I，C-II和C-III)，ApoD和ApoE。在LDL颗粒中也观察到了ApoC和ApoE。

已经报道了许多主要类别的HDL颗粒，包括HDL2b、HDL2a、HDL3a、HDL3b和HDL3。基于琼脂糖上的电泳迁移率，已经将各种形式的HDL颗粒描述为两个主要类型，具有α-HDL迁移率的主要部分和具有类似于VLDL迁移的次要部分。后一部分被称为前-βHDL，并且这些颗粒是诱导细胞胆固醇外排的最有效的HDL颗粒亚类。

HDL脂蛋白颗粒由ApoA-1、磷脂和胆固醇组成。前-βHDL颗粒被认为是细胞游离胆固醇的第一个接受者，并且对于最终将游离和酯化的胆固醇转移到α-HDL至关重要。前-βHDL颗粒可能会将胆固醇转移到α-HDL或转化为α-HDL。α-HDL将胆固醇转移到肝脏，在这里可以从体内除去多余的胆固醇。

HDL水平与动脉粥样硬化和冠状动脉疾病负相关。一旦携带胆固醇的α-HDL到达肝脏后，α-HDL颗粒会释放胆固醇并将游离胆固醇转移到肝脏。α-HDL颗粒(除掉胆固醇)随后被转化为前β-HDL颗粒，并离开肝脏，随后前β-HDL颗粒在体内吸收额外的胆固醇并被转化回α-HDL，以此方式重复这一循环。因此，需要一种从这些多样HDL颗粒(特别是α-HDL颗粒)中减少或除去胆固醇的方法，使得它们可用于从细胞中除去额外的胆固醇。

肾动脉狭窄是指向肾脏供血的动脉的阻塞，其特征为两种形式：a)平滑肌斑块或b)胆固醇填充斑块。这种情况通常称为肾动脉狭窄，会减少流向肾脏的血液，并可能导致高血压。在CT血管造影期间可发现肾动脉斑块。在某些情况下，进行主动脉瘤的CT血管造影时发现肾动脉狭窄。通常，血压随着年龄的增长而逐渐增加。但是，高血压的突然发作也可能与肾梗阻或肾动脉狭窄有关。随着肾脏开始产生过量的细胞因子，流向肾脏的血液流量减少会引起血管收缩或高血压。

此外，通常从动脉粥样硬化斑块释放出动脉中的胆固醇时，会发生“胆固醇栓塞”，并在血液中以栓塞的形式传播，从而在距离较远的血管中造成阻塞(栓塞)。一旦进入血液循环，所述胆固醇颗粒就会卡在微小的血管或小动脉中。它们可以减少流向组织的血量，并引起损害肾脏的炎症和组织损伤。胆固醇栓塞可能导致肾功能衰竭，是一种称为动脉粥样硬化性肾病(AERD)的疾病。AERD是胆固醇填充斑块可能引起的疾病表现之一。对于患有AERD的患者，斑块可能在动脉中破裂，并将斑块内的胆固醇和其他“垃圾”释放到血管中。释放的胆固醇和垃圾可能会沿着动脉行进，并可能阻塞动脉并损害肾脏及其组织的一部分，从而导致AERD。主动脉粥样硬化是AERD的最常见原因。

当前，肾动脉狭窄(表现如AERD)和其他心血管疾病的治疗方法涉及将支架置于动脉中以打开血管。这种技术通常可以使血压正常化。但是，安装支架可能仅能治疗症状(如高血压)。在某些情况下，血压正常，但患者体内存在AERD。因此，需要解决疾病的根本原因，并与高血压症状组合或独立于高血压症状来治疗肾动脉狭窄。

可以通过改变患者的饮食来治疗高脂血症(或血液中异常高浓度的脂质)。然而，饮食作为主要的治疗方式需要患者、医生、营养专家、膳食学家和其他卫生保健专业人员的大量努力，这样不合情理地占用卫生专业人员资源。该疗法的另一个不利方面是其成功并不仅仅取决于饮食。相反，饮食疗法的成功取决于社会、心理、经济和行为因素的结合。因此，仅基于纠正患者饮食中的缺陷的疗法并不总是成功的。

在饮食调整不成功的情况下，药物疗法已被用作辅助疗法。这样的疗法包括单独或与其他疗法联合给药市售降血脂药物作为饮食控制的补充。这些称为他汀类药物的药物包括洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和西立伐他汀。他汀类药物对降低LDL水平特别有效，并且在减少甘油三酯方面也有效，显然与其降低LDL作用成正比。他汀类药物可提高HDL水平，但程度不及其他抗胆固醇药物。他汀类药物还增加一氧化氮，如上所述，一氧化氮在氧化的LDL存在下被降低。

胆汁酸树脂是另一种药物疗法，它与胆汁酸结合起效。胆汁酸是肝脏使用胆固醇作为主要制造成分之一制成的物质。由于这些药物在消化道中与胆汁酸结合，因此它们随粪便排出体外，而不是被人体吸收。结果，肝脏必须从血液循环中吸收更多的胆固醇以继续构建胆汁酸，从而导致LDL水平的总体下降。

较之任何其他抗胆固醇药物，烟酸(也称为维生素B3)可更有效降低甘油三酯水平并提高HDL含量。烟酸还可以降低LDL-胆固醇。

当通常用于这些目的的其他药物(例如烟酸)无效时，可使用纤维酸衍生物或贝特类药物来降低甘油三酯水平并增加HDL。

普罗布考降低了LDL胆固醇的水平，但是也降低了HDL的水平。它通常用于导致高胆固醇水平的某些遗传疾病，或在其他降低胆固醇的药物无效或无法使用的情况下使用。

PCSK9通过增加肝脏中LDL受体的细胞水平来降低LDL-胆固醇水平。

降血脂药在降低血脂方面已经取得了不同程度的成功。但是，没有一种降血脂药能成功治疗所有类型的高脂血症。尽管某些降血脂药已经相当成功，但医学界几乎没有确凿的证据表明降血脂药会导致动脉粥样硬化的消退。此外，所有降血脂药都有不良副作用。由于饮食控制、药物治疗和其他疗法不成功，动脉粥样硬化仍然是世界许多地方的主要死亡原因。

对于药物和饮食疗法不足以有效治疗的患者，已使用新疗法用于减少其脂质含量。例如，已经采用了诸如血浆置换和LDL置换等体外程序，并且显示出它们在降低LDL方面是有效的。

血浆置换疗法涉及使用供体血浆或更通常的血浆蛋白组分代替患者的血浆。血浆置换是通过细胞分离器从血细胞中除去血浆的过程。分离器通过高速旋转血液以使细胞从液体中分离，或者使血液通过具有小孔的膜而起作用，该孔小到只有血液的液体成分才能通过。细胞被送回接受治疗的人，而血浆被丢弃并被其他液体替代。

由于外来蛋白质的引入和传染病的传播，这种治疗方法已经造成了并发症。进一步，血浆置换具有非选择性除去如VLDL、LDL和HDL等所有血清脂蛋白的缺点。而且，血浆置换会导致多种副作用，包括发烧、寒战和皮疹形式的过敏现象，甚至可能是过敏反应。

如上所述，除去肝脏和肠子两者中分泌的HDL是不适宜的，该HDL为含有胆固醇和磷脂的新生盘状颗粒。人们认为HDL在胆固醇逆向运输中起着作用，这一过程是从组织中除去过量胆固醇，然后将其运输到肝脏以在胆汁中再利用或处置的过程。

与血浆置换相反，LDL置换程序选择性除去含胆固醇的ApoB，例如LDL，同时保留HDL。已经开发了几种用于LDL置换的方法。这些技术包括在肝素-琼脂糖珠中吸收LDL，使用固定的LDL-抗体，级联过滤吸收以固定硫酸葡聚糖，以及在肝素存在的情况下低pH沉淀LDL。上述每种方法在除去LDL方面都是有效的。然而，该治疗方法具有缺点，包括不能积极影响HDL或不能造成可促进动脉粥样硬化和其他心血管疾病的代谢迁移。顾名思义，LDL血液分离术仅治疗重度高脂血症患者的LDL。

在纯合子家族性高胆固醇血症、杂合子家族性高胆固醇血症和获得性高脂血症患者中实现降低血浆胆固醇的另一种方法是体外脂质消除过程，称为胆固醇单采。在胆固醇单采中，从患者体内抽出血液，从血液中分离血浆，然后混合血浆和溶剂混合物。溶剂混合物从血浆中提取出脂质。此后，将脱脂的血浆与患者的血细胞重组并返回患者。然而，使用该程序导致LDL颗粒的调整，使得调整的LDL颗粒可导致心脏病强度增加。同时，该过程还导致HDL颗粒进一步脱脂。

然而，常规的体外脱脂过程是针对LDL和HDL的同时脱脂。此过程有许多缺点。主要缺点是脱脂LDL易于聚集，继而引起心脏病症状的增加，而不是减少。此外，体外系统被设计成可能通过多阶段溶剂暴露和提取步骤对体液进行实质性处理。

剧烈的多阶段溶剂暴露和萃取有几个缺点。可能难以从脱脂血浆中除去足够量的溶剂以使脱脂血浆安全地返回患者。

因此，现有的用于血浆部分治疗方法的血液分离术和体外系统具有许多缺点，这些缺点限制了它们在临床应用中的使用能力。对一种能够从血液成分中除去脂质的改进的系统、装置和方法的存在需求，以便为慢性心血管疾病提供治疗和预防措施。还提供了从HDL颗粒中选择性除去脂质，藉此产生具有增加的接受胆固醇能力的调整的HDL颗粒的方法。

已经提供了在慢性疾病中从HDL颗粒中选择性除去脂质，并藉此产生具有提高的接受胆固醇能力的调整的HDL颗粒，而基本上不影响LDL颗粒的方法。但是，这些方法需要立即重新给药调整的HDL颗粒，并且不提供任何在更长的时间段内保存、储存或以其他方式使用调整的HDL颗粒的方法。

同时需要一种保存脱脂血浆和调整的HDL颗粒的方法。从自体和非自体来源衍生的血浆需要在衍生后的几个小时内引入患者体内。但是，在某些情况下，可能无法在规定的衍生期限内将衍生的调整的HDL颗粒引入患者体内。在患者需要的调整的HDL颗粒不能从患者(自体)充分衍生，而是利用非自体血浆源的情况下尤其如此。通过保存和易于获得脱脂血浆，可以增加更多患者获得挽救生命的治疗机会，为的是可以到必要时候使用它。

发明内容

结合系统、工具和方法来描述和说明以下实施例及其方面。所述系统、工具和方法是示例性和说明性的，并不限制范围。

一种保存给药至患者的前-β高密度脂蛋白的方法，其包括：获得一批包含前-β高密度脂蛋白的脱脂血浆；测试该批次脱脂血浆的一部分以表征所述前-β高密度脂蛋白；保存该批脱脂血浆；制备用于给药至患者的保存的脱脂血浆；测试所制备的脱脂血浆以表征前-β高密度脂蛋白；向患者给药前-β高密度脂蛋白。

任选地，该方法进一步包括在保存步骤之前，调整所述前-β高密度脂蛋白的量以确保前-β高密度脂蛋白的浓度在1mg/dl至400mg/dl的范围内。

任选地，保存步骤包括在低于-30℃的温度下冷冻所述批次产品。

任选地，制备步骤包括在2℃至26℃的温度范围内解冻保存的脱脂血浆。

任选地，保存步骤包括使体积介于1毫升至2升之间的脱脂血浆处于低于-30℃的温度少于20分钟。

任选地，测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述前-β高密度脂蛋白的步骤包括确定前-β高密度脂蛋白的第一浓度。任选地，测试所制备的脱脂血浆以表征前-β高密度脂蛋白的步骤包括确定所述前-β高密度脂蛋白的第二浓度，并将前-β高密度脂蛋白的第二浓度与前-β高密度脂蛋白的第一浓度进行比较，以确定降解程度。任选地，所述方法进一步包括基于所述前-β高密度脂蛋白的第二浓度来确定所制备的脱脂血浆是否适合于给药。

任选地，所述方法进一步包括，在保存步骤之前，将防腐剂添加到脱脂血浆中。

任选地，制备步骤包括解冻保存的脱脂血浆，并且进一步包括将解冻的脱脂血浆在1℃至6℃的温度下储存不超过5天。

本说明书同时公开了一种保存用于给药至患者的调整的高密度脂蛋白的方法，其包括：获得一批包含调整的高密度脂蛋白的脱脂血浆——通过将至少一个人连接到抽血设备，从所述至少一个人抽出含有血细胞的血液，从血液中分离血细胞以获得含有高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分，用溶剂对高密度脂蛋白脱脂处理，分离出低密度脂蛋白，并收集含有调整的高密度脂蛋白的脱脂血浆；测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述调整的高密度脂蛋白；保存该批脱脂血浆；制备用于给药至患者的保存的脱脂血浆；测试所制备的脱脂血浆以表征所述调整的高密度脂蛋白；和向患者给药调整的高密度脂蛋白。

任选地，所述方法进一步包括，在保存步骤之前，调整所述调整的高密度脂蛋白的量以确保所述调整的高密度脂蛋白的浓度在1mg/dl至400mg/dl之间。

任选地，保存步骤包括在低于-30℃的温度下冷冻所述批次产品。

任选地，制备步骤包括在2℃至26℃的温度范围内解冻保存的脱脂血浆。

任选地，保存步骤包括使体积介于1毫升至2升之间的脱脂血浆处于低于-30℃的温度少于20分钟。

任选地，测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述调整的高密度脂蛋白的步骤包括确定调整的高密度脂蛋白的第一浓度。任选地，测试所制备的脱脂血浆以表征调整的高密度脂蛋白的步骤包括确定所述调整的高密度脂蛋白的第二浓度，并将调整的高密度脂蛋白的第二浓度与调整的高密度脂蛋白的第一浓度进行比较，以确定降解程度。任选地，所述方法进一步包括基于所述调整的高密度脂蛋白的第二浓度来确定所制备的脱脂血浆是否适合于给药。

任选地，所述方法进一步包括，在保存步骤之前，将防腐剂添加到脱脂血浆中。

任选地，制备步骤包括解冻保存的脱脂血浆，并且进一步包括将解冻的脱脂血浆在1℃至6℃的温度下储存不超过5天。

本说明书同时公开了一种用于治疗患者的心血管疾病的方法，其包括：获得一种包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分，混合所述血浆部分和一种除去脂质的脂质除去剂，以获得一种脂质、脂质除去剂、调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的混合物，其中所述调整的高密度脂蛋白是一种脱脂高密度蛋白，从脂质和脂质除去剂中分离调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，在延长的时间保存调整的高密度脂蛋白，制备用于使用的保存的调整的高密度脂蛋白，从保存后制备的调整的高密度脂蛋白中分离出高密度脂蛋白颗粒的组分，并将所述高密度脂蛋白颗粒的成分输送给患者。

任选地，所述保存步骤的方法包括冷冻。任选地，所述制备用于使用的步骤的方法包括解冻。

任选地，所述保存步骤的方法包括保存体积介于1毫升至2升之间的DP。

任选地，所述混合步骤的方法包括混合血浆部分和脂质除去剂，所述脂质除去剂除去与高密度脂蛋白相关的脂质，而基本不调整低密度脂蛋白。

任选地，所述获得一种包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分的方法，包括从至少一位患者或一个人获得，而不是所述患者。

任选地，所述治疗心血管疾病的方法，包括治疗AERD、纯合子家族性高胆固醇血症、杂合子家族性高胆固醇血症、缺血性中风、冠状动脉疾病，急性冠状动脉综合征和外周动脉疾病中的至少一种。

任选地，所述治疗心血管疾病的方法，包括治疗阿尔茨海默氏病病情发展的方法。

任选地，所述混合血浆部分和脂质除去剂的步骤，获得调整的高密度脂蛋白，其中高密度脂蛋白相对于总蛋白具有增加的前-β高密度脂蛋白浓度。

任选地，所述从治疗心血管疾病中获得一种血浆部分的步骤，进一步包括：将一个人连接到抽血设备，从所述一个人抽出含有血细胞的血液，从血液中分离血细胞以获得包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分。

任选地，所述从调整的高密度脂蛋白分离出高密度脂蛋白颗粒成分的步骤，包括使用亲和层析。

任选地，所述使用亲和层析的方法包括：将含有脱脂的高密度脂蛋白的血浆添加到色谱柱中，使血浆滴过其中包含与ApoA-I蛋白结合的抗体的色谱柱，清洗所述色谱柱以除去任何不需要的物质，并通过向所述色谱柱输送解离试剂以破坏抗体和ApoA-I蛋白之间的化学键，藉此至少分离前-βHDL。

任选地，所述从调整的高密度脂蛋白分离高密度脂蛋白颗粒的成分的步骤，包括使用超速离心。

任选地，所述使用超速离心包括：旋转密度为1.21的调整的高密度脂蛋白，分离出一种含有前-β高密度脂蛋白颗粒和血浆蛋白的底部馏分，并旋转密度为1.25的底部馏分，以从血浆蛋白中分离出前-β高密度脂蛋白颗粒。

任选地，所述使用超速离心包括：旋转所述密度为1.006的调整的高密度脂蛋白，分离包含低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的底部馏分，旋转所述密度为1.063、具有低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的血浆，分离出一种包含所述高密度脂蛋白颗粒的底部馏分，旋转所述密度为1.21、分离的高密度脂蛋白颗粒，分离出一种包含前-β高密度脂蛋白颗粒和血浆蛋白的底部馏分，并旋转所述密度为1.25的底部馏分，以从血浆蛋白中分离前-β高密度脂蛋白颗粒。

任选地，所述使用超速离心包括：旋转密度为1.063的调整的高密度脂蛋白，分离出一种含有α和前-β高密度脂蛋白颗粒和血浆蛋白的底部馏分，并旋转密度为1.25的底部馏分，以从血浆蛋白中分离出α和前-β高密度脂蛋白颗粒。

本说明书同时公开了一种用于治疗患者的心血管疾病的方法，包括：获得一种包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分，混合血浆部分和除去脂质的脂质除去剂，以获得一种脂质、脂质除去剂、调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白混合物，其中调整的高密度脂蛋白是脱脂的高密度脂蛋白，从脂质和脂质除去剂中分离调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，从调整的高密度脂蛋白中分离出高密度脂蛋白颗粒的成分，在延长的时间保存高密度脂蛋白颗粒成分，制备用于使用的调整的高密度脂蛋白颗粒成分，并输送高密度脂蛋白颗粒的成分给患者。

本说明书同时公开了一种用于治疗患者的心血管疾病的方法，包括：获得包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分，混合血浆部分和除去脂质的脂质除去剂，得到一种脂质、脂质除去剂、调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白混合物，其中调整的高密度脂蛋白是脱脂的高密度脂蛋白，从脂质和脂质除去剂中分离调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，从调整的高密度脂蛋白中分离出高密度脂蛋白颗粒的成分，并在延长的时间保存高密度脂蛋白颗粒成分。

任选地，所述方法进一步包括制备用于使用的高密度脂蛋白颗粒的保存成分。

任选地，所述方法进一步包括将所述高密度脂蛋白颗粒的成分输送给患者。

任选地，所述保存步骤包括冷冻。

任选地，所述制备步骤包括解冻。

任选地，高密度脂蛋白颗粒的成分包括α高密度脂蛋白和/或前-β高密度脂蛋白。

任选地，高密度脂蛋白颗粒的成分包括前-β高密度脂蛋白。

本说明书同时公开了一种用于治疗患者的心血管疾病的方法，包括：获得一种包含高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分；混合血浆部分和除去脂质的脂质除去剂混合，以获得一种脂质、脂质除去剂、调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白混合物，其中调整的高密度脂蛋白是脱脂的高密度脂蛋白，从脂质和脂质除去剂中分离调整的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，在预定或延长的时间保存调整的高密度脂蛋白，制备用于使用的保存的调整高密度脂蛋白，从保存后制备的所述调整的高密度脂蛋白中分离出高密度脂蛋白颗粒成分，在延长或预定的时间保存高密度脂蛋白颗粒成分，制备用于使用所述保存的高密度脂蛋白颗粒成分，并输送高密度脂蛋白颗粒成分给患者。

任选地，所述保存步骤包括冷冻。

任选地，所述制备步骤包括解冻。

任选地，高密度脂蛋白颗粒成分包括α高密度脂蛋白和/或前-β高密度脂蛋白。

任选地，高密度脂蛋白颗粒成分包括前-β高密度脂蛋白。

在以下附图和方案详述中，将更深入地描述本说明书的前述及其他实施方案。

附图简述

考虑结合附图时，通过参考以下详细描述将会更好地理解本发明的这些和其他特征和优点，其中：

图1A是根据本说明书的一些实施方案用于说明从脱脂的(调整的)HDL中分离前-βHDL的示例性方法的流程图；

图1B是包括根据本说明书的一些实施方案的用以实现本文所公开过程中的各个组件的系统示意图；

图1C是根据本说明书的一些实施方案的用以实现本文所公开过程的各个组件的系统配置的示例性实施方案的图示说明；

图1D是示出了根据本说明书的一些实施方案，使用亲和色谱法增加脱脂血浆中所需物质的浓度的示例性方法的流程图。

图1E是示出了根据本说明书的一些实施方案，通过超速离心来增加脱脂血浆中所需物质的浓度的示例性方法的流程图；

图1F是示出了根据本说明书的一些实施方案，通过超速离心来增加脱脂血浆中所需物质的浓度的另一种示例性方法的流程图；

图1G是示出了根据本说明书的一些实施方案，通过超速离心来增加处理的血浆中所需物质的浓度的另一示例性步骤组的流程图；

图2是测试、保存和验证所存储的包含前-βHDL的脱脂血浆的方法的流程图。

方案详述

在一些实施方案中，本说明书涉及用于保存具有降低的脂质含量，特别是降低的胆固醇含量的调整的HDL颗粒(也称为脱脂HDL)的系统、装置和方法，所述胆固醇含量主要来自患者的非自体来源的血浆，所述保存的产品可能会在将来使用。本说明书的实施方案在基本不调整LDL颗粒的情况下，制造并保存这些具有降低的脂质含量的调整的HDL颗粒。本说明书的实施方案调整原始的α-HDL颗粒(存在于脱脂血浆中)，以获得较之于原始的HDL，具有增加的HDL成分浓度的调整的HDL颗粒，所述HDL成分包括α-HDL和/或前-βHDL。进一步，处理新形成的HDL颗粒衍生物(调整的HDL)，以从脱脂血浆中分离出α-HDL和/或前-βHDL。在一些实施方案中，处理脱脂血浆以制造一种更加浓缩的α-HDL和/或前-βHDL的溶液。在一个实施方案中，通过冷冻而保存所述调整的HDL，其包括浓缩的α-HDL和/或前-βHDL的溶液，然后在将来再解冻保存的调整的HDL，之后再给药至患者，以增强细胞内胆固醇排出并且治疗心血管疾病和/或其他脂质相关疾病。在一个实施方案中，所述调整的HDL包含约20％的α-HDL颗粒(存在于脱脂血浆中)和约80％的前β-HDL的浓缩溶液。

本说明书的治疗过程使本说明书的方法和系统更有效地治疗心血管疾病，包括纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH)、杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)，缺血性中风、冠状动脉疾病(CAD)、急性冠脉综合征(ACS)、外周动脉疾病(PAD)、AERD、肾动脉狭窄(RAS)及其症状，并用于治疗阿尔茨海默氏病的病情发展。

本说明书涉及多个实施方案。提供以下公开内容是为了使本领域普通技术人员能够实施本发明。在本说明书中使用的语言不应被解释为对任何一个特定实施方案的普遍否认，或不应被用来限制超出了在此使用的术语的含义的权利要求。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文中定义的普遍原理可以应用于其他实施方案和申请。同时，所使用的术语和措词是出于描述示例性实施方案的目的，并且不应被认为是限制性的。因此，本发明应被赋予最宽泛的范围，包括与所公开的原理和特征一致的许多替代、改进和等同形式。为了清楚起见，未详细描述与本发明相关的技术领域中涉及已知技术资料的细节，以免不必要地使本发明晦涩难懂。在本申请的说明书和权利要求书中，单词“包括”、“包括”和“具有”中的每一个及其形式不一定限于所述单词可能相关的列表中的成分。

在此应当注意，除非另外明确指出，否则与特定实施方案相关联描述的任何特征或成分可以与任何其他实施方案一起使用和实施。

术语“液体”可以定义为来自动物或人类的含有脂质或含有脂质的颗粒的液体，来自培养组织和细胞的含有脂质的液体，以及与含有脂质的细胞混合的液体。出于本发明的目的，减少液体中脂质的量包括减少血浆中及血浆中包含的颗粒(包括但不限于HDL颗粒)的脂质。液体包括但不限于：生物液体，例如血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊髓液、腹膜液、胸膜液、心包液，以及包括但不限于精液，射精液，卵泡液和羊水等生殖系统的各种液体；细胞培养试剂，例如正常血清、胎牛血清或任何动物或人的血清；免疫试剂，例如来自培养组织和细胞的各种抗体和细胞因子的制剂，与含脂质的细胞混合的液体，以及含脂质的生物组织的液体，例如含脂质的生物组织的盐水溶液。用本发明方法处理的优选液体是血浆。

术语“脂质”可以定义为存在于人或动物中的一组脂肪或类脂肪物质中的任何一种或多种。脂肪或类脂肪物质的特征是它们在水中的不溶性和在有机溶剂中的溶解性。术语“脂质”是本领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于复杂脂质、简单脂质、甘油三酯、脂肪酸、甘油磷脂(磷脂)，以及例如脂肪酸、甘油、脑苷脂类、蜡等的酯的真正脂肪，和例如胆固醇和麦角固醇等固醇。

术语“提取溶剂”可以定义为用于从液体或液体中的颗粒中提取脂质的一种或多种溶剂。所述溶剂进入所述液体并保留在液体中，直到被其他子系统除去。合适的提取溶剂包括提取或溶解脂质的溶剂，包括但不限于酚、烃、胺、醚、酯、醇、卤代烃、卤烃及其组合。合适的提取溶剂的实例是醚、酯、醇、卤代烃或卤烃，其包括但不限于二异丙醚(DIPE，也称为异丙醚)、二乙醚(DEE，也称为乙醚)、低级醇(诸如丁醇，尤其是正丁醇)、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、异氟烷、七氟醚(1,1,1,3,3,3-六氟-2-(氟甲氧基)丙烷-d3)、全氟环己烷、三氟乙烷、环氟己醇及其组合。

术语“患者”是指动物和人类，它们可以是使用本发明的方法治疗的液体源，也可以是脂质含量降低的HDL颗粒和/或血浆衍生物的接受者。

术语“HDL颗粒”包括基于多种方法(例如测量电荷、密度、尺寸和免疫亲和性的方法)定义的几种类型的颗粒，所述方法包括但不限于电泳迁移、超速离心、免疫反应和其他本领域普通技术人员已知的方法。所述HDL颗粒包括但不限于以下：α-HDL、前-βHDL(包括前-β1HDL，前-β2HDL和前-β3HDL)、HDL2(包括HDL2a和HDL2b)、HDL3、VHDL、LpA–I、LpA-II、LpA-I/LpA-II(综述参见Barrans set al.，Biochemica Biophysica Acta1300；73-85，1996)。因此，实施本发明方法制造了调整的HDL颗粒。所述HDL颗粒的调整的衍生物可以在很多方面进行调整，所述方面包括但不限于以下一种或多种代谢和/或理化性质的改变(综述参见Barrans等人，Biochemica Biophysica Acta 1300；73-85，1996)：分子量(kDa)、电荷、直径、形状、密度、水合密度、浮选特性、胆固醇含量、游离胆固醇含量、酯化胆固醇含量、游离胆固醇与磷脂的摩尔比、免疫亲和性，和以下一种或多种酶或蛋白质的含量、活性或螺旋度：ApoA-I、ApoA-II、ApoD、ApoE、ApoJ、ApoA-IV、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、卵磷脂、胆固醇酰基转移酶(LCAT)，以及胆固醇结合的能力和/或速率，胆固醇转运的能力和/或速率。

术语“调整的高密度脂蛋白”和“脱脂的高密度脂蛋白”可以互换使用，是指脂质含量降低的血制品，尤其是脂质含量降低的高密度脂蛋白。一旦脱脂过程已经完成，所述脂质含量降低的高密度脂蛋白就可能包含在所得血浆中。类似地，术语“处理的血浆”是指一经脱脂过程完成后的所得血浆。

图1A是根据本说明书的一些实施方案的用于说明从调整的HDL中分离前-βHDL的示例性方法的流程图。其中，在102对患有心血管疾病或相关疾病的受试者或患者开始血浆脱脂过程。该过程通常在医生治疗患者时进行一次或多次观察后开始。所述观察可以是基于症状和测试结果(例如但不限于血液测试和成像分析)的组合。该观察结果可使医生得出以下结论：治疗患者需要减少患者生理系统中的有害脂质。

在104，获得血液部分，该部分在一个实施方案中为血浆。根据本说明书的实施方案，该血液部分是从患者(自体)源或非自体源中获得的。非自体源的血液部分是从健康的自愿者中收集的。血液分离的过程通常通过过滤、离心血液、抽吸或本领域技术人员已知的任何其他方法进行。血液分离是从血液中分离血浆。在一个实施方案中，血液分离是按图1A上下文所描述的方法远程进行的。在一个实施方案中，基于患者或提供者的体重，以足以产生约12ml/kg血浆的体积从患者或供者抽出血液。在分离过程中，可以任选地将该血液与抗凝剂(例如柠檬酸钠)混合，并在等于大约2000倍重力的作用力下离心。通过使用本领域技术人员通常已知的方法(例如血浆置换术)将所述血液分为血浆和红细胞。在一个实施方案中，所述红细胞随后从血浆中抽吸出。在一个实施方案中，血液分离过程是通过从正接受医生治疗的、患有心血管疾病和/或相关疾病的患者中抽取血液来进行的。在一个替代实施方案中，血液分离的过程是通过从正接受医生治疗的、患有心血管疾病和/或相关疾病的患者以外的其他人中抽取血液来进行的。因此，由所述血液分离过程而获得的血浆可以是自体的，也可以是非自体的。

在分离之后，将红细胞存储在适当的存储溶液中，或者优选地，在血浆置换过程中将其返回给患者。生理盐水也可以任选地给予患者以补充体积。如果血液是从患者以外的其他个体获得的，则将细胞返回给该个体，该个体也可以被称为供者。

从血液中获得的血浆通常是稻草色液体(包含血细胞的细胞外基质)。血浆通常含有95％的水，并且含有溶解的蛋白质(约占血浆的6-8％)。该血浆还包含葡萄糖、凝血因子、电解质、激素、二氧化碳和氧气。血浆密度约为1006kg/m³或1.006g/ml。

在一些替代实施方案中，也将低密度脂蛋白(LDL)与血浆分离。分离的LDL通常被丢弃。在替代实施方案中，将LDL保留在血浆中。根据本说明书的实施方案，在104获得的血液部分或血浆包括具有高密度脂蛋白(HDL)的血浆；可能包括也可能不包括其他蛋白质颗粒。在实施方案中，随后收集自患者或供者的自体或非自体血浆分别通过批准的血浆置换设备分离。所述血浆可以使用连续或间歇过程来输送。

在106，将在104获得的血液部分或血浆与一种或多种溶剂(例如脂质除去剂)混合。在一个实施方案中，所使用的溶剂包括七氟醚和正丁醇中的一种或两种有机溶剂。在实施方案中，将血浆和溶剂引入至少一个设备中以使血浆与溶剂以混合、搅动或以其他方式接触。在实施方案中，溶剂系统被最优化设计，以使得仅HDL颗粒被处理以降低其脂质水平而LDL水平不受影响。所述溶剂系统包括考虑所用溶剂、混合方法、时间和温度等变量。在此步骤中，溶剂类型、比例和浓度可能会有所不同。溶剂与血浆的可接受比例包括溶剂与血浆的任何组合。在一些实施方案中，使用的比例是2份血浆对1份溶剂，1份血浆对1份溶剂或1份血浆对2份溶剂。在一个实施方案中，当使用包含95份七氟醚与5份正丁醇的溶剂时，使用每一份血浆两份溶剂的比例。另外，在采用包含正丁醇的溶剂的实施方案中，本说明书所使用的溶剂与血浆的比例在最终的溶剂/血浆混合物中产生至少3％的正丁醇。在一个实施方案中，最终溶剂/血浆混合物中正丁醇的最终浓度为3.33％。将血浆和溶剂引入至少一个设备中，以使血浆与溶剂以混合、搅动或其他方式接触。所述血浆可以使用连续或间歇过程来输送。还可以纳入各种传感方法以监视压力、温度、流速、溶剂水平等。所述溶剂溶解血浆中的脂质。在本说明书的实施方案中，溶剂溶解脂质以产生经处理的血浆(该血浆包含脂质含量降低的经调节的HDL颗粒)。设计该过程对HDL颗粒进行处理以降低其脂质水平并产生调节的HDL颗粒，而不破坏血浆蛋白或基本上不影响LDL颗粒。应当指出的是，血浆置换后的血液成分没有临床上的显著减少。

能量以各种混合方法、时间和速度的形式引入系统。在108，通过离心从调节的HDL颗粒中去除大量溶剂。在实施方案中，通过木炭吸附、蒸发或中空纤维浓缩(HFC)渗透蒸发除去所有剩余的可溶性溶剂。可以选择使用气相色谱法(GC)或类似方法任选地测试混合物中的残留溶剂。基于统计验证可以选择消除对残留溶剂的测试。

提取的调节的HDL溶液增加前β-HDL浓度。据估计，在脱脂血浆中的调节的HDL具有约80-85％的前β颗粒和约15-20％的αHDL颗粒。相对于用溶剂处理之前血浆中存在的原始HDL，调节后的HDL中前-βHDL的浓度更高；而与最初从血液部分中分离的血浆溶液(该血浆溶液通常包含大约5％的前-βHDL颗粒)相比，前-βHDL颗粒的浓度大大提高。

图1B示出了用于实现本说明书方法的系统及其组件的示例性实施方案。该图描绘了定义HDL调节系统200的元件的示例性基本组件流程图。系统200的组件的实施方案在从患者或另一个体(供者)获得血液部分之后使用：将与血液分离的血浆放入无菌袋中，送至系统200进行进一步处理。提供了液体输入组件205，并通过管道将其连接到混合装置220。提供了溶剂输入组件210，并通过管道将其连接到混合装置220。在实施方案中，阀215、216用于控制来自液体输入组件205的液体和来自溶剂输入组件210的溶剂的流量。应当理解，液体输入组件205包含所有包括HDL颗粒的液体，并包括如上所述具有LDL颗粒或没有LDL颗粒的血浆。还应当理解，溶剂输入组件210可以包括单一溶剂、溶剂混合物或在输入组件210处混合的多种不同溶剂。虽然溶剂输入组件210被描绘为单个溶剂容器，但是其可以包括多个单独的溶剂容器。上面已讨论了可以使用的溶剂类型的实施方案。

混合器220将来自液体输入组件205的液体与来自溶剂输入组件210的溶剂混合以产生液体-溶剂混合物。在实施方案中，混合器220能够使用振动筛袋混合方法以多个批次(例如1、2、3或更多个批次)将输入液体和输入溶剂进行混合。示例性的混合器是BarnsteadLabline轨道振动台。液体-溶剂混合物一旦形成就会通过管道并由至少一个阀215a控制引导到分离器225。在实施方案中，分离器225能够通过在漏斗状袋中的重力分离来进行大量溶剂分离。

在分离器225中，液体-溶剂混合物分离为第一层和第二层。第一层包含已经从HDL颗粒中移除的溶剂和脂质的混合物。所述第一层通过阀215b输送到第一废料容器235。第二层包括残留溶剂、调节的HDL颗粒和输入液体中的其他成分的混合物。本领域普通技术人员应当理解，第一层和第二层的组成将基于输入液体的性质而不同。一旦第一层和第二层在分离器225中分离，第二层就将通过管道输送到溶剂提取装置240。在一个实施方案中，压力传感器229和阀230在液流中定位以控制第二层流至溶剂提取装置240。

可以通过由液体输入组件205、210和分离器225测定的重量而得出的质量平衡计算，来对阀215、216的打开和关闭(使液体能够从输入容器205、210中流出)进行定时。例如，阀215b(分离器225与第一废料容器235之间)和阀230(分离器225与溶剂提取装置240之间)在输入物质(液体和溶剂)与分离器225中的质量基本平衡，并且经过足够的时间，以允许第一层与第二层分离之后打开。根据所使用的溶剂，以及因此导致的哪一层沉积在分离器225的底部来确定是打开阀215b(分离器225与第一废料容器235之间)还是阀230(分离器225与溶剂提取装置240之间)。本领域普通技术人员应当理解，打开的时间取决于第一层和第二层中的液体量的多少，并且还应当理解，优选保持阀215b(分离器225和第一废料容器235之间)打开足够长的时间以刚好除去所有第一层和一些第二层，从而确保送至溶剂提取装置240的液体中已被尽可能多地除去了溶剂。

在实施方案中，葡萄糖输入组件255和盐水输入组件260(一个或多个)与从分离器225通向溶剂提取装置240的流体路径221流通。多个阀215c和215d也分别被引入到来自葡萄糖输入组件255和盐水输入组件260的液流中，再并入流动路径221(从分离器225到溶剂提取装置240)的管道中。葡萄糖和盐水被引入到本说明书实施方案中的目的是在系统操作之前灌注溶剂提取装置240。如果不需要这种灌注，则不需要葡萄糖和盐水输入组件。同样，本领域普通技术人员应当理解，如果溶剂提取装置240需要，则葡萄糖和盐水输入可以用其他灌注物代替。

在一些实施方案中，溶剂提取装置240是炭柱，其被设计成除去在溶剂输入组件210中使用的特定溶剂。示例性溶剂提取装置240是Asahi Hemosorber炭柱。泵250用于使第二层从分离器225通过溶剂提取装置240，移动到达输出容器245。在实施方案中，泵250是旋转蠕动泵，例如Masterflex77201-62型。

第一层被引导至废料容器235，该废料容器235通过管道和至少一个阀215b与分离器225流通。另外，如果产生其他废料，可以将其从连接溶剂提取装置240和输出容器245的流体路径引导至第二废料容器255。在一个实施方案中，阀215f可任选地包括在从溶剂提取装置240到输出容器245的路径上。在一个实施方案中，阀215g任选地包括在从溶剂提取装置240到第二废料容器255的路径上。

在本说明书的一个实施方案中，在可行的情况下使用重力来移动液体通过多个部件中的每一个。例如，重力用于将输入血浆组件205和输入溶剂组件210排放到混合器220中。在混合器220包括振动筛袋，且分离器225包括漏斗袋的情况下，液体从振动筛袋移至漏斗袋，如果合适的话，利用重力再移至第一废料容器235。

在另一实施方案中(在图1B中未示出)，对输出容器245中的输出液体进行溶剂检测系统或脂质除去剂系统的检测，以确定输出液体中是否有任何溶剂或其他不需要的成分。在一个实施方案中，输出液体经传感器检测(该传感器能够确定引入到溶剂输入组件中的溶剂(如正丁醇或二异丙醚)的浓度)。在实施方案中，传感器能够实时地提供这种浓度信息，而不必将输出液体的样品或顶部空间中的空气物理传输到远程设备。

在一个实施方案中，在第二阶段中进一步处理输出液体以分离至少前β-HDL颗粒，并且如果需要，同时分离α和前-βHDL颗粒。在一个实施方案中，第二阶段(如下所述)发生在与脱脂过程分开且独立的区域中，其中最终产品输出液体被输送至处理实验室或病房(room)。在一个替代实施方案中，第二阶段处理与脱脂系统串联，从而将该系统连接至亲和柱子系统或超离心子系统。然后将所得分离的α和/或前-βHDL颗粒引入患者的血流中。

在一个实施方案中，使用分子印迹聚合物技术来启用表面声波传感器。表面声波传感器通过其表面与周围环境的某种相互作用来接收输入，并产生由传感器基板的压电特性产生的电响应。使用分子印迹聚合物技术是为了实现相互作用。分子印迹聚合物是经过编程的塑料，可以识别复杂生物样品中的目标分子，例如药物，毒素或环境污染物。分子印迹技术通过在目标模板分子的存在下使一种或多种功能性单体与过量的交联单体聚合来实现，所述目标模板分子表现出与待识别的目标分子即目标溶剂相似的结构。

使用分子印迹聚合物技术制造表面声波传感器，可以使其对目标溶剂的浓度更具针对性，并能够将此类目标溶剂与其他可能的干扰物区分开。因此，具有可能与目标溶剂相似的结构和/或特性的可接受干扰物的存在不会阻止传感器准确记录现有的各自溶剂浓度。

或者，如果输入溶剂包括某些溶剂，例如正丁醇，则可以使用电化学氧化来测量溶剂浓度。电化学测量具有几个优点：简单、灵敏、快速，并且具有广泛的动态范围、仪器简单，不受湿度影响。在一个实施方案中，目标溶剂(例如正丁醇)在铂电极上通过循环伏安法被氧化。该技术是基于以预定的扫描速率在正向和反向两个方向上改变工作电极上的施加电势，同时监视电流实现的。其可以执行一个完整的循环，部分循环或一系列循环。尽管铂是优选的电极材料，但也可以使用其他电极，例如金、银、铱或石墨。尽管使用了循环伏安技术，但其他脉冲技术(例如差分脉冲伏安法或方波伏安法)可能会提高测量速度和灵敏度。

本说明书的实施方案明确涵盖了自动采样和测量、检测和分析输出液体或输出液体上方顶部空间的任何和所有形式。例如，可以通过集成微型气相色谱(GC)测量设备来实现这种自动检测：该设备自动对输出容器中的空气进行采样，然后将其传输到对脱脂过程中使用的指定溶剂进行了优化的GC设备，并使用已知的GC技术分析样品中是否存在溶剂。

返回到图1B，能用于本文所述的任何设备部件的合适材料包括：具有生物相容性的材料、被批准用于涉及与体内液体接触的医学应用材料、符合美国PVI或ISO 10993标准的材料。此外，还包括在至少一次单独使用时，基本上不会由于暴露于本发明所用的溶剂而降解的材料。所述材料可通过辐射灭菌或环氧乙烷(EtO)灭菌。此类合适材料能够通过使用例如但不限于挤出、注射成型等常规方法形成目标物体。满足这些要求的材料包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、聚砜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、含氟弹性体(例如VITON，可从DuPont Dow Elastomers LLC获得)、热塑性弹性体(例如SANTOPRENE，可从孟山都公司(Monsanto)获得)、聚氨酯、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯醚(PFE)、全氟烷氧基共聚物(PFA，可作为TEFLON PFA从E.I.du Pont de Nemours and Company获得)及其组合。

阀215、215a、215b、215c、215d、215e、215f、215g、216以及在每个实施方案中使用的任何其他阀可以包括但不限于夹管、截止阀、球阀、闸阀或其他常规阀组成。在一些实施方案中，阀是闭塞阀，例如Acro Associates的955型阀。但是，本说明书不限于具有特定样式的阀。此外，根据本说明书的实施方案描述的每个系统的组件可以物理地连接在一起或使用导管连接在一起，所述导管可以包括柔性或刚性管，管道或本领域普通技术人员已知的其他此类装置。

图1C示出了根据本说明书的一些实施方案用于实现本文所公开过程的系统的示例性配置。图1C展示了HDL调节系统300的基本组件的配置。该系统配备了液体输入组件305，并通过管道将其连接到混合装置320。该系统配备了溶剂输入组件310，并且将其通过管道连接到了混合装置320。阀316优选地用于控制来自液体输入组件305和溶剂输入组件310的液体。应当理解，液体输入组件305优选地包含任何含有HDL颗粒的液体，包括含有LDL颗粒或不含有LDL颗粒的血浆，如上所述。还应当理解，溶剂输入组件310可以包括单一溶剂、混合溶剂或在溶剂输入组件310处混合的多种不同的溶剂。虽然被描绘为单个溶剂容器，但是溶剂输入组件310可以包括多个单独的溶剂容器。所使用的和优选的溶剂类型已在前面进行了讨论。

混合器320将来自液体输入组件305的液体与来自溶剂输入组件310的溶剂混合以产生液体-溶剂混合物。混合器320能够优选地以多个批次(例如1、2、3或更多个批次)对输入液体和输入溶剂使用振动筛袋混合方法。液体-溶剂混合物一旦形成，就将通过管道和至少一个阀321控制引导至分离器325。在优选的实施方案中，分离器325能够通过在漏斗状袋中的重力分离法来进行大量溶剂分离。

在分离器325中，液体-溶剂混合物分离为第一层和第二层。第一层包含已经从HDL颗粒中去除的溶剂和脂质的混合物。第二层包括残余溶剂、调整的HDL颗粒和输入液体的其他成分的混合物。本领域普通技术人员应当理解，第一层和第二层的组成将基于输入液体的性质而不同。一旦第一层和第二层在分离器325中分离，就将第二层通过管道输送到溶剂提取装置340。优选地，将压力传感器326和阀327定位在流动流中以控制第二层向溶剂提取装置340的流动。

优选地，使葡萄糖输入组件330和盐水输入组件350与从分离器325通向溶剂提取装置340的流体路径液体联通。多个阀331也优选地并入从葡萄糖输入组件330和盐水输入组件350至分离器325到溶剂提取装置340流动路径的管道的液流中。葡萄糖和盐水被引入到本发明中的目的是在系统运行之前灌注溶剂提取装置340。如果不需要这种灌注，则不需要葡萄糖和盐水输入。同样，本领域普通技术人员应当理解，如果溶剂提取装置340需要，则葡萄糖和盐水输入可以用其他灌注物代替。

溶剂提取装置340优选地被设计为用于去除在溶剂输入组件310中使用的特定溶剂的炭柱。一种示例性的溶剂提取装置340是Asahi Hemosorber炭柱。泵335用于使第二层从分离器325移动通过溶剂提取装置340到达输出容器315。该泵优选为蠕动泵，例如Masterflex 77201-62型。

第一层被引导至废料容器355，该废料容器355通过管道和至少一个阀356与分离器325流通。另外，如果产生其他废料，则可以从连接溶剂提取装置340和输出容器315的流体路径中将其引导至废料容器355。

优选地，本发明的实施方案在可行的情况下使用重力来使液体移动经过各个部件。例如，优选地利用重力将输入血浆组件305和输入溶剂组件310排放到混合器320中。在混合器320包括振动筛袋和分离器325包括漏斗袋的情况下，液体从振动筛袋移动到漏斗袋，如果合适的话，随后利用重力输送液体至废料容器355。

通常，本发明优选易于放置、可以很容易地卸下并由技术人员更换的构造，该构造包括所有输入组件(例如输入血浆和输入溶剂)、一次性元件(例如混合袋，分离袋，废料袋)、溶剂提取装置、溶剂检测装置以及输出容器。

为了使本发明的上述实施方案能够进行操作，优选的是以套件的形式向这些实施方案的使用者提供成套的包装组件，该成套组件包括实践本说明书的实施方案所需的每个组件。试成套组件可包括输入液体容器(即高密度脂蛋白源容器)、脂质除去剂源容器(即溶剂容器)、混合器的一次性组件(例如袋子或其他容器)、分离器的一次性组件(例如袋子或其他容器)、溶剂提取装置的一次性部件(即炭柱)、输出容器、废料容器的一次性组件(例如袋子或其他容器)、溶剂检测装置以及多个管和阀，用于控制从输入容器输入的液体(高密度脂蛋白)和从溶剂容器的脂质除去剂(溶剂)到混合器的流动、控制脂质除去剂、脂质和颗粒衍生物混合物向分离器的流动、用于控制脂质和脂质除去剂向废液容器的流动、用于控制残留脂质除去剂、残留脂质、颗粒衍生物向输出容器的流动、以及用于控制颗粒衍生物向输出容器的流动。溶剂提取装置(例如，炭柱)、输入液体、输入溶剂和溶剂提取装置的一次性部件可以单独提供。

通过血浆脱脂来提取调整的HDL可以被视为本说明书实施方案所描述方法的第一阶段。根据本说明书的实施方案，在110，脱脂血浆被保存以在以后使用。在实施方案中，该脱脂血浆可以在较长的时间(例如，至少一年，更优选地至少两年)保存后使用。在实施方案中，可以将脱脂血浆存储预定长度的时间，该时间长度可以取决于所采用的保存过程。

可以通过使用适当的保存方法(例如但不限于冷冻)以任何等分(aliquot)或体积保存脱脂血浆(DP)。在各种实施方案中，可以采用任何保存方式，只要最终产品与新鲜的脱脂血浆相比具有预定量功效。因此，至关重要的是使用2D凝胶抽检或质量测试来评估包含前-βHDL的脱脂血浆，以证明前-βHDL没有降解为游离的Apo A1。具体来说，本发明使储存的预定部分的包含前-βHDL的血浆经受2D凝胶测试，并证明如果不超过80％前-βHDL降解为Apo A1，则与被测脱脂血浆相关的批次对于患者给药是可接受的。

参照图2，示出了用于获取、保存和解冻提取的脱脂血浆的过程400。使用本文所述的方法获得包含前-βHDL的提取的脱脂血浆405。给定批次的提取的脱脂血浆的一部分进行抽检410，以建立前-βHDL的基线量或基线浓度。抽检410可以使用2D凝胶电泳完成：将提取的脱脂血浆的一批样品溶解，负载到凝胶上，并施加电场使蛋白质根据其等电点通过凝胶运动，然后将分离的蛋白质再次溶解，并通过它们在正交第二轴上的分子量分离。因此，抽检410沿着两个轴(等电点和分子量)量化样品中蛋白质(例如前-βHDL)的浓度或数量。其他临床评估将在下面进一步描述。

一旦进行抽检410，优选地，如下文进一步描述的，通过快速冷冻对批料进行保存420。在一个实施方案中，在保存420之前，如下文进一步描述，该批料可被调整415以确保前-βHDL的蛋白质浓度在预定范围内。已经确定，如果制剂的浓度太稀，则保存的前-βHDL不稳定，而如果制剂的浓度太高，则功效降低。因此，通过稀释或浓缩415任选地对该批料进行调整，以确保脱脂血浆中前-βHDL的浓度在0.5mg/dl至500mg/dl的范围内，优选在1mg/dl至400mg/dl的范围内，或其中的任何量。优选地，所述脱脂血浆中前-βHDL的浓度不大于500mg/dl。

在保存420之后，存储脱脂血浆，该血浆可存储1周至3年或其中任何时间。在某一点上，脱脂的血浆被解冻430。在一个实施方案中，通过取出冷冻的脱脂血浆并将其置于温度范围为2℃至26℃的环境中来实现解冻。在一个实施方案中，脱脂血浆的解冻维持在3℃至5℃的温度范围内，更优选为在4℃的环境中保持不超过48小时的时间。优选地，解冻的脱脂血浆在解冻的48小时内使用，更优选在24小时内使用，并且不再次冷冻。解冻430之后，可以如下文进一步描述，再次测试440该批次的一部分，以确定脱脂血浆中的前-βHDL是否已经降解或不再有效。

可以选择纳入添加剂作为保存过程的一部分：可以将添加剂添加到前体或最终产品中以增强保存过程。在实施方案中，使用类似于保存血浆的方法和标准来保存DP。在一个实施方案中，通过冷冻实现保存。这些标准方法和实践中的一部分在CFR和AABB，ABC，ARC《关于使用人血和血液成分的信息的通函》，以及欧洲药典中用于制备血浆的准则中被定义。在完成脱脂过程后的几个小时内，将一定量或等分的脱脂源血浆放入冰箱。在一些实施方案中，将DP在脱脂过程的8小时内或在用于血液收集、处理和存储系统的使用说明中指定的时间范围内放置在冰箱中。在实施方案中，通过各种冷冻新鲜血浆的标准方法将DP冷冻在约-18℃至-80℃的温度。

在本文中应当注意，以上指示的体积或等分仅是示例性的，并且可以使用本说明书的系统和方法来保存任何量(体积或等分)的脱脂血浆样品。还应注意，可以依次保存多个体积或等分试样(依次保存每个体积或等分)，也可以平行保存多个体积或等分试样(同时保存每个体积或等分)。

回到保存步骤，在一个实施方案中，举例来说，使用液氮通过快速冷冻法将50ml的脱脂血浆(DP)冷冻，然后在-80℃下储存。在另一个实施方案中，举例来说，使用较慢的冷冻方法在-80℃下冷冻50ml的脱脂血浆(DP)。在又一个实施方案中，举例来说，使用慢速冷冻方法在无霜冰箱中在-20℃下冷冻50ml脱脂血浆(DP)。在一个实施方案中，举例来说，使用快速冷冻方法冷冻100ml的DP。在另一个实施方案中，举例来说，使用快速冷冻方法冷冻多达400ml的DP。在其他实施方案中，使用上述保存方法将至少1ml至400ml或更高体积(单位)量的DP一起冷冻；可以使用任何冷冻方法来保存任何体积的DP。冷冻所需的时间取决于样品大小。因此，不同大小等分的冷冻时间不同。在实施方案中，冷冻等分大小所花费的时间也是所用冷冻方法的函数。在实施方案中，冷冻样品所需的时间是基于样品的大小和/或冷冻方法预先确定的。在一个实施方案中，将浓缩的前-βHDL快速冷冻至-80℃所需的时间小于30分钟，小于20分钟，优选小于10分钟。在另一个实施方案中，用于快速冷冻的温度小于-30℃。

在本说明书的各种实施方案中可以使用其他冷冻方法。选择的冷冻方法将确保DP的关键组分被维持。冷冻脱脂血浆的有效期可以随冷冻温度变化。通常，对于较冷的冷冻温度，产品可以存放更长的时间，因此具有更长的“保质期”(过期较慢)。

在实施方案中，对脱脂过程前后源血浆的每个单位分别评估。评估血浆的参数，包括但不限于以下参数：

1.前-β和αHDL颗粒的浓度和大小：在一些实施方案中，将2D凝胶电泳技术与重凝胶和轻凝胶一起使用，并且对ApoA-I进行免疫印迹。

2.血浆的临床化学：需确定的各种特征可包括总胆固醇、HDL、LDL、ApoA-I、ApoB、甘油三酯、CBC、钠、钾、氯、钙、磷、肌酐、BUN、纤维蛋白原、aPTT、PT、ALT、AST、ALP、胆红素、尿酸、葡萄糖、LDH。

3.另外，在冷冻前后以及后续步骤中的解冻，采用已知技术(例如快速蛋白液相色谱(FPLC))通过紫外线吸收评估DP部分的胆固醇含量。

4.选定样品/部分的胆固醇外排能力将被测定，其包括但不限于图1A和图1G中所解释的部分。

在实施方案中，保存或冷冻脱脂血浆之前和在脱脂血浆解冻之后的上述参数也被评估。在一些实施方案中，解冻的脱脂血浆的功效为保存前的脱脂血浆功效的1％至100％。在一些实施方案中，解冻的脱脂血浆的功效为保存前的脱脂血浆功效的1％至150％。在一些实施方案中，解冻的脱脂血浆的功效为保存前的脱脂血浆功效的1％至200％。在一些实施方案中，解冻的脱脂血浆的功效低于保存前脱脂血浆的功效。在一些实施方案中，解冻的脱脂血浆的功效高于保存前脱脂血浆的功效。

在112，保存的DP被制备以在进一步处理或治疗患者中正常使用。由DP治疗的患者可能是也可能不是获得血浆用于脱脂过程(可以是自体的也可以是非自体的)的个体。如果在110通过冷冻保存DP，则其在112通过解冻制备。在一个实施方案中，将冷冻的DP用水浴在30℃至37℃范围内的温度下解冻约30分钟。在一些实施方案中，解冻的血浆在1℃至6℃下保持1-5天。在另一个实施方案中，将冷冻的DP在室温下缓慢解冻。在又一个实施方案中，将冷冻的DP在约5℃的冰箱中快速解冻。其他解冻冷冻的DP的方法可以用于不同数量和组成的DP。

在本说明书的各种实施方案中，在第二阶段，进一步处理脱脂或调整的HDL以分离HDL颗粒的组分(例如前-βHDL颗粒或α和前-βHDL颗粒的组合)。在114，将含调整的HDL颗粒(在108处与溶剂分离的含有降低的脂质含量)的经处理和解冻的血浆进一步用溶剂处理以产生包含较高浓度的α和前-βHDL颗粒的溶液。后面讨论了从脱脂血浆中分离α和前-β颗粒的示例性方法。

在116，根据本说明书的一些任选的实施方案，分离的α和前-βHDL颗粒通过冷冻保存，并且可以在118长时间后解冻后使用。在一个实施方案中，通过取出冷冻的脱脂血浆，将其置于温度范围为2℃至26℃的环境中实现解冻。在一个实施方案中，解冻的脱脂血浆在温度范围为3℃至5℃(更优选为4℃)的环境中保持不超过48小时的时间。优选地，解冻的脱脂血浆在解冻后的48小时内使用，更优选在24小时内使用，并且不再再次冷冻。在实施方案中，保存和制备衍生的α和前-βHDL颗粒的过程类似于保存和制备DP的方法。在一个实施方案中，优选使用快速冷冻法来冷冻衍生的α和前β-HDL颗粒。

从脱脂血浆中分离前-β颗粒的方法

在一个实施方案中，亲和色谱可用于减少脱脂血浆中不需要的物质(例如血浆蛋白和某些脂蛋白，例如LDL和VLDL)的量，并因此增加所需物质的浓度(例如，前-βHDL颗粒)。

图1D是示出了根据本说明书的一些实施方案使用亲和色谱法增加处理的血浆中所需物质的浓度的示例性步骤组的流程图。在一个实施方案中，亲和柱用于捕获ApoA-I蛋白颗粒(以及相应的前-βHDL)，同时从处理的血浆中去除不需要的颗粒。在120，将处理的血浆添加到使用ApoA-I抗体的亲和色谱柱中，使得当处理的血浆流过该柱时，ApoA-I与抗体结合。可以使用诸如树脂的固体介质来结合HDL颗粒形式的所需物质。期望的HDL颗粒可包含α-HDL和前-βHDL颗粒的混合物。这些颗粒按大约15％的α-HDL和85％的前-β颗粒的顺序组成。在122，未结合的和不需要的物质(包括LDL和VLDL)通过柱子滴过(因为它们不与ApoA-I的抗体结合)，从而从处理的血浆溶液中除去。在124，可以使洗涤缓冲液流过该柱以去除任何不需要的蛋白质。然后使解离试剂或溶液流过该柱，以使前-βHDL颗粒(或ApoA-I，其包含前β-HDL颗粒)不再与ApoA-I的抗体结合并有效地分离。

超速离心是另一种可用于减少不需要物质(例如血浆蛋白和某些脂蛋白，例如LDL、VLDL以及在本情况下的αHDL颗粒)的量的方法，并由此增加所需物质(例如，前-βHDL颗粒)的浓度。在这种方法中，离心原理是运用了通过以非常高速度旋转溶液来分离溶液中的成分。

起始原料(脱脂血浆溶液)的密度为1006kg/m³或1.006g/ml。为了在超速离心过程中分离出各部分，如下所述，可能有必要在每个步骤中调整起始原料的密度。在实施方案中，可以通过向处理的血浆中添加一定体积密度更大的物质或溶剂(例如溴化钾(KBr))来调节密度。在一个实施方案中，可以使用具有可用于调节起始原料密度的任何溶液。

在一个实施方案中，将具有1.346组合密度的溴化钾(KBr)和氯化钠(NaCl)的浓储备溶液添加到所述脱脂/处理的血浆溶液中，以将处理的血浆溶液的密度调节至期望的密度。所述储备溶液的密度高于1.25g/mL(例如，4.62M KBr水溶液，密度为1.37g/mL)，而处理的血浆溶液的密度约为1.006g/mL。向处理的血浆中添加致密物质而产生的溶液具有特定的密度，以允许在超速离心过程中分离出各个部分。调节密度的方法是本领域普通技术人员所熟知的，并且也已被Havel等人，J.Clin.Invest.1955,34；1345-1353描述，其讨论了以制备规模分离和纯化脂蛋白组分的方法，以在代谢研究中使用和分析，并将其作为参考文献引入本文。

在一个实施方案中，将合并的血浆和溶剂引入超速离心管中(或在管中合并)。管可以由转子保持。可以将管高速旋转足够长的时间以产生分离，随后转子平稳停止，且从每个管中轻轻倒出梯度(gradient)以分离需分离的组分。在一个实施方案中，超速离心以大约105000xg的速度进行大约16-20小时。应当注意的是，旋转时间是根据起始原料的密度和要分离的所需部分的相对密度进行调整的。例如，如果第一步提取的原料的密度为1.21g/mL，后续第二步所需的密度为1.25g/mL，则将需要更长的时间分离这两种密度相似的原料，而从密度为1.21g/mL的起始原料中分离出密度为1.006g/mL的原料则耗时较短。

在实施方案中，所得的所需馏分至少包括与处理的血浆分离的前β-HDL颗粒。

图1E是示出了根据本说明书的一些实施方案的使用超速离心来增加处理的血浆中所需物质的浓度的示例性步骤组的流程图。在一个实施方案中，该流程图中描述的方法可用于使用超速离心来更快速地分离前-βHDL。在130，可以旋转调节密度为1.21(对应于HDL的密度)的处理的血浆起始原料。顶部馏分将包含VLDL、LDL和αHDL，而前-βHDL将在底部馏分中。在一个实施方案中，所述旋转进行18-24小时的时间。在132，分离出包含前-βHDL和血浆蛋白的底部部分。在134，旋转密度为1.25的分离的包含前-βHDL的底部馏分，得到包含前-βHDL的顶部馏分和包含血浆蛋白的底部馏分。在一个实施方案中，旋转进行24-48小时。在136，从包含血浆蛋白的底部馏分中分离出所得的包含前-βHDL的上底部馏分，得到浓缩的前-βHDL产物。

在超速离心过程的最后，前-βHDL颗粒漂浮到顶部，其可被分离以获得含高浓度前-βHDL颗粒的溶液。随后，可以拆下包含浓缩的前-βHDL颗粒的管。

图1F是示出了根据本说明书的一些实施方案的使用超速离心来增加处理的血浆中所需物质的浓度的另一示例性步骤组的流程图。

在一些实施方案中，超速离心是在不同密度下进行的逐步过程。由于脂蛋白比蛋白轻，可以使用超速离心技术将不同密度的脂蛋白与脱脂(处理的)血浆分离，以实现顺序分离。在140，将密度为1.006的脱脂的(处理的)血浆旋转18-24小时，相应于血浆密度为1006kg/m³或1.006g/ml。在此阶段，蛋白质位于离心管的底部，而VLDL位于离心管的顶部。另外，包含LDL和HDL的血浆在管的最底部。

在步骤142，将含有LDL/HDL的血浆的馏分与管中的其他成分分离。

在步骤144，旋转密度为1.063的包含LDL/HDL的血浆(加上用于调节密度的溶液)，该密度对应于LDL的密度。在管顶部的馏分包含LDL，在管的底部的馏分包含HDL。

在步骤146，将含有HDL的底部馏分与管中的其他成分分离。

在步骤148，旋转密度为1.21的HDL馏分，该密度对应于HDL的密度。最终结果是在管顶部馏分包含HDL，管底部馏分包含前-βHDL。

在步骤150，旋转密度为1.25的包含前-βHDL的底部馏分。最终结果是在管顶部包含前-βHDL的馏分，在管底部包含剩余的血浆成分。在超速离心过程的最后，前-βHDL颗粒漂浮到顶部，可以将其分离以获得高浓度前-βHDL颗粒的溶液。随后，可以拆下包含浓缩的前-βHDL颗粒的管。使用透析、凝胶过滤或其他合适的方法将分离的脂蛋白馏分与KBr分离。

本领域技术人员可以理解，可以以不同的方式分离通过旋转处理的血浆而衍生的馏分，并不限于图1E至图1F中描述的方法。

图1G是示出了根据本说明书的一些实施方案中使用超速离心来增加处理的血浆中所需物质的浓度的另一示例性步骤组的流程图。在一个实施方案中，该流程图中所描述的方法可用于使用超速离心法从脱脂血浆中更快速地分离α(alpha-1)和前-βHDL。在170，可以旋转调整密度为1.063(该密度对应于LDL的密度)的处理的血浆起始原料。结果为包含LDL的馏分在管的顶部，包含HDL的馏分在管的底部。在一个实施方案中，旋转进行18-24小时的时间。在172，分离出包含α-1和前-βHDL以及血浆蛋白的底部馏分。在174，旋转密度为1.25的分离的包含α-1和前-βHDL的底部馏分，得到包含α-1和前-βHDL的顶部馏分和包含血浆蛋白的底部馏分。在一个实施方案中，旋转进行24-48小时。在176，从包含血浆蛋白的底部馏分中分离出包含α-1和前-βHDL的顶部馏分，得到包含α-1和β前HDL的浓缩产物。

在超速离心过程结束时，α-1和前-βHDL颗粒浮到顶部，其可以被分离以获得高浓度的α-1和前-βHDL颗粒的溶液。随后，可以将装有浓缩的α-1和前-βHDL颗粒的试管拆下。通过透析、凝胶过滤或其他合适的方法从KBr中分离出分离的脂蛋白馏分。

回到图1A中，在160，从溶剂中分离出了包含脂质含量降低的前-βHDL或α和前-βHDL颗粒组合的浓缩溶液的处理的血浆，进行适当的处理后递送给患者。所递送的溶液具有浓度进一步增加的α和/或前-βHDL。在用盐水透析之后，将所得的包含具有降低的脂质和增加的前-β浓度的HDL颗粒的处理的血浆提供给患者。在亲和色谱的情况下，透析还会释放出夹带的所需物质(浓缩的前β-HDL颗粒)。在自体血浆的情况下，如果患者的红细胞在血浆置换过程中尚未返回，则可以在手术过程中的某个时间点将其施用于患者。在一个可选的实施方案中，在将红细胞与分离的α和/或前-βHDL颗粒组合后返回给患者。一种给药途径是通过血管系统，优选静脉内。

在另一个替代实施方案中，采用两步法完全分离前-βHDL颗粒。首先，使用亲和色谱法分离包含前β和αHDL颗粒的溶液。随后，使用超速离心完全分离出前-βHDL颗粒。

上面的例子仅仅是本发明系统的许多应用的说明。尽管这里仅描述了本发明的几个实施方案，但是应当理解，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以以许多其他特定形式来实施本发明。因此，本实施例和实施方案应被认为是说明性的而不是限制性的，并且可以在所附权利要求的范围内修改本发明。

Claims (20)

1.一种保存用于给药至患者的前-β高密度脂蛋白的方法，其包括：

获得一批包含前-β高密度脂蛋白的脱脂血浆；

测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述前-β高密度脂蛋白；

保存该批脱脂血浆；

制备用于给药至患者的保存的脱脂血浆；

测试所制备的脱脂血浆以表征所述前-β高密度脂蛋白；和

向患者给药所述前-β高密度脂蛋白。

2.权利要求1的方法，进一步包括，在保存步骤之前，调整所述前-β高密度脂蛋白的量以确保所述前-β高密度脂蛋白的浓度在1mg/dl至400mg/dl之间。

3.权利要求1的方法，其中所述保存步骤包括在低于-30℃的温度下冷冻所述批次产品。

4.权利要求1的方法，其中所述制备步骤包括在2℃至26℃的温度范围内解冻保存的脱脂血浆。

5.权利要求1的方法，其中所述保存步骤包括使体积介于1毫升至2升之间的脱脂血浆处于低于-30℃的温度少于20分钟。

6.权利要求1的方法，其中所述测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述前-β高密度脂蛋白的步骤包括确定所述前-β高密度脂蛋白的第一浓度。

7.权利要求6的方法，其中所述测试所制备的脱脂血浆以表征所述前-β高密度脂蛋白的步骤包括确定所述前-β高密度脂蛋白的第二浓度，并将所述前-β高密度脂蛋白的第二浓度与所述前-β高密度脂蛋白的第一浓度进行比较，以确定降解程度。

8.权利要求7的方法，进一步包括基于所述前-β高密度脂蛋白的第二浓度来确定所制备的脱脂血浆是否适合于给药。

9.权利要求1的方法，进一步包括，在保存步骤之前，将防腐剂添加到脱脂血浆中。

10.权利要求1的方法，其中所述制备步骤包括解冻保存的脱脂血浆，并且进一步包括将解冻的脱脂血浆在1℃至6℃的温度下储存不超过5天。

11.一种保存用于给药至患者的调整的高密度脂蛋白的方法，其包括：

如下获得一批包含调整的高密度脂蛋白的脱脂血浆：通过将至少一个人连接到抽血设备，从所述至少一个人抽出含有血细胞的血液，从血液中分离血细胞以获得含有高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的血浆部分，用溶剂对高密度脂蛋白脱脂处理，分离出低密度脂蛋白，并收集含有调整的高密度脂蛋白的脱脂血浆；

测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述调整的高密度脂蛋白；

保存该批脱脂血浆；

制备用于给药至患者的保存的脱脂血浆；

测试所制备的脱脂血浆以表征所述调整的高密度脂蛋白；和

向患者给药所述调整的高密度脂蛋白。

12.权利要求11的方法，进一步包括，在保存步骤之前，调整所述调整的高密度脂蛋白的量以确保所述调整的高密度脂蛋白的浓度在1mg/dl至400mg/dl之间。

13.权利要求11的方法，其中所述保存步骤包括在低于-30℃的温度下冷冻所述批次产品。

14.权利要求11的方法，其中所述制备步骤包括在2℃至26℃的温度范围内解冻保存的脱脂血浆。

15.权利要求11的方法，其中所述保存步骤包括使体积介于1毫升至2升之间的脱脂血浆处于低于-30℃的温度少于20分钟。

16.权利要求11的方法，其中所述测试该批脱脂血浆的一部分以表征所述调整的高密度脂蛋白的步骤包括确定所述调整的高密度脂蛋白的第一浓度。

17.权利要求16的方法，其中所述测试所制备的脱脂血浆以表征所述调整的高密度脂蛋白的步骤包括确定所述调整的高密度脂蛋白的第二浓度，并将所述调整的高密度脂蛋白的第二浓度与所述调整的高密度脂蛋白的第一浓度进行比较，以确定降解程度。

18.权利要求17的方法，进一步包括基于所述调整的高密度脂蛋白的第二浓度来确定所制备的脱脂血浆是否适合于给药。

19.权利要求11的方法，进一步包括，在保存步骤之前，将防腐剂添加到脱脂血浆中。

20.权利要求11的方法，其中所述制备步骤包括解冻保存的脱脂血浆，并且进一步包括将解冻的脱脂血浆在1℃至6℃的温度下储存不超过5天。

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