DE3118072A1

DE3118072A1 - Verfahren zur trennung von lipophilen bestandteilen aus waessrigen kolloid-loesungen zu praeparativen zwecken und/oder zum nachweis eines analyts in waessriger phase

Info

Publication number: DE3118072A1
Application number: DE19813118072
Authority: DE
Inventors: Claus-Christian Dr.Rer.Nat. Dr.Med. 6901 Wilhelmsfeld Heuck
Original assignee: HEUCK CLAUS CHRISTIAN DR RER N
Current assignee: HEUCK CLAUS CHRISTIAN DR RER N
Priority date: 1981-05-07
Filing date: 1981-05-07
Publication date: 1982-11-25

Description

Verfahren zur Trennung von lipophilen Bestandteilen
aus wässrigen Kolloid-Lösungen zu präparativen Zwecken und/oder zum Nachweis eines Analyts in wässriger Phase Zahlreiche Stoffe,die sich in organischen Lösungsmitteln lösen'die jedoch in wässrigem Medium unlöslich sind,können in Form einer Emulsion,d.h. in Gegenwart von niedermolekularen und/oder hochmolekularen Verbindungen mit amphifilen Eigenschaften dennoch in der wässrigen Phase in Lösung gebracht werden.Insbesondere bei Naturstoffen'aber auch bei synthetischen Produkten können lipophile Stoffe(z.B.Neutralfette,fettlösliche Farbstoffe) die Weiterverarbeitung von hydrophilen Substanzen in der wässrigen Phase beeinträchtigen.
Sie müssen daher zum Zwecke der weiteren Aufarbeitung beseitigt werden.Verschiedene Verfahren sind entwickelt worden,die eine Extraktion von lipophilen Stoffen aus stabilen wässrigen,polymerhaltigen Lösungen ermöglichen (z.B.Extraktion mit Chloroform/Methanol bzw.Athanol; Isopropyläther/Butanol; Halogenkohlenwasserstoffen; Äther/Methanol bzw.Athanol).Diese Verfahren erweisen sich jedoch für die Untersuchung und/oder Verarbeitung eines wasserlöslichen Polymers,das sich durch seine Eigenschatten als Detergenz auszeichnet,als unzureichend,denn typische in der wässrigen Phase erhaltene W1erkmale des Xn:llyts werden durch diese Behandlung bescitigt In der Biüchemie wird der Vcrlust Vc rlus t dieser Merkmale als"Denaturierung" bezeichnet.
Häufig ist hingegen eine Beseitigung von störenden lipophilen Bestandteilen aus der wässrigen Kolloidlösung unter der Erhaltung der physikochemischen und/oder biologischen Eigenschaften eines Analyts in der wässrigen Phase se zum wecke der weiteren Aufarbeitung notwendig. In einzelnen Fällen hat sich eine Extraktion der Lipoide in einem Sweiphasensystem als geeignet erwiesen(z.B.Äther/Wasser; Halogenkohlenwasserstoffe bzw. Hlogenkohlenstoffe/ Wasser).Bei wässrigen Kolloidlösungen'die lipophile Bestandteile enthalten,ist jedoch bei diesen Verfahren eine ausreichende Durchmischung der Flüssigphasen nicht gewährleistet. Darüberhinaus bildet sich eine Zwischenphase,in der sich insbesondere ein Analyt mit Detergentieneigenschaften anreichert.Er wird dadurch dem wässrigen Medium für den Nachweis und/oder die weitere Verarbeitung entzogen.Ein Zusatz von neutralen Detergentien(z.B.Polyäthylenoxydderivaten) oder anionischen Seifen kann die Anreicherung von Polymeren wie z.B. Proteinen in der @wischenphase nicht verhindern.
überraschender Weise wurde festgestellt daß eine Vorbehandlung von wässrigen kolloidalen Lösungen'die lipophile Bestandteile in cmulgierter Form enthalten,mit einer Mischung eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels mit geringer Oberflächenspannung ( (< 25 dyn/cm gegen Dampf oder Luft)und einem niedermolekularen organischen Lösungsmittel mit nur geringer WasserLöslichkeit,aber die Oberflächenspannung des Wassers stark herabsetzenden Eigenschaften eine Beseitigung der Lipoide aus der wässrigen kolloidlösung in einem Ausmaß ermöglicht,das bei ausschließlicher Verwendting eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches nicht erreicht werden kann.Darüberhinaus wurde festgestellt'daß unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches mit den angegebenen Eigenschaften keine Phase zwischen der wässrigen und der organischen Phase ausgebildet wird, in der ein gegebenenfalls zu untersuchender polymcre Analyt sich anreichert. Ferner ergab sich, daß die biologischen und/oder physikochemischen Eigenschaften eines zu untersuchenden Analyts in der wässrigen Phase erhalten bleiben und somit einem z.B. immunologischen oder biologischen Nachweis zugänglich sind, ohne daß ursprünglich In Jer wässrigen kolloidlösung vorhandene lipophile Substan@en den Nachweis störend beeinflussen.
Im Vergleich zu den erwähnten herkömmlichen Methoden zeichnet sich das Verfahren dadurch vorteilhaft aus'daß es in Anbetracht der nur geringen Mengen der zu verwendenden Lösungsmittelgemische für eine Aufarbeitung von Kolloidlösungen zeitersparend und weniger arbeitsintensiv ist,da sich für die weitere Aufarbeitung eines Analyts in der wässrigen Phase eine Beseitigung von organischen Lösungsmittelbestandteilen erübrigt.
Folgende organische Lösungsmittel mögen als Vertreter ihrer Verbindungsklasse aufgeführt sein: I. Organische Lösungsmittel mit geringer Löslichkeit in wässrigem Medium und niederer Oberflächenspannung (< 20 dyn/cm) C~H@ -OH n:5-10;m:0 oder Z CnH2m+m-NH2 n:4-12;m:0 oder 2 (CnH2n+m)2NH n:3-6 ;m:O oder 2 (CnH2n+m)3N n:2-6 ;m:0 oder 2 (CnH2n+m-O-CH2CH2-)2O n:2-6 ;m:0 oder 2 CnH2N+2-(O-CH2CH2)2-OH n:3-6 ;m:0 oder 2 CnH2n+2-CO-CmH2m+2 n:1-3 ;m:3-6 II.Wasserunlöslichc organischeLösungsmittel mit niedriger Oberflächenspannung (< 25 dyn/cm) Fluor-Chlorkohlenstoffe und Fluor-Chlorkohlenwasserstoffe Al iphate aliphatische Ather und Thioäther mit 6 der mehr Kohlenstoffatomen lolgende Beispiele mögen den Vorteil dts ncuentwickelten Verfahrens verdeutlichen: Beispiel 1 Jeweils 0,5 ml Serum werden 10 Minuten mit lml des organischen Lösungsmittels a bzw.der Lösungsmittelmischungen b bis e geschüttelt.Anschließend wird zentrifugiert und aus der wässrigen Phase die Lipidkonzentration gemessen.
Die Ergebnisse zeigen,daß bei alleiniger Verwendung des Fluor-Chlorkohlenstoffpolymer als organischesLösungsmittel eine unzureichende Lipidextraktion erreicht wird.Bei der Verwendung der angegebenen Lösungsmittelgemische(in Vol.Teilen)wird hingegen eine Extraktion von Triglycerid bzw. Cholesterin bis zu 98%, für Phospholipid bis zu 85% er reicht a. Fluor-Chlorkohlenstoffpolymer (Frigen 113 Polymer) b.Cyclohexanol/Frigen 113 Polymer (25/@5) c.n-Hexanol /Frigen 113 Polymer (25/75; d.1-Heptanol/Frigen 113 Polymer (25/75; e.2-Heptanol/Frigen 113 Polymer (25/75' Triglycerid Cholesterin Phospholit (mg/d) (mg/dl) (mg/dl)pid Serum nativ 1670 510 356 n.Extraktion a 510 254 " Extrakt 1 on b 34 7 98 @ 34 10 55 d rl d 36 13 65 e e 34 13 84 Beispiel 2 Extraktion von Lipiden in wässriger Kolloidlösung mit anderen als in Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittelmischungen.O,5 nil Serum wird mit 0,7 ml eines organischen Lösungsmittels bzw. einer Lösungsmittelmischung in der gleichen Weise behandelt,wie in Beispiel 1 beschrieben.Die Ergebnisse zeigen den wesentlich höheren Effekt der angegebenen Lösungsmittelgemische bei der Lipidextraktion gegenüber den reinen wasserunlöslichen Lösungsmitteln£)ie in Klammern angegebenen Quotienten kennzeichnen das Mischungsverhältnis der Volumina der einzelnen Lösungsmittelkomponenten.
Triglycerid Cholesterin Phospheli-(mg/dl) (mg/dl) tmo dl Serum nativ 653 290 351 Serum + CF3CCl3* 151 101 80 Serum + Frigen 113 Pol.*107 64 109 ~~ Serum + CF3CCl3/ n-Hexylamin(95/5) 12 16 21 + CF3CCl3/Diäthylenglye@lmonobutyläther (80/20) 17 17 29 + CF3CCl3/ n-Hexanol(75/25)* 33 24 + CF3CCl3/Diäthylenglykoldiäthyläther (95/5) 92 57 138 +Frigen 113 Polym./ n-Hexylamin(95/5) 17 13 20 +Frigen 113 Polym./ Diäthylenglykolmonobutyläther(80/20) 6 15 51 " +Frigen 113 Polym./ n-Hexanol (75/25) 31 20 80 " +Frigen 113 Polym./ Diäthylenglykoldiäthyläther(80/20) 82 53 81 * geringfügige Eiweispräaipitation in der Zwischenpha Beispiel 3 Extraktion von Lipiden in Flüssigphase mit Hilfe weiterer Lösungsmittel bzw.Lösungsmittelgemische.Das Efischungsverhältnis beträgt 0,5 ml Serum und 0,7 ml organisches Lösungsmittel.
Die in Klammern angegebenen quotienten kennzeichnen das Mischungsverhältnis der Volumina der organischen Lösungsmittelkomponenten.Die Tabelle veranschaulicht den deutlich wirksameren Effekt der Lipidextraktion bei der Verwendung der angegebenen Lösungsmittelgemische.
Triglycerid Cholesterin Phosholipid (mg/dI) (mg/dI) (mg/dI) Serum nativ 171 183 88 Serum + n-Elexan * 170 180 84 Serum + Diisopropyläther* 122 161 51 Serum +n-Hexan/n-Hexylamin (95/5) 3 1 0 Serum +Diisopropyläther/ n-Hexylamnin (95/5) 8 11 0 Serum +n-Rexan/Diäthylenglykolmonobutyläther 9(1/10) O 1 1 12 Serum + D@lsopropyläther/Diäthylenmonobutyläther (90/ 1 0 ) 0 3 0 Serum + CF,CCl/n-Octylamin (95/5) 0 10 10 Serum +CF3CCl3/n-Hexylamin 34 36 18 * geringfügige Eiweispräzipitation in der Zwischen-Phase Beispiel 4 Nachweis der Erhti itung der immunchemischen Eigenschaften eines komplexgebundenen ant igenen Biopolymeren nach ei flQ r Delipidierung in Flüssigphase.
0,1 ml einer Lösung eines aus menschlichem Serum isolierten Lipoproteins ( High Density Lipoprotein ,HDL) wurden mit 0,3ml eines organischen Lösungsmittels nach Beispiel 1 ,Extraktionsverfahren a bzw. b 10 min im Schüttelautomaten geschüttelt.
Anschließend wurden die Phasen durch entritugation in einer Laborzentrifuge getrennt. 20 @l der wässrigen Phase wurden mit 2ml 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt.100 pl dieser Verdünnung wurden mit einem Antiserum gegen Apolipoprotein Al,einem Proteinbestandteil der HDL,gemischt.Die Lichtstreuung der sich hi1-denden Immunkomplexe mit Apolipoprotein Al wurde über einen Zeitraum von 2 Std. mit hilfe eines Laser-Nephelometers gem(2ssen.
Die Messung ergab'daß die Reaktion mit nativer HDL,in der der antigene Analyt mit Lipid assoziiert ist,wesentlich langsamer verläuft als nach einer Delipidierung nach dem Extraktionsverfahren b.Die Vorbehandlung der Probe nach dem Extraktionsv.rfahren a führte um gleichen Ergebnis im immunchemischen Nichweis wie im Falle der unbehandeiten Probe. Während nach der 1ipidextraktion nach Verfahren b das Maximum des immunnephelometrischen Signals nach 90 min erreicht ist,ist die Immunreaktion nach Extraktion nach dem Verfahren a nach 5 Std.noch nicht beendet.

Claims

Patentansprüche 1.Verfahren zur Trennung von fettlöslichen Stoffen aus wässrigen Kolloidlösungen,dadurch gekennzeichnet, daß man einer lipophile Substanzen enthaltenden Kolloidlösung eine Mischung aus einem wasserunlösllchen org;ínischen Lösungsmittel mit einer Oberflächenspannung ( 25 dyn pro cm und einem organischen Lösungsmittel mit geringer Wasserlöslichkeit und/oder einer Oberflächenspannung < 20 dyn/cm zufügt,die beiden Flüssigphasen miteinander durch Schütteln durchmischt und anschließend von einander trennt.
2.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,daß die organische Lösungsmittelphase ein geringeres oder höheres spezifisches Gewicht als die wässrige Phase hat.
3.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet daß als wasserunlösliches organisches Lösungsmittel mit geringer Ober£lächenspannung ein AILphat,ein aliphatischer äther oder Thioäther mit o oder mehr Kohlenstoffatomen,ein Halogenkohlenstoff oder Halogenkohlenwasserstoff mit einer Oberflächenspannung < 25 dyn/cm(gegen Dampf oder Luft) für die Lösungsmittelmischung verwendet wird.
4.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekenn=eichnet,daß als Lösungsmittelkomponente mit geringer Wasserlöslichkeit und/oder geringer Oberflächenspannung (< 20 dyn/cm geger Dampf oder Luft) ein Alkohol mit 5 bis 12 kohlenstoffatomen, ein primäres,sekundäres oder tertiäres Amin mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen,ein aliphatischer Menoalkyläther von Athylenglykol mit ~ bis 12 Kohlenstoffatomen,ein Dialk äther von Diäthylenglykol mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen oder Mischungen derselben verwendet wird.
5.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,daß der Volumenanteil der wasserunlöslichen Komponente 50 bis 98@ der organischen Lösungsmittelmischung beträgt.
6.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennXeichnet,daß das Ver mischen einer wissrigen kolloidlösung mit der organischen Lösungsmltielmisechung zwlschen den Festpunbten und den biedepunkten der Flüssigphasen erfolgt.
7.Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet'daß bei Kolloidlösungen biologischer Herkunft das Vermischen der wässrigen Lösung mit der organischen Lösungsmittelmischung bei einer Temperatur zwischen 40C und 60,5°C, günstigenfalls zwischen 200C und 410C erfolgt.
8.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,daß die Durchmischung der Lösungen manuell oder automatisch erfolgt.
9.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,daß nach Durchmischung die Phasentrennung der Lösungen nach einem Verfahren erfolgt'das die unterschiedlichen spezifischen Dichten der Phasen berücksichtigt.
10.Verfahren nach Anspruch 1'dadurch gekennzeichnet,daß das Ab=iehen der Phasen manuell oder automatisch erfolgt.
11.Verfahren nach Anspruch 1'dadurch gekennzeichnet'daß die wässrige einen Analyt enthaltende Phase zu analytischen oder präparativen Zwecken weiterverarbeitet wird.
12.Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet'daß bei der Aufarbeitung von Flüssigkeiten biologischer Herkunft ein cilemischer,biologischer,biochemiscller oder immunologischer Nachweis eines Analyts in der delipidierten wässrigen Phase ausgeführt wird.