DE2944138A1

DE2944138A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung von analysen in automatischen analysensystemen unter abtrennung von niederschlaegen

Info

Publication number: DE2944138A1
Application number: DE19792944138
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr.med. Gerd Assmann; Dr.rer.nat. Horst-Dietrich 4400 Münster Helb; Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. Werner 3418 Üslar Specht; Dipl.-Phys. Rainer 6368 Niederdorfelden Weber
Original assignee: TECHNICON GmbH
Current assignee: TECHNICON GmbH
Priority date: 1979-11-02
Filing date: 1979-11-02
Publication date: 1981-06-11

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung
von Analysen in automatischen Analysensystemen unter Abtrennung von Niederschlägen Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Analysen in einem kontinuierlichen Fließsystem unter Abtrennung von Präzipitaten, die entweder mit der Probe zugeführt werden oder im Verlauf einer Reaktion entstehen. Die Analyse wird dann mit einem Teil des klaren Überstandes durchgeführt.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von High-Density-Lipoproteinen (HDL) über die Messung des Cholesteringehaltes, bei dem zuvor die Low- und Very-Low-Density-Lipoproteine (LDL bzw. VLDL) ausgefällt werden müssen.
Die Hypercholesterinämie ist als primärer Risikofaktor für das Auftreten der koronaren Herzkrankheiten seit 25 Jahren bekannt. Jüngste Befunde scheinen allerdings an der Allgemeinverbindlichkeit des Gesamt-Serumcholesterinspiegels als eines Risikofaktors gewisse Modifikationen erforderlich zu machen. In vielfältigen Studien konnte die Bedeutung des HDL-Cholesterins nachgewiesen werden. Aufgrund einer Vielzahl von Befunden stellte sich das HDL-Cholesterin - im Gegensatz zum Gesamt-Cholesterin - als ein Schutzfaktor gegen die koronare Herzkrankheit dar; niedrige HDL-Cholesterinspiegel sind als Risikofaktor für die koronare Herzkrankheit anzusehen.
HDL-Cholesterin läßt sich einfach und spezifisch durch eine enzymatische Reaktion mit nachfolgender Farbentwicklung bestimmen, wenn zuvor die anderen Lipoproteine mit geringerer Dichte abgetrennt werden. Aus einer Reihe von Veröffentlichungen geht hervor, daß ein Reagenz aus Phosphorwolframsäure und Magnesiumchlorid spezifisch VLDL- und LDL-Anteile im Serum ausfällt, während HDL in Lösung verbleibt.
Aus der Methodenbeschreibung 'HDL-Cholesterin" der Firma Boehringer Mannheim aus dem Jahre 1979 ist ein manuelles Verfahren unter Einsatz des genannten Reagenzes bekannt, das sich aus den folgenden Arbeitsgängen zusammensetzt: Abmessen der Probe, Zusatz einer abgemessenen Reagenzmenge, Mischen des Ansatzes, Inkubation für eine bestimmte Zeit, Zentrifugation für eine bestimmte Zeit mit vorgegebener Leistung, Abnahme des Überstandes, Einsatz eines aliquoten Teils zur Cholesterinbestimmung, Zugabe einer abgemessenen Menge von Cholesterin-Reagenz, Inkubation für eine bestimmte Zeit und fotometrische Bestimmung des entstandenen Farbstoffes.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine derartige aufwendige manuelle Arbeitsweise durch ein automatisches Analysenverfahren zu ersetzen, das sich dadurch auszeichnet, daß unabgemessene Proben eingesetzt werden können und keine Pipettier- und Zentrifugierschritte erforderlich sind.
Gegenstand der Erfindung sind das in den Ansprüchen 1 und 2 gekennzeichnete Verfahren sowie die in den Ansprüchen 3 und 4 gekennzeichnete Vorrichtung.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen näher erläutert, worin F i g . 1 eine schematische Darstellung des Strömungsverlaufs in einem durch zwei Luftblasen segmentierten Probenabschnitt, F i g . 2 eine schematisierte Ansicht einer bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Sedimentationseinrichtung und F i g . 3 ein Fließschema des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeuten.
Für eine ausreichende Sedimentation in vertretbarer Zeit sind zwei Voraussetzungen notwendig, wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwirklicht sind: 1. Gleichmäßige Luftsegmentierung des Stromes, 2. horizontaler und geradliniger Fluß bei Vermeidung Jeglicher Störung des Strömungsverhaltens, wie er gemäß Abb. 1 zu einer völlig symmetrischen Strömungsverteilung führt.
Durch die zweiseitige Begrenzung des strömenden Flüssigkeitssegments mit zwei Luftblasen werden die der Wand benachbarten Flüssigkeitsschichten in die Mitte des Segments und in Fließrichtung transportiert. Teilchen mit größerer Dichte als der der Flüssigkeit reichern sich sehr schnell in der unteren Hälfte des Flüssigkeitssegments an. Wird nach der Sedimentationsstrecke etwa die Hälfte des Stroms nach unten abgesaugt, verbleibt ein fast klarer Uberstand. Verbleibende Niederschlagsreste setzen sich auf einer zweiten Sedimentationsstrecke ab. Zur Analyse wird von oben ein aliquoter Teil abgenommen und in bekannter Weise etwa mit einem luftsegmentierten Strom aus Analysenreagenz in Kontakt gebracht und inkubiert, wonach die erhaltene Farbreaktion fotometrisch ausgewertet wird.
Das allgemeine Verfahren nach Anspruch 1 wird gemäß Anspruch 2 zur automatischen Bestimmung von HDL-Cholesterin angewandt. Das Verfahren verläuft vollautomatisch von der Probenaufnahme bis zur fotometischen Auswertung. Die angesaugten Proben werden verdünnt, mit Fällungsreagenz versetzt und inkubiert, bevor der Niederschlag nach Sedimentation durch Absaugen entfernt wird. Der Niederschlag der Lipoproteine verändert sich im Verlauf der Inkubation: Anfangs ist er schmierig-fettig und bleibt daher leicht an der Gefäßwandung haften, wenn diese nicht aus antiadhäsivem Material besteht. Zum Schluß besitzt er jedoch eine fast körnige, feste Konsistenz.
Die Bestimmung der Cholesterinkonzentration erfolgt in der vom Niederschlag befreiten Lösung nach einer enzymatischen Reaktion entsprechend den folgenden Gleichungen:

Cholesterin-

1 t j + H20 esterase > »½ + RCOOH

lt HO

RCO

Cholesterinester Cholesterin Fettsäure

½ Cholesterin-

H <) + O oxidase < + H205

Cholesterin Cholestenon

y OH - H3 CN0 4 H20

2H2O2+H3C0+ Peroxidase 4

H3C H2 H

4-Amino-Phenazon Phenol

Farbstoff Die Analysenvorrichtung zur Durchführung der Verfahren gemäß der Erfindung besteht gemäß Fig. 3 beispielsweise aus einem Probennehmer 1, einer Pumpe 2, einer analytischen Einheit, die eine Mischspirale 5, ein Heizbad 7 mit einer weiteren Mischspirale und eine Sedimentationsschlange 6 enthält, sowie einem Einkanal-Durchflußfotometer 3 mit einer Küvette von 15 mm Länge und 1,5 mm Durchmesser sowie einem Einkanal-Linienschreiber 4. Vorzugsweise sind das Zugabefitting 8 und die Inkubationsschlange 5 aus einem antiadhäsiven Werkstoff, insbesondere Polytetrafluorethylen (PTFE), gefertigt oder mit einem derartigen Werkstoff ausgekleidet, um ein Anhaften der Ausfällungen an der Wand zu vermeiden.
Beispiel Die Bereitstellung der Proben (Seren) erfolgt in Kunststoffbechern, die sich im Probenteller des Probennehmers 1 befinden. Die Proben werden eine nach der anderen unter Dazwischenschaltung von Waschflüssigkeitsabschnitten in einem derartigen Rhythmus angesaugt, daß das Proben/Waschflüssigkeits-Entnahmeverhältnis 6:1 beträgt und 60 Proben/h verarbeitet werden. (Diese Betriebsweise kann variiert werden.) Das die Waschflüssigkeit enthaltende Gefäß im Probennehmer wird über die Pumpe 2 mit 2 ml Wasser/min versorgt.
Über den in der Pumpe 2 installierten Probenschlauch mit einer Förderleistung von 0,16 ml/min wird das Serum in einen luftsegmentierten Strom von Fällungsreagenz mit Netzmittel (1,0 ml/min) über eine Zugabestelle 8 aus Polytetrafluorethylen (PTFE) zudosiert. Der Luftschlauch fördert 0,42 ml Luft/min. Das Fällungsreagenz ist wie folgt zusammengesetzt: 0,5 % Phosphorwolframsäure 6,25 mM Magnesiumchlorid 20 mM Natriumhydroxid pH 7,1 5 ml Polyoxyethylenlauryläther (Brij 35) pro 1000 ml Nach der Inkubation in der PTFE-Mischspirale 5 mit 25 Windungen fließt der Strom durch die Sedimentationsschlange 6 mit 1 Windung (Fig. 2). Der angereicherte Niederschlag B wird mit 0,8 ml/min nach unten abgesaugt. Aus dem Überstand wird am Ende mit 0,16 ml/min ein Teil A der Flüssigkeit und der Luftblasen abgenommen und einem mit Luft segmentierten Strom aus Cholesterinreagenz zudosiert, der in einer Heizschlange bei 37 OC inkubiert wird. Die optische Dichte des in der enzymatischen Reaktion mit der Probe entstehenden Farbstoffes wird im Duchflußfotometer 3 gemessen. Das Ergebnis erscheint auf dem Schreiber 4.
L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche z9 Verfahren zur Durchführung von Analysen in automatischen alysensystemen, die nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses arbeiten, unter Abtrennung von Niederschlägen, dadurch gekennzeichnet, daß man den in einer zu analysierenden Flüssigkeit enthaltenen oder in ihr erzeugten Niederschlag - ggf. nach einer Inkubationszeit - in einem horizontal und geradlinig geführten Abschnitt eines gleichmäßig mit Luft segmentierten Probenstromes absitzen läßt, den sedimentierten Niederschlag durch Absaugen entfernt und aus dem verbleibenden Probenstrom einen aliquoten Teil zur Analyse entnimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von High-Density-Lipoproteinen (HDL), insbesondere in Körperflüssigkeiten, über die Messung des Cholesteringehalts, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der verdünnten Probe durch Zusatz eines Reagenzes aus Phosphorwolframsäure und Magnesiumchlorid die Very-Low-Density-Lipoproteine (VLDL) und Low-Density-Lipoproteine (LDL) ausfällt, die Probe anschließend inkubiert, nach Sedimentation den abgesetzten Niederschlag absaugt und aus dem verbleibenden Flüssigkeitsstrom einen aliquoten Teil entnimmt und der enzymatischen Cholesterinanalyse zuführt.
3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit durch eine Förderpumpe sperrbaren und für den Durchfluß freigebbaren Zuführungsleitungen für Waschflüssigkeit, Luft, Probe und Reagenzien, einem Probennehmer, der von einem Probenteller Anteile der zu untersuchenden Flüssigkeit und Waschflüssigkeit in die Probenzuführungsleitung eingibt, einer Einmündung der Luftleitung in die Probenleitung, einer stromabwärts davon angeordneten Einmündung einer Reagenzienleitung in die Probenleitung, einer davon stromabwärts angeordneten Mischspirale mit Heizbad sowie einem Fotometer und einem Registriergerät, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Einmündungen von Luft- und Reagenzienleitung, ggf. nacF d- Einmündung einer Fällungsreagenzleitung und bzw. oder Einschaltung einer Mischspirale (5) zur Inkubation der Ausfällung, eine aus horizontal und geradlinig verlaufenden Leitungsabschnitten bestehende Sedimentationsschlange (6) mit einem Auslaß für den Niederschlag (B) und einem Auslaß für die überstehende Flüssigkeit (A) vorgesehen ist.
4. Vorrichtung gemäß Anspruch 3 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Einmündung der Luftleitung und der Sedimentationsschlange (6) die Einmündung einer Fällungsreagenzleitung und stromabwärts davon daran anschließend eine Mischspirale (5) vorgesehen sind und daß der Abschnitt von der Einmündung der Fällungsreagenzleitung bis zum Ende der Mischspirale (8, 5) aus einem antiadhäsiven Werkstoff, insbesondere Polytetrafluorethylen, besteht oder mit ihm ausgekleidet ist.